Kontakt:jerry.he@wecistanche.com

Lin Bai|Gui-ying Shi|Ya-jun Yang|Wei Chen|Lian-feng Zhang|Chuan Qin

Cistanche deluje proti staranju

Povzetek

Ozadje: S časom povezano zmanjšanje regenerativne sposobnosti in homeostaze organov je glavna značilnoststaranje. Rehmannia glutinosa in Astragalus membranaceus se uporabljata kot tradicionalni kitajski zeliščni zdravili za izboljšanje imunosti in podaljšanje življenja. Vendar mehanizem, s katerim to zeliščno zdravilo upočasni staranje, ni znan. V tej študiji smo raziskali mehanizem delovanja zeliščučinek proti staranju.

Metode: Miši so bile 10 mesecev hranjene s hrano, dopolnjeno z R. glutinosa ali A. membranaceus; kontrolna skupina je bila hranjena s standardno dieto. Fenotipi so bili ovrednoteni z uporabo sistema ocenjevanja in analize preživetja. Odstotki fenotipov staranja hematopoetskih matičnih celic (HSC) so bili določeni z analizo razvrščanja celic, aktiviranih s fluorescenco. Delovanje in mehanizem HSC so analizirali s klonogenim testom in verižno reakcijo polimeraze v realnem času.

Rezultati: Theučinek proti staranjuR. glutinosa je posledica okrepljenega delovanja HSC. Miši, hranjene z R. glutinosa, so pokazale značilnosti upočasnjenegastaranjeprocesa, vključno z zmanjšanim staranjem in povečano stopnjo preživetja. Analiza s pretočno citometrijo je pokazala zmanjšano število celic Lin–Sca1 plus c-kit– (LSK), dolgotrajnih HSC (LT-HSC) in kratkoročnih HSC (ST-HSC) v skupini R. glutinosa. In vitro so klonogeni testi pokazali povečano sposobnost samoobnavljanja LT-HSC iz skupine R. glutinosa kot tudi vzdrževanje mirovanja LSK s povečano ekspresijo p18. Skupina R. glutinosa je prav tako pokazala zmanjšane ravni reaktivnih kisikovih vrst in odstotek ‐gal plus celic z znižano regulacijo proteina p53 in p16, povezanega s celičnim staranjem.

Zaključek: Rehmannia glutinosa delujeproti staranjuučinke z ohranjanjem mirovanja in zmanjšanjem staranja HSC.

KLJUČNE BESEDE: proti staranju, hematopoetske matične celice, mirovanje, Rehmannia glutinosa

1|UVOD

Staranje je opredeljeno kot od časa odvisno funkcionalno poslabšanje, ki prizadene večino živih organizmov.1 Dolgoživost organizmov v glavnem ohranjajo matične celice.2 Tkivno specifične matične celice imajo sposobnost samoobnavljanja in se diferencirajo v različne efektorske celice. 3 Vendar pa med procesom staranja ta sposobnost samoobnavljanja upada, kar sčasoma privede do kopičenja nepopravljenih, poškodovanih tkiv v starajočih se organizmih. V hematopoetskem sistemu so hematopoetske matične celice (HSC) odgovorne za proizvodnjo krvnih celic. Pri starih miših hematopoetski sistem kaže okvaro T- in B-limfoidnih celic, število mieloidnih celic pa se poveča. Starejši HSC so pokazali zmanjšano aktivnost samoobnavljanja in zmanjšano sposobnost rekonstrukcije hematopoeze. Predvsem s starostjo povezane spremembe v predelu HSC se kažejo pri starajočem se gostitelju kot anemija, povečana nagnjenost k mieloproliferativnim novotvorbam, zmanjšano delovanje imunskega sistema in povečana incidenca raka.7-9 Vendar mehanizem staranja HSC in učinki zeliščnih zdravil na staranje HSC niso znani.10

Ljudje se že od antičnih časov ukvarjajo z upočasnitvijo procesa staranja in ohranjanjem mladostiproti staranjuje trenutno središče raziskav. Tradicionalna kitajska medicina je deležna vse večje pozornosti pri zdravljenju različnih bolezni, povezanih s staranjem. Znano je, da mnoga zelišča, ki se uporabljajo v tradicionalni kitajski medicini, z različnimi mehanizmi pozitivno vplivajo na staranje. Rehmannia glutinosa in Astragalus membranaceus se na ta način pogosto uporabljata že tisočletja.

Rehmannia glutinosa se uporablja za zdravljenje različnih sladkornih bolezni, pospešuje presnovo kosti pri osteoporozi ter zavira vnetje jeter in fibrozo. Poleg tega ima to zelišče druge učinke, vključno zproti utrujenosti, antidepresivne in nevroprotektivne lastnosti. V zadnjih nekaj letih so se farmakološke študije bakterije R. glutinosa in njenih aktivnih sestavin osredotočale predvsem na njeno široko delovanje na krvni, endokrini, kardiovaskularni in živčni sistem.11-14 Tako se je pokazalo, da ima R. glutinosa močan imunski ‐izboljševalna dejavnost, ki je dala teoretično osnovo za nadaljnje študije.

Astragalus membranaceus ima tonične, hepatoprotektivne, diuretične in izkašljevalne lastnosti15 in dokazano deluje imunomodulatorno,16protivnetno,inantioksidantučinki.17 Razjasnitev molekularnih mehanizmov, na katerih temeljijo učinki tradicionalnih kitajskih zdravil v klinični praksi, je ključni korak k njihovi svetovni uporabi in ta tema je trenutno predmet intenzivnega raziskovalnega zanimanja.

Tako smo v tej študiji 10 mesecev hranili miši s hrano, dopolnjeno z R. glutinosa in A. membranaceus, da bi raziskali mehanizem, na katerem temelji sposobnost R. glutinosa, da podaljša življenjsko dobo.

2|MATERIALI IN METODE

2.1|Razvrščanje živali v skupine in zdravljenje

Samice miši C57BL/6J so vzdrževali v okolju brez patogenov in hranili s standardno dieto. Uporabo živali v tej študiji so odobrili odbori za nego in uporabo živali Inštituta za laboratorijsko živalsko znanost medicinske fakultete Peking Union. Miši (stare 10 mesecev) so bile naključno razdeljene v tri skupine (n=20/skupino). Kontrolna skupina je bila hranjena s standardno dieto (Beijing HFK Biosicence, Peking, Kitajska). Prehrani drugih dveh skupin sta bili dopolnjeni z zmletim R. glutinosa in A. membranaceus (Beijing Tong Ren Tang Chinese Medicine, Peking, Kitajska) v odmerku 200 mg/d 10 mesecev. Ta odmerek je bil izbran z uporabo metode normalizacije telesne površine za potrditev odmerkov zdravila iz študij na ljudeh v študije na miših. Telesno težo so določali vsaka 2 meseca in dnevno beležili preživetje.

2.2|Ocena stopnje staranja

Za ovrednotenje stopnje staranja v skladu z merili, ki so jih opredelili Takeda et al.18, je bil sprejet sistem ocenjevanja točk. Vsaka kategorija, navedena v protokolu, je bila izbrana med kliničnimi znaki, povezanimi s procesom staranja. Vsaka miška je bila ocenjena pri starosti 18 mesecev in rezultati v vsaki kategoriji so bili sešteti, da se določi skupni rezultat ocenjevanja.

2,3|Pretočna citometrija

Celice smo pobrali iz timusa, vranice, periferne krvi (PB) in kostnega mozga (BM). Vranico in timus smo takoj izrezali, sprali s fiziološko raztopino in stehtali. Vranice in timuse smo nežno homogenizirali v steklenem homogenizatorju in celice suspendirali v sterilni fiziološki raztopini s fosfatnim pufrom (PBS). Celice iz PB so bile uporabljene za lizo rdečih krvničk (BD Biosciences, San Jose, CA, ZDA). Celice iz BM smo izolirali z izpiranjem obeh golenic in stegnenic s sterilnim PBS. Vse celice so bile izolirane s filtracijo preko sterilne najlonske mreže in obarvane 30 minut pri 4 stopinjah z naslednjimi protitelesi, konjugiranimi s fluoroforjem: protitelesi, konjugiranimi s fikoeritrinom (PE), anti-CD3 (G4.18), anti-CD3, konjugiranimi z alofikocianinom (APC). ‐ CD4 (OX35) in PE-Cy7-konjugiran anti-CD8a (OX8). Za celice BM so bili markerji linije obarvani z biotinom konjugiranim protimišjim CD4 (RM4-5), CD5 (53-7,3), CD8a (53-6,7), CD11b (M1/70), B220 (RA3-6B2), TER119 (TER‐ 119) in Gr1 (RB6‐8C5), čemur je sledilo barvanje s protitelesom APC‐eFluor 780-konjugiranim streptavidinom, smo prav tako pridobili pri eBioscience (San Diego, CA, ZDA). Za površinsko barvanje smo uporabili naslednja protitelesa: APC imunoglobulin (Ig)M (II/41), fluorescein izotiocianat (FITC) IgD (11-26), PE-Cy7 Sca-1 (D7), PE Flt3 ( A2F10), FITC B220 (RA3-6B2), FITC CD34 (RAM34), PerCP-Cy5.5 CD127 (A7R34), PE CD16/CD32 (93) in PerCP-Cy5.5 CD3e (145-2C11). Vsa protitelesa so bila pridobljena iz eBiosciences (San Diego, CA, ZDA). Podatke je pridobil FACS

Aria II (Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, ZDA) in analizirano s programsko opremo FlowJo (Three Star, Ashland, OR, ZDA).

2,4|Analiza celičnega cikla

Za analizo celičnega cikla so bile celotne celice BM obarvane na površinske markerje matičnih celic (Lin–Sca‐1 plus c‐KitHigh; LSTKs), nato fiksirane in permeabilizirane (00‐5123‐43; Becton Dickinson ) pred barvanjem s FITC Ki‐

67 protiteles in 7-aminoaktinomicin D (7-AAD). Zajem podatkov je bil izveden na FACS Aria II (Becton Dickinson). Podatki so bili analizirani s programsko opremo FlowJo.

2,5|S staranjem povezano galsko obarvanje

Aktivnost, povezana s staranjem (SA)-gal, je bila prav tako testirana s pretočno citometrijo z uporabo C12FDG, kot je opisal proizvajalec (Molecular Probes, Eugene, Oregon, ZDA). Na kratko, izvorne celice so bile najprej obarvane za označevalce celične površine in nato inkubirane s 100 nmol L-1 bafilomicina A1 1 uro pri 37 stopinjah, da so inducirali lizosomsko alkalinizacijo. Po izpiranju s PBS so bile celice inkubirane z 2 mmol L-1 C12FDG 1-2 uri pri 37 stopinjah in nato analizirane z uporabo FACS Aria I (Becton Dickinson).

2,6|Določanje proizvodnje reaktivnih kisikovih spojin (ROS).

Celice smo inkubirali z dikloro-dihidro-fluorescein diacetatom (DCFH-DA; Beyotime, Šanghaj, Kitajska) pri 37 stopinjah 20 minut. DCFH-DA pasivno difundira v celice, kjer ga esteraze deacetilirajo, da nastane nefluorescenčni 2',7'-diklorofluorescein (DCFH). Količina oddane fluorescence je v korelaciji s količino ROS v celici. Podatki so bili pridobljeni na FACS Aria I (Becton Dickinson) in analizirani s programsko opremo FlowJo.

2,7|Analiza verižne reakcije s polimerazo (PCR) v realnem času

Celotno RNA smo ekstrahirali iz celic z uporabo reagenta TRIzol (Invitrogen, San Diego, CA, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca. Zanimivi geni so bili pomnoženi iz totalnih RNA, obdelanih z DNazo I, z uporabo M-MLV reverzne transkriptaze (Promega, Madison, WI, ZDA)

in poli-dT primerji. Primerji, uporabljeni za PCR, so bili naslednji: p21 (5′-TCCAGACATTCAGAGCCACA-3′ in 5′-CGAAGAGACAACGG-CACACT-3′, Tm=60 stopnja, 30 ciklov), p53 (5′-CATGAACCGCCGACC- TATC- 3′ in 5′‐TCCCGGAACATCTCGAGGC‐3′, Tm=62 stopinja , 35 ciklov), p16 (5′‐CGAACTCTTTCGGTCGTACCC‐3’ in 5′‐ CGAATCTGCACCGTAGTTGAGC‐3′, Tm=62 stopnja , 35 ciklov), p57 (5′‐ AGGAGCAGGACGAGAATCAA‐3′ in 5′‐ TTCTCCTGCGCAGTTCTC TT‐3’, Tm=61 stopnja , 30 ciklov), p19 (5′‐ATGGGTCGCAGGTTCTTGGT‐ 3’ in 5′‐GTAGTGGGGTCCTCGCAGTT‐3 ′, Tm=61 stopinj, 35 ciklov), p18 (5′‐GGGACCTAGAGCAACTTACT‐3′ in 5′‐TGACAGCAAAAC- CAGTTCCA‐3′, Tm=61 stopinj, 30 ciklov), gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza (5′‐GAGCGAGACCCCACTAACAT‐3′ in 5′‐TTCACACCCATCACAAACAT‐3′, Tm=60 stopnja, 25 ciklov). PCR v realnem času (RT) je bil izveden z uporabo SYBR Premix Ex Taq II (TaKaRa Shuzo, Kyoto, Japonska) na detekcijskem sistemu ABI StepOne™ (Applied Biosystems, Foster City, CA, ZDA).

2,8|Klonogeni testi

Dolgotrajne (LT)- HSC so bile razvrščene s fluorescenčno aktiviranim celičnim razvrščanjem (FACS) in nato gojene v celičnih ploščah s 96 vdolbinicami z uporabo medija na osnovi metilceluloze (HSC007; R&D Systems, Minneapolis, MN, ZDA) . Za vsak vzorec smo pripravili deset ponovitev vdolbinic. Uporabili smo ploščo s 96 vdolbinicami za celične kulture, tri celice na vdolbinico. Dva tedna po nasaditvi smo pod mikroskopom prešteli število in velikost kolonij.

2,9|Statistična analiza

Podatki so bili analizirani z enosmerno ANOVA z uporabo programske opreme Microsoft Excel (Microsoft, Redmond, WA, ZDA) in GraphPad Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA, ZDA). Podatki so bili predstavljeni kot povprečje ± SD. Šteje se, da P < 0.05="" kaže="" statistično="">

3|REZULTATI

3.1|R. glutinosa in A. membranaceus sta imela učinke proti staranju

Za potrditevučinki proti staranjuR. glutinosa in A. membranaceus smo raziskovali učinke jemanja kot prehranskega dopolnila (200 mg/d). Nato smo zabeležili telesno težo, stopnjo staranja in stopnjo preživetja miši. Telesna teža miši, ki so se hranile z R. glutinosa ali A. membranaceus, je bila normalna v primerjavi s tistimi v kontrolni skupini, čeprav je prišlo do zmanjšanja telesne teže skupine R. glutinosa in A. membranaceus po 20 mesecih (slika 1A). Analiza stopnje staranja je pokazala enakomerno in ireverzibilno zvišanje stopnje razvrščanja s starostjo v skupinah z R. glutinosa in A. membranaceus v primerjavi s tistim v kontrolni skupini, čeprav je bilo povečanje izrazitejše pri A. membranaceus skupino (slika 1B). Visok rezultat ocenjevanja je bil posledica zgodnejšega začetka izgube pasivnosti in reaktivnosti, izgube sijaja kože in povečane grobosti, izgube las, perioftalmičnih lezij, povečane lordokifoze hrbtenice in izrazitejšega povečanja njihove resnosti.18 Miši v A skupina miši membranaceus je pokazala bolj izrazite značilnosti fenotipa staranja, vključno z izgubo sijaja kože in izpadanjem las. Krivulje preživetja so pokazale, da je bila življenjska doba miši v skupinah R. glutinosa in A. membranaceus nekoliko daljša kot v kontrolni skupini (slika 1C). Ti podatki so potrdiliučinki proti staranjuR. glutinosa in A. membranaceus, čeprav je bilo ugotovljeno, da je R. glutinosa učinkovitejša pri upočasnjevanju procesa staranja.

SLIKA 1 Rehmannia glutinosa in Astragalus membranaceus sta imelaučinki proti staranju. Miši so bile hranjene s hrano, dopolnjeno z zmletim R. glutinosa ali A. membranaceus (200 mg/d); kontrolna skupina je bila hranjena s standardno dieto. A, Spremembe telesne teže miši, merjene vsaka 2 meseca. B, Spremembe ocene staranja miši s starostjo. C, Krivulje preživetja. Podatki predstavljajo povprečje ± SD; n=20 miši/skupino. Podatki predstavljajo povprečje ± SD; n=5 miši/skupino.*P < 0,05,="" ***p=""><>

3.2|R. glutinosa je zmanjšala število hematopoetskih izvornih celic

Izčrpanost matičnih celic naj bi bila integrativna posledica več vrst poškodb, povezanih s staranjem, in eden glavnih vzrokov za staranje tkiv in organizma.1 Nedavne študije kažejo, da lahko pomlajevanje matičnih celic obrne fenotip staranja na ravni organizma.5 Mi domneval, daučinki proti staranjubakterije R. glutinosa so posredovane s krepitvijo delovanja matičnih celic. Zato smo izvedli pretočno citometrično analizo števila hematopoetskih matičnih/progenitornih celic, izoliranih iz miši (starih 20 mesecev), ki so bile 10 mesecev hranjene s hrano, dopolnjeno z R. glutinosa ali A. membranaceus (200 mg/dan) (slika 2A). . Odstotek LSK je bil zmanjšan v skupinah R. glutinosa in A. membranaceus (slika 2B). Število LT- in kratkotrajnih (ST)- HSC je bilo zmanjšano za približno dvakrat v skupini z R. glutinosa v primerjavi s številom v kontrolni skupini (slika 2C-D). V skupini R. glutinosa so odkrili večje število običajnih limfoidnih potomcev (CLP) v primerjavi s številom v kontrolni skupini (slika 2I). Ni bilo razlik v številu multipotentnih progenitorjev (MPP), skupnih mieloidnih progenitorjev (CMP), granulocitno-makrofagnih progenitorjev (GMP) in megakariocitno-eritroidnih progenitorjev (MEP) v skupini R. glutinosa v primerjavi s številom v skupini R. glutinosa. kontrolna skupina. V skupini z A. membranaceus ni bilo pomembne razlike v številu LT- in ST-HSC v primerjavi s številom v kontrolni skupini (slika 2C-D). Poleg tega ni bilo razlike v številu celic MPP, CMP, MEP in CLP v primerjavi s številom v kontrolni skupini (slika 2E, 2F, 2H in 2I); vendar se je število GMP zmanjšalo v skupini A. membranaceus. Tako so miši, hranjene s hrano, dopolnjeno z R. glutinosa, pokazale zmanjšano število hematopoetskih matičnih in matičnih celic.

3.3|R. glutinosa je okrepila delovanje in ohranila mirovanje HSC

Za ovrednotenje delovanja HSC je bil in vitro raziskan klonogenski potencial LT-HSC. Celice LT-HSC smo razvrstili v medij na osnovi metilceluloze z uporabo FACS in po 14 dneh prešteli število in velikost kolonij. V primerjavi s številom in velikostjo kolonij, ki so jih proizvedle celice miši v kontrolni skupini, so celice miši v skupini R. glutinosa pokazale povečanje števila kolonij, zlasti pri majhni velikosti (P ​​= 0.0241 ) in velikega klona (P=0.0418), medtem ko pri miših v skupini A. membranaceus ni bilo razlike v številu (slika 3). Povečana velikost in število kolonij v skupini R. glutinosa nakazujeta, da ta rastlina povečuje potencial samoobnavljanja LT-HSC.

Večina HSC pri odraslih miših ostane v mirovanju;19 zato je vzdrževanje celičnega mirovanja bistven mehanizem za samoobnovo matičnih celic.20,21 Opaženo zmanjšanje HSC kaže na zmanjšano celično proliferacijo v R. glutinosa in A. membranaceus skupine; zato smo pregledali status celičnega cikla HSC z analizo proliferativnega celičnega markerja Ki-67 v kombinaciji z določitvijo vsebnosti DNA 7-AAD v populaciji LSK. Opazili smo povečano število celic LSK v fazi G0 v skupinah R. glutinosa in A. membranaceus v primerjavi s tistim v kontrolni skupini (slika 4A). Ti rezultati so pokazali, da R. glutinosa in A. membranaceus vzdržujeta mirovanje HSC.

Analiza PCR v realnem času regulatorjev celičnega cikla v celicah LSK je pokazala, da imajo p18, p19 in p57 ključno vlogo pri vzdrževanju mirovanja HSC.22-24 Za p57 in p19 ni bilo očitnih sprememb (slika 4C- D), in p18 je bil povečan v skupini R. glutinosa v primerjavi s tistim v kontrolni skupini in rahlo povečan v skupini A. membranaceus (slika 4B).

SLIKA 2 Rehmannia glutinosa in Astragalus membranaceus sta vplivala na število hematopoetskih matičnih/progenitornih celic. Miši (stare

20 meseca) so 10 mesecev hranili s hrano, dopolnjeno z R. glutinosa ali A. membranaceus (200 mg/dan) (n=5/skupino); kontrolna skupina je bila hranjena s standardno dieto. Sveže izolirane celice kostnega mozga (BM) smo obarvali z navedenimi protitelesi in analizirali s pretočno citometrijo. A, Reprezentativni profili obarvanja BM hematopoetskih matičnih celic in populacij matičnih celic. B, Odstotek Lin–Sca1 plus c-kit– celic (LSK) v celicah BM. C-I, Število celic (C) dolgoročno (LT; Lin–, Sca-1 plus, c-Kit, CD34 plus –, Flt3–); D, kratkoročni (ST; Lin–, Sca‐ 1 plus, c‐ Kit, CD34 plus plus, Flt3–); E, multipotentni progenitor (MPP; Lin–, Sca‐1 plus, c‐Kit plus, Flt3 plus); F, skupni mieloidni prednik (CMP; Lin–, Sca‐ 1–, c‐ Kit–, CD34 plus, CD16/ CD32–); G, granulocitno-makrofagni progenitor (GMP; Lin–, Sca‐1–, c‐Kit–, CD34 plus, CD16/CD32 plus); H, megakariocitno-eritroidni prednik (MEP; Lin–, Sca‐ 1–, c‐ Kit–, CD34–, CD16/CD32–); in I, skupni limfoidni prednik (CLP; Lin–, Sca‐1low, c‐Kitlow, CD127 plus). Podatki predstavljajo povprečje ± SD; n=5 miši/skupino. *P <0,05, **p=""><>

3,4|R. glutinosa je odložil staranje HSC

Dolgoročno prehransko dopolnilo z R. glutinosa lahko podaljša življenjsko dobo miši. Celično staranje se s starostjo povečuje; zato smo raziskali staranje HSC pri starajočih se miših s pretočno citometrično analizo SA--gal obarvanih HSC-jev z uporabo fluorescenčnega -gal substrata (C12FDG).25 Odstotek SA--gal-pozitivnih celic se je zmanjšal v skupino R. glutinosa, kar kaže, da R. glutinosa zadržuje staranje celic LSK (slika 5A).

Reaktivne kisikove vrste igrajo pomembno vlogo pri staranju HSC, izguba mirovanja HSC pa je pogosto povezana s povečanim celičnim ROS.26 Analiza znotrajceličnih ROS v LSK je pokazala, da so bile ravni v skupini R. glutinosa znižane v primerjavi s tistimi v kontrolni skupini. skupino (slika 5B). Ti podatki so pokazali, da lahko R. glutinosa vzdržuje mirovanje HSC in izboljša delovanje HSC z znižanjem ravni ROS.

Nato smo raziskali izražanje več genov, vključenih v celično staranje, z RT-PCR analizo celic LSK. V primerjavi

SLIKA 3 Delovanje hematopoetskih matičnih celic, okrepljeno s prehranskim dodatkom Rehmannia glutinosa. Klonogeni potencial dolgotrajnih jetrnih zvezdastih celic in vitro miši (n=3)

s kontrolno skupino je bila ekspresija proteinov p53 in p16, povezanih s celičnim staranjem, znižana v skupini R. glutinosa (slika 5D-E). Toda ekspresija p53 in p16 ni bila bistveno zmanjšana med skupino A. membranaceus in kontrolno skupino (slika 5D-E). Ti podatki skupaj kažejo, da več ključnih genov, povezanih s celičnim ciklom in staranjem celic, uravnava delovanje HSC pri miših, hranjenih s hrano, dopolnjeno z R. glutinosa.

3,5|R. glutinosa izboljša imunost B-celic

Limfociti B in T so pomembni za imunološke odzive. Limfociti T igrajo ključno vlogo pri celični imunosti in njeni regulaciji, medtem ko limfociti B sodelujejo predvsem pri humoralni imunosti. Proliferacija limfocitov je najbolj neposreden indeks, ki odraža organsko imunost. Da bi raziskali vlogo pri imunološkem izboljšanju, so preučili učinke R. glutinosa in A. membranaceus na proliferacijo limfocitov.

Miši v skupini R. glutinosa so pokazale zmanjšano število HSC in povečano število CLP. Analiza pretočne citometrije je pokazala povečano število zrelih celic B (B220 plus) v PB, BM in vranici miši v skupini R. glutinosa v primerjavi s številom, odkritim v kontrolni skupini (slika 6A); vendar ni bilo bistvenih razlik v številu celic T (CD4 plus in CD8 plus), monocitov in granulocitov (CD11b plus) med obema skupinama (slika 6B-D). Tako ti rezultati kažejo, da dietna R. glutinosa poveča imunost B-celic.

SLIKA 4 Prehranska dopolnila Rehmannia glutinosa in Astragalus membranaceus so ohranila mirovanje krvotvornih matičnih celic. A, Odstotek celic v vsaki fazi celičnega cikla. Pretočna citometrična analiza 7-aminoaktinomicina D (7-AAD) in Ki-67 obarvanje Lin–Sca1 plus c-kit– celic (LSK). B, Analiza verižne reakcije s polimerazo v realnem času razvrščene genske ekspresije celic LSK; Za normalizacijo je bil uporabljen GAPDH. Podatki predstavljajo povprečje ± SD treh poskusov. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p=""><>

SLIKA 5 Dodatek Rehmannia glutinosa v prehrani je zmanjšal staranje jetrnih zvezdastih celic (HSC). Miši (stare 20 meseca) so bile 10 mesecev hranjene s hrano, dopolnjeno z Rehmannia glutinosa ali Astragalus membranaceus (200 mg/dan) (n {{4 }}/skupina); kontrolna skupina je bila hranjena s standardno dieto. A, Pretočna citometrična analiza SA--gal-pozitivnih celic Lin–Sca1 plus c-kit– (LSK) z uporabo substrata fluorescentne galaktozidaze (C12FDG). B, Odstotek celic, pozitivnih na reaktivne kisikove vrste (ROS) v LSK. Pretočna citometrična analiza ROS-pozitivnih LSK. Podatki predstavljajo povprečje ± standardni odklon (SD). *P < 0.05,="" ***p="">< 0,001.="" c,="" ekspresijski="" vzorec="" genov,="" povezanih="" s="" celičnim="" staranjem,="" v="" lsk;="" za="" normalizacijo="" je="" bil="" uporabljen="" gapdh.="" podatki="" predstavljajo="" povprečje="" ±="" sd="" treh="" poskusov.="" *p=""><0,05, **p=""><0,01, ***p=""><>

4|DISKUSIJA

V tej študiji smo raziskali mehanizemučinki proti staranjuR. glutinosa ali A. membranaceus z dopolnjevanjem prehrane miši z zelišči v odmerku 200 mg/dan 10 mesecev. Ugotovljeno je bilo, da R. glutinosa kaže učinke proti staranju, vključno z zmanjšanim staranjem in povečanim preživetjem HSC, kot tudi

povečana imunost B-celic. Kar zadeva mehanizem delovanjaučinki proti staranju, smo ugotovili, da je R. glutinosa zmanjšala število HSC, medtem ko se je zmogljivost proliferacije povečala. Poleg tega je R. glutinosa ohranjala mirovanje HSC in zmanjšala število SA--gal-pozitivnih celic in ravni ROS z regulacijo p18, p53 in p16. V kombinaciji so naši rezultati potrdili, da jeučinki proti staranjubakterije R. glutinosa pri miših zdravijo z vzdrževanjem mirovanja in izboljšanjem delovanja HSC.

Rehmannia glutinosa, ki se že tisočletja uporablja kot tradicionalno kitajsko zeliščno zdravilo, se lahko uporablja za zdravljenje hipoglikemije pri različnih diabetičnih motnjah.27,28 Poročali so tudi, da izvleček R. glutinosa izboljša presnovo kosti.29 Poleg tega, R. glutinosa zavira vnetne odzive in sindrome,30,31 in ščiti pred poškodbami celic z lovljenjem prostih radikalov.14,32 V tej študiji smo ugotovili, da prehransko dopolnilo z R. glutinosa pri miših delujeučinki proti staranjuin povečano imunost celic B s povečanjem proliferativne sposobnosti LT-HSC in zmanjšanjem števila SA--gal-pozitivnih celic in ravni ROS.

Ugotovljeno je bilo, da se stopnja oksidativne poškodbe s starostjo povečuje v različnih celicah in tkivih. Oksidativni stres je kritična determinanta samoobnove HSC. Izguba mirovanja LT-HSC je pogosto povezana s povečano celično ROS, ki je negativno povezana s samoobnavljanjem HSC.26 Catalpol je iridoidni glukozid, ki so ga našli v korenu R. glutinosa. Catalpol je v prejšnji študiji pokazal zaviranje oksidativnega stresa, poškodbe DNA in skrajšanje telomer preko poti PGC-1 /TERT.33 V naši študiji je bila raven ROS znižana v celicah LSK iz skupine R. glutinosa v primerjavi s kontrolno skupino. Tako R. glutinosa podaljša preživetje miši z zaviranjem oksidativnega stresa v HSC.

SLIKA 6 Pretočna citometrična analiza odstotka zrelih imunskih celic v periferni krvi (PB), kostnem mozgu (BM), vranici in timusu. Miši (stare 20 meseca) so bile 10 mesecev hranjene s hrano, dopolnjeno z Rehmannia glutinosa ali Astragalus membranaceus (200 mg/dan) (n=5/skupino); kontrolna skupina je bila hranjena s standardno dieto. A, Pretočna citometrična analiza odstotka celic B (B220 plus ) v PB, BM in vranici. B, Pretočna citometrična analiza odstotka monocitnih in granulocitnih celic (CD11b plus ) v PB in BM. C in D, Pretočna citometrična analiza odstotka celic CD4 plus in CD8 plus v PB, vranici in timusu. Podatki predstavljajo povprečje ± SD. *P <>

Astragalus membranaceus se uporablja tudi v tradicionalni kitajski medicini za krepitev imunosti, zniževanje krvnega sladkorja in spodbujanje apoptoze tumorskih celic, ima pa tudiantioksidacijainproti staranjulastnosti. V tej študiji smo ugotovili, da prehransko dopolnilo z A. memranaceus 10 mesecev ni imelo očitnih učinkov v primerjavi s tistimi, opaženimi pri kontrolnih miših, medtem ko se je teža miši zmanjšala po 20 mesecih. Zato je A. membranaceus morda neprimeren za zdravljenje LT pri hranjenih miših.

Na koncu naši rezultati kažejo, da R. glutinosa lahko podaljša življenjsko dobo miši z ohranjanjem mirovanja in izboljšanjem delovanja HSC. Poleg tega lahko R. glutinosa zmanjša medcelično raven ROS in število SA--gal-pozitivnih celic ter okrepi imunost B-celic.

ZAHVALA

To študijo so delno podprli Nacionalna znanstvena fundacija za Kitajsko (31672374), Inovacijski sklad za medicinske znanosti CAMS (CIFMS) (2016-12M-1-012) in PUMC Youth Fund (2017310018).

NASPROTJA INTERESOV

Noben.

AVTORSKI PRISPEVKI

Vsi navedeni avtorji izpolnjujejo pogoje za avtorstvo. CQ in LFZ sta zasnovala in oblikovala poskuse. LB je izvedel poskuse in napisal glavni preizkus rokopisa. GYS je izvedel in analiziral podatke FACS. YJY je zasnoval eksperiment o kitajski tradicionalni medicini. WC je upravljal miši. Vsi avtorji so prebrali in potrdili rokopis.