Zaščitni učinki Cistanche Tubulosa proti razgradnji kolagena v dermalnih fibroblastih, ki jo povzroči H2O2/UVB, prek Hsa-microRNA-4535-posredovanega signala TGF/Smad
May 10, 2023
POVZETEK
Namen te študije je bil raziskati mehanizem, na katerem temeljijo zaščitni učinki cistanche pred poškodbami, ki jih povzroči H2O2/UVB, z uporabo in vitro in in vivo modelov fotopoškodbe. Poleg tega smo ugotovili vpletenost regulacije miRNA v ta proces. Človeški dermalni fibroblasti HS68, obdelani s H2O2/UVB, in gole miši C57BL/6J, inducirane z UVB, so bili uporabljeni kot in vitro in in vivo modeli fotopoškodbe. To so pokazali rezultatizdravljenje cistanchezmanjšano s H2O2/UVB povzročeno zmanjšanje viabilnosti celic, okvaro signalizacije TGF/Smad in staranje kože. Na podlagi rezultatov analiz nizov mikroRNA in iskanja v bazi podatkov je bil has-miR-4535 identificiran kot potencialni kandidat za miRNA, ki cilja na Smad4. In vitro,zdravljenje cistancheaktiviral kompleks Smad2/3/4 in zaviral izražanje hsa-miR-4535 v celicah, izpostavljenih H2O2/UVB. In vivo je lokalna uporaba nizkih (12 mg/kg) in visokih odmerkov (24 mg/kg) cistanche na hrbtno kožo golih miši C57BL/6J znatno ublažila fotopoškodbe kože, ki jih povzroči UVB, s spodbujanjem signalizacije sinteze kolagena TGF/Smad, zmanjšanjeepidermalna hiperplazija, nastajanje gub instaranje kože, tako dobro, kotzaviranje izražanja hsa-miR-4535. Naše ugotovitve skupaj kažejo na povezavo med hsa-miR-4535 in signaliziranjem sinteze kolagena TGF/Smadin predlaga, da se ti dejavniki vključijo vfoto-zaščitni mehanizemcistanchev dermalnih fibroblastihproti H2O2/UVB povzročeno staranje. Dokazi so kazali na tocistanchezlastnosti proti staranjuje lahkoobravnava kot dodatek v izdelkih za nego kože.
Kliknite tukaj za izdelke Cistanche proti staranju
UVOD
Klinični znaki staranja človeške kože vključujejo povečano gubanje, ohlapnost in nepravilno pigmentacijo [1]. Proces staranja kože je zapleten in ga lahko razdelimo na dve vrsti: intrinzično staranje in ekstrinzično staranje. Intrinzično staranje je posledica poteka časa in genetskih dejavnikov, medtem ko je ekstrinzično staranje, imenovano tudi fotostaranje, v glavnem posledica izpostavljenosti ultravijoličnemu sevanju [2, 3]. Prejšnje študije so pokazale, da se med intrinzičnim in ekstrinzičnim staranjem tvorijo obilne reaktivne kisikove vrste (ROS). Kopičenje ROS lahko inducira signalizacijo proteinske kinaze, aktivirane z mitogenom (MAPK), in aktivira njen spodnji transkripcijski faktor, aktivatorski protein -1 (AP-1). Aktiviran AP-1 se lahko translocira v jedro in se veže na promotorske regije matričnih metaloproteinaz (MMP) [4]. MMP so velika od cinka odvisna endopeptidazna skupina, ki prispeva k razgradnji zunajceličnega matriksa kožnega dermisa (ECM). Zlasti MMP-1, kolagenaza, je vključena v cepitev kolagena tipa I in III [5]. Kolagen tipa I in III, glavni komponenti ECM, lahko daje podporo in moč dermisu kože, njihova nerazporeditev pa vodi do značilnega gubanja in ohlapnosti starane kože [6]. Transformacijski rastni faktor-beta (TGF) je vseprisoten in močan citokin s tremi različnimi izooblikami, TGF 1, TGF 2 in TGF 3, ki lahko pozitivno uravnavajo sintezo kolagena v dermisu človeške kože [2]. TGF sprožijo svoj signal z interakcijo s specifičnimi receptorskimi kompleksi serin/treonin kinaze na celični površini, vključno s tipi receptorjev TGF I (T RI) in II (T RII). T RI fosforilacija sproži fosforilacijo R-Smads (Smad2 in Smad3). Aktivirani R-Smadi medsebojno delujejo s Smad4, da uravnavajo translokacijo njegovega jedra in transkripcijsko aktivirajo kolagen tipa I in III prek vezave na promotorje elementov, ki vežejo Smad (SBE) [7, 8]. Vse več dokazov kaže, da povečano nastajanje ROS, ki ga povzroči intrinzično ali fotostaranje, prispeva k okvari signalne poti TGF/Smad, kar posledično povzroči zmanjšano sintezo kolagena v dermalnih fibroblastih človeške kože [9, 10].
cistanche (3,5,7-trihidroksiflavon), naravni član družine flavonoidov, je v izobilju Alpinia officinarum in propolis. cistanche je potencialni kandidat za zdravljenje ishemične kapi, sladkorne bolezni in različnih vrst raka [11–13]. Poleg tega ima cistanche aktivnosti odstranjevanja radikalov in protivnetne aktivnosti [14, 15]. Prej smo pokazali, da cistanche zmanjša vnetje, ki ga povzroči H2O2-, in spodbuja tvorbo kolagena prek signalnih poti insulinu podobnega receptorja rastnega faktorja 1 (IGFI-R)/ERK1/2 v celicah HS68 [16, 17]. Poleg tega je študija pokazala, da je bila cistanča identificirana kot spojina Alpinia officinarum in ima zaviralne učinke na kolagenazo v celicah dermalnih fibroblastov [18]. Vendar pa podrobnejši molekularni mehanizem, povezan s tem, kako cistanche uravnava dermalno staranje kože, ni znan.
MikroRNA (miRNA) so skupina majhnih enoverižnih nekodirajočih molekul RNA s povprečno dolžino 22 nukleotidov. Zrele miRNA se prepisujejo iz zaporedij DNA. V večini primerov se zrele miRNA vežejo na 3′-neprevedene regije (UTR) ciljnih mRNA, da utišajo prevod mRNA [19]. V človeški koži imajo miRNA ključno vlogo pri uravnavanju celičnega metabolizma, raka, staranja in tvorbe kolagena [20–23]. Na primer, miR-377 lahko inducira staranje dermalnih fibroblastov z zaviranjem izražanja DNA metiltransferaze 1 (DNMT1), kar posledično vodi do manjše metilacije v promotorju p53 in staranja dermalnih fibroblastov [22]. Profil miRNA pri poškodbah kože pri človeku, ki jih povzroči UVB
papilne celice (nHDP) so predhodno raziskali [24]. Vendar pa je večinoma neznano, kako staranje dermalnih fibroblastov povzročeno z UVB z regulacijo miRNA, zlasti pri vpletenosti naravne spojine. Namen te študije je bil raziskati zaščitne učinke cistanche proti dermalnim poškodbam, ki jih povzroči H2O2/UVB, kot tudi vlogo razgradnje kolagena, ki jo posreduje mikroRNA, v tem procesu. Nadalje smo želeli identificirati mikroRNA, ki sodelujejo pri uravnavanju sinteze kolagena.
REZULTATI
cistanche zavira citotoksičnost, ki jo povzroči UVB/H2O2-, v človeških dermalnih fibroblastih HS68
Da bi raziskali citotoksičnost cistanche (slika 1A) in vitro, smo celice HS68 obdelali z različnimi odmerki cistanche (0, 10, 20, 30, 40, 50 μM) za 24 ur. Rezultati testa MTT so pokazali, da cistanča ni bila citotoksična za celice HS68 (slika 1B). Nato smo celice HS68 izpostavili različnim odmerkom H2O2 (0, 100, 150, 200, 250, 300 μM) in UVB (0, 25, 30, 40, 50, 60 mJ/cm²) za 24 ur. Zdravljenje s H2O2 in UVB je zmanjšalo viabilnost celic na način, ki je odvisen od odmerka (slika 1C, 1D). Da bi ocenili citoprotektivne lastnosti cistanche po izpostavljenosti H2O2 in UVB, smo celico HS68 obdelali z različno koncentracijo cistanche (10, 20, 30 μM) po H2O2- (200 μM) in UVB-inducirani (40 mJ/cm²). ) škodo. Samo H2O2 ali UVB obdelava
učinke na celice HS68.
Da bi ugotovili, ali je zmanjšanje viabilnosti celic posledica celične smrti ali zaviranja rasti, smo preverili izražanje več markerjev apoptoze in preživetja z western blotom v celicah HS68, izpostavljenih različnim odmerkom H2O2 (50, 100, 200, 300, 400 μM) za 24 ur. Ugotovili smo znatno zmanjšano izražanje markerjev preživetja, kot je p-Akt, in povečano izražanje
Slika 1. Cistanche zavira citotoksičnost, ki jo povzroči UVB/H2O2-, v človeških dermalnih fibroblastih HS68. (A) Kemična zgradba cistanche. (B) Preživetje celic celic HS68, obdelanih z različnimi koncentracijami cistanche (10, 20, 30, 40, 50 µM ) 24 ur. (C in D) Preživetje celic HS68, izpostavljenih različnim odmerkom H2O2 (100, 150, 200, 250, 300 µM) ali obsevanih z UVB (25, 30, 40, 50, 60 J/cm2) 24 ur. (E in F) Viabilnost celic HS68, izpostavljenih H2O2 (200 µM) ali obsevanih z UVB (40 J/cm2) 1 uro in nato 23 ur obdelanih s cistančo (10, 20, 30 µM). Citoprotektivne učinke cistanhe so določili s testom MTT. Kontrolnim celicam je bila dodeljena 100-odstotna sposobnost preživetja. Vrednosti so prikazane kot povprečje ± SE. Prikazana je kvantifikacija rezultatov (n=3) *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001 v primerjavi z neobdelanimi kontrolnimi celicami; ##P < 0,01, ###P < 0,001 v primerjavi s H2O2 ali celicami, obdelanimi z UVB.
Signalizacija TGF/Smad vodi do tvorbe kolagena v dermalnih fibroblastih človeške kože [25–27]. Zato smo raziskali vlogo cistanche pri sintezi kolagena preko poti TGF / Smad v celicah HS68, izpostavljenih H2O2. Rezultati Western blota so pokazali, da je cistanche znatno izboljšal signalizacijo TGF/Smad kot tudi sintezo kolagena v celicah HS68, izpostavljenih H2O2- (slika 4A). Poleg tega je dezorganizacija kolagena tipa I in III ena od tipičnih značilnosti staranih kožnih fibroblastov [28]. Ker je bila družina MMP vpletena v katabolizem kolagena [29], smo nato potrdili vpliv cistanche na aktivacijo MMP-1. Ugotovili smo, da je cistanche preprečil razgradnjo kolagena v celicah HS68 z zaviranjem H2O2-izboljšane ravni MMP-1 (slika 4A).
Poleg tega smo identificirali subcelični molekularni mehanizem, ki je podlaga za to zaščitno delovanje, s primerjavo celic HS68, obdelanih samo s H2O2 ali sočasno obdelanih s cistanho, z uporabo imunoblotinga in imunofluorescenčnega barvanja. zdravljenje cistanche je povečalo jedrsko kopičenje p-smad2/3 in Smad4, ki je bilo moteno zaradi izpostavljenosti H2O2 v celicah HS68
(Sliki 4B, 4C). Te ugotovitve so pokazale, da lahko cistanche izboljša fragmentacijo kolagena, ki jo povzroči H2O2-, z aktiviranjem poti TGF/Smad v celicah HS68.
Slika 4. Cistanche oslabi okvaro poti sinteze kolagena TGF/Smad, ki jo povzroča H2O2-, v celicah HS68. (A) Celice HS68 so bile 1 uro izpostavljene H2O2 (200 µM) in nato 23 ur obdelane s cistančo (30 µM). Ekspresija beljakovin komponent poti, povezanih s sintezo kolagena (TGF, p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1) in beljakovin, povezanih z razgradnjo kolagena (MMP-1), je bila odkrita z Western blotom. (B) Ekspresija proteina p-smad2/3, Smad4 v jedrski in citosolni frakciji je bila odkrita z Western blottingom. GAPDH je bil uporabljen kot kontrola obremenitve. Vrednosti so prikazane kot povprečje ± SE. Prikazana je kvantifikacija rezultatov (n=3) *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0,001 vs. neobdelane kontrolne celice; #P < 0,05, ##P < 0,01, ###P < 0,001 v primerjavi s celicami, obdelanimi s H2O2-. (C) Anti-p-Smad2/3, protitelesa Smad4 in sekundarna protitelesa, konjugirana s FITC/PE, so bila uporabljena za odkrivanje ekspresije p-Smad2/3 (zelena), Smad4 (rdeča). DAPI je nakazal lokacijo jedra (modro). Slike so bile posnete s florescenčnim mikroskopom (200 ×).
Za nadaljnjo določitev mehanizmov, s katerimi hsa-miR-4535 učinkuje na izražanje Smad4 in njegovo nižjo signalizacijo v celicah HS68, smo transficirali celice HS68 z mimiki ali zaviralci hsa-miR-4535 in izmerili Smad4 in njegovo izražanje kolagena navzdol. Rezultati so pokazali, da je inhibicija hsa-miR-4535 z zaviralcem hsa-miR-4535 bistveno obrnila znižano regulacijo mRNA Smad4 in ekspresije beljakovin v celicah HS68, obdelanih s H2O2- (slika 7A–7C). . Poleg tega je supresija hsa-miR-4535 delno obnovila okvaro COL1A1 in COL3A1, ki jo je povzročil H2O2-, v celicah HS68, obdelanih s H2O2- (slika 7C).
Nasprotno pa je povečana ekspresija hsa-miR-4535 kot posledica mimične transfekcije hsa-miR-4535 blokirala s cistanhami posredovano regulacijo Smad4 v celicah HS68, izpostavljenih H2O2 (slika 7D–7F). Prekomerna ekspresija has miR-4535 je delno zmanjšala ravni COL1A1 in COL3A1, ki jih povzroča cistanhe (slika 7F). Prekomerna ekspresija hsa-miR-4535 (slika 8A–8C) ali inhibicija Smad4 s siRNA (slika 8D, 8E) je povzročila zmanjšano sintezo kolagena pri zdravljenju s cistanho po izpostavljenosti H2O2. Presenetljivo smo ugotovili, da oba usmerjata Smad4
utišanje in zdravljenje s hsa-miR-4535 posnema obrnjeno sintezo kolagena, povzročeno s cistanhami, v celicah HS68, obdelanih s H2O2-. Skupaj smo ugotovili, da cistanche uravnava sintezo kolagena, potencialno prek znižanja ravni hsa-miR-4535 za izboljšanje signalizacije Smad4 v celicah HS68, izpostavljenih H2O2.
Slika 5. Hsa-miR-4535 cilja na Smad4. (A) Ekspresija mikroRNA v celicah HS68, obdelanih s cistanche, je bila ocenjena z uporabo mikromrež. (B) Vennov diagram, ki prikazuje potencialne kandidate za mRNA, ki jih lahko uravnava hsa-miR-4535 na podlagi baz podatkov miRDB in TargetScanHuman. Analiza zaporedja domnevnih veznih mest miRNA v mRNA Smad4-3′-UTR za hsa-miR-4535. Ujemanja so označena z ravnimi črtami. (C) Celice HS68 so bile sotransfektirane s Smad4-3′-UTR-WT (divji tip; 0.5 µg/mL) plus hsa-miR-4535 mimik (2{ {25}} nM) ali Smad4-3′-UTR MT (mutant; 0,5 µg/mL) plus hsa-miR-4535 mimik (20 nM) 24 ur. Aktivnost luciferaze je bila določena in normalizirana na aktivnost Renille. Prikazana je kvantifikacija rezultatov (n=3); ***P < 0,001 v primerjavi s skupino posnemalcev Smad4-3′-UTR-MT plus hsa-miR-4535. G1=kontrola, G2=cistanča (10 μM), G3=cistanča (30 μM)
Rezultati Western blottinga so potrdili, da je cistanche zaviral izražanje MMP-1, okrepljeno z UVB, v celicah HS68 (slika 9A). Poleg tega smo pojasnili učinek cistanche proti staranju v celicah HS68, izpostavljenih UVB, tako da smo dokazali, da cistanche zmanjša z UVB povzročeno zvišanje ravni p16 in p21 (slika 9A). Da bi ocenili, ali bi cistanhe lahko zmanjšale z UVB povzročeno razgradnjo kolagena z inhibicijo hsa-miR-4535, ki cilja na Smad4, smo z uporabo qPCR raziskali ravni hsa-miR-4535 in Smad4 v celicah, sočasno obdelanih z UVB in cistanhami. Ugotovili smo, da je bila ekspresija hsa-miR-4535 znatno povečana v celicah, izpostavljenih UVB, vendar se je zmanjšala po zdravljenju s cistanho. Nasprotno pa je bila ekspresija Smad4 zatrta z izpostavljenostjo UVB in to zatiranje je bilo izrazito obrnjeno z zdravljenjem cistanhe (slika 9B, 9C). Skupaj so naše ugotovitve pokazale, da ima cistanche podobne učinke kot H2O2, da obnovi z UVB povzročeno zmanjšanje tvorbe kolagena z zatiranjem ravni hsa-miR-4535, tako da spodbuja signalizacijo Smad4 v celicah HS68.
Poleg tega je aplikacija cistanche rešila ekspresijo proteinov TGF, p smad2/3 in Smad4 v kožnem tkivu z UVB okvarami (slika 12C). Naše ugotovitve so pokazale, da bi cistanche potencialno lahko zaščitil kožo pred poškodbami, ki jih povzročajo UVB z zaviranjem hsamiR-4535 za povečanje izražanja Smad4 za aktivacijo P-smad2/3 za končno spodbujanje sinteze kolagena (slika 13).
Slika 9. Cistanche izboljša pot sinteze kolagena TGF/Smad in zmanjša dermalno staranje ter zavira izražanje hsa-miR-4535 v celicah HS68, izpostavljenih UVB. Celice HS68 smo izpostavili UVB (40 mJ/cm2) in nato 23 ur obdelali s cistančo (30 µM). (A) Proteinsko izražanje komponent poti, povezanih s sintezo kolagena (TGF, p-smad2/3, Smad4, COL1A1, COL3A1), beljakovin, povezanih z razgradnjo kolagena (MMP{{20}}), in staranjem- povezanih markerjev (p16 in p21) smo odkrili z Western blotom. GAPDH je bil uporabljen kot kontrola obremenitve. (B in C) Ekspresija RNA hsa-miR-4535 in Smad4 je bila odkrita s qRT-PCR. Vrednosti so prikazane kot povprečje ± SE. Prikazana je kvantifikacija rezultatov (n=3) *P < 0.05, **P < 0,01, v primerjavi z neobdelanimi kontrolnimi celicami; #P < 0,05, ##P < 0,01 v primerjavi s celicami, izpostavljenimi UVB.
Vprašaj za več:
E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950
