Zaščitni učinki mikrovezikul endotelijskih matičnih celic na poškodbo ledvičnih celic podgan, ki jo povzroči Ang II
Mar 11, 2022
Povzetek.Kronična hipertenzija lahko povzročipoškodbe ledvic,znana kot hipertenzivna nefropatija ali hipertenzivna nefroskleroza. Nadaljnje razumevanje molekularnih mehanizmov, prek katerih se razvije hipertenzivna nefropatija, je bistveno za učinkovito diagnozo in zdravljenje. Ta študija je preučevala mehanizme, s katerimi endotelne matične celice (EPC) popravljajo primarno podganoledvicacelic (PRK). ELISA, komplet za štetje celic-8 in testi s pretočno citometrijo so bili uporabljeni za analizo učinkov EPC ali EPC-MV na oksidativni stres, vnetje, celično proliferacijo, apoptozo in cikel PRK, ki jih povzroča AngII. Model poškodbe PRK je bil vzpostavljen z uporabo angiotenzina II (Ang II). Po indukciji Ang II se je proliferacija PRK zmanjšala, apoptoza se je povečala in celični cikel je bil blokiran v fazi G1 pred vstopom v fazo S. Ugotovljeno je bilo, da so bile ravni reaktivnih kisikovih vrst in malondialdehida povečane, medtem ko so bile ravni glutation peroksidaze in superoksid dismutaze znižane. Poleg tega so se znatno povečale ravni vnetnih citokinov IL-1, IL-6 in TNF-. Tako je Ang II poškodoval PRK s spodbujanjem oksidativnega stresa in spodbujanjem vnetnega odziva. Ko pa so PRK gojili skupaj z EPC, se je škoda, ki jo povzroča Ang II, znatno zmanjšala. Trenutna študija je zbrala mikrovezikle (MV), ki jih izločajo EPC, in jih gojila skupaj s PRK, ki jih povzroča Ang II, ter ugotovila, da so EPC-MV ohranili svoj zaščitni učinek na PRK. Skratka, EPC ščitijo PRK pred poškodbami, ki jih povzroča Ang II, preko izločenih MV.
CISTANCHE BO IZBOLJŠAL LEVIČNE/LEDVIČNE BOLEZNI
Uvod
Hipertenzija je dejavnik tveganja za pojav srčno-žilnih in možgansko-žilnih bolezni ter z njimi povezano umrljivost (1). Theledvicelahko povzročijo hipertenzijo in so eden od tarčnih organov hipertenzivne poškodbe (2). kroničnobolezni ledvic(CKD) je bil v zadnjih dveh desetletjih eden glavnih vzrokov povečane umrljivosti med posamezniki z visokim krvnim tlakom po vsem svetu (3,4). Zato obstaja nujna potreba po spodbujanju zdravljenja hipertenzivne nefropatije in preučevanju njenega patološkega mehanizma. Prejšnje študije so pokazale, da je angiotenzin II (Ang II) povzročil poškodbe žil in imel ključno vlogo pri vaskularnih boleznih prek več mehanizmov, kot je indukcija apoptoze (5), zaustavitev celičnega cikla (6), povečanje ravni reaktivnih kisikovih vrst (ROS) ( 7), spodbujanje odziva na oksidativni stres s povečanjem izločanja malondialdehida (MDA) in zmanjšanjem izločanja glutation peroksidaze (GSH‑Px) in superoksid dismutaze (SOD) (8,9). Ang II spodbuja tudi nastajanje dejavnikov, povezanih z vnetjem, kot so IL-6, IL-1 in TNF- (10-12). Poškodba, povzročena z Ang II, je bila zato uporabljena za modeliranje hipertenzije in vitro, vključno s primarnimi podganamiledvicacelic (PRK) (13,14).
Za bolnike zdelovanje ledvicokvara, poškodba endotelijskih celic ter zmanjšana regeneracija in popravilo so glavni vzroki za izgubo peritubularnih mikrovezikul (MV) (15). Endotelne matične celice (EPC), pridobljene iz kostnega mozga, lahko spodbujajo popravilo endotelija (16,17). Prejšnje študije so pokazale, da lahko EPC izboljšajo regeneracijo srca in ožilja (18) in uravnavajo angiogenezo (19) ter imajo terapevtske učinke na akutneledvičnaishemično-reperfuzijsko poškodbo (20) in pri bolnikih zpresaditev ledvice(21). Vendar, kolikor nam je znano, učinek EPC na hipertenzivno nefropatijo še ni bil opisan. Domnevali smo, da imajo lahko EPC zaščitni učinek proti hipertenzivni nefropatiji priledvičnacelice. MV nenehno izločajo različne celice v telesu, kot so epitelne celice, tumorske celice in izvorne celice, in obstajajo v več telesnih tekočinah, kot so kri, urin in mleko, kjer posredujejo biološke funkcije (22). Kopičenje dokazov kaže, da je zaščitni učinek EPC-jev tesno povezan s sproščanjem MV (23, 24). V tej študiji je bila potencialna uporaba EPC-MV za zdravljenje hipertenzivne nefropatije proučena s preiskovanjem zaščitnih učinkov in mehanizmov prek katerih EPC-MV ščitijo pred poškodbo PRK, ki jo povzroča Ang II, da bi zagotovili biološko teoretično podlago za zdravljenje hipertenzivne nefropatije.
Ključne besede:EPC-MV, hipertenzivna nefropatija, Ang II, ROS, MV, vnetje, ledvice, ledvice
Materiali in metode
Živali.Skupno 12 8-teden stare podganje samce Wistar-Kyoto (WKY) brez specifičnih patogenov (teža, 80–120 g) so pridobili od Beijing Vital River Laboratory Animal Technology Co., Ltd. (licenca št. SCXK, Guangdong, 2015-0063). Podgane so bile postavljene v prostor s konstantno temperaturo in vlažnostjo (temperatura 23±2˚C; vlažnost 50±10 odstotkov), pod 12-urnim ciklom svetloba/tema z ad libitum dostopom do standardne hrane in vode za podgane. kletka iz polistirena. Vse poskuse na živalih je odobril Odbor za nego in uporabo živali Hainan Medical University (Haikou, Kitajska; odobritev št. HYLL‑2021‑053) in so bili izvedeni v skladu s smernicami Nacionalnega inštituta za zdravje (25).
CISTANCHE BO IZBOLJŠAL DELOVANJE LEDVIC/LEDVIC
Izolacija in kultura PRK.Podgane WKY s prostim dostopom do vode so se pred poskusom postile 12 ur. Miši WKY smo evtanazirali z intraperitonealno injekcijo natrijevega pentobarbitala (200 mg/kg telesne teže), natoledviceodstranili aseptično in kortikalni delledvicaje bil izrezan in presajen v majhno čašo. Theledvičnaskorjo smo razrezali na fragmente tkiva ~1 mm3, trikrat sprali s PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), centrifugirali pri 1,000 xg pri 25˚C 5 minut in supernatant zavrgli. Fragmente tkiva smo dodali kolagenazi tipa I (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) pri končni koncentraciji 1 g/l in fragmente tkiva smo oscilirali in razgradili pri 37˚C 30 min. Po filtraciji skozi sito iz nerjavečega jekla z 200-mrežami (0,075 mm) smo celice ločili s centrifugiranjem z gostotnim gradientom po Ficollu (Sigma-Aldrich; Merck KGaA) (26). Po centrifugiranju pri 1,000 x g pri 25 °C 2 minuti smo vmesno suspenzijo zbrali in zmešali z medijem MEM/F12 (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.), inokulirali v ploščo s 6 vdolbinicami in gojene pri 37˚C pod 5 odstotki CO2. Po 24 urah smo medij odstranili in nadomestili s svežim medijem in nepritrjenimledvičnacelice in tkivo so zavrgli. Po 48 urah smo medij ponovno odstranili, celice dvakrat sprali s PBS in jih označili kot PRK (27, 28); glavni sestavni del so bile glomerularne mezangialne celice podgan. PRK so gojili tri generacije in obdelali z Ang II (1 µM; Sigma‑Aldrich; Merck KGaA) pri 37˚C 24 ur, da se vzpostavi PRKpoškodbe ledvicmodel. Ang II-inducirano vnetje pri podganahledvičnatubularnih epitelijskih celic je bila izvedena, kot so predhodno opisali Nair et al (29).
PRK so identificirali z imunofluorescenčnim (IF) testom.Po trikratnem izpiranju s PBS in fiksiranju s 4-odstotnim paraformaldehidom pri 25 °C 1 uro smo celice inkubirali (25 °C) s Tritonom X‑100 2 uri, čemur je sledil 5-odstotni BSA (Peking). Solar Science & Technology Co., Ltd.) pri 25˚C 30 minut. PRK so nato čez noč inkubirali v temi z aktinom -gladkih mišic (-SMA; 1 µg/ml; kat. št. ab7817; Abcam) in vimentinom (1:250; kat. št. ab92547; Abcam) pri 4˚C. Po trikratnem izpiranju s PBS smo celice inkubirali s sekundarnimi protitelesi Alexa Fluor® 488‑ (1:100; kat. št. ab150077; Abcam) ali 647-označenimi (1:200; kat. št. ab150075; Abcam) pri 37 ˚C 1 uro. Nato smo celice obarvali z DAPI (0,5 µg/ml; Beyotime Institute of Biotechnology) pri 25˚C 5 minut. Nazadnje so bile slike zajete s fluorescenčnim mikroskopom (povečava, x400; Leica Microsystems GmbH).
Kultura in identifikacija EPC.Stegnenico in golenico podgane smo razrezali in vsako cev kostnega mozga splaknili s sterilnim PBS. Nastalo mešanico smo centrifugirali (1,000 xg; 25˚C; 15 min) in delce ponovno suspendirali v mediju MEM/F12. Celice smo izolirali s centrifugiranjem z gostotnim gradientom Ficoll (Sigma‑Aldrich; Merck KGaA) (1,000 xg; 25˚C; 20 min) in dali v 25‑cm2 bučko za kulturo, prevlečeno s fibronektinom (BD Biosciences). Celice smo vzdrževali v popolnem gojišču pri standardnih pogojih (37˚C; 5 odstotkov CO2). Gojišče smo zamenjali po 4 dneh in adherentne celice gojili dodatne 3 dni (30). Za identifikacijo EPC-jev je bilo uporabljeno barvanje z acetiliranim lipoproteinom nizke gostote Dil-kompleksa (Dil-Ac-LDL) (Beijing Solar Science & Technology Co., Ltd.). Za sistem kokultivacije so bili PRK (1x104) dodani v spodnjo komoro plošče za sokultivacijo (Corning, Inc.) za 24 ur, nato pa Ang II (1 µM) ali 200 µl PBS in EPC (3x104) dodamo v zgornjo komoro in inkubiramo pri 37 °C 24 ur, preden izvedemo nadaljnjo analizo delovanja celic. Pri presejanju PRK in najboljšega deleža EPC so bila razmerja števila celic 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6 in 1:7.
Priprava EPC‑MV. EPC so gojili 7 dni, kot je opisano prej (30), dvakrat sprali s PBS in 12 ur izpraznili serum. Nato smo medij MEM/F12, ki je vseboval gojene EPC, zbrali in centrifugirali pri 4˚C (1,000 xg; 15 min), supernatant pa ekstrahirali pri 4˚C (100,000 xg; 60 min) za zbiranje izločenih EPC-MV. Po vdelavi v epoksidno smolo Pon 812 (Structure Probe, Inc.) smo ga čez noč postavili pri 37 °C. Nato smo za 4 ure dodali raztopino za fiksiranje elektronskega mikroskopa (Wuhan Service Technology Co., Ltd.) ter uranov acetat (2 odstotka; Wuhan Service Technology Co., Ltd.) in svinčev citrat (Wuhan Service Technology Co., Ltd.). ) smo obarvali pri 25 °C 15 minut. MV so bili potrjeni s transmisijsko elektronsko mikroskopijo. V sistemu sokulture smo 50 µg/ml EPC-MV (31) dodali v zgornjo komoro preskusne plošče Transwell, parke pa dodali v spodnjo komoro, kot je opisano prej, in inkubirali 24 ur.
Test celične proliferacije.PRK smo razgradili s tripsinom, inokulirali v plošče s 96 vdolbinicami pri gostoti 3x103 celic/vdolbinico in gojili 24 ur. Za oceno hitrost celične proliferacije.
CISTANCHE BO IZBOLJŠAL LEDVIČNE/LEDVIČNE BOLEČINE
Test celične apoptoze.Test celične apoptoze je bil izveden z uporabo kompleta za odkrivanje apoptoze Annexin V‑FITC (BD Biosciences) v skladu z navodili proizvajalca. PRK smo pobrali, dvakrat sprali z ledeno mrzlim PBS (Gibco; Thermo Fisher Scientific, Inc.) in resuspendirali v 500 µl vezavnega pufra. Resuspendirane PRK smo nato inkubirali s 5 µl aneksina V-FITC in 5 µl PI v temi 15 minut pri 23±2˚C. Apoptozo celic so ocenili s pretočno citometrijo (FCM; FACSCanto II; programska oprema BD FACSChorus™, različica: 1.0; BD Biosciences).
Fuzija EPC‑MV in PRK.Da bi ugotovili, ali so bili EPC-MV spojeni s PRK, so bili EPC-MV pred soinkubacijo označeni s fluorescenčnim barvilom, vgrajenim v lipidno membrano (PKH26). Na kratko, 50 µg/ml EPC-MV smo združili z 2 ml PKH26 (2x10-6 M; Sigma-Aldrich; Merck KGaA) in mešali pri 23 ± 2˚C 5 minut. Označeno mešanico smo dodali 2 ml 1 % BSA (v) in centrifugirali pri 100,000 xg pri 4˚C 60 minut, nato pa splaknili s hladnim PBS. Oborino smo suspendirali v 1 ml medija MEM/F12, dodali k PRK in inkubirali pri 37 °C 24 ur. Nazadnje smo dodali 1 µg/ml DAPI za jedrsko barvanje pri 25 °C 15 minut. Slike celic so bile pridobljene s fluorescenčnim mikroskopom (povečava, x400; Leica Microsystems GmbH).
Test celičnega cikla.Test celičnega cikla je bil izveden z uporabo kompleta Cell Cycle Detection (BD Biosciences). EPC ali PRK (1x106) smo pobrali, dvakrat sprali s PBS in nato fiksirali v 500 µl 70-odstotnega ledeno mrzlega etanola 2 uri pri 25 °C. Celice smo nato dvakrat sprali s hladnim PBS in inkubirali v PI (400 µl) in RNazi (100 µl) 30 minut pri 37 °C v temi. Signal PI je bil zaznan s pomočjo FCM (FACSCanto II). Odstotke celic v fazi G1, S in G2 smo prešteli in primerjali s programsko opremo FlowJo (različica 10.0.6; FlowJo LLC).
Merjenje ROS s FCM.PRK so gojili do 60–70-odstotne konfluence in pobrali s tripsinizacijo. Vse celice smo inkubirali z 1,0 µM 2',7'-diklorodihidrofluorescein diacetatom 15 minut pri 37 °C. Celice smo nato dvakrat sprali s PBS in analizirali preko FCM za odkrivanje ROS z uporabo 488 nm laserja za vzbujanje in 535 nm laserja za odkrivanje.
ELISA.Po centrifugiranju (1,000 xg; 25˚C; 5 min) smo zbrali celični supernatant vsake podskupine za analizo ravni MDA, GSH-Px, SOD in vnetnih faktorjev IL-6, IL- 1 in TNF‑ . V skladu z navodili proizvajalca so bili uporabljeni naslednji kompleti: testni komplet Micro MDA (kat. št. BC0020; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), testni komplet GSH‑Px (kat. št. BC1195; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), komplet za odkrivanje aktivnosti SOD (kat. št. BC0170; Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.), komplet za ELISA podganjega IL-1 (kat. št. RLB{ {13}}; R&D Systems, Inc.), podganji komplet IL-6 Quantikine ELISA (kat. št. R6000B; R&D Systems, Inc.) in podganji komplet TNF Quantikine ELISA (kat. št. RTA00; R&D Systems, Inc. ).
Statistična analiza.Vsi poskusi so bili ponovljeni trikrat in vsi podatki so izraženi kot povprečje ± SD. Podatki so bili analizirani s programsko opremo SPSS različice 21.0 (IBM Corp.). Razlike med več skupinami so bile ocenjene z enosmerno ANOVA in Dunnettovim post hoc testom. p<0.05 was="" considered="" to="" indicate="" a="" statistically="" significant="">
Rezultati
Identification of isolated EPCs and PRKs. The isolated EPCs were identified using Dil‑Ac‑LDL staining (Fig. 1A). Microscopic counting revealed that the degree of coincidence between red (Dil‑Ac‑LDL staining) and blue (nuclear staining with DAPI) fluorescence was >90 odstotkov, kar potrjuje, da so bili EPC uspešno izolirani. Izolirane PRK so analizirali z IF (vimentin/-SMA). Rezultati so pokazali, da je bila raven izražanja vimentina/-SMA v PRK visoka in pozitivna, kar kaže na uspešno izolacijo PRK (slika 1B).
Optimalno razmerje med EPC in PRK.Preučevali so učinek kombiniranja različnih deležev PRK/EPC v sistemu sokulture in ugotovili, da PRK, gojene v razmerju 1:3 PRK/EPC, niso imele povečane stopnje proliferacije v primerjavi s PRK, gojenimi z 2: 1, 1:1 ali 1:2 razmerje PRK/EPC (slika 1C). Poleg tega so naraščajoči deleži EPC (1: 4, 1: 5, 1: 6 in 1: 7) povzročili znatno povečanje širjenja PRK v primerjavi s tistim pri EPC (1: 3). Zato je bilo za nadaljnje študije izbrano razmerje 1:3 PRK/EPC, da bi preprečili morebitne motnje zaradi čezmernih EPC v naslednjih poskusih.
Učinek sokulture EPC na škodo, ki jo povzroča Ang II.PRK (1 x 104 ) smo inokulirali 24 ur vnaprej v spodnji predel plošče Transwell. Zgornja komora je vsebovala 200 µl PBS v kontrolni skupini in 200 µl EPC (3x104 ) v poskusni skupini. Modeliratipoškodbe ledvic,V spodnji del smo dodali 1 µM Ang II. Po 24 urah so bili izvedeni testi CCK-8 in FCM za merjenje stopnje proliferacije PRK. PRK, ki so prejemali Ang II v odsotnosti EPC, so se znatno zmanjšale (P<0.05) proliferation="" rate="" (fig.="" 1d),="" and="" increased="" apoptosis="" rate="" (fig.="" 1e)="" and="" cell="" cycle="" arrest="" in="" the="" g1="" phase="" (fig.="" 1f)="" compared="" with="" the="" control="" group,="" while="" prks="" co‑cultured="" with="" epcs="" receiving="" ang="" ii="" showed="" the="" reverse="" effects.="" these="" results="" indicated="" that="" co‑culture="" with="" epcs="" can="" reduce="" the="" damage="" induced="" by="" ang="" ii="" in="" a="" rat="">ledvicacelični model.
EPC ščitijo PRK pred poškodbami, ki jih povzroča Ang II, so bile preučene ravni oksidativnega stresa, ki ga povzroča Ang II v PRK, gojenih skupaj z EPC. Rezultati testa FCM so pokazali, da se je Ang II znatno povečal (P<0.05) the="" levels="" of="" ros="" in="" prks="" in="" the="" absence="" of="" epcs,="" while="" prks="" co‑cultured="" with="" epcs="" had="" comparatively="" lower="" ros="" levels="" (fig.="" 2a).="" similarly,="" the="" elisa="" results="" indicated="" that="" the="" levels="" of="" secreted="" mda="" (fig.="" 2b)="" were="" increased="" and="" gsh="" and="" sod="" (fig.="" 2c="" and="" d)="" levels="" were="" decreased="" in="" prks="" receiving="" ang="" ii,="" while="" prks="" receiving="" ang="" ii="" and="" co‑cultured="" with="" epcs="">
Figure 1. Recovery of PRKs by co‑culture with EPCs following injury induced by Ang II. (A) Confirmation of the isolation of EPCs via Dil‑Ac‑LDL staining. Magnification, x100. (B) Confirmation of the isolation of PRKs using an immunofluorescence assay. Magnification, x400. (C) CCK‑8 analysis of the effects of different proportions of co‑cultured EPCs on the proliferation of PRKs. NS P>0.05 proti PRK: EPC, skupina 2:1; * P<0.05 vs.="" prks:epcs,="" 2:1="" group.="" (d)="" cck‑8="" analysis="" of="" the="" effects="" of="" co‑cultured="" epcs="" on="" the="" proliferation="" rate="" of="" ang="" ii‑treated="" prks.="" fcm="" analysis="" of="" the="" effects="" of="" co‑cultured="" epcs="" on="" the="" (e)="" apoptosis="" and="" (f)="" cell="" cycle="" of="" ang="" ii‑treated="" prks.="" *=""><0.05 vs.="" control;="" #=""><0.05 vs.="" ang="" ii.="" ang="" ii,="" angiotensin="" ii;="" epcs,="" endothelial="" progenitor="" cells;="" prks,="" primary="" rat="">ledvicacelice; FCM, pretočna citometrija; CCK‑8, Komplet za štetje celic‑8; Dil-Ac-LDL, Dil kompleks acetiliran lipoprotein nizke gostote; OD, optična gostota; ‑SMA, ‑aktin gladkih mišic; NS, ni pomembno. nasprotni rezultati glede izločanja teh encimov. Nastajanje ROS je torej lahko vključeno v poškodbe celic, ki jih povzroči Ang II, in jih je mogoče izboljšati s sokulturo z EPC.
Ang II lahko tudi poškoduje celice s spodbujanjem izločanja vnetnih citokinov, medtem ko lahko EPC preprečijo vnetje (32). Nato je bilo raziskano, ali Ang II spodbuja izločanje vnetnih citokinov v PRK in ali lahko EPC izvajajo svojo zaščitno vlogo z zaviranjem izločanja vnetnih citokinov. Izločanje IL-1, IL-6 in TNF- je bilo v PRK znatno povečano z dodatkom Ang II. Nasprotno pa so bile ravni IL-1, IL-6 in TNF- (slika 2E-G) sorazmerno nižje pri PRK, so-kultiviranih z EPC-ji (P<0.05) than="" those="" in="" prks="" cultured="" alone.="" therefore,="" the="" damage="" induced="" by="" ang="" ii="" in="" prks="" was="" also="" associated="" with="" pro‑inflammatory="" cytokines,="" and="" co‑culture="" with="" epcs="" exerted="" protective="" effects="" by="" reducing="" the="" secretion="" of="" these="">
Zaščitni učinek EPC se izvaja prek MV.Mehanizmi, prek katerih imajo EPC zaščitne učinke na induciran Ang IIledvicacelice smo nadalje analizirali z izolacijo MV iz EPC (slika 3A). EPC-MV so bili označeni s PKH26 in dodani PRK-jem skupaj z Ang II v plošči Transwell, kot je opisano prej. Fluorescenca PKH26 je bila odkrita v citoplazmi PRK (slika 3B), kar kaže, da so se EPC-MV zlile s PRK. Nato je bilo ugotovljeno, da so EPC-MV zavirali zmanjšano stopnjo proliferacije, ki jo povzroča Ang II, spodbujajo apoptozo in zaustavitev cikla v fazi G1 (slika 3C-E). Podobno kot PRK, gojene skupaj z EPC, so imele PRK, gojene v prisotnosti EPC-MV in izpostavljene Ang II, znižane ravni ROS in MDA (sliki 4A in B), povečane ravni GSH in SOD (sliki 4C in D) in zmanjšano izločanje vnetnih citokinov IL-1, IL-6 in TNF- (slika 4E-G) v primerjavi s skupino Ang II.
Diskusija
Kolikor nam je znano, je ta študija prvič pokazala, da lahko EPC zaščitijo PRK pred poškodbami celic, ki jih povzroča Ang II. Ta zaščitni učinek vsaj delno posredujejo MV, ki jih izločajo EPC in se zlijejo s PRK med sokulturo. Z dodajanjem obogatenih MV k PRK, izpostavljenim Ang II, je bilo ugotovljeno, da lahko samo EPC-MV zaščitijo PRK pred poškodbami, ki jih povzroča Ang II, z zaviranjem oksidativnega stresa in vnetja. MV so opredeljeni kot membranski nanodebris (0.05-1 µm) (33) in se izločijo s celične površine po aktivaciji, stresu ali apoptozi. Poleg tega lahko MV izvirajo iz različnih vrst celic, kot so trombociti, endotelijske celice, EPC in bele krvne celice (34, 35). MV izražajo specifične označevalce celične površine, ki se razlikujejo glede na izvorno celico in njihovo tvorbo ter lahko delujejo protivnetno, antikoagulantno in angiogeno (36). MV, sproščeni iz EPC, lahko prenašajo biološke informacije svoje starševske celice in tako izvajajo podobno funkcijo na ciljnih celicah (33). Na primer, EPC-MV ščitijo kardiomiocite pred hipertrofijo in apoptozo, ki ju povzroča Ang II (28), izboljšujejo delovanje endotelija in sposobnost uravnavanja angiogeneze (37) ter blažijo endotelijsko disfunkcijo, ki jo povzroča oksidativni stres (38). Vendar, kolikor nam je znano, učinek EPC-MV na hipertenzivno nefropatijo še ni bil opisan. Zato je bil cilj te študije raziskati možne zaščitne učinke EPC in EPC-MV vpoškodba ledvičnih celic.
V tej študiji je bil vzpostavljen model poškodbe PRK z indukcijo poškodbe z Ang II. V skladu s prejšnjimi poročili (26, 39) je Ang II zmanjšal proliferacijo PRK, povečal apoptozo in zaustavil celični cikel v fazi G1, preden je vstopil v fazo S. Na podlagi teh markerjev, povezanih s hipertenzijo, je bilo sklenjeno, da je bil model hipertenzije PRK, ki ga povzroča Ang II, uspešno vzpostavljen. Poleg tega je bilo ugotovljeno, da sokultura z EPC ščiti PRK pred poškodbami, ki jih povzroča Ang II. Po soinkubaciji EPC s PRK in Ang II so se ravni encimov oksidativnega stresa in vnetnih dejavnikov v PRK znižale. Tako lahko potencialni mehanizmi, prek katerih EPC izvajajo svoje zaščitne učinke na PRK, vključujejo regulacijo oksidativnega stresa in vnetja. Kolikor nam je znano, je trenutna študija prvič pokazala, da lahko EPC izboljšajo odziv oksidativnega stresa, ki ga povzroči Ang II, in vnetje v PRK.
EPC učinkovito ščitijodelovanje ledvicpri kronični ledvični bolezni (40) in imajo pomembno vlogo pri ohranjanju vaskularne celovitosti in popravljanju endotelijske poškodbe (15), pa tudi zmanjšajo vaskularno puščanje, izboljšajo delovanje organov in povečajo stopnjo preživetja pri sepsi (41). Kopiči se dokazi, ki kažejo, da lahko EPC izvajajo zaščitno vlogo preko izločanja MV (37, 42, 43). Da bi testirali zaščitni učinek EPC-MV v PRK, so EPC-MV izolirali in označili s PKH26, nato pa so bili označeni MV soinkubirani s PRK in Ang II. EPC-MV so se združili s PRK in znatno zavirali odziv na oksidativni stres in vnetje, ki ga povzroča Ang II, in ti rezultati so podobni tistim Fu et al (44). Zaviralni učinek EPC-MV na ravni encimov oksidativnega stresa je bil večji kot sam EPC; to je mogoče pripisati višji koncentraciji MV v PRK, zdravljenih z EPC-MV, kot v tistih, gojenih skupaj z EPC. Te ugotovitve kažejo, da je zaščitni učinek EPC na PRK pred poškodbami celic, ki jih povzroča Ang II, lahko odvisen od izločenih MV. Omejitev te študije je, da potencialni mehanizmi, prek katerih EPC-MV uravnavajo osi mikroRNA/mRNA/transdukcije signala, niso bili v celoti raziskani. Vloga in mehanizmi, prek katerih EPC‑MV izvajajo zaščito predpoškodbe ledvicje treba ovrednotiti na živalskem modelu hipertenzivne nefropatije, kar je obetavna smer za prihodnje raziskave. Na koncu je ta študija pokazala, da lahko EPC zaščitijo PRK pred oksidativnim stresom, ki ga povzroči Ang II, in povečanim vnetjem prek izločanja MV. To zagotavlja novo usmeritev za zdravljenje hipertenzivne nefropatije in vzpostavlja in vitro model za preučevanjepoškodba ledvic.
