Rapamicin alternativno spreminja mitohondrijsko dinamiko v dendritičnih celicah za zmanjšanje ishemične reperfuzijske poškodbe ledvic
Feb 22, 2022
Povzetek:Dendritične celice (DC) so edinstvene imunske celice, ki lahko povežejo prirojene in prilagodljive imunske odzive, imunski metabolizem pa močno vpliva na njihov fenotip. Rapamicin je makrolidna spojina, ki deluje imunosupresivno in se uporablja za preprečevanje izgube presadka pri presaditvi ledvice. Sedanja študija je ovrednotila terapevtski potencial ex-vivo DC, zdravljenih z rapamicinom, za zaščitoledvicev mišjem modelu akutnepoškodba ledvic (AKI). Za zdravljenje z rapamicinom (S) (Rapa-S-DC) smo Veh-DC zdravili z rapamicinom (10 ng/mL) 1 uro pred LPS. Nasprotno pa je bilo večkratno (M) zdravljenje z rapamicinom (Rapa-M-DC) izpostavljeno 3 zdravljenjem v 7 dneh. Le večkratno zdravljenje DC z rapamicinom ex vivo je povzročilo vztrajno reprogramiranje mitohondrijske presnove. Ti DC so imeli 18--krat več mitohondrijev, imeli so skoraj 4--krat večjo porabo kisika in proizvedli več ATP v primerjavi z Veh-DC (kontrolni DC-ji, obdelani z Veh). Analiza poti je pokazala, da je signalizacija IL10 glavna pot, ki prispeva k spremenjenemu imunofenotipu po zdravljenju z rapamicinom v primerjavi z vehiklom s pomembno nižjimi citokini Tnfa, Il1b in Il6, medtem ko so regulatorji mitohondrijske vsebnosti Pgc1a, Tfam in Ho1 ostali povišani. Ključnega pomena je posvojitveni prenos DC, zdravljenih z rapamicinom, na prejemnike WT 24 ur pred dvostranskimledvicaishemija pomembno zaščitilaledvicezaradi poškodbe z znatnim 3-kratnim izboljšanjemdelovanje ledvic. Nazadnje, infuzija DC, ki vsebujejo večje število mitohondrijev (obdelanih ex vivo z zdravimi izoliranimi mitohondriji (10 µg/mL) en dan prej), je tudi delno zaščitilaledviceod IRI. Te študije dokazujejo, da ima preventivna infuzija ex-vivo reprogramiranih DC, ki imajo višjo vsebnost mitohondrijev, terapevtsko sposobnost za induciranje protivnetnega regulativnega fenotipa za zaščitoledviceod poškodbe.
Ključne besede:dendritična celica; rapamicin; mitohondrije; akutna poškodba ledvic; ishemična reperfuzijska poškodba
UvodPatobiologija akutnegapoškodba ledvicje večfaktorski in vključuje zapletene interakcije medledvičnaparenhimskih celic in imunskih celic [1,2]. Vledvica,običajne dendritične celice (DC) so glavna podskupina imunskih celic in jih najdemo intimno v intersticijskem prostoru po vsemledvica[3–5]. DC so ena od primarnih vrst celic, ki sodelujejo pri prirojeni imunosti in so bistvenega pomena pri zagotavljanju zaščite pred patogeni. Naše predhodno objavljeno delo z uporabo DC, pridobljenih iz kostnega mozga, je pokazalo, da lahko terapija z DC uravnava različne prirojene in prilagodljive imunske odzive, povezane z AKI [6,7].
DC-ji se nahajajo v veliki meri v vseh tkivih, s podskupino DC-jev (CD11c in DC-ji), ki se nahajajo vledvičnaparenhim. Vendar imajo ti CD11c plus DC tudi patogeno vlogo pri poslabšanjupoškodba ledvicpo ishemično-reperfuzijski poškodbi (IRI) [8]. IRI je opredeljen kot poškodba, ki je posledica ponovnega vnosa kisikove krvi v organ po obdobju ishemije in se pogosto pojavi pri miokardnem infarktu, možganski kapi in presaditvi trdnih organov. Kot odziv na IRI obsegajo CD11c in DC precejšen del infifiltrata vnetnih celic vledvičnatkivo.
DC-ji so sposobni prepoznati s patogeni povezane molekularne vzorce (PAMP) prek različnih receptorjev za prepoznavanje vzorcev, ki se nahajajo na površini DC-jev, kot so tolllike receptorji (TLR) in NOD-podobni receptorji. Vezava receptorjev za prepoznavanje vzorcev (PRR) na njihove specifične PAMP povzroči aktivacijo več poti, ki vključujejo proinflamatorne odzive, sintezo protimikrobnih peptidov in indukcijo adaptivne imunosti, posredovane z limfociti [9]. Pomembne raziskave so bile posvečene proučevanju sprememb v celični bioenergetiki DC po aktivaciji s PAMP. Ugotovljeno je bilo, da aktivacija DC z lipopolisaharidom (LPS; PAMP, ki se razlikuje od gramnegativnih bakterij) prek vezave na njegov specifični receptor TLR4 povzroči presnovno spremembo iz zelo učinkovite oksidativne fosforilacije v proces, ki je zelo podoben Warburgovemu metabolizmu ali aerobni glikolizi . Za presnovo Warburga je značilno preusmerjanje piruvata, ki nastane pri glikolizi, v smeri pretvorbe v laktat za proizvodnjo energije in stran od transporta v mitohondrije, da se podvrže katabolizmu prek cikla TCA, kljub zadostni razpoložljivosti kisika. Ena od razlag tega pojava vključuje enega od številnih učinkov aktivacije TLR4, ki sledijo toku, kar je povečana aktivnost serin/treonin kinaze, tarče rapamicina pri sesalcih (mTOR). Inhibicija mTOR z rapamicinom ohranja mitohondrijsko funkcijo v aktiviranih DC z znižanjem iNOS, pri čemer DC, zdravljeni z rapamicinom, stimulirani v prisotnosti LPS, kažejo zmanjšane ravni aerobne glikolize [10]. Zaviralci mTORC1, kot je rapamicin, se trenutno uporabljajo pri presaditvi trdnih organov kot možna alternativa zaviralcem kalcinevrina, da bi se izognili kroničnimledvičnapoškodbe alogenskega presadka, saj ima tudi možnost širjenja CD4 in CD25 ter regulatornih T-celic [11,12]. Vendar pa lahko uporaba rapamicina pri presaditvi povzroči vnetne zaplete, ki vključujejo periferni edem, zvišanje kreatinina in trombocitopenijo. Prejšnje študije so pokazale, da se neželeni učinki hipoksičnih dražljajev povečajo z izpostavljenostjo LPS in oslabijo z rapamicinom [8, 13].
Cilj je razviti metode za uporabo zdravil klinične kakovosti, ki jih je odobrila FDA, kot je Rapamycin, za induciranje regulativnih DC, ki lahko nadzorujejo neželene prirojene in prilagodljive imunske odzive. Namen te študije je bil določiti potencialni zaščitni mehanizem(-e) BMDC, stimuliranih z rapamicinom, v predkliničnem mišjem modeluledvicaIRI. Zdravljenje BMDC ex-vivo z rapamicinom se izogne kakršnim koli neželenim stranskim učinkom in vnetnim zapletom, povezanim s sistemskimi injekcijami zdravil. Optimalni odmerek in čas uporabe večine farmakoloških spojin ali zdravil sta odvisna od različnih parametrov. V rakavih celicah nizek odmerek rapamicina v primerjavi z visokim odmerkom različno zavira mTORC1 in mTORC2, kar ima za posledico delno ali popolno zaviranje napredovanja celičnega cikla [14]. Za vse naše študije kondicioniranja ex-vivo BMDCs v trenutnem rokopisu smo izbrali nizek odmerek 10 ng/mL rapamicina na podlagi predhodno poročanih študij s tolerogenimi BMDC [15,16]. Časovna razporeditev števila odmerkov (trije ali eden) je temeljila na našem predhodno objavljenem delu z razmnoževanjem mišjih BMDC in dodanem GMCSF [17,18]. Naši trenutni podatki kažejo, da tako enkratno kot večkratno zdravljenje DC z rapamicinom povzroči manj robustne imunogene odzive (nižje citokine in kostimulatorne molekule) po stimulaciji LPS. Prenos enega ali več DC, obdelanih z rapamicinom, enako ščitiledviceiz IRI v singenskih (miši C57BL/6 BMDC→C57BL/6) ali alogenskih (miši BALB/c BMDC→C57BL/6) modelih IRI. Vendar pa je večkratno ex-vivo zdravljenje z rapamicinom (3 zdravljenja v 7 dneh) poleg zmanjšanja imunogenih odzivov povečalo tudi število in delovanje mitohondrijev (Seahorse Analyzer) v primerjavi z DC, zdravljenimi z nosilcem. Ta eksperimentalna opažanja kažejo, da imajo DC z višjim številom mitohondrijev potencial, da postanejo regulativni, in prenos teh DC lahko zaščitiledviceod ishemične poškodbe. Kot je pokazala naša nedavna študija z uporabo DC-jev, obdelanih s FTY720 [18], farmakološke ali mitohondrijske transplantacije, ki inducirajo večje število mitohondrijev v imunskih celicah (DC-ji ali makrofagi), prav tako povzročijo, da imajo te celice protivnetni fenotip, kar je verjetno posledica vzdrževanja mitohondrijev. oksidativno fosforilacijo (OXPHOS) in z zmanjšanim preklopom na glikolizo za energijo po stimulaciji. Za te učinke smo eksogeno povečali število mitohondrijev v DC, da bi preizkusili, ali lahko višje število mitohondrijev inducira regulativni fenotip z uporabo mitohondrijskih presadkov. Prenos teh Mito-DC zaščitenledviceiz IRI; vendar za razliko od Rapa-DC ti Mito-DC nimajo zmanjšanih imunogenih odzivov (MHCII, kostimulatorne molekule in citokini) po stimulaciji LPS, kar verjetno kaže, da lahko povečanje števila kopij mitohondrijev preglasi funkcionalne spremembe, ki jih povzroči eksogena stimulacija LPS. V tej študiji in kot je bilo že prikazano [6,7,18], so sistemsko vbrizgani DC (obdelani z nosilcem, rapamicinom ali mitohondriji) v odmerku pol milijona večinoma najdeni samo v vranici in ni bilo najdenih signalov. vledvice. V vranici, kot je FTY720-DC, lahko rapamicin in mitohondriji bogati DC povzročijo protivnetni odziv, kar povzroči zaščito predledvicaIRI. Te semenske ugotovitve zagotavljajo nove dokaze, ki nakazujejo, da je povečanje števila mitohondrijev (eksogeno s presaditvijo mitohondrijev ali s farmakološkim posegom (FTY720 ali rapamicin)) v imunskih celicah lahko nov terapevtski način za končno uravnavanje njihovih imunoloških odzivov za preprečevanje in/ali zgodnje zdravljenjepoškodba ledvic.
Materiali in metode
MišiVsi postopki in ravnanje z živalmi so bili izvedeni v skladu z navodili Nacionalnega inštituta za zdravje za nego in uporabo laboratorijskih živali, številka protokola Bajwa UTHSC, 18-080, datum odobritve 28. 9. 2018, pa je odobrila Univerza v Odbori za institucionalno oskrbo in uporabo živali Tennessee Health Science Center (UTHSC). Politike oskrbe laboratorijskih živali sledijo politiki javne zdravstvene službe o humani oskrbi in uporabi laboratorijskih živali. Vsi rezultati so navedeni na način, ki je skladen s smernicami ARRIVE [19]. Za vse študije prenosa so bile miši C57BL/6J in BALB/c kupljene pri The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, ZDA). Miši so bile nameščene v standardnem vivariju s 12--urnim ciklom svetloba/tema na dieti s hrano, voda pa je bila prosto dostopna.
Ledvična ishemija-reperfuzijska poškodba Sledili so vsem podrobnim kirurškim postopkom, kot je bilo že sporočeno [18]. Miši samci C57BL/6 (stari 8–12 tednov) so bili izpostavljeni 26--minutni dvostranski ishemiji, ki ji je sledila 20–24-urna reperfuzija. Na kratko, vse mišje samce so anestezirali z intraperitonealno (ip) injekcijo mešanice ketamina in ksilazina, s subkutano injekcijo buprenorfina in jih položili na toplo blazino, da so vzdrževali telesno temperaturo pri 34,5–36 ◦C. Miši so bile nato randomizirane na lažno operacijo ali operacijo IRI. Izveden je bil obojestranski bočni rez. Telesno temperaturo smo preverjali in vzdrževali skozi celotno ishemično obdobje. Shamoperirane miši so bile podvržene enakemu postopku, razen vpenjanja žil in zapiranja kirurških ran. Miške, ki so imele enegaledvicabrez reperfuzije 24 ur po ishemiji so bili izključeni iz vseh analiz.
Ocena delovanja ledvic in histologijaPod anestezijo smo odvzeli kri iz retroorbitalnega sinusa in določili kreatinin v plazmi (mg/dL) z uporabo encimske metode z manjšimi spremembami protokola proizvajalca (Diazyme Laboratories, Poway, CA, ZDA) in dušika v krvi in urinu (BUN ) in meritev kreatinina je bila izvedena z uporabo kompleta QuantiChrom Urea Assay Kit (DIUR-100, BioAssay Systems, Hayward, CA, ZDA), kot je opisano prej [18,20]. Za histologijo,ledviceso bili čez noč fiksirani v 4-odstotnem PLP ali 10-odstotnem formalinu in vdelani v parafin.Ledviceso bili pripravljeni za barvanje s H&E, kot je opisano prej [18], fotografije pa so bile posnete s prilagoditvijo svetlosti/kontrasta z mikroskopom EVOS (Thermo Fisher Scientifific, Waltham, MA, ZDA). Za kvantifikacijo ocene tubularne poškodbe so bili odseki ocenjeni s štetjem odstotka tubulov, ki so pokazali celično nekrozo, izgubo krtačastega roba, tvorbo odlitka in dilatacijo tubulov, kot sledi: 0=normalno; 1=manj kot ali enako 10 odstotkom; 2=10 do 25 odstotkov; 3=26 do 50 odstotkov; 4=51 do 75 odstotkov; 5=Večji ali enak 75 odstotkom. Pet do 10 fi polj iz vsake zunanje medule je bilo ocenjenih in točkovanih na slep način. Histološka sprememba je bila izražena kot akutna tubularna nekroza (ATN), ocenjena, kot je opisano prej [7, 21]. Apoptotične celice so bile odkrite s testom TUNEL (komplet za odkrivanje smrti celice In Situ, TMR Red; Roche, Basel, Švica) v skladu z navodili proizvajalca.
Kultura dendritičnih celic (DC), pridobljena iz kostnega mozga (BM) in posvojeni prenos8–10 tednov stare mišje samce C57BL/6J ali BALB/c WT so uporabili za generiranje DC iz celih prekurzorjev BM [22]. Supernatant, bogat z GMCSF, je bil pridobljen iz celic J558L, stabilno transficiranih z mišjim GMCSF. Celična linija je bila velikodušno darilo dr. Ira Mellman (Oddelek za biologijo, Univerza Yale, New Haven, CT, ZDA). Na kratko, sveže izoliran BM smo gojili s 6 ng/mL rekombinantnega mišjega GMCSF (skupaj 3 zdravljenja) 8 dni v RPMI 1640 (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA). Optimalni odmerek 10 ng/ml rapamicina je bil določen po testiranju različnih odmerkov (0,1–10 ng/ml). BMDC so zdravili z 10 ng/mL rapamicina (Sigma, St. Louis, MO, ZDA) za skupno tri zdravljenja ali 1-zdravljenje čez noč). BMDC so zdravili z lipopolisaharidom agonistom TLR4 (LPS; Escherichia coli serotip 0111:B4: 100 ng/mL; Sigma-Aldrich); ali vehikel (1 × PBS) 24 ur v gojišču za singenske študije (C57BL/6J BMDCs→C57BL/6J miši) in pustimo neobdelano za alogenske študije (BALB/c BMDCs→C57BL/6J miši). Celice smo sprali in 0,5 × 106 celic na miš smo intravenozno (iv) injicirali v naivne miši 1 dan pred obojestranskoledvicaIRI. BMDC so označili z MitoTracker CMXRos Red ali MitoTracker Deep Red (100 nM, 30 min pri 37 °C, Invitrogen) ali Mitosox (5 µM; 10 min pri 37 °C; Invitrogen).
Kvantitativni PCR v realnem časuRaven izražanja relativne mitohondrijske DNA (mtDNA) je bila izmerjena, kot je opisano prej [23]. Na kratko, celotno genomsko DNA smo izolirali in enake količine (5 ng) uporabili za RTPCR z uporabo ND1 kot nadomestnih primerjev za mtDNA in HK2 primerjev za jedrno DNA (nDNA) za miško in ND6 za človeško mtDNA, kot je opisano prej [23, 24]. Celotna RNA je bila izolirana in obrnjeno prepisana v cDNA, RT-PCR pa je bila izvedena, kot je opisano prej [7, 25, 26].
Izolacija in kvantifikacija mitohondrijevMitohondrije smo izolirali iz celic HEK293, kot je opisano prej [18]. Na kratko, 60 cm plošče s celicami HEK293 smo zbrali z dodatkom 5 mL homogenizacijskega pufra (300 mmol/L saharoze, 10 mmol/L HEPES-KOH, 1 mmol/L EGTA-KOH, pH 7,4) z 1 mg Subtilisin A proteaze iz Bacillus licheniformis (Sigma-Aldrich). Podroben protokol za izolacijo mitohondrijev je na voljo v našem prejšnjem objavljenem rokopisu [18].
2Bioanalizator Seahorse FluxSedem dni stare BMDC so bile prenešene na plošče s tkivno kulturo Seahorse 24-in izmerjena je bila stopnja porabe kisika (OCR), parametri pa izračunani, kot je opisano prej [25] z naslednjo modifikacijo. Po merjenju bazalne frekvence dihanja so oligomicin (Sigma; 2 µM), FCCP (Sigma; 1,5 µM; karbonil cianid 4- (trifluorometoksi)-fenilhidrazon (FCCP)) in zaviralci transportne verige elektronov (kompleksa I in III) rotenon (Sigma; 0.5 µM) in antimicin A (Sigma; 0.5 µM)) so vbrizgali zaporedno med testom. Bazalno mitohondrijsko dihanje, dihanje, povezano z ATP, uhajanje protonov (poraba kisika, ki ni povezana z ATP), maksimalno dihanje, nemitohondrijsko dihanje, rezervna dihalna kapaciteta, razmerje nadzora dihanja in učinkovitost sklopitve so bili določeni v celih celicah v skladu z Brand et al. . [27]; Za vsako poskusno skupino smo uporabili N=4–5 vdolbinic in poskuse ponovili najmanj 3-krat.
Analiza pretočne citometrije, Western blot in ELISAZajem podatkov s pretočno citometrijo je bil izveden na FACS Calibur (Becton Dickinson, San Jose, CA, ZDA) z nadgradnjo barvne pretočne citometrije Cytek {{0}} (Cytek Development, Inc., Fremont, CA, ZDA). Podatki so bili analizirani s programsko opremo FlowJo 9.0 (Tree Star, Ashland, OR, ZDA), kot je opisano prej [6,7,28]. Za ELISA so bili mediji zbrani iz BMDC 24 ur po zdravljenju s 100 ng/mL LPS. Ravni TNF, IL6 ali IL10 so bile izmerjene z uporabo kompletov mišjega ELISA (Invitrogen) po protokolu proizvajalca in kot je bilo prej opisano [18]. Veh- ali Mito-DC, obdelan z LPS in brez njega 6 ali 24 ur, smo uporabili za izolacijo celotnega proteina z uporabo liznega pufra RIPA, dopolnjenega s koktajlom inhibitorjev proteaze in fosfataze (Thermo Fisher Scientifific, Vernon Hills, IL, ZDA). Za GAPDH lizatne supernatante smo bodisi kuhali (10 minut pri 100 ◦C) in lizate pustili pri sobni temperaturi 10 minut za koktajl OXPHOS za glodavce (Abcam, Cambridge, MA, ZDA) [18]. Podrobnejše metode so bile že opisane [18].
Podatkovna in statistična analizaZa analizo in predstavitev podatkov je bil uporabljen GraphPad Prism 8 (GraphPad Inc., San Diego, CA, ZDA). Podatki so bili analizirani po transformaciji, če je bila potrebna za ustvarjanje normalne porazdelitve, s 2-testom t z repom ali 1-way ANOVA z post-hoc analizo, kot je ustrezno. Dvostranski neparni t test je bil uporabljen za analizo dveh skupin. p Manjše ali enako 0.05 je bilo uporabljeno za označevanje pomembnosti.
Rezultati
Večkratno zdravljenje z rapamicinom (Rapa-M) povzroči večje število mitohondrijev in manj imunogenih DCC57BL/6 WT DC izolirali in razmnoževali 8 dni v prisotnosti GMCSF in nosilca (1X PBS) ali rapamicina (10 ng/mL), skupaj tri zdravljenja. DC so bili čez noč obdelani s 100 ng/mL LPS. DC-ji, obdelani z LPS, so bili uporabljeni za RNASeq ali označeni z različnimi mitohondrijskimi barvili. Podatki RNASeq so potrdili prejšnje podatke, da zdravljenje z rapamicinom inducira manj imunogene DC z nižjimi pro-vnetnimi citokini, ki uravnavajo prirojene in prilagodljive imunske odzive z IL10 kot glavno spreminjajočo se potjo (slika S1A, B in tabela S1 dodatnega materiala). V primerjavi z zdravljenjem z nosilcem je zdravljenje z rapamicinom povečalo vsebnost mitohondrijev v BMDC (slika 1A), kot je bilo preverjeno z MitoTracker CMXRos Red (50 nM) z in brez LPS. Podobno je bilo značilno večje označevanje z MitoTracker Deep Red (100 nM) in bistveno nižje označevanje z MitoSox (5 µM) in po nočni stimulaciji LPS v Rapa-M-DC v primerjavi z Veh-DC (slika 1B,C). Polkvantifikacija histogramov MFI za vsa mitohondrijska barvila (slika 1D). Poleg tega so Veh- in Rapa-M-DC obarvali z JC-1, da bi preverili, ali je zdravljenje z rapamicinom spremenilo potencial mitohondrijske membrane. Večkratno zdravljenje z rapamicinom ne spremeni izhodiščnega potenciala mitohondrijske membrane v primerjavi s kontrolnimi BMDC, zdravljenimi z nosilcem, kot je prikazano z imunoflfluorescenco (slika S2A dodatnega materiala) in pretočno citometrijo (slika S2B, C dodatnega materiala).
(Veh) in označeno z (A) MitoTracker CMXRos (50 nM) ali (B) MitoSox (5 µM) ali (C) MitoTracker Deep Red (100 nM) . (D) Polkvantificirana analiza MFI podatkov pretočne citometrije, označenih z mitohondrijskimi barvili. (E) DC so bili zasejani v analizator Seahorse XF-24e, stimulirani z in brez LPS 24 ur, stopnja porabe kisika (OCR) pa je bila določena med zaporednimi zdravljenji z oligomicinom (1), FCCP (2) in antimicin A/rotenon (3). (F) Kvantifikacija bazalne proizvodnje OCR in ATP. (G) ravni mRNA Pgc1a in Tfam v Veh-DC in Rapa-M-DC, zdravljenih s 100 ng/mL LPS ali nestimuliranih 24 ur. (H) Analiza pretočne citometrije MHC II, kostimulatornih molekul (CD40/80/86) in ekspresije PDL1 je bila določena s stimulacijo LPS in brez nje. (I) ELISA IL10, IL6 in TNF iz Veh-DC in Rapa-M-DC, obdelanih s 100 ng/mL LPS 24 ur. (J–L) ravni mRNA Il10, Tnfa in Il6 v Veh-DC in Rapa-M-DC, zdravljenih s 100 ng/mL LPS ali nestimuliranih 24 ur. * p Manjše ali enako 0,05, ** p Manjše ali enako 0,01 in *** p Manjše ali enako 0,001, enosmerna ANOVA, ki ji sledi Tukeyjev naknadni test. Podatki predstavljajo povprečje ± SEM trojnikov.
Spremenjeno mitohondrijsko delovanje, bioenergetska analiza je bila ovrednotena z uporabo Seahorse Bioanalyzerja. Kot smo že poročali [18], je LPS zmanjšal porabo kisika v primerjavi s kontrolami Veh v Veh-DC, kot je bilo pričakovano (slika 1E, modra do črna črta). Zanimivo je, da imajo rapa-M DC z ali brez LPS višji bazalni OCR (slika 1E, zelena do modra črta v času nič). Rapa-M-DC je pokazal neuspeh pri povečanju maksimalne dihalne zmogljivosti po injiciranju FCCP v nestimulirane celice, ki se je vzdrževala s stimulacijo LPS, kar dokazuje, da rapamicin zmanjša rezervno dihalno zmogljivost, kot smo prej poročali o delu s FTY-DC [18]. DC, obdelani z LPS, so imeli zmanjšano proizvodnjo ATP, merjeno z OCR (modra do črna) v primerjavi z Veh-DC. Rapa-M-DC je pokazal znatno večjo proizvodnjo ATP v primerjavi z Veh-DC v nestimuliranih in z LPS stimuliranih DC (slika 1F). Rapa-M-DC so pokazali povišane ravni mRNA za koaktivator receptorja gama 1-alfa (Pgc1a), aktiviran s peroksisomskim proliferatorjem, v primerjavi z Veh-DC (slika 1G) in gensko ekspresijo za Pgc1a in mitohondrijski transkripcijski faktor A (Tfam ) vzdrževali v Rapa-M-DC po stimulaciji LPS. Ti podatki kažejo, da je razmnoževanje BMDC v prisotnosti rapamicina povečalo vsebnost mitohondrijev, bazalni OCR in proizvodnjo ATP.
Preizkusiti, ali je rapamicin poleg povečanja števila in delovanja mitohondrijev povzročil tudi spremembo v DC kostimulatornih molekulah po testiranju LPS. Zanimivo je, da ima Rapa-M-DC po zdravljenju z LPS znatno nižjo raven izražanja kostimulatornih antigenskih predstavitvenih molekul (CD80, CD86 in CD40), MHCII in PDL1 v primerjavi z Veh-DC (slika 1H, modra proti rdeči). Zanimivo je, da so imeli Rapa-M-DC podobne ravni izražanja za PDL1 v primerjavi z Veh-DC, vendar so imeli znatno povečanje razmerja PDL1/CD86 po stimulaciji LPS v primerjavi z Veh-DC, zdravljenimi z LPS, kjer je PDL1/CD{{ 18}} zmanjšano (Veh/Veh 0.59 ± 0.03 v primerjavi z Veh/LPS 0.43 ± 0.{{33 }}02, p < 0.001="" in="" rapa/veh="" 0,56="" ±="" 0,001="" v="" primerjavi="" z="" rapa/lps="" 0,73="" ±="" 0,02,="" p="">< 0,05).="" med="" veh-="" in="" rapa-m-dc="" niso="" opazili="" nobenih="" pomembnih="" sprememb="" v="" izražanju="" cd11c,="" čeprav="" je="" imel="" rapa-m-dc="" nižji="" stranski="" razpršeni="" signal,="" ki="" kaže="" na="" manjšo="" velikost="" celic="" po="" stimulaciji="" lps="" (podatki="" niso="" prikazani).="" rapa="" m-dc="" so="" imeli="" višje="" relativne="" ravni="" mtdna/ndna="" v="" primerjavi="" z="" veh-dc="" (105,7="" ±="" 8,7="" proti="" 196,8,9="" ±="" 49,3),="" kar="" dokazuje,="" da="" zdravljenje="" z="" rapamicinom="" poveča="" število="" mitohondrijev="" dc.="" rapamicin="" je="" znatno="" zmanjšal="" gensko="" izražanje="" z="" lps="" induciranih="" il6,="" il10="" in="" tnfa="" ter="" koncentracije="" beljakovin="" tnf="" in="" il6,="" vendar="" je="" ohranil="" višje="" ravni="" il10="" v="" primerjavi="" z="" veh-dc,="" zdravljenim="" z="" lps="" (slika="" 1i–l).="" drugi="" geni,="" za="" katere="" je="" znano,="" da="" jih="" uravnava="" rapamicin="" (avtofagija="" ali="" vnetje),="" so="" navedeni="" v="" tabeli="" s2="" dodatnega="" materiala.="" geni="" po="" lps,="" označeni="" z="" zeleno,="" so="" bili="" regulirani="" navzdol="" in="" z="" rdečo="" so="" bili="" regulirani="" navzgor="" v="" primerjavi="" z="" ustreznim="" zdravljenjem="" z="">
Prenos Rapa-M-DC ščiti ledvice pred ishemično poškodboVse DC so bile aktivirane s 100 ng/mL LPS pred prenosom v vseh singenih študijah (C57BL/6 BMDC→C57BL/6 miši). Pol milijona DC je bilo vbrizganih 1 dan pred 26- min dvostranskoledvicaIRI. Shema zasnove študije (slika 2A). Kot kontrolo so miši injicirali 1 × PBS kot kontrole brez celic (NC). V primerjavi z mišmi, zdravljenimi z NC in Veh-DC, so miši, zdravljene z Rapa-M-DC, znatno zaščitileledvicezaradi poškodbe, kreatinin v plazmi (slika 2B); pri teh miših so opazili podobne spremembe v BUN [Sham 41,30 ± 3,4 proti NC 159,75 ± 3,2 proti Veh-DC 151,82 ± 1,5 proti Rapa-M-DC 114,68 ± 16,3; p < 0,05="" nc="" ali="" veh-dc="" v="" primerjavi="" z="" rapa-m-dc].="" morfološke="" spremembe="" (slika="" 2c,="" d)="" so="" bile="" vzporedne="" s="" funkcionalnimi="" študijami.="" miši,="" zdravljene="" z="" rapa-m-dc,="" imajo="">ledvicaRavni mRNA Kim1 [Veh DC 0.016 ± 0.009 proti Rapa-M-DC {{2{{23} }}}.001 ± 0.002], Ngal [Veh-DC 2,14 ± 1,2 proti Rapa-M-DC 0,12 ± 0,09] in Tnfa [Veh-DC 0,19 ± 0,15 proti Rapa-M-DC 0,0005 ± 0,0002] v primerjavi z mišmi, zdravljenimi z Veh-DC. V teh študijah in kot je bilo prikazano prej [6,7,17,18], imajo miši, zdravljene z Veh-DC v odmerku pol milijona, primerljive spremembe vdelovanje ledvicinledvicacitokinski profil. V študijah singenega prenosa so imele miši, zdravljene z Rapa-M-DC, zmanjšano apoptozo (terminalno deoksinukleotidil transferazo posredovano digoksigenin deoksiuridin nick-end označevanje [TUNEL]) v primerjavi z mišmi, zdravljenimi z Veh-DC (Veh-DC 3,8 ± 1,4 v primerjavi z Rapa- M-DC 1,1 ± 0.6; p < 0.05);="" reprezentativne="" slike="" iz="" analize="" tunel="" so="" prikazane="" na="" sliki="" s3="" dodatnega="" materiala.="" zanimivo="" je,="" da="" ni="" bilo="" pomembnih="" sprememb="" v="" številu="" infifiltriranih="" nevtrofilcev="" pri="" miših,="" zdravljenih="" z="" rapa-m-dc,="" v="" primerjavi="" z="" veh-dc="" (podatki="" niso="" prikazani),="" kar="" kaže,="" da="" miši,="" zdravljene="" z="" rapa-m-dc,="" morda="" nimajo="" sprememb="" v="" kemokinih,="" čeprav="" delovanje="" teh="" infifiltrirajočih="" prirojenih="" imunskih="" celic="" se="" lahko="">
Enkratno zdravljenje z rapamicinom (Rapa-S) inducira manj imunogene DC brez spreminjanja mitohondrijske dinamikeNato smo testirali, ali je eno samo zdravljenje z rapamicinom zadostovalo za indukcijo regulativnega fenotipa, zaradi česar je bila izvedljivost indukcije regulatornega fenotipa DC bolj klinično pomembna. WT DC smo izolirali in razmnoževali 8 dni v prisotnosti GMCSF, skupno tri zdravljenja. Sedem dni stare DC so bile obdelane z rapamicinom (10 ng/mL) pred obdelavo z 100 ng/mL LPS za inkubacijo čez noč in naslednji dan označene z MitoTracker CMXRos Rdeča (50 nM). V primerjavi z zdravljenjem z nosilcem zdravljenje z Rapa-S ne spremeni vsebnosti mitohondrijev v BMDC (slika 3A) z in brez LPS. Podobno ni bilo sprememb pri označevanju z MitoTracker Deep Red (100 nM) in MitoSox (5 µM) ter po nočni stimulaciji LPS v Rapa-S-DC v primerjavi z Veh-DC (Slika 3B,C). Polkvantifikacija histogramov MFI za vsa mitohondrijska barvila (slika 3D). Podobno pri analizi večkratnega zdravljenja so Veh- in Rapa-S-DC obarvali z uporabo JC{{20}}, da bi preverili, ali enkratno zdravljenje z rapamicinom spremeni potencial mitohondrijske membrane. Enkratno zdravljenje z rapamicinom ne spremeni izhodiščnega potenciala mitohondrijske membrane v primerjavi s kontrolnimi BMDC, zdravljenimi z vehiklom, kot je prikazano z imunoflfluorescenco (slika S2A dodatnega materiala) in pretočno citometrijo (Slika S2B, C dodatnega materiala). LPS je zmanjšal porabo kisika v primerjavi s kontrolami Veh v Veh-DC, kot je bilo pričakovano (slika 3E, modra do črna črta). Rapa-S-DCs niso imeli sprememb v bazalnem OCR (slika 3E, zelena do modra črta v času nič). Ko je bila proizvodnja ATP kvantificirana, je LPS zmanjšal proizvodnjo ATP, merjeno z OCR (modra do črna) v Veh-DC in Rapa-S-DC (slika 3F). Vendar pa so Rapa-S-DC-ji pokazali povišane ravni mRNA za Pgc1a v primerjavi s kontrolami Veh in te ravni so se ohranile v Rapa-S-DC-jih po LPS (slika 3G), pri ravneh transkripta Tfam pa so opazili malo ali nič sprememb. Nato smo testirali, ali je enkratno zdravljenje z rapamicinom povzročilo spremembo kostimulatornih molekul DC po LPS. Zanimivo je, da ima Rapa-S-DC po zdravljenju z LPS znatno nižjo raven izražanja kostimulatornih antigenskih predstavitvenih molekul (CD80, CD86 in CD40), MHCII, in PDL1 v primerjavi z Veh-DC (slika 3H). Rapa-S-DC so imeli podobno raven izražanja za PDL1 v primerjavi z Veh-DC in so imeli podobno pomembno zmanjšanje razmerja PDL1/CD86 po stimulaciji LPS v primerjavi z Veh-DC (Veh/Veh 0. 59 ± 0,03 v primerjavi z Veh/LPS 0,43 ± 0,002, p < 0,001="" in="" rapa-s/veh="" 0,69="" ±="" 0,02="" v="" primerjavi="" z="" rapa-s/lps="" 0,56="" ±="" 0,008,="" p="">< 0,05).="" enkratno="" zdravljenje="" z="" rapamicinom="" je="" pomembno="" zmanjšalo="" gensko="" izražanje="" lps-induciranih="" il6,="" il10="" in="" tnfa="" skupaj="" z="" nižjimi="" koncentracijami="" beljakovin="" il10="" z="" malo="" ali="" brez="" spremembe="" tnf="" in="" po="" zdravljenju="" z="" lps="" (slika="" 3i–l).="" drugi="" znani="" geni,="" ki="" naj="" bi="" jih="" reguliral="" rapamicin="" (avtofagija="" [beclin,="" atg7,="" atg9,="" lc3b="" in="" lamp2]="" ali="" vnetje="" [il1b,="" il12p40,="" tlr4,="" nos2,="" hif1a="" in="" ho1]),="" so="" bili="" le="" delno="" regulirani="" v="" primerjavi="" z="" nosilnimi="" dc="" po="" stimulaciji="" lps="" (dodatna="" materialna="" tabela="">
Prenos Rapa-S-DC ščiti ledvice pred ishemično poškodboVse DC so bile aktivirane s 100 ng/mL LPS ali obdelane z rapamicinom (10 ng/mL) pred prenosom v vseh singenih študijah (C57BL/6 BMDC→C57BL/6 miši). Pol milijona DC je bilo injiciranih 1 dan pred dvostranskimledvicaIRI. Shema zasnove študije (slika 4A). Kot kontrolo so miši injicirali 1 × PBS kot kontrole brez celic (NC). V primerjavi z mišmi, zdravljenimi z Veh-DC, so miši, zdravljene z Rapa-S-DC, znatno zaščitileledvicezaradi poškodbe kreatinina v plazmi (slika 4B); pri teh miših so opazili podobne spremembe v BUN [Veh-DC 151,82 ± 1,5 proti Rapa-S-DC 139,53 ± 3,8]. Morfološke spremembe (slika 4C, D) so bile vzporedne s funkcionalnimi študijami. Miši, zdravljene z Rapa-S-DC, imajo nižjeledvicaRavni mRNA Kim1 [Veh-DC 0.016 ± 0.{{10}}{{20}}9 v primerjavi z Rapo -S-DC 0.004 ± 0,002], Ngal [Veh DC 2,14 ± 1,2 proti Rapa-S-DC 0,14 ± 0,008] in Tnfa [Veh-DC 0,196 ± 0,15 proti Rapa-S-DC 0,0017 ± 0,001] v primerjavi z mišmi, zdravljenimi z Veh-DC.
Alogenski BMDC prenos Rapa-M-DC ali Rapa-S-DC enako ščiti ledvice pred ishemično poškodboPol milijona DC je bilo injiciranih 1 dan pred dvostranskimledvicaIRI za študije alogenskega (BALB/C BMDC→C57BL/6) prenosa. Shema zasnove študije (slika 5A). Kot kontrolo so miši injicirali 1x PBS kot kontrole brez celic (NC). V primerjavi z mišmi, zdravljenimi z Veh-DC, so miši, zdravljene z Rapa-M-DC ali Rapa-S-DC, znatno zaščitileledvicezaradi poškodbe (slika 5B). Morfološke spremembe (slika 5C, D) so bile vzporedne s funkcionalnimi študijami. Miši, zdravljene z rapamicinom DC, imajo nižjeledvicaRavni mRNA Kim1 [Veh-DC 0.04 ± 0.{{10}}2 proti Rapa-M-DC 0. 005 ± 0.0{{30}}2 proti Rapa-S-DC 0.{{37} }05 ± 0.0002], Ngal [Veh-DC 0,57 ± 0,3 proti RapaM-DC 0,19 ± 0,11 proti Rapa- S-DC 0,05 ± 0,01] in Tnfa [Veh-DC 0,037 ± 0,02 proti Rapa-M-DC 0,007 ± 0,003 proti Rapa-S-DC 0,008 ± 0,005] v primerjavi z mišmi, zdravljenimi z Veh-DC. V študijah alogenskega prenosa so miši, zdravljene z Rapa-M-DC ali Rapa-S-DC, zmanjšale apoptozo TUNEL v primerjavi z mišmi, zdravljenimi z Veh-DC (Veh-DC 16,7 ± 8,2 v primerjavi z Rapa-M-DC 7,2 ± 2,5 v primerjavi z Rapa- S-DC 9,1 ± 0,1).
Eksogeni mitohondriji obremenjeni DC (Mito-DC) z višjo mitohondrijsko dinamiko in bolj imunogenim fenotipom po stimulaciji LPSWT DC smo izolirali in razmnoževali 8 dni v prisotnosti GMCSF, skupaj 3 zdravljenja. Sedem dni stare DC so bile čez noč obdelane s človeškimi eksogenimi mitohondriji (10 µg/mL). V primerjavi z obdelavo z nosilcem imajo DC Mito-DC, obdelani z mitohondriji, višje mitohondrije. Mitohondrije so izolirali iz človeške celične linije HEK293. BMDC so analizirali na prisotnost človeških mitohondrijev v mišjih WT DC z uporabo človeških mtDNA primerjev za NADH dehidrogenazo (ND). Relativna vsebnost človeške [mtDNA] v Veh-DC je bila {{10}}.26 ± 0.10 v primerjavi s 16,8 ± 0,59; p < 0,001,="" 63--kratno="" povečanje="" genomske="" dnk,="" izolirane="" iz="" bmdc.="" omejitev="" trenutnega="" testa="" je,="" da="" meri="" človeško="" ali="" mišjo="" mtdna="" glede="" na="" jedrno="" dna,="" majhna="" količina="" človeške="" mtdna,="" odkrite="" v="" veh-dc,="" pa="" je="" lahko="" posledica="" manjšega="" prekrivanja="" v="" zaporedju="" nd="" v="" testu="" pcr="" ali="" možnosti,="" ker="" smo="" kaže="" relativno="" izražanje="" glede="" na="" mišjo="" jedrno="" dna.="" da="" bi="" ugotovili,="" ali="" je="" večja="" vsebnost="" mitohondrijev="" spremenila="" tudi="" mitohondrijsko="" funkcijo,="" je="" bila="" opravljena="" bioenergetska="" analiza="" z="" uporabo="" seahorse="" bioanalyzerja.="" lps="" je="" zmanjšal="" porabo="" kisika="" v="" primerjavi="" s="" kontrolami="" veh="" v="" veh-dc,="" kot="" je="" bilo="" pričakovano="" (slika="" 6a,="" modra="" do="" črna="" črta).="" mito-dc="" imajo="" višji="" bazalni="" ocr="" (slika="" 6a,="" zelena="" do="" modra="" črta="" v="" času="" nič).="" po="" zdravljenju="" z="" odklopnikom="" fccp="" je="" mito-dc="" pokazal="" neuspeh="" pri="" povečanju="" maksimalne="" dihalne="" zmogljivosti="" v="" nestimuliranih="" celicah,="" ki="" se="" je="" vzdrževala="" s="" stimulacijo="" lps,="" kar="" dokazuje,="" da="" zdravljenje="" z="" izoliranimi="" mitohondriji="" zmanjša="" rezervno="" dihalno="" zmogljivost="" (verjetno="" zato,="" ker="" je="" že="" pri="" največjem="" ocr="" v="" bazalnem="" stanju).="" ko="" je="" bila="" proizvodnja="" atp="" kvantificirana,="" je="" lps="" zmanjšal="" proizvodnjo="" atp,="" merjeno="" z="" ocr="" (modra="" do="" črna)="" v="" veh-dc.="" mito-dc="" je="" pokazal="" znatno="" večjo="" bazalno="" proizvodnjo="" ocr="" in="" atp="" v="" primerjavi="" z="" veh-dc="" v="" dc-jih,="" stimuliranih="" z="" lps="" (slika="" 6b).="" mito-dc-ji="" so="" pokazali="" povišane="" ravni="" mrna="" za="" pgc1a="" in="" zanimivo="" znatno="" nižji="" tfam="" v="" primerjavi="" s="" kontrolami="" veh="" (slika="" 6c).="" razlike="" v="" pgc1a="" in="" tfam="" v="" teh="" nizih="" poskusov="" po="" stimulacijah="" lps="" v="" primerjavi="" s="" podatki="" na="" slikah="" 1="" in="" 3="" so="" verjetno="" posledica="" uporabe="" balb/c="" bmdc.="" v="" primerjavi="" s="" c57bl/6="" bmdc="" imajo="" dc="" iz="" balb/c="" pomembne="" spremembe="" v="" proizvodnji="" mitohondrijev="" in="" citokinov="" po="" stimulaciji="" [29,30].="" možnost,="" da="" smo="" zaradi="" teh="" sprememb="" v="" dc="" zgodovinsko="" gledano="" uporabljali="" daljši="" ishemični="" čas="" pri="" miših="" balb/c="" v="" primerjavi="" s="" c57bl/6,="" da="" bi="" imeli="">ledvicapoškodba [6,18]. Ti podatki kažejo, da prenos eksogenih zdravih mitohondrijev povzroči povečano vsebnost mitohondrijev, bazalno OCR in proizvodnjo ATP. To kaže na potencial za protivnetni fenotip v DC po zdravljenju z eksogenimi mitohondriji, kot je prikazano v naši prejšnji študiji [18]. Nato testiramo, ali so DC-ji, obdelani z eksogenimi mitohondriji, kar ima za posledico povečano število in delovanje mitohondrijev, povzročili tudi spremembo kostimulacijskih molekul DC po LPS. Zanimivo je, da ima Mito-DC s stimulacijo LPS in brez nje bistveno višje stopnje izražanja kostimulatornih predstavitvenih molekul antigenov (CD80, CD86 in CD40), MHCII in PDL1 v primerjavi z Veh-DC (slika 6D). Poleg tega so imeli Mito-DC višjo stopnjo izražanja za PDL1 v primerjavi z Veh-DC; vendar so imeli tudi povečanje razmerja PDL1/CD86 po stimulaciji LPS v primerjavi z Veh-DC, zdravljenimi z LPS (podatki niso prikazani). Mito-DC je znatno zmanjšal gensko izražanje Tnfa, ki ga povzroča LPS, vendar je imel večjo gensko izražanje Il6 in Il10 v primerjavi z Veh-DC in nižje koncentracije beljakovin TNF in IL10, vendar je ohranil višje ravni IL6 v primerjavi z Veh-DC, zdravljenim z LPS (slika 6E). –H). Drugi geni, za katere je znano, da jih regulirajo mitohondriji (avtofagija [Beclin, Atg7, Atg9, Lc3b in Lamp2] ali vnetje [Il1b, Il12p40, Tlr4, Nos2, Hif1a in Ho1]), so bili delno regulirani po stimulaciji LPS (tabela dodatnega materiala S3). Veh-DC in Mito-DC so bili zdravljeni z LPS 6 in 24 ur. Izmerjene so bile relativne spremembe mitohondrijskega kompleksa. Mito-DC, zdravljeni z LPS in brez njega, imajo znatno višje ravni beljakovin mitohondrijskih kompleksov IV, II in I ter bistveno nižje ravni kompleksov V in III v primerjavi z Veh-DC (slika 6I). Polkvantitativna analiza relativne beljakovinske ekspresije mitohondrijskih kompleksov glede na GAPDH (slika 6J). Pise celotne dolžine so na voljo kot dodatne slike (slike dodatnega materiala S4–S7).
Slika 6. DC, obremenjeni z mitohondriji (Mito-DC), imajo večjo mitohondrijsko funkcijo in imunogenost po stimulaciji LPS v primerjavi z Veh-DC. Sedem dni star Veh-DC in so bili inkubirani z 10 µg/mL mitohondrijev HEK293 en dan pred zdravljenjem z 100 ng/mL LPS dodatnih 24 ur ali pustili nestimulirano ( Veh). (A) 24 ur po dodatku mitohondrijev so bili DC zasejani v analizator Seahorse XF-24e, stimulirani z in brez LPS 24 ur, stopnja porabe kisika (OCR) pa je bila določena med zaporednimi zdravljenji z oligomicinom (1 ), FCCP (2) in antimicin A/rotenon (3). (B) Kvantifikacija bazalne proizvodnje OCR in ATP. (C) ravni mRNA Pgc1a in Tfam v Veh-DC in Mito-DC, zdravljenih s 100 ng/mL LPS ali nestimuliranih 24 ur. (D) Analiza ekspresije MHCII, kostimulatornih molekul (CD40/80/86) in PDL1 s pretočno citometrijo je bila določena s stimulacijo LPS in brez nje. (E) ELISA IL10, IL6 in TNF iz Veh-DC in Mito-DC, obdelanih s 100 ng/mL LPS 24 ur. (F–H) ravni mRNA Tnfa, Il6 in Il10 v Veh-DC in Mito-DC, zdravljenih s 100 ng/mL LPS ali nestimuliranih 24 ur. Podatki predstavljajo povprečje ± SEM, * p Manjše ali enako 0,05, ** p Manjše ali enako 0,01 in *** p Manjše ali enako 0,001, enosmerna ANOVA, ki ji sledi Tukeyjev naknadni test. Podatki predstavljajo povprečje ± SEM trojnikov.
Alogenski BMDC prenos Mito-DC ščitiLedvicezaradi ishemične poškodbe. Pol milijona DC je bilo injiciranih 1 dan pred obojestranskoledvicaIRI za študije alogenskega prenosa Mito-DC (BALB/C BMDC→C57BL/6 miši). Shema zasnove študije (slika 7A). Kot kontrolo so miši injicirali 1x PBS kot brezcelične (NC) kontrole. V primerjavi z mišmi, zdravljenimi z Veh-DC, so miši, zdravljene z Mito-DC, znatno zaščitileledvicezaradi poškodbe (slika 7B). Morfološke spremembe (slika 7C, D) so bile vzporedne s funkcionalnimi študijami. Miši, zdravljene z Mito-DC, imajo nižjeledvicaRavni mRNA Kim1 [Veh-DC 0.04 ± 0.02 proti Mito-DC 0.02 ± 0.01], Ngal [Veh-DC 0.57 ± 0.3 proti Mito-DC 0.39 ± {{29} }.20] in Tnfa [Veh-DC 0,037 ± 0,02 proti Mito-DC 0,0028 ± 0,0013] v primerjavi z mišmi, zdravljenimi z Veh-DC. V študijah alogenskega prenosa so miši, zdravljene z Mito-DC, zmanjšale apoptozo TUNEL v primerjavi z mišmi, zdravljenimi z Veh-DC (Veh-DC 16,7 ± 8,2 v primerjavi z Mito-DC 3,0 ± 1,2).
Razprava V trenutni študiji smo dokazali zaščito predledvicaIRI, ki ga povzroči posvojitveni prenos DC-jev, obdelanih z rapamicinom (enkrat ali večkrat), alternativno uravnava funkcijo DC, ki je odvisna od relativnih sprememb v dinamiki mitohondrijev. Tako enkratno kot večkratno zdravljenje z rapamicinom povzroči zmanjšane imunogene (nižje vrednosti citokinov in kostimulatornih molekul) DC. Prenos Rapa-M-DC ali Rapa-S-DC ščitiledvicezaradi ishemične reperfuzijske poškodbe, kar kaže na zmanjšano imunogeno stanje DC, modificiranih z rapamicinom, inducira zaščito. Poleg tega ščiti tudi prenos Veh-DC, ki je imel prehodno povečanje števila mitohondrijevledviceod IRI (slika 8A–D)). Iz teh študij lahko sklepamo, da je vbrizgavanje manj imunogenih DC osrednjega pomena za indukcijo zaščite pred IRI, procesa, ki ga je mogoče doseči s farmakološkim zdravljenjem (rapamicin) ali s prenosom zdravih eksogenih mitohondrijev. Kot smo že poročali [31] in potrdili v naših študijah RNAseq, na splošno ni jasnega tolerogenega podpisa, povezanega z rapamicinom moduliranimi DC. Čeprav DC-ji z rapamicinom kažejo nekatere pomembne spremembe v genih po stimulaciji LPS v primerjavi z DC-ji z vehikli, so bile te omejene na RapaM-DC z nižjo signalizacijo, posredovano s citokini, in proizvodnjo citokinov (signaliziranje TNF prek NF-kB in proizvodnja IFN), kar je kritično pri obeh prirojeni in adaptivni imunski odzivi. Kot smo že poročali in potrdili v naši študiji, je bilo signaliziranje IL-10 opredeljeno kot glavna pot, ki je bila drugačna pri DC, zdravljenih z rapamicinom, s FDR 5,87 × 10 4 (slika S1 dodatnega materiala), značilnega citokina tolerogenega podpisa v DC.
Zgodovinsko gledano so tolerogeni DC (Tol-DC) opredeljeni kot osebe z oslabljenim dozorevanjem ali pol nezrele z nizko izraženostjo kostimulacije (CD80, CD86, CD40) s povečano proizvodnjo IL10, ki jo spremlja nizko izločanje IL12 in IFN , nižjo sposobnost priprave celic T in potencial za indukcijo Treg po proinflamatorni stimulaciji [32,33]. Regulativne ali tolerogene DC je mogoče razlikovati in vitro z uporabo imunosupresivnih zdravil ali spojin, kot je FTY720 [18] ali rapamicin (trenutna študija), ali protivnetnih citokinov, kot je IL10 [34], ali z gensko modifikacijo.
Vloga dendritičnih celic pri akutni ledvični poškodbi (AKI)Čeprav je bil dosežen velik farmakološki napredek pri preprečevanju ali zdravljenju različnih poškodb, nobena ni na voljo za AKI, zato ostaja veliko breme za zdravje [35]. Poleg tega je uporaba nespecifičnih imunosupresivnih zdravil za preprečevanje ali zmanjšanje adaptivnih imunskih odzivov, ki jih povzroča zavrnitev alogenskega presadka ali avtoimunske bolezni, povezana z neželenimi stranskimi učinki. Tako je uporaba vrste imunskih celic, kot so DC, ki lahko ciljajo na prirojene in prilagodljive imunske odzive, prednost. Poleg tega so DC pomembne celice pri imunosti ali toleranci in zamisel o uporabi ex-vivo regulativnih ali toleriranih DC v celičnih terapijah raka, avtoimunskih motenj in presaditev je bila v fazi preiskave [36]. Farmakološke (FTY720 [18]) ali biološke strategije (gensko spremenjene) inducirajo regulativne ali tolerogene DC (Tol-DC) [37], ki so bodisi odporne na zorenje ali imajo nižje stopnje zorenja ali pa se alternativno aktivirajo, da na koncu izražajo nizke ravni MHC I ali MHC II in kostimulatorne molekule, kot so CD40, CD80 in CD86. Z uporabo transgenih miši CD11c-DTR smo predhodno objavili študije, ki so pokazale, da je izčrpavanje DC s toksinom davice znatno zaščitilo miškoledvicezaradi ishemične reperfuzijske poškodbe (IRI) [7, 38] in obratno se je od odmerka odvisno povečanje števila DC poslabšalopoškodba ledvic[7], kar nakazuje, da bi lahko DC igrali pomembno vlogo pri uravnavanju AKI. Omeniti velja, da pri AKI model AKI, ki se uporablja (kemoterapija z uporabo cisplatina ali ishemija), narekuje vlogo, ki jo imajo DC pri spreminjanju imunoloških odzivov. Pri AKI, povzročeni s cisplatinom, ablacija DC bodisi z uporabo transgenih miši bodisi z injekcijo liposomskega klodronata povzroči večjo poškodbo, saj je IL-10, proizveden iz DC v tem modelu, končno potreben za ublažitev nefrotoksične poškodbe [39,40].
Rapamicin: vnetje, imunske celice, ishemična reperfuzijska poškodba (IRI)Prej objavljene študije so pokazale zaščitno vlogo rapamicina pri modelih AKI z uporabo študij IRI, ki so vključevale uravnavanje infifiltracije in delovanja NKT celic, s čimer se je izboljšalopoškodba ledvic[41] so v tej študiji miši trikrat peroralno prejeli rapamicin 24 ur, 1 uro pred ishemijo in 12 ur po ishemiji. Kronično peroralno odmerjanje miši en dan prejledvicaIRI in vsak dan pozneje (do 7 dni) je povzročil višjepoškodba ledviczaradi zaviranjaledvičnaproliferacijo tubularnih celic 1 in 3 dni po ishemiji [42]. To je bilo očitno kot pri mišjem modelu enostranske ureteralne obstrukcije (UUO), kjer se je zdravljenje z rapamicinom izboljšaloledvicafifibrozo z neposrednim zaviranjem signalizacije mTOR v miofifibroblastih in intersticijskih makrofagih [43]. Te študije kažejo, da ima rapamicin lahko nasprotne učinke pri različnih akutnih in kroničnihledvicamodeli. Vendar pa so različne študije poročale o škodljivi vlogi rapamicina pri živalskih modelih IRI. Peroralno odmerjanje rapamicina (4 mg/dan) 7 dni pri jorkširskih prašičih je pri modelu okluzije koronarne arterije poslabšalo vazorelaksacijo, odvisno od endotelija, in povečalo nekrozo miokarda [44]. Vendar pa je pri miših akutno zdravljenje z rapamicinom (eno uro pred ishemijo, intraperitonealno injiciranje) povzročilo zaščito srca z uravnavanjem signalizacije JAK2-STAT3 za zaščito pred miokardnim infarktom [45]. Odvisno od poti (gavaža, subkutano ali intraperitonealno), odmerjanja (0.1–6 mg/kg/dan), časovnega razporeda (zgodnji ali zapozneli) [46] in vrste uporabljenega modela (srce [47] , jetra [48] ozledvica[41,49]), se je izkazalo, da rapamicin deluje zaščitno [47] ali ne [50].
Celična terapija in rapamicinRazmnoževanje mišjih BMDC ali človeških CD14 plus monocitov, za katere menimo, da so kronični, je povzročilo alternativni zaščitni ali regulativni fenotip v DC, ki je reguliral tako prirojene kot adaptivne imunske odzive. Pri smrtonosni bolezni presadka proti gostitelju so DC, ustvarjeni z rapamicinom, zmanjšali MHC II in kostimulatorne molekule, vendar so imeli večjo populacijo IL12, ki je nastajal po stimulaciji LPS. Ti Rapa-M-DC, ki proizvajajo IL12, so okrepili aloreaktivno apoptozo celic T, mehanizem, ki je vključeval IFN [51]. Podobno so CD14 plus monociti, razmnoženi v prisotnosti rapamicina, proizvedli tudi višje ravni IL12p70 skupaj z ravnmi IL27, ki so uravnavale delovanje NK celic, s čimer so spremenile alogenske T-celične odzive prek IFN [52]. notriledvica,prenos z rapamicinom zdravljenih Tregov je izrazito zavrl odziv T-celic, mieloidnih celic in miofibroblastov, kar je povzročilo izboljšanje akutnih in kroničnihbolezni ledvicv primerjavi z neposrednim zdravljenjem miši z rapamicinom [53]. Podobno se je izboljšal adaptivni prenos z rapamicinom obdelanih mieloidnih supresorskih celic (MDSC) v mišidelovanje ledvicz zmanjšanimi histološkimi poškodbami in infifiltracijo imunskih celic [54]. Te študije zagotavljajo dokaze, da se celična terapija, ki vključuje zdravljenje celic z rapamicinom pred injiciranjem, izogne neželenim stranskim učinkom, ki bi lahko bili povezani s sistemskim zdravljenjem z rapamicinom. Poleg tega smo preizkusili uporabo metformina ali spojin, kot je 5-aminoimidazol-4-karboksamid-1- -4- ribofuranozid (AICAR), da induciramo regulativni fenotip v mišjih DC, da preizkusimo njihovo vlogo pri spreminjanjuledvicaIRI. Tako kot strategija odmerjanja, uporabljena pri rapamicinu (Rapa-S-DC), smo BMDC zdravili z nizkimi odmerki metformina (1 mM) ali AICAR (1 mM) 7. dan skupaj z LPS. Dan prej smo sistemsko injicirali 0,5 x 106 metformin-DC ali AICAR-DCsledvicaIRI. Miši, zdravljene z metforminom-DC ali AICAR-DC, so bile znatno zaščitene v primerjavi z mišmi, zdravljenimi z NC ali Veh-DC (neobjavljena opažanja, laboratorij Bajwa). Tako bi bilo morda vredno preizkusiti več zdravil ali spojin, ki povzročajo presnovne spremembe ali aktivirajo pot AMPK, bodisi samostojno bodisi v kombinaciji. Treba je omeniti, da je treba uporabo več kombinacij zdravil ali spojin (metformin ali AICAR), ki bi potencialno dopolnjevale zaščitne učinke rapamicina, še raziskati pri ocenjevanju njihove uporabe pri BMDC. V rakavih celicah kombiniranje AICAR z rapamicinom poveča učinkovitost rapamicina za nadaljnje zaviranje mTORC2 za induciranje apoptoze [55]. V celicah T je bila preizkušena tudi kombinirana uporaba metformina in rapamicina kot možnega regulatorja presnovne kontrolne točke za vpliv na delovanje celic T [56]. Zato je treba te kombinirane terapevtske modalitete v prihodnosti preizkusiti s tolerogenimi ali regulativnimi BMDC kot potencialnimi neposrednimi ali posrednimi regulatorji presnovnih kontrolnih točk.
Rapamicin: Vloga mitohondrijev v dendritičnih celicah in makrofagihFunkcije DC in makrofagov uravnava mitohondrijska presnova. Makrofagi tipa 1 [57,58] in imunogeni DC (aktivacija, ki jo posreduje TLR) imajo presnovni prehod, pri katerem mitohondrijsko oksidativno fosforilacijo inhibira endogeno sintetiziran dušikov oksid (NO) in zavezanost visokim stopnjam aerobne glikolize [59]. Aktivacija DC ali makrofagov z več agonisti TLR (LPS ali CpG) vodi do hitrega povečanja glikolize, čemur sledi zmanjšanje OXPHOS in potenciala mitohondrijske membrane [59–61]. Določena vloga mitohondrijev je bila dokazana z DC, zdravljenimi in vitro z vitaminom D; ti DC so povečali OXPHOS, mitohondrijsko maso in proizvodnjo mROS [62], naša nedavna študija z uporabo FTY720 [18] je pokazala podobne spremembe v DC (višji OXPHOS in manjša imunogenost), dokazano je, da akutno zdravljenje z rapamicinom podaljša življenjsko dobo celic DC, ki je bil odvisen od ohranjanja mitohondrijske funkcije [10] z zaviranjem NO. V nasprotju s podaljšanjem življenjske dobe DC-jev so iste skupine tudi poročale, da akutna ali kratka izpostavljenost rapamicinu v DC-jih povzroči tudi močne aktivatorje antigen specifičnih celic CD8 plus T, s čimer se izboljša nadzor nad melanomom B16 kot cepljenje pri miših [63]. Akutno zdravljenje (90 min) DC-jev, pridobljenih iz človeških monocitov, z rapamicinom zavira imunostimulatorne molekule, ki jih povzroča LPS, in alostimulatorni potencial, ki je vključeval nezmožnost zdravljenega DCS-ja, da poveča signalizacijo NF-kB [64]. V makrofagih rapamicin zavira nastajanje IL1 in IL-18po stimulaciji LPS, proces, ki vključuje tudi zmanjšanje mitohondrijskih ROS (mtROS) z neposrednim zaviranjem poti NLRP3 inflammasoma-p38 MAPK-NF-kB [65]. DC (Rapa-DC), kondicionirani z rapamicinom, iz miši in ljudi se obnašajo drugače v primerjavi z mišjim Rapa-DC, človeški Rapa-DC so se izkazali za delno odporne na zorenje po proinflamatornih citokinih in kažejo heterogenost pri uravnavanju ekspanzije efektorskih T-celic in funkcija [66]. Veliko imunoregulacijskih lastnosti DC-jev, pridobljenih iz monocitov, pogojenih z rapamicinom, in njihovo vlogo pri presaditvi so elegantno pregledali Macedo et al. [67].
Naše trenutne ugotovitve kažejo, da imajo eno ali več DC, zdravljenih z rapamicinom, zmanjšan imunogeni in imunostimulatorni fenotip po stimulaciji LPS. Prenos teh DC-jev ščitiledviceod IRI. Rapamicin alternativno uravnava dinamiko mitohondrijev; le večkratno zdravljenje povzroči večje število mitohondrijev. Ti podatki kažejo, da mitohondrijska dinamika DC (višja vsebnost mitohondrijev) skupaj z manj imunogenim fenotipom, ki ga povzroča rapamicin, skupaj ščitiledvicezaradi kemične poškodbe. Čeprav je bolj zanimivo, naši podatki z eksogenimi mitohondriji, obdelanimi z DC, kažejo, da lahko višje število mitohondrijev premaga bolj imunogeno stanje DC po stimulaciji LPS, da tudi zaščitiledviceod IRI. Zanimivo bo potrditi, če višje število mitohondrijev v DC spremeni odzive celic T, DC lahko spremenijo imunski odziv, kot je pokazala naša prejšnja študija. Naši predhodni podatki kažejo, da v alogenskih študijah proliferacije celic T DC z višjim številom mitohondrijev zavirajo proliferacijo celic T CD4 v reakcijah mešanih limfocitov (MLR, podatki niso prikazani). Trenutno ni jasno, ali lahko DC z višjim številom mitohondrijev inducirajo odziv Treg, ki bi lahko pozitivno prispeval k zaščitiledviceod IRI. Te bodo v središču naših naslednjih študij.
Sklepi Če povzamemo, smo dokazali, da lahko BMDC regulirajopoškodba ledvicz mehanizmom, ki vključuje biogenezo mitohondrijev bodisi z večkratnim zdravljenjem z rapamicinom bodisi z eksogenim povečanjem števila mitohondrijev z uporabo eksogenih mitohondrijev. Sklepamo, da so regulativni DC (DC z višjim številom mitohondrijev) lahko koristni priledvicaIRI kot tudi pri drugih vnetnih stanjih, kot so presaditev in avtoimunske motnje za preprečevanje ali zdravljenje poškodb.
