Metilacija proteina arginina: nastajajoča sprememba v imunosti proti raku in imunoterapiji 1. del

V zadnjih letih so se proteinske arginin metiltransferaze (PRMT) pojavile kot novi člani družine regulatorjev genske ekspresije pri evkariontih in so povezane s patogenezo in napredovanjem raka. Imunoterapija raka je znatno izboljšala zdravljenje raka v smislu splošnega preživetja in kakovosti življenja. Metilacija proteina arginina je funkcija epigenetske modifikacije ne le pri transkripciji, obdelavi RNK in kaskadah transdukcije signala, ampak tudi v številnih procesih cikla imunosti proti raku. Metilacija arginina je vključena v aktivacijo imunosti proti raku in uravnavanje učinkovitosti imunoterapije.

V tem pregledu povzemamo najnovejše informacije o regulacijskih molekularnih mehanizmih in različnih osnovnih signalnih poteh metilacije arginina pri prirojenih in adaptivnih imunskih odzivih med rakom. Opisujemo tudi potencial zaviralcev PRMT kot učinkovitega kombiniranega zdravljenja z imunoterapijo.

Ključne besede: proteinske arginin metiltransferaze (PRMT), imunost proti raku, imunoterapija raka, posttranslacijska modifikacija, molekularni mehanizem

Koristi Click cistanche tubulosaizdelek

For more information:1950477648nn@gmail.com

1. UVOD

Posttranslacijska modifikacija je kemična modifikacija, ki poveča funkcionalno raznolikost beljakovin s kovalentnim dodatkom kemične skupine. Proces modulira delovanje beljakovin in se je izkazal kot ključni regulator več celičnih procesov pri raku.

Vendar pa je bila metilacija arginina, za razliko od acetilacije, ubikvitinacije in fosforilacije, do nedavnega deležna malo pozornosti, predvsem zaradi motene narave odkrivanja substrata in odsotnosti zanesljivih protiteles in učinkovitih zaviralcev majhnih molekul. Odkritje proteomike in inhibitorjev je poglobilo naše razumevanje piscev, bralcev in regulatorjev med metilacijo arginina. Proteinske arginin metiltransferaze (PRMT) katalizirajo metilacijo arginina kot "pisci" in so v glavnem vključene v aktivacijo in represijo transkripcije, spajanje pred mRNA in odzive na poškodbe DNA (1). Metilacija arginina tudi modulira transkripcijo ciljnih lokusov, s čimer posreduje ključne celične procese za vzdrževanje tkivne homeostaze in fenotipov bolezni. Ker je metilacija arginina ciljna modifikacija, so zaviralci PRMT pokazali velik potencial pri zdravljenju raka v predkliničnih modelih in kliničnih preskušanjih za učinkovito izboljšanje preživetja bolnikov (2).

Ker so funkcije imunskega sistema dobro uveljavljene in ključnega pomena za nadzor tumorjev in zdravljenje raka, so hitro razvijajoče se imunoterapije proti raku zdaj postavljene kot četrti steber zdravljenja raka (poleg kirurgije, radioterapije in kemoterapije) (3).

Imunost proti raku običajno odstrani tumorske celice ali omeji njihovo rast, vendar tudi spodbuja napredovanje tumorja z vzpostavljanjem tumorskih mikrookoljev (TME), ki se prilagajajo rasti tumorja (4). Kljub učinkovitosti terapije z blokado imunske kontrolne točke (ICB) ima manjšina bolnikov z napredovalimi malignimi boleznimi klinične koristi od teh zdravljenj, pri večini pa se razvije prirojena ali pridobljena odpornost (5).

Zato so potrebne nadaljnje raziskave kombiniranih metod, ki temeljijo na imunoterapiji, da bi izboljšali splošno preživetje pri bolnikih z rakom v napredovalem stadiju.

Glede na to, da so imunski odzivi raka neprekinjeni, dinamični, strogo regulirani in dobro načrtovani procesi, lahko supresivne odzive na imunoterapijo pripišemo številnim dejavnikom, vključno z imunskim fenotipom TME in molekularnimi mehanizmi, na katerih temelji intrinzična odpornost tumorja (6). Med vprašanji, ki so pomembna za optimalne odzive na imunoterapijo, je vsak korak v seriji procesov kaskadnega ojačanja, imenovanega cikel imunosti proti raku, medsebojno delovanje med prirojeno in adaptivno imunostjo ter aktivacija ali izguba onkogenih signalnih poti. Klasični cikel imunosti proti raku vključuje izražanje in predstavitev antigena, promet s celicami T in infiltracijo tumorja ter ubijanje ciljnih celic s citotoksičnimi limfociti T (CTL). Prirojena imunost popolnoma integrira, vzdržuje in krepi ta cikel. Medtem ko so epigenetski regulatorji vključeni v aktivacijo in translokacijo imunskih celic v TME, pa tudi v kasnejše imunske odzive, njihova specifična vloga pri imunosti tumorja in njihovi kombinirani učinki z imunoterapijo ostajajo nejasni (7, 8).

Tukaj pregledamo funkcije metilacije arginina pri imunosti tumorja s treh vidikov: 1) vpletenost cikla imunosti proti raku v protitumorske odzive, 2) proizvodnja interferona tipa I (IFN) in s tem povezane signalne poti in 3) intrinzični mehanizmi tumorske odpornosti. Z uporabo teh perspektiv zagotavljamo dokaze, ki poudarjajo nove fiziološke vloge PRMT pri imunosti proti raku, in sprašujemo, ali je mogoče zaviralce PRMT kombinirati z imunoterapijo, da bi dosegli največje in dolgotrajne terapevtske učinke pri raku.

2 PRMTS

2.1 Razvrstitev PRMT

Metilacija arginina se večinoma nanaša na dodajanje metilnih skupin iz S-adenozilmetionina (SAM) na gvanidino skupine stranske verige arginina, kar katalizirajo PRMT (9). Pet potencialnih donorjev vodikove vezi se nahaja v skupini gvanidino, pri čemer metilacija ostanka arginina odstrani potencialnega darovalca vodikove vezi, s čimer se spremeni oblika ostanka arginina brez nevtralizacije kationskih nabojev in ustvarjanja fizioloških učinkov v večini celic (10, 11). 

Trenutno je bilo v celicah sesalcev identificiranih devet PRMT (PRMT 1–9), ki so razdeljeni v tri različne skupine.glede na katalitično aktivnost: 1) w-NG-monometil arginin (MMA) se nanaša na eno samo metilno skupino, dodano končnemu atomu dušika, 2) asimetrični w-NG-dimetilarginin (aDMA) se nanaša na drugo metilno skupino, nameščeno na istem gvanidinu skupino, ki temelji na MMA, in če jo postavimo na drugi končni gvanidino dušik, se to nanaša na 3) simetrični w-NG, N'Gdimetilarginin (CDMA). Encimi tipa I (PRMT1, PRMT2, PRMT3, PRMT4 (CARM1), PRMT6 in PRMT8) katalizirajo aDMA (12), medtem ko encimi tipa II (PRMT5 in PRMT9) katalizirajo CDMA (13), encimi tipa III (PRMT7) pa le katalizirajo MMA (slika 1). PRMT sodelujejo v številnih bioloških procesih, vključno z regulacijo izražanja genov, odzivi na poškodbe DNA in celično signalizacijo (dodatna tabela 1). PRMT so prevladujoči in bistveni za človeške celice, zlasti PRMT1, ki je odgovoren za 85 odstotkov aDMA, in kaže dramatično izgubo metilacije, ko je izločen (14).

Poleg tega se špekulira, da med PRMT obstaja veliko preslušavanja (15). Izguba PRMT1 povzroči sproščanje različnih substratov, ker jih modifikacija aDMA ne blokira več, zaradi česar ti substrati preidejo na tarče PRMT tipa II in III (15). Vendar imajo PRMT medsebojno izključujoče funkcije, tudi če se nanašajo na različne enake substrate in vitro (16).

2.2 Funkcije PRMT v biologiji raka

Prejšnje študije so poročale, da je bila povišana ekspresija PRMT povezana s tumorigenezo in slabo prognozo pri več vrstah raka (17–19) (dodatna tabela 2). Do danes je večina PRMT vpletenih v regulacijo celičnih procesov, povezanih z vzdrževanjem raka, vključno z epigenetsko posredovano ekspresijo genov, spajanjem mRNA in odzivi na poškodbe DNA (20). Med temi potmi je epigenetska regulacija pomemben mehanizem, ki vpliva na celično aktivnost, predvsem zaradi aktivacije odlaganja PRMT (histonski H4R3me2a, H3R2me2s, H3R17me2a in H3R26me2a) ali represivnih (H3R2me2a, H3R8me2a, H3R8me2s in H4R3me2s) histonskih oznak, ki spodbujajo ali zavirajo (oziroma) ključnih genov, povezanih s tumorjem (21). Zgodnje študije o nehistonski metilaciji so opredelile vlogo PRMT pri konstitutivni in alternativni regulaciji spajanja (22, 23). Inhibicija PRMT5 in PRMT tipa I je dejansko zavirala funkcije sDMA in aDMA v proteinih, ki vežejo RNA, vključenih v regulacijo spajanja, kar je privedlo do odzivov na zatiranje tumorja pri modelih živalske levkemije z mutacijami faktorja spajanja (24). Nizka regulacija popravljanja poškodb DNK je že dolgo znana kot vse večja nestabilnost genoma, ki povzroča nenadzorovan razvoj raka (25). Glede na to, da je argininska metilacija proteinov, povezanih s popravilom poškodbe DNA, vključno z MRE11, 53BP1 in hnRNPUL1, potrebna za popravilo DNA s homolognim rekombinacijskim popravljanjem in nehomolognim spajanjem koncev, so zaviralce PRMT kombinirali s kemoterapijo za premagovanje odpornosti na citotoksična zdravljenja (26 –28).

Te spodbudne ugotovitve kažejo na močno in vznemirljivo vlogo PRMT pri zdravljenju raka. Druga nepričakovana ugotovitev je bil sinergistični učinek zaviranja PRMT v kombinaciji z zaviralci imunske kontrolne točke (ICI) (19). Zato bi lahko študije, ki pojasnjujejo molekularne mehanizme, na katerih temelji izčrpavanje ali inhibicija PRMT, pomagale prepoznati nove "zdravljive" tarče za imunoterapijo.

3 PRMT-ji PRI IMUNOSTI PROTI RAKU

Nedavno je imunoonkologija postala vidno področje pri zdravljenju raka, pri čemer so ICI opredeljeni kot obetavne monoterapije ali kombinirane terapije za zdravljenje različnih vrst raka (29). Postopni dogodki, vključeni v indukcijo in izvedbo protirakavih imunskih odzivov, tako imenovani cikel imunosti proti raku, zagotavljajo teoretično osnovo za tumorsko imunoterapijo (30). V tem kontekstu je pomembno razumeti medsebojno delovanje med PRMT in komponentami v ciklu imunosti proti raku, saj bi ciljanje na enega ali več korakov cikla lahko okrepilo tekoče protitumorske imunske odzive in/ali spodbudilo nove. Številne študije so pokazale, da je interferon tipa I (IFN) ključnega pomena za imunski odziv proti raku, saj je IFN glavni regulator in posrednik na vsakem koraku cikla imunosti proti raku (31, 32).

Zato bi lahko razvoj varnih in učinkovitih agonistov za stimulacijo IFN tipa I predstavljal obetavne strategije za imunoterapijo raka. Pravzaprav se intrinzične tumorske okvare pojavljajo kot ključni molekularni dejavniki, ki narekujejo imunski kontekst različnih vrst raka, z ovirajočo vlogo pri lokalnih protitumorskih imunskih odzivih (33). Izkoriščanje odnosov med intrinzičnimi tumorskimi genetskimi dogodki in PRMT je potrebno za povečanje učinkovitosti zaviralcev in razvoj prilagojenih strategij imunskega posega. Skupaj bo prepoznavanje dogodkov metilacije v ciklu imunosti proti raku, karakterizacija proizvodnje IFN tipa I in razkrivanje onkogenih poti zagotovilo celovit in poglobljen vpogled v PRMT v imunoonkologiji in pomagalo pri prepoznavanju novih tarč.

3.1 Vloga PRMT v ciklu imunosti proti raku

Številni dokazi kažejo, da imunost na tumor ni izoliran proces, ampak zahteva niz postopnih dogodkov, imenovanih "cikel imunosti proti raku", ali samoojačevalni proces, kjer vsak korak vpliva na razvoj tumorja in prognozo s krepitvijo pozitivnih regulativnih signalov ali zaviranjem negativnih regulacijski signali (30, 34, 35). Popolna odstranitev malignih tumorjev je teoretično dosegljiva (30). V tem modelu je pobeg tumorskih celic dosežen z motnjami specifičnih korakov v ciklu imunosti raka. Tumorsko-imunski cikel se začne s sproščanjem s tumorjem povezanih neoantigenov iz tumorskih celic, ki jih prepoznajo celice, ki predstavljajo antigen, kot so dendritične celice (DC), celice B in makrofagi, da tvorijo antigensko peptidno glavno histokompatibilnost (MHC) kompleksi. Zreli DC migrirajo iz tumorja v sekundarne limfoidne organe (SLO), da dostavijo komplekse antigenskega peptida in MHC celicam CD4 plus T in CD8 plus T (36). T-celični receptorji (TCR) prepoznajo te komplekse in ustvarijo prvi signal, ki mu sledi povečana regulacija transmembranskega proteina CD40L na površini celic Th. Nato se CD40L veže na CD40 na površini DC, kar močno poveča ekspresijo B7 in se posledično močneje veže na CD28 na površini celic Th. Ta dvojni signal sproži kostimulacijo celic T in proizvaja citokine, kar vodi do aktivacije efektorskih celic T proti antigenom, specifičnim za raka. Aktivirane efektorske celice T nato potujejo do tumorja preko krvnega obtoka in ustvarijo imunske celice, ki se infiltrirajo v tumor.

Končno TCR na celicah CD8 in T prepoznajo kompleks antigenskega peptida-MHC-I in uničijo ciljne rakave celice, pri čemer antigene sprostijo mrtve rakave celice v naslednji cikel (30). Potencialne spremembe, ki jih uravnava metilacija arginina v ciklu imunosti proti raku so prikazani (slika 2).

3.1.1 PRMT in predstavitev tumorskega antigena

Mnogi raki se izognejo imunski zavrnitvi z zaviranjem procesiranja in predstavitve antigena MHC razreda I (MHC-I). MHC-I je pritegnil veliko pozornosti, saj predstavlja endogene peptidne antigene celicam CD8 plus T, zavira motnje pri prepoznavanju tumorja in zmanjšuje citotoksičnost celic CD8 plus T, ki je primarni efektor tipov celic za uspeh ICB (4). Znižano regulacijo MHC-I so opazili pri 40–90 odstotkih človeških tumorjev, kar vpliva na interakcije MHC: TCR in zmanjša prepoznavanje rakavih celic s celicami CD8 in T. IFN regulatorni faktorji (IRF) in nukleotidno vezavna domena z levcinom bogato ponovitvijo (NLR) družina CARD domena, ki vsebuje 5 (NLRC5) so pogosto povezani z znižano regulacijo MHC-I (37–40). Molekule MHC razreda II (MHC-II) večinoma izražajo specializirane celice, ki predstavljajo antigen (APC) in predstavljajo eksogene peptidne antigene predvsem celicam CD4 in T (41). Znižana regulacija MHC-I ali MHC-II je povezana s slabo prognozo raka, oslabljenim odzivom ICB in zmanjšano stopnjo zavrnitve tumorja pri mišjih modelih (42–44).

Nedavna študija je poročala, da PRMT5 nadzoruje številčnost MHC-I in predstavitev antigena, ki vpliva na transkripcijo NLRC5 (19). Znižana regulacija PRMT5 ali farmakološka inhibicija aktivnosti PRMT5 je povečala izražanje NLRC5 in njegovih ciljnih genov, ki so bili vpleteni v obdelavo in predstavitev antigena. NLRC5 je transkripcijski aktivator genov MHC-I, ko je povezan s transkripcijskimi faktorji, ki medsebojno delujejo z regulativnimi elementi promotorja MHC-I, kot je modul SXY (39, 45). Knockdown PRMT5 je prav tako povečal izražanje NLRC5 po zdravljenju z IFN-g, spremljalo pa ga je povečano površinsko izražanje MHC-I (19). Izražanje NLRC5 je bilo v obratni korelaciji z izražanjem PRMT5 v rakavih celicah (46). Zato bi lahko bilo ciljanje na PRMT5 obetavna strategija za povečanje številčnosti MHC-I in spodbujanje predstavitve antigena. Poleg PRMT5 je bilo dokazano, da več drugih PRMT negativno uravnava ravni MHC-I.

V monocitih je inhibicija PRMT1 zmanjšala obogatitev vezave elementa odgovora na ciklični adenozin monofosfat (cAMP) (CREB) na mestu CRE na promotorju HLA-B (glavni histokompatibilni kompleks, razred I, B), da se povečajo ravni MHC-I (47). V celicah mišjega melanoma B16, zdravljenih z zaviralci PRMT7 ali z zaviralci PRMT7, so regulatorji genov MHC-I, kot je Nlrc5 in njegovi ciljni geni, prav tako regulirani navzgor, podobno kot pri skupini MS023 (zaviralec PRMT1) (48).

Pokazalo se je, da PRMT1 metilira transaktivator razreda II (CIITA), ki je ključni regulator ekspresije MHC-II, ter je povezan in sodeluje z vezavo transkripcijskega faktorja na promotor MHC-II (49). Metilacija arginina CIITA je povzročila njegovo kasnejšo razgradnjo in znižanje ravni MHC-II mRNA in beljakovin (49). Nedavna študija je poročala, da PRMT5 negativno uravnava izražanje MHC-II v hepatocelularnem karcinomu, ki ga poganja MYC (50). MHC-II se je znatno povečal na tumorsko infiltriranih CD45.1 plus levkocitih in DC, ko so transgene miši s prekomerno ekspresijo MYC zdravili z zaviralcem PRMT5, GSK3326595 (50). Utišanje PRMT5 v celicah hepatocelularnega karcinoma s prekomerno ekspresijo MYC je neposredno reguliralo izražanje MHC-II z zmanjšanjem in vitro obogatitve H3R8me2s in H4R3me2s na promotorjih CIITA in CD74 (50).

Zato bi ciljanje na PRMT5 z uporabo majhnih molekularnih inhibitorjev lahko povzročilo infiltracijo imunskih celic v jetrne tumorje in spodbudilo predstavitev antigena z regulacijo MHC-II. Vendar pa je druga študija pokazala, da PRMT5- posreduje kopičenje simetrično dimetiliranega histona, H3R2 (H3R2me2s) kot odgovor na stimulacijo IFN-g in ga spremlja obogatitev CIITA na promotorju MHC-II; PRMT5 je aktiviral transkripcijo MHC-II na način, odvisen od aktivnosti (51). Ti različni učinki PRMT5 na transkripcijske procese MHC-II so morda posledica različnih modelov, zato so za razjasnitev teh vprašanj potrebne nadaljnje študije. CARM1 je prav tako aktiviral transkripcijo MHC-II, stimulirano z IFN-g, inducirano s CIITA, na način, odvisen od aktivnosti arginin metiltransferaze. Poleg tega je CARM1 metiliral vezavni protein CREB na položajih R714, R742 in R768, s čimer je olajšal povezavo s promotorjem MHC-II in sinergistično aktiviral transkripcijo MHC-II s CIITA (52). Skupaj so PRMT vplivali na indukcijo MHC II, ki jo je posredoval CIITA, z IFN prek različnih mehanizmov.

3.1.2 PRMT posredujejo pri migraciji imunskih celic z uravnavanjem kemokinov, CXCL10 in CXCL11

Za izvajanje protitumorskih učinkov celice T migrirajo skozi cirkulacijski sistem do tumorja po začetku v bezgavkah. Os CXCL9, -10, -11/CXCR3 v glavnem uravnava migracijo, diferenciacijo in aktivacijo imunskih celic. CXCR3 je površinsko izražen receptor za kemokine CXCL9, CXCL10 in CXCL11 na imunskih in rakavih celicah. Kemokini rekrutirajo CTL, celice naravnega ubijalca (NK), celice NK-T in makrofage, nato olajšajo infiltracijo v rakavo tkivo preko kemotaktičnega gradienta, kar izzove usmerjeno migracijo kot odziv na IFN-g, ki je sinergistično povečan s faktorjem tumorske nekroze-a ( TNF-a) (53). Subkutana injekcija smrtonosnih ali subletalnih odmerkov celic melanoma B16 v CXCR3-/-miši vzpostavlja ključno vlogo CXCR3 kot receptorja za CXCL9, CXCL10 in CXCL11 med migracijo CTL (54). Kemokini, ki izhajajo iz tumorjev, so odgovorni tudi za rekrutiranje celic Th2, Tregs in mieloidnih supresorskih celic (MDSC) (53). Zato imajo CXCL9, CXCL10 in CXCL11 ključne, neredundantne, celično avtonomne vloge, ki posredujejo infiltracijo imunskih celic v tumorje in inducirajo učinkovito protitumorsko imunost. Poleg tega sta metilacija histonskega lizina, posredovana z zeste homologom 2 (EZH2), in metilacija DNA, posredovana z DNA metiltransferazo-1 (DNMT-1), zavirala nastajanje CXCL9 oziroma CXCL10 in nato zavirala T-celični tumor domovanje.

Zato lahko zdravljenje z epigenetskimi modulatorji odpravi to zatiranje in na koncu izboljša zdravljenje raka (55). Ta opažanja kažejo, da lahko epigenetsko reprogramiranje tumorjev uravnava novačenje celic T in klinično učinkovitost tumorske imunoterapije, metilacija arginina kot razširjena in kritična epigenetska modalnost pa vpliva na te procese.

Katalitična strukturna domena CARM1 neposredno sodeluje s p65, ki se nahaja v domeni Rel-homologije jedrskega faktorja kappa-B (NF-kB) in služi kot bistveni dimerizacijski motiv (56). V celicah CARM1, stimuliranih s TNF-a, je bilo rekrutiranje p65 na promotor CXCL10 bistveno okvarjeno in metilacije H3R17 na promotorju ni bilo mogoče zaznati, medtem ko je ponovna uvedba CARM1 popolnoma rešila te odzive, kar kaže, da je bil CARM1 potreben za rekrutiranje p65 na promotor CXCL10 in H3R17 metilacija (56). PRMT5 je reguliral tudi povezavo p65 s promotorjem CXCL10, ker je PRMT5 sprožil dimetilacijo mest R30 in R35 na p65 ter vezavo DNA in jedrsko translokacijo p65 (57). TNF-a-indukcija CXCL10 v endotelijskih celicah je zahtevala PRMT5-posredovano metilacijo arginina p65. Glede na druge raziskave te skupine je PRMT5 induciral dimetilacijo R174 na p65, da bi spremenil vezavo na promotor CXCL11 (58).

Dosledno je PRMT5 simetrična dimetilacija p65 pri R30 povečala njegovo afiniteto za DNA in sprožila ekspresijo genov, ki jo povzroča NF-kB (59). Nasprotno pa je EPZ015666, ki je zmanjšal aktivnost PRMT5 s kratko ostrino RNA ali majhnim molekularnim inhibitorjem, v celicah melanoma B16 povečal izražanje CCL5 in CXCL10 po stimulaciji (19). PRMT5 je tudi metiliral IFI16, oslabil njegovo vezavo na intracelularno dvoverižno DNA (dsDNA) in tako induciral izražanje CCL5 in CXCL10 (19). Čeprav interakcije med PRMT1 in CXCL10 ali CXCL11 niso bile opisane, je PRMT1 asimetrično dimetiliral ohranjeni ostanek R30 p65 (60). Metilacijsko mesto PRMT1 se nahaja v motivu RxxRxRxxC zanke L1, ki veže DNA p65 (60). Metilirani p65 ima slabo afiniteto za skupne oligonukleotide NF-kB; negativno je reguliral vezavo p65 DNA in transkripcijsko aktivnost, s čimer je preprečil pridobivanje NF-kB za ciljne genske promotorje (60).

Zato domnevamo, da bi PRMT1 lahko reguliral kemokine na transkripcijski ravni. PRMT1, CARM1 in PRMT5 so se vsi vezali neposredno na domeno homologije Rel p65, zaradi dejstva, da je interakcijo posredovala osrednja regija, ki vsebuje strukturno domeno metiltransferaze, ki je bila evolucijsko ohranjena (61). Na splošno so interakcije PRMT-kemokini dinamične in odvisne od konteksta, tako da se lahko simetrična in asimetrična dimetilacija izravna in pojavi na različnih stopnjah reakcij NF-kB, s čimer se rekrutirajo različne efektorske molekule in proizvajajo raznoliki biološki učinki. Treba je spodbujati proizvodnjo kemokinov, da se olajša rekrutiranje limfocitov, ki infiltrirajo tumor, s selektivnim ciljanjem na različne PRMT.

3.1.3 Premagovanje zaviralnih mrež v TME

TME se zdaj obravnava kot kompleksen tumorski ekosistem in ne vzorec rasti, osredotočen na tumorske celice (62). Da bi bolje razumeli delovanje TME, moramo razumeti njegov zunajcelični matriks in sestavo stromalnih celic. Stromalne celice so kategorizirane na naslednji način; infiltrirajoče imunske celice (IIC), angiogene vaskularne celice in fibroblaste, povezane z rakom (63). Antigen specifične infiltracijske imunske celice obsegajo tipe prirojenih imunskih celic (makrofage (Mjs), dendritične celice (DC), MDSC, NK, mastocite, nevtrofilce in adaptivne imunske celice (limfociti T in B), ki se odzivajo na različne dražljaje) (64). Medtem ko so te celice prvotno rekrutirane iz okoliškega tkiva ali kostnega mozga, da obdajo tumorsko tkivo, se sčasoma "prevzgojijo", da postanejo različne vrste celic, ki povzročajo kronično vnetje in angiogenezo.

V tem okolju se rakave celice in okoliška stroma medsebojno preslušajo tako, da zavirajo imunološko koristne gene in inducirajo nenormalno signalizacijo poti, ki končno proizvaja močne citokine in kemokine, ki vplivajo na imunski nadzor gostitelja, da vzdržuje rast, napredovanje in metastaze rakavih celic. Veliko kliničnih dokazov zdaj kaže, da TME pomembno vpliva na učinkovitost imunoterapije in klinične rezultate ter da lahko PRMT zagotovijo nove terapevtske tarče za tumorsko imunoterapijo z modulacijo TME v smeri visoke infiltracije limfocitov.

3.1.3.1 Usmerjanje na proliferacijo in diferenciacijo T-celic

Ker so CD{0}}učinkovite celice T najmočnejše celice, ki uničujejo tumorje, so populacije celic T zelo aktualne raziskovalne teme. CD8 plus citotoksične T celice in CD4 plus T pomožne celice sestavljajo subpopulacije T celic v TME. Naivne celice CD4 plus se večinoma diferencirajo v štiri različne populacije: celice T helper 1 (Th1), Th2, Th17 in regulatorne celice T (Treg). Njihovo razlikovanje določajo vzorci signalov, prejeti med njihovimi začetnimi interakcijami z antigeni (65). Celice T v TME ne izvajajo samo protitumorskih efektorskih funkcij, ampak nekatere spodbujajo rast tumorja. Med temi imajo CD8 plus citotoksične celice T in celice Th1, splošno znane kot CTL, vlogo ubijanja tumorjev. Za slednje celice je značilna proizvodnja IFN-g, TNF-a in interlevkina (IL)-2, ki podpirajo prvi tip celic ali delujejo kot citotoksične celice T za neposredno odstranjevanje tumorskih celic (66). Celice Th2 podpirajo celice B s sproščanjem IL-4, IL-5 in IL-13, medtem ko celice Th17 spodbujajo rast tumorja s proizvodnjo IL-17, IL-21 in IL22 (65, 67). Poleg tega Tregs oslabi protitumorske imunske odzive, posredovane s T-celicami, tako da neposredno zavira delovanje T-celic in proizvodnjo citokinov ali posredno zavira predstavitev antigena, da ovira aktivacijo T-celic (68, 69). Visoko razmerje med Tregs in CD8 plus T celicami običajno kaže na slabo prognozo raka (70). CD8 in citotoksične celice T pogosto ne zavirajo tvorbe tumorja med tumorigenezo zaradi izčrpanosti T-celic, ki je opredeljena kot vztrajno izražanje zaviralnih receptorjev T-celic in progresivna izguba proizvodnje IFN-g in funkcij degranulacije kot odziv na dolgotrajne dejavnike kot je kronično vnetje ali stimulacija raka (71). IL-12 in IFN-g polarizirata naivne celice CD4 plus T proti celicam Th1 z delovanjem signalnega pretvornika in aktivatorja T-box transkripcijskega faktorja T-bet. Diferenciacija celic Th2 zahteva GATA3, ki je nižje od IL-4. Za diferenciacijo celic Th17 je potreben z retinoidom povezan orphan receptor (ROR)gt, ki je transkripcijski faktor, induciran s transformirajočim rastnim faktorjem (TGF-b) v kombinaciji z IL-6, IL-21 in IL{{55 }}. Diferenciacija Treg celic prav tako zahteva forkhead box P3 (FOXP3) kot transkripcijski faktor.

Celovita karakterizacija metilacije arginina v primarnih celicah T je identificirala regulativne vloge PRMT pri odločitvah o usodi celic T. Z uporabo masne spektrometrije so Geoghegan et al. identificirali 2.502 mesti metilacije arginina v 1.257 proteinih v človeških celicah T (72). Na seznamu so bile komponente signalnega mehanizma receptorjev T-celičnega antigena in ključni transkripcijski faktorji, ki uravnavajo določanje usode T-celic. Poleg tega so ti avtorji kvantificirali spremembe v zasedenosti metilacije arginina med primarno diferenciacijo T-celic in dokazali spremembe v stehiometriji metilacije arginina med celično stimulacijo v podskupini proteinov, ki so kritični za diferenciacijo T-celic (72).

Tri neodvisne študije z uporabo T-celično specifičnih miši s pomanjkanjem PRMT5- so potrdile ključno vlogo PRMT5 pri vzdrževanju perifernih T-celic in usmerjanju prehoda naivnih T-celic v efektorski/spominski fenotip (73–75). Inoue et al. poročali, da so imele miši s homozigotnim pomanjkanjem, specifične za PRMT5 T celice, v primerjavi s kontrolnimi mišmi manjše število invariantnih NK (iNK) T, CD4 plus T in CD8 plus T celic. PRMT5 je bil potreben tudi za preživetje in proliferacijo celic T (74). Tanaka idr. je pokazalo, da je bil PRMT5 kritičen za prehod T-celic iz naivnega v aktivirani fenotip in tudi za vzdrževanje že zrelih T-celic (73). Lindsay et al. je tudi potrdilo, da je PRMT5 potreben za vzdrževanje normalne populacije iNKT, CD4 plus T in CD8 plus perifernih celic T (75). Tako aktivnost simetrične dimetilacije arginina kot nivoji izražanja PRMT5 so bili znatno inducirani v aktiviranih T celicah.

Še več, Inoue et al. je tudi poročal, da je PRMT5 olajšal spajanje pred mRNA iz Il2rg in Jak3, da se poveča njihova ekspresijska raven za vzdrževanje populacije T-celic. Il2rg kodira gc, ki je receptorska podenota, ki si jo delijo citokini, vključno z IL-2, IL-4, IL-7, IL-9, IL-15 in IL-21 (76). Družina citokinov gc natančno uravnava razvoj limfocitov in deluje preko tirozin kinaz JAK1 in JAK3 (77). Pomanjkljiv razvoj limfocitov, vključno s celicami T, B, NK in iNKT, so opazili pri miših s pomanjkanjem gc ali JAK3. Ti avtorji so tudi pokazali, da je simetrična dimetilacija argininskih ostankov v proteinih Sm s PRMT5 morda odgovorna za spremembe spajanja, ki jih povzroča pomanjkanje PRMT5 (74).

CD8 visoke gostote in citotoksične celice T so povezane z boljšo prognozo pri številnih vrstah raka (78). Zato so bile v številnih študijah raziskane korelacije med PRMT, proliferacijo celic CD8 plus T in sposobnostjo proizvodnje citokinov. Kumar et al. je pokazalo, da je zaviranje CARM1 povečalo število celic CD8 plus T, ki infiltrirajo tumor, spodbudilo ekspresijo grancima B in IFN-g ter proliferacijo markerjev Ki-67, kar je omogočilo močnejšo sposobnost ubijanja tumorjev v celicah CD8 plus T, kar kaže na zaviranje CARM1 povečana proliferacija CD8 plus T in proizvodnja citokinov (79). Kumar et al. je tudi pokazalo, da izločene T-celice Carm1- izražajo višje ravni spominskega CD8 in transkripcijskih faktorjev, povezanih s celicami T, kot sta Tcf7 in Myb (79). Myb je spodbujal tvorbo spominskih CD8 in celic T s pomočjo transkripcijske aktivacije represije Tcf7 in Zeb2 (80). Predvsem Carm1-izločene T-celice so sočasno izražale nizke ravni zaviralnih receptorjev PD-1 in TIM3, ki sta označevalca izčrpanosti celic T (79). Za razliko od CARM1 je inhibicija PRMT5 in vitro zavirala indukcijo za tumorski antigen specifičnih CD8 in celic T (81). Reakcije metilacije PRMT so pretvorile SAM kot kofaktor, ki donira metil, v sadenozil-l-homocistein (SAH), medtem ko je bil SAM pretvorjen tudi v metiltioadenozin (MTA). Tako SAH kot MTA sta zavirala PRMT v povratnih zankah, medtem ko je MTA učinkovito zaviral aktivnost PRMT5 (82). MTA je zmanjšal proliferacijo in sposobnost preživetja celic CD8 plus T, saj je zaviral efektorske funkcije v za humani antigen specifičnih CD8 in citotoksičnih celicah T z zmanjšanjem degranulacijske sposobnosti celic CD8 plus T in zaviranjem izločanja IFN-g in IL-2 v odvisno od odmerka (81). Strobl et al. poročali, da PRMT5-specifični zaviralec metiltransferaze, EPZ015666, zavre proliferacijo, sposobnost preživetja in funkcionalnost celic CD8 plus T (83).

Poleg tega so ti avtorji povezali PRMT5 s selektivnim spajanjem MDM4, ki je povzročilo transdukcijo signalne kaskade p53 za posredovanje zaustavitve celičnega cikla in apoptoze v celicah CD8 plus T. Inhibicija PRMT5 je tudi zmanjšala signalizacijo protein kinaze B (AKT)/tarče rapamicina (mTOR) pri sesalcih, kar je oslabilo proliferacijo in preživetje celic CD8 plus T (83).

CD28, vezan na B7 na APC, in sostimulacija s TCR sta zmanjšala aktivacijski prag celic T, s čimer je spodbudila diferenciacijo celic CD4 plus T in izražanje citokinov tipa Th2- (84). Blanchet et al. poročali, da kostimulatorni signali CD28 inducirajo metilacijo arginina v celicah T (85). Glede na to, da je SAH hitro odstranila S-adenozil-L-homocistein hidrolaza (SAHase) in je SAH zaviral aktivnosti PRMT, SAHase služi kot aktivator PRMT. Farmakološki zaviralci SAHase so močno zavirali aktivacijo več ključnih proteinov, stimuliranih s signalizacijo TCR, vključno z AKT, zunajcelično reguliranimi protein kinazami (ERK)1/2 in NF-kB. vodi do oslabljene aktivacije celic CD4 plus T (86).

Zato imajo lahko PRMT pomembno vlogo pri aktivaciji in diferenciaciji celic CD4 plus T. Selektivni zaviralci PRMT5 bi lahko zavirali proliferacijo celic Th2 (87). Webb et al. opazili, da se je pri miših s homozigotnim pomanjkanjem celic PRMT5 T povečal delež IFN-g plus T-bet plus, IFN-g plus in T-bet plus T celic med diferenciacijo celic Th1, vendar je bilo skupno število diferenciranih celic Th1 zmanjšana, več kot verjetno zaradi zmanjšane proliferacije Th1 (75). Poleg tega so ti avtorji opazili, da se je odstotek GATA-3 plus IL-4 plus in IL-4 plus celic T povečal med diferenciacijo Th2 (75). Tako je inhibicija PRMT5 povečala diferenciacijo celic CD4 plus T, vendar je zatrla proliferacijo. Mehansko gledano se je izkazalo, da zaviralci SAHase zmanjšajo metilacijo arginina faktorja izmenjave 1 (Vav1) gvaninskega nukleotida Vav, bistvene molekule, kar vodi do omejene aktivacije celic CD4 in celic T (86, 88). Dosledno se je Vav1, metiliran z argininom, kopičil v jedru in aktiviral transkripcijski kompleksni jedrski faktor aktiviranih celic T (NFAT) in NF-kB za spodbujanje proizvodnje IL-2 in proliferacije celic T (85). PRMT5 je reguliral tudi transkripcijo IL-2 z metiliranjem določenih proteinov, ki vsebujejo sDMA (89).

Poleg tega je zmanjšano izločanje IL-2 z zaviralci PRMT5 pomagalo zatreti proliferacijo in diferenciacijo celic Th1 (87). PRMT1 je tudi metiliral protein, ki medsebojno deluje z NFAT, NIP45, kar je olajšalo povezavo z NFAT, kar je potrebna modifikacija za močno povečanje transaktivacije NFAT, ki jo povzroči NIP45-, in koaktivacije PRMT1 promotorja IL-4 (90, 91). Skupaj so zaviralci SAHase delno nadzorovali proteine, stimulirane s signalizacijo TCR z zmanjšano metilacijo Vav1, s čimer so zavirali aktivacijo CD4 in T celic. PRMT5 je spodbujal tudi proizvodnjo IL-2 z metiliranjem Vav1 ali NF-45 in NF-90. Glede na to, da ima IL-2 ključno vlogo pri polarizaciji naivnih celic CD4 plus T na fenotip Th2 in pri proliferaciji celic T, so visoke ravni izražanja IL-2, ki jih povzroča PRMT5, prispevale k celicam CD4 plus T diferenciacijo in proliferacijo (92, 93).

Nedavne študije so pokazale, da je disregulacija metilacije arginina prispevala k diferenciaciji Th17. Po eni strani je farmakološka inhibicija PRMT1 preprečila nastanek celic Th17 (94). Mehansko je PRMT1 kot odziv na IL-6 in transformirajoči rastni faktor-b (TGF-b) sodeloval s ključnim transkripcijskim faktorjem pri diferenciaciji celic Th17, RORgt, in induciral transkripcijo in ekspresijo IL-17, kar označil fenotip Th17 (94). Po kombinaciji z RORgt je bil PRMT1 rekrutiran na promotor IL-17 in asimetrično dimetiliran histon 4 arginin 3 (H4R3). Metilacija H4R3 je stabilizirala STAT3, ki ga je aktiviral IL-6, in odstranila STAT5, ki ga je aktiviral IL-2, s čimer je ublažil zaviralni učinek STAT5 na promotor IL-17 in spodbudil diferenciacijo Th17 (95).

Po drugi strani pa je bila diferenciacija Th17 močno ovirana v T-celično specifičnem modelu s pomanjkanjem PRMT5, pri čemer je bilo število celic RORgt plus IL17 plus, IL-17 plus in RORgt plus Th17 v tem modelu zelo nizko. (96). Do te situacije je lahko prišlo zaradi naslednjega: PRMT5 je simetrično dimetiliral SREBP1 pri R321, kar je zaviralo njegovo fosforilacijo pri S430 in preprečilo razgradnjo SREBP1 po poti ubikvitin-proteasom (96). Ta sprememba je spodbudila stabilnost in transkripcijsko aktivnost SREBP1, genskega transaktivatorja, ki spodbuja biosintezo holesterola, kar ima za posledico kopičenje močnega endogenega agonista RORg, dezmosterola (75, 97).

Poleg učinkov na biosintezo holesterola je PRMT5 izboljšal tudi glikolitični mehanizem za uravnavanje diferenciacije Th17. Inhibicija PRMT5 je zavrla izražanje faktorja, ki uravnava glikolizo, faktorja, ki povzroča hipoksijo 1-a (HIF-1a), da bi spodbudil diferenciacijo Th17 prek neposredne transkripcijske aktivacije RORgt in spodbujanje glikolitične poti ( 75, 83, 98). Na splošno so PRMT z metiliranjem histonov za aktiviranje promotorja IL-17 in uravnavanje presnovnega reprogramiranja, vključno z glikolizo in presnovo lipidov po aktivaciji celic T, spodbujali diferenciacijo Th17.

Za celice Treg so poročali o FOXP3 kot transkripcijskem regulatorju, ki določa usodo, z visokimi ravnmi FOXP3 in stabilnostjo, potrebnimi za imunosupresivno aktivnost celic Treg (99, 100). PRMT so aktivno regulirali diferenciacijo in supresivno aktivnost Tregs z regulacijo FOXP3. PRMT1-katalizirana neposredna metilacija FOXP3 pri R48 in R51 je okrepila supresivno funkcijo celic Treg (101). Podobno je lahko PRMT1 vplival tudi na aktivnost Treg z uravnavanjem drugih proteinov, ki medsebojno delujejo s FOXP3, kot sta protein O1 Forkhead box (FOXO1) in transkripcijski faktor Runt-povezan transkripcijski faktor 1 (Runx1) (102, 103). PRMT1 je metiliral FOXO1 pri R248 in R250, da je stabiliziral protein, in tudi metiliral Runx1 pri R206 in R21, da je okrepil njegovo transkripcijsko aktivnost (104, 105).

Poleg tega je zdravljenje z zaviralcem PRMT1 AMI-1 okrepilo Tregovo občutljivost na ekspresijo FOXP3, ki jo povzroči TGF-b, ter povečalo pogostnost in zaviralni učinek Tregs z neposrednim izboljšanjem ekspresije FOXP3 (106, 107). Poleg PRMT1 je PRMT5 reguliral tudi ekspresijo FOXP3 v naivnih celicah T z vplivanjem na ekspresijo DNMT1, ki je nadzorovala metilacijo CpG v promotorju FOXP3 in s tem izboljšala transkripcijsko dostopnost do regulativnih regij FOXP3 (108, 109). Poleg tega je inhibicija PRMT5 vplivala na modifikacijo H3K27me3 v promotorju FOXP3 in olajšala izražanje FOXP3 (106). Ker je PRMT5 medsebojno deloval z EZH2, kar je doseglo vrhunec v povečanem odlaganju H3K27me3, so lahko spremembe H3K27me3 v celicah s pomanjkanjem PRMT5 povzročile interakcije PRMT5-EZH2 (110).

Nasprotno pa so Yasuhiro et al. v modelu pomanjkanja PRMT5-, specifičnem za celice Treg, opazili zmanjšanje supresivne aktivnosti in učinkov/fenotipa spomina Tregov, kar je posledica zmanjšanega markerja simetrične dimetilacije lokusa FOXP3 R51 (111 ). Vendar so ti avtorji kasneje odkrili, da je pomanjkanje PRMT5 morda povezano z okvarjenim vzdrževanjem, aktivacijo in proliferacijo celic Treg prek oslabljenega signaliziranja gc in ne metiliranega FOXP3 (73).

3.1.3.2 Ciljna aktivacija in diferenciacija celic B

Medtem ko so bile celice T že dolgo v središču raziskav tumorske imunosti, so druge podskupine imunskih celic pomembne za to področje, zlasti v zvezi s konceptom terciarne limfoidne strukture (TLS). Namesto da bi zahtevali, da se DC preselijo z mesta tumorja na SLO, hipoteza TLS predpostavlja, da se ta pojav pojavi neposredno v ektopičnih limfoidnih organih, ki jih ustvari nelimfoidno tkivo, ki infiltrira tumorske robove in stromo (112). Takšne strukture so sestavljene iz celične cone CD3 plus T in celične cone CD20 plus B, pri čemer prva vsebuje DC, pozitivne na membranski glikoprotein, povezan z DC-lizosomom, in fibroblastne retikulocite, druga pa vsebuje zarodna središča, plazemske celice, folikularne DC in kompleksi antigen-protitelo (113). V TLS antigeni, povezani s tumorjem, sprožijo transformacijo celic B v fenotip efektorja/pomnilnik, ki proizvaja protitelesa in predstavi tumorske antigene celicam T, s čimer poveča prognostično funkcijo celic CD8 plus T in spodbuja rast celic T (113). Povišane ravni CD8 plus in CD4 plus celic T, lokalizirane skupaj s precejšnjo infiltracijo celic CD20 plus B, so bile povezane z dolgoročnim kliničnim preživetjem (114).

Poleg tega so celice B izločale več kemokinov, da bi rekrutirale DC, celice T in celice NK (113). Tako klinične kohortne kot analitične študije TME so odkrile pozitivne korelacije med odzivi bolnikov na terapijo z ICB ter infiltracijo celic B in tvorbo TLS. Te študije so poudarile doslej necenjeno vlogo celic B pri človeški protitumorski imunosti, zato se lahko tumorji, neobčutljivi na ICB, bolje odzovejo na nastajajoče terapije, ki ciljajo na aktivnost celic B (115–117).

PRMT1, PRMT5 in PRMT7 uravnavajo proliferacijo in diferenciacijo celic pred B, tvorbo zarodnega središča in odzive protiteles. Pri B-celično specifičnih miših s pomanjkanjem PRMT1- je bilo število celic B v kostnem mozgu in drugih perifernih limfoidnih organih znatno zmanjšano (118), medtem ko je bil razvoj celic B močno okrnjen v fazi pred celicami B (119 ). Aktivirane celice B so pokazale povečane ravni PRMT1 in z argininom metiliranega proteina. Z zniževanjem rekombinacijskih aktivirajočih genov, Rag1 in Rag2, je FOXO1 blokiral napredovanje diferenciacije celic B onkraj stopnje pro-B celic (120). Yamagata idr. je pokazalo, da PRMT1 neposredno metilira FOXO1, da zavira fosforilacijo z AKT in posledično proteasomsko razgradnjo (105). Poleg tega je PRMT1 tudi metiliral podenoto Iga receptorja B-celic (BCR), da je zaviral z BCR-inducirano aktivacijo Syk in signaliziranje fosfoinozitid 3-kinaze (PI3K), blokiral razgradnjo proteina FOXO in spodbujal diferenciacijo celic pred B, namesto širjenje (121, 122).

Tako je PRMT1 negativno reguliral signalne dogodke B-celic, kot sta rekombinacija razrednega stikala in izbor antigena prek signalizacije PI3K-FOXO1, s čimer je olajšal razvoj od pred-celic B do nezrelih celic B. Poleg tega je PRMT1 posredoval pri metilaciji CDK4 z argininom, destabiliziral kompleks CDK4-Cyclin-D3, povzročil zaustavitev celičnega cikla in spodbudil diferenciacijo celic pred B (119). V modelu miši s pomanjkanjem PRMT1- v perifernem predelu B-celic je bila proliferacija in diferenciacija zrelih celic B po stimulaciji močno ovirana, generacija celic B zarodnega središča (GC-B) je bila pomanjkljiva, aktivacija in proliferacija spominskih celic B pa sta bili precej zmanjšana (121). PRMT1 je tudi vzdrževal število folikularnih celic B (FO-B) in spodbujal tvorbo zarodnega središča (GC) po aktivaciji celic FO-B (118). PRMT1 je zaščitil aktivirane celice B pred apoptozo z uravnavanjem ekspresije proteinov družine BCL2 za preživetje, MCL1, BCL2, A1 in BCLX (121).

Litzler et al. poročali, da sta bili tako ravni proteina PRMT5 kot sDMA povečani v stopnjah proliferacije celic B in da PRMT5 spodbuja preživetje aktiviranih celic B (123). PRMT5 je bil potreben za razvoj celic B v celicah Pro-B in Pre-B. PRMT5 je zaščitil zrele celice B pred apoptozo in spodbujal proliferacijo in tvorbo GC z uravnavanjem transkripcije celic B in zvestobe spajanja (123). Poleg tega je PRMT5 neposredno sodeloval z BCL6 in ga metiliral, da bi olajšal BCL6-posredovano transkripcijsko represijo in tako uravnaval tvorbo GC (124). Ciljna gena BCL6 Irf4 in Prdm1, ki sta posredovala pri diferenciaciji plazemskih celic, je prav tako znižala PRMT5 (123).

Z uporabo modela miši z izločitvijo PRMT7, specifičnega za celice B, Ying et al. dokazali, da je izguba PRMT7 oslabila razvoj celic B zmanjšala celice B robne cone (MZ-B), povečala celice FO-B in spodbudila nastanek GC po imunizaciji (125). Izčrpavanje PRMT7 je povečalo izražanje Bcl6 z rekrutiranjem H4R3me1 in simetričnega H4R3me2 na promotor Bcl6. Diferenciacija podtipov plazemskih celic, ki izločajo IgA in IgG1-, je bila prav tako zmanjšana pri miših s pomanjkanjem PRMT7-, verjetno zato, ker je izguba PRMT7 povzročila regulacijo Bcl6 in zavirala Irf4 in Prdm1 v celicah GC-B (125 ).

3.1.3.3 Usmerjanje na diferenciacijo tumorsko povezanih makrofagov (TAM) in izražanje drugih imunskih celic

Vse več dokazov je zdaj pokazalo, da TME spremeni imunske celice, da zavre imunski nadzor in imunološke odzive (126). Klasično aktivirani makrofagi M1 težijo k fagocitozi tumorskih celic z vzpostavitvijo provnetnega okolja in spodbujanjem Th1 in CTL odzivov.

Vendar pa alternativno aktivirani makrofagi M2, kot so TAM, spodbujajo rast tumorja in invazijo s povečanjem polarizacije Th2, tumorske angiogeneze in zaviranjem protitumorskih imunskih odzivov (127). DC so specializirani za obdelavo in predstavitev antigenov, medtem ko NK učinkovito identificirajo tumorske celice in uporabljajo citotoksičnost, ki jo posreduje perforin/granzim, da omejijo rast tumorja, medtem ko akumulirani MDSC izvajajo izrazite imunosupresivne učinke namesto diferenciacije v zrele mieloidne celice (128).

Tikhanovich et al. so uporabili model mieloične mieloidno specifične mišičje izločene miške PRMT1. je pokazalo, da je PRMT1 potreben za diferenciacijo makrofagov M2. Indukcijo PRMT1 so opazili med diferenciacijo monocitov v makrofage, kar je vodilo do odlaganja H4R3me2a na promotorju receptorja g, aktiviranega s proliferatorjem peroksisoma (PPARg), ki je povečal izražanje PPARg (ključni transkripcijski faktor, potreben za diferenciacijo fenotipa M2). Za makrofage specifična delecija PPARg je poslabšala zorenje alternativno aktiviranih makrofagov M2 (129, 130). V skladu s to študijo je PRMT1 induciral polarizacijo makrofagov na tipe M2 in povečal ekspresijo IL-6 in nizvodno STAT3 s spodbujanjem PPARg-odvisne eferocitoze makrofagov za porabo apoptotičnih teles v mišjem modelu od alkohola odvisnega hepatocelularnega karcinoma (131).

Poleg tega je pomanjkanje PRMT1 zmanjšalo tipe M2 prek poti PPARg, ki jo posreduje c-Myc, kar je vplivalo na trgovanje, eferocitozo, fagocitozo in alternativno aktivacijo makrofagov (132–134). PRMT1 je tudi metiliral c-Myc pri R299 in R346, da bi povečal njegovo sposobnost vezave na p300, namesto na HDAC1. To okrepljeno rekrutiranje kompleksa c-Myc-p300 na gene je sprožilo kasnejšo transkripcijo M2, kot so promotorji PPARg in manoznega receptorja C-tipa 1 (MRC1) (129).

Poleg tega so PRMT vplivali na ekspresijo in delovanje c-MYC v drugih celičnih linijah, kot sledi: 1) PRMT1 in CARM1 sta deponirala markerje H4R3me2a na promotor gena cMYC, ki jih je prebral protein 3 (TDRD3)-topoizomeraza IIIB (TOP3B), ki vsebuje domeno Tudor ) zapletena in olajšana transkripcija c-MYC (135). 2) PRMT5 je metiliral mesti R218 in R225 v heterogenem jedrskem ribonukleoproteinu A1 (hnRNP A1), da je uravnal prevod c-MYC, ki je odvisen od vstopnega mesta notranjega ribosoma (IRES) (136). 3) Od encimov odvisna inhibicija c-MYC poliubikvitinacije s PRMT3 je odpravila z ubikvitinom posredovano razgradnjo C-MYC (137) in 4) PRMT5-posredovano označevanje H4R3me2 je bilo bogato z vezavo c-Myc na CANNTG E- elementov škatle in tudi regulirano funkcijo MYC (138).

PRMT6 je prav tako spodbujal napredovanje tumorja z olajšanjem diferenciacije makrofagov na fenotip M2 namesto fenotipa M1 in podpiral tumorsko neoangiogenezo. PRMT6 je medsebojno deloval z ILF2 v pljučnem adenokarcinomu, da bi reguliral sintezo faktorjev zaviranja migracije makrofagov, da bi induciral alternativno aktivacijo TAM (139, 140).

Metilacija arginina je prizadela tudi druge imunske celice, razen makrofagov. Zaviralec majhne molekule CARM1, tumorji, zdravljeni z EZM2302, so bili infiltrirani z velikim številom dendritičnih celic, navzkrižno predstavljenih celic cDC1 in celic NK. V modelu PRMT5-knockdown tumorja so dosledno opazili večjo številčnost NK, DC in MDSC v primerjavi s kontrolnim knockdown modelom (19, 79).

V kombinaciji imajo PRMT bistveno vlogo pri uravnavanju diferenciacije makrofagov in celične proliferacije NK, DC in MDSC. Te funkcije ne zagotavljajo le novih perspektiv za alternativno aktivacijo makrofagov, ampak bi lahko identificirale nove terapevtske cilje za raka.

3.2 PRMT in signalizacija IFN tipa I

IFN-ji tipa I olajšajo imunski nadzor raka, protitumorsko imunost in učinkovitost imunoterapije na več načinov, predvsem s spodbujanjem zorenja DC in izboljšanjem njihove sposobnosti za obdelavo in predstavitev antigenov v ciklu imunosti, prirojene raku (141). Interferoni interferonov tipa povečajo tudi izražanje citotoksičnih mediatorjev v CTL in preprečijo celicam NK, da bi očistile aktivirane CD8 in CTL, hkrati pa ohranjajo spominski fenotip in vplivajo na supresivne funkcije Treg (142). Ko različni razredi receptorjev za prepoznavanje vzorcev (PRR), vključno s Toll-podobnimi receptorji (TLR), RNA-sensing retinoic acid inducible genom (RIG)-I podobnimi receptorji (RLR) in senzorji citosolne DNA prepoznajo s patogenom povezane molekularne vzorce ali molekularnih vzorcev, povezanih s poškodbo, se inducira rekrutacija TBK1 skupaj z zaporedno aktivacijo IRF3/7 in NF-kB, kar običajno poveča ekspresijo gena, stimuliranega z IFN (ISG), in nastanek IFN tipa I (143). Možno je, da bi lahko ustrezno stimulacijo IFN-jev tipa I in z njimi povezanih signalnih poti razvili kot učinkovito protitumorsko imunoterapijo.

3.2.1 Poti PRMT in TLR

Prepoznavanje molekularnih vzorcev, povezanih s patogeni, s TLR-ji prispeva k povečanju transkripcijske regulacije različnih genov. Faktor 6 (TRAF6), povezan z receptorjem faktorja tumorske nekroze (TNFR), je bil identificiran kot ključni za signalno pot, odvisno od primarnega odziva mieloidne diferenciacije 88 (MyD88), z imunoregulacijskimi funkcijami, ki je bila nižja od TLR (143). PRMT1 je metiliral in deaktiviral TRAF6 za zatiranje TRAF6-odvisne poti TLR. To zatiranje je obrnila domena jumonji, ki vsebuje 6 (JMJD6), pri čemer je TRAF6 demetiliran z JMJD6. Razmerje PRMT1/JMJD6 je določilo aktivacijo poti TLR, odvisne od MyD88-. Metilacija arginina TRAF6 je bila povezana z nižjo aktivnostjo TRAF6 in NF-kB v smeri toka, medtem ko je izpostavljenost ligandu TLR začasno zmanjšala PRMT1, kar je vodilo do demetilacije TRAF6 z JMJD6 in aktivacijo NF-kB, nato pa, ko je bil signal prekinjen, PRMT1 ponovno blokiral TRAF6-odvisno pot (144) (slika 3).

3.2.2 PRMT in pot RIG-I

Na poti RIG-I je bila ugotovljena pomembna vloga PRMT5 pri metilaciji IFI16/IFI204; Metilacija IFI16/IFI204 je aktivirala odzive interferona tipa I, ki jih je povzročil RIG-I/TLR3-inducirana dsRNA, čeprav je IFI16/IFI204 običajno služil proteinu, ki zaznava DNA (19, 145). PRMT7 je tvoril agregate za mono-metiliranje mitohondrijskega protivirusnega signalnega proteina (MAVS) pri R52, s čimer je zaviral njegovo interakcijo z RIG-I in TRIM31-sprožil MAVS K63-povezano poliubikvitinacijo na katalitično odvisen način. PRMT7 je zaviral aktivacijo MAVS in z virusom inducirane molekularne dogodke (IRF3, IkB in STAT1), vendar jih je rešil zaviralec PRMT7, SGC3027 (146). MAVS je rekrutiral tako TRAF3 kot TRAF6, da je tvoril kompleks MAVS/TRAF3/TRAF6, ki je medsebojno deloval s TBK1 in IKK, da je aktiviral proizvodnjo IRF3 in IFN tipa I (147). V zgodnjih fazah virusne okužbe je bil PRMT7 samodejno metiliran pri R32, kar je onemogočilo njegovo encimsko aktivnost in agregacijo. SMURF1 je bil nato rekrutiran v PRMT7 na način, ki je odvisen od MAVS, da katalizira K48-povezano poliubikvitinacijo PRMT7, da se zagotovi njegova pravočasna proteasomska razgradnja in kasnejša aktivacija RIG-I-MAVS, medtem ko je SMURF1 razgradil MAVS, TRAF3, TRAF6 ali USP25 v poznejših fazah virusne okužbe, da bi se izognili pretirani aktivaciji signalizacije RLR (146).

Pri ribah cebricah so PRMT2, PRMT3 in PRMT7 oslabili protivirusne odzive z zaviranjem signalne poti RIG-IMAVS. Samodejno vseprisotnost TRAF6, povezano z Lys63-, je preprečila PRMT2-posredovana asimetrična dimetilacija R100 pri TRAF6, s čimer je bila deaktivirana Nemodependent TBK1/IKKϵ signalizacija (148). PRMT2 je tudi tekmoval z MAVS za vezavo TRAF6 in preprečil novačenje TBK1/IKKϵ na MAVS (148). Prek dveh zgoraj omenjenih mehanizmov je PRMT2 negativno nadzoroval fosforilacijo IRF3/IRF7 in izražanje genov za IFN tipa I navzdol (148). Ti avtorji so tudi predlagali, da sta tako PRMT3 kot PRMT7 vplivala na fosforilacijo IRF3 in zavirala proizvodnjo IFN z interakcijo z RIG-I (149, 150) (slika 4).