Sestavljanje De Novo transkriptoma na osnovi RNA-Seq in odkritje gena mesnatega stebla Cistanche Deserticola-Ⅱ

Funkcionalna klasifikacija vseh izraženih transkriptov na podlagi genske ontologije in podatkovnih baz KEGG

Opomba genske ontologije (GO) je bila pridobljena iz asociacijske datoteke z opombami in identitetami UniProt. Skupaj je bilo 20.907 transkriptov, kar predstavlja 32,69% vseh izraženih zaporedij, dodeljenih 1.745 funkcionalnim izrazom. Od skupnih funkcionalnih izrazov GO so dodelitve biološkemu procesu predstavljale večino (1.116, 63,95 %), sledili sta ji celična komponenta (329, 18,85 %) in molekularna funkcija (300, 17,20 %). Dodeljene funkcije izraženih transkriptov so zajemale širok spekter kategorij GO in prvih 10 izrazov GO z največ komentarji transkriptov je bilo navedenih v tabeli 3. Zagotavljamo porazdelitev vseh izraženih transkriptov v treh kategorijah genske ontologije (molekularna funkcija, celična komponenta in biološki proces) v dodatni datoteki (nabor podatkov S3). Izrazi GO, povezani z vezavnimi funkcijami in aktivnostjo transferaze, so bili pretežno zastopani v kategoriji molekularne funkcije. Glede na vezne funkcije je bila najpogostejša kationska vezava (4.394 transkriptov), ​​sledita ji vezava nukleotidov/nukleozidov (povprečno 3.404 transkriptov) in vezava na beljakovine (2.422 transkriptov). Medtem ko je v skupini s transferazno aktivnostjo največ tistih s prenašajočimi fosfor vsebujočimi skupinami (2.256 transkriptov, 65,77 %). Med kategorijo celične komponente so bili transkripti bolj znotrajcelični (povprečno 10.581 transkriptov), ​​medtem ko so bili med kategorijo bioloških procesov transkripti bolj vključeni v presnovni proces biopolimerov (povprečno 6.683 transkriptov), ​​sledila je regulacija celičnega procesa (4.841 transkriptov). ), izražanje genov (4.678 transkriptov) in transport (3.512 transkriptov).

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA PREPREČEVANJE ALZHEIMERJEVE BOLEZNI PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Za odkrivanje genov, vključenih v biosintezo lignina in PhG, je bilo preiskanih 21.358 neredundantnih potencialnih proteinskih zaporedij glede na genska zaporedja 13 rastlinskih organizmov v bazi podatkov KEGG in dodeljenih 275 potem KEGG z vsaj 5 zadetki. Prvih 10 poti z najbolj usklajenimi zaporedji je navedenih v tabeli 4. Večina poti je bila vključena v primarne presnovne procese, kot so presnova aminokislin ali beljakovin (ko01230, ko04141 in ko04120), presnova ogljikovih hidratov (ko01200 in ko00500) in nukleotidni oz. metabolizem nukleozidov (ko03018, ko00230 in ko00240). Poleg tega obstaja 27 sekundarnih poti, povezanih s presnovo (slika 2), kot so biosinteza terpenoidnega ogrodja, biosinteza fenilpropanoidov, biosinteza karotenoidov, biosinteza izokinolinskih alkaloidov ter biosinteza alkaloidov tropana, piperidina in piridina. Ti rezultati dodatno kažejo, da so v njem potekali aktivni presnovni procesiC. deserticolatkivo stebla. Vsi izraženi transkripti, povezani s potmi KEGG, so bili navedeni v dodatni datoteki (nabor podatkov S4). Čeprav obstaja nekaj bistveno spremenjenih poti med C. deserticola in drugimi rastlinami, kot je riž (nabor podatkov S5), je naš glavni cilj v tej študiji razkriti celoten profil transkriptoma stebla C. deserticola in prikazati povezane poti biosinteze PhG. kar bi lahko bilo koristno za usmerjanje gojenja.

Geni kandidati, ki kodirajo encime, vključene v biosintezo lignina

Lignin je drugi najpogostejši naravni kopenski polimer v rastlinskem kraljestvu, ki sestavlja do ene tretjine materiala v celičnih stenah rastlin. Kot pomembna sestavina celičnih sten lignini pomagajo pri transportu vode, zagotavljajo mehansko podporo in strukturno celovitost ter ščitijo pred patogeni in rastlinojedci. Te vloge lignina so zelo dragocene pri podpiranju podzemne pokončne rasti C. deserticola v puščavi. V tej študiji smo predstavili celotno sliko poti biosinteze lignina v C. deserticola (slika 3), v kateri se monomeri lignina biosintetizirajo iz fenilalanina skozi vrsto encimskih reakcij, vključno s hidroksilacijo, metilacijo, redukcijo in procesom oksidativne polimerizacije. Encimi, povezani z biosintezo lignina, so bili odkriti za tri večinoma sintetizirane oblike v žilnem tkivu (p-hidroksil-fenil (H), gvajacil (G) in siringil (S) lignin) in 5-hidroksil-gvajacil lignin, ki je bil le identificiran v rastlinah s pomanjkanjem COMT (kofeinska kislina 3-O-metiltransferaza, EC 2.1.1.68) (kot so knock-down).

Fenilalanin amonijačna liaza (PAL, EC 4.3.1.24) je prvi ključni encim v poti biosinteze lignina (slika 3), ki pretvori fenilalanin v cimetovo kislino z neoksidativno deaminacijo. Skupaj 6.297 odčitkov PAL je bilo sekvenciranih in 7 transkriptov PAL je bilo sestavljenih v C. deserticola (tabela 5). S primerjavo podobnosti zaporedij smo ugotovili, da imajo 4 od njih (komp28550_c1_seq1/2/3/5) več kot 95-odstotno podobnost z znanim zaporedjem mRNA C. deserticola (gi| 289595227|gb|ADD12041.1|), medtem ko sta imela comp28550_c1_seq4 in comp25940_c0_seq1 77 % oziroma 82 % podobnosti. Napoved ORF je pokazala, da ima 5 transkriptov potencial za kodiranje proteinov in prenaša z domeno liaze aromatičnih aminokislin (PF00221.14). Med njimi lahko samo transkript comp28550_c1_seq4 kodira celotno proteinsko zaporedje 718 aminokislinskih ostankov. Poročali so, da je bil PAL kodiran z majhno multigensko družino v večini rastlinskih vrst, kot so 4 pri Arabidopsis thaliana, 5 pri Populus trichocarpa, 3 pri Scutellaria baicalensis in 7 Cucumis sativus itd. Naša filogenetska analiza je pokazala, da obstajajo 4 Geni, ki kodirajo PAL, v C.

deserticola in smo jih poimenovali CdPAL1, CdPAL2, CdPAL3 in CdPAL4 (slika S2). 4-kumarat-CoA ligaza (4CL, EC 6.2.1.12) in trans-cinamat 4-monooksigenaza (CYP73A, EC 1.14.13.11) sta dva encima, odgovorna za pretvorbo cimetove kisline v dikumarol-CoA v dveh obratnih smereh. naročila. Prav tako so v hrbtenicah in njihove izrazne vrednosti FPKM so 39,57 oziroma 51,93.

Štiri vrste ligninov so bile biosintetizirane po različnih poteh, ki so jih nadzirali trije ključni encimi, cinamoil-CoA reduktaza (CCR, EC 1.2.1.44), šikimat o-hidroksicinamoiltransferaza (HCT, EC 2.3.1.133) in ferulat{{1{ {56}}}}hidroksilaza (F5H, EC 1.14.-.-). CCR je bil opisan kot kontrolna točka ligninske poti [50, 51], ki je katalizirala X-CoA (X vključno z dikumarolom, kafeoilom, feruloilom, 5-hidroksil-feruloilom in sinapoilom) v Y-aldehid (Y vključno s p -kugar, kafeoil, koniferil, 5-hidroksil-koniferil in snap), medtem ko je HCT kataliziral p-kumaroil-CoA v p-kumaroil šikimsko kislino/p-kumaroil kininsko kislino. Oba encima sta kot stikalo uravnavala biosintezo P-hidroksil-fenil ligninov oziroma ostalih treh tipov ligninov. F5H je bilo drugo razvejno stikalo, ki je reguliralo siringil lignin in 5-hidroksil-gvajacil lignin. Drugi pomembni encimi, vključno s 3-O-metiltransferazo kofeinske kisline (COMT, EC 2.1.1.68), kafeoil-CoA O-metiltransferazo (CCoAOMT, EC 2.1.1.104) in cinamil-alkohol dehidrogenazo (CAD, EC 1.1.1.195) ) so bile zaznane tudi izražene. Podrobne informacije o izražanju so navedene v tabeli 6. Ti encimski geni, identificirani v tej študiji, bodo zagotovili dragocen vir za funkcionalne genomske študije te pomembne zdravilne rastline. 10 genov, povezanih s potjo biosinteze ligninov v tabeli 6, je bilo izbranih za preverjanje RT-qPCR, da potrdi naše rezultate RNAseq (slika 4), njihove visoke korelacije (Pearsonov korelacijski koeficient: 0,90343) pa so pokazale visoko natančnost in ponovljivost naše analize transkriptoma. Podatkovni nabor S1 navaja sekvence primerjev, uporabljene v tej analizi.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA IZBOLJŠANJE SPOLNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Geni kandidati, ki kodirajo encime, vključene v biosintezo PhG

Znano je, da so feniletanoidni glikozidi (PhG) glavne aktivne sestavine v C. deserticola z aktivnostmi izboljšanja spolne moči, čiščenja prostih radikalov in zaviranja staranja. Tri kemične komponente PhG so organska kislina, saharid in feniletanol aglikon (slika 3). Organske kisline, vključno s kofeinsko kislino, ferulinsko kislino in kumalično kislino, so produkti poti biosinteze fenilpropanoida. Sestavine saharida, vključno z glukozo in ramnozo, so produkti presnovnih poti ogljikovih hidratov, kot so presnova škroba in saharoze, presnova amino sladkorja in nukleotidnega sladkorja, presnova fruktoze in manoze itd. Vendar pa pot biosinteze feniletanolnega dela še ni jasna. Tukaj smo predlagali dve možni poti biosinteze feniletanola na podlagi naših podatkov o zaporedju. Ena je poročana pot kofeinske kisline ali ferulinske kisline, znana tudi kot pot cimetove kisline, ki je podobna poti hrbtenice biosinteze lignina. Druga temelji na presnovni poti fenilalanina (slika 3), pri kateri je bil fenilalanin v feniletanol dosežen z znano 'Enrlichovo potjo', ki so jo prvič našli v kvasovkah pred enim stoletjem in potrdili v cvetovih petunije, paradižniku in vrtnici. V steblu C. deserticola so odkrili štiri encimske gene, ki kodirajo aspartat/tirozin aminotransferazo, histidin-fosfat aminotransferazo in primarno amino oksidazo, ki so odgovorni za pretvorbo fenilalanina v feniletanol. Produkt fenil etanola se lahko nadalje oksidira z monooksigenazo ali metilira z metiltransferazo v njegove derivate (fenil etanol aglikon), ki sodelujejo pri biosintezi PhG. Če povzamemo, sta bili predlagani dve domnevni poti biosinteze aglikona feniletanola zaC. deserticolavendar še vedno potrebujejo več študij.

Razprave

V zadnjih letih se je rastlinska genomika hitro razvila z uporabo tehnologije sekvenciranja naslednje generacije, medtem ko je bilo malo raziskav osredotočenih na genomiko puščavskih zdravilnih rastlin. Nujno je treba opraviti genomske ali transkriptomske raziskave, da bi razumeli njegovo prilagoditev na okolja s sušo in slanostjo ter pot biosinteze glavnih bioaktivnih komponent. De novo odkritje transkriptoma za nekatere zdravilne rastline,

kot so Panax ginseng, Ginkgo biloba in Glycyrrhiza uralensis, so bili prvič izkoriščeni s platformo Roche 454 zaradi njene dolge dolžine branja. Zaradi učinkovite zmožnosti sestavljanja s kratkimi branji, zlasti prednostnimi branji na koncu v paru, sta bila sekvenciranje in sestavljanje transkriptoma na osnovi Illumina v veliki meri uporabljena tudi za modelne in nemodelne organizme. V tej študiji smo ustvarili približno 8G od 101 bp seznanjenih končnih branj in izdelali daljša unigenska zaporedja s povprečno dolžino 725 bp. Obsežni podatki o transkriptomih, specifičnih za deblo, bi lahko zagotovili uporabne referenčne podatke in jih uporabili za rudarjenje sekundarne presnove bioaktivnih komponent C. deserticola. 81,62 % vseh neobdelanih odčitkov je prestalo stroge filtre kakovosti (vključno z obrezovanjem adapterja in zavračanjem nizkokakovostnih odčitkov) pred sestavljanjem, kar kaže na visoko kakovost naših podatkov o zaporedju, 82,08 % visokokakovostnih odčitkov pa je bilo uporabnih za sestavljanje. Drugi odčitki, ki jih ni bilo mogoče uporabiti za sestavljanje, so lahko posledica napak v zaporedju, parametrov sestavljanja itd. Ta neuporabljena visokokakovostna branja so ostala v pomoč pri izboljšanju sestavljanja de novo v kombinaciji z daljšimi branji z druge platforme (kot je Roche 454) v prihodnosti.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA IZBOLJŠANJE SPOLNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Veliko število sestavljenih transkriptov (30.098) je pokazalo veliko podobnosti zaporedij z znanimi geni v javnih zbirkah podatkov, kar kaže na to, da so naši podatki o seznanjenih koncih, ki temeljijo na Illumini, zajemali znaten del transkriptov C. deserticola. Transkripti brez zadetkov BLAST so lahko posledica 3' ali 5' neprevedenih regij, nekodirajoče RNA ali novih genskih zaporedij C. deserticola. Izraženi transkripti so bili označeni s številnimi kategorijami GO in potmi KEGG (tabeli 3 in 4), v katerih je bilo veliko transkriptov dodeljenih sekundarnim potem, povezanim s presnovo. Kot vemo, lahko fenilpropanoid deluje kot inducibilna protimikrobna spojina, ki je zelo koristna za podzemni življenjski slog [1] in deluje tudi kot signalna molekula v interakcijah med rastlino in mikrobom poleg svoje medicinske uporabnosti [68, 69]. Terpenoid se uporablja za biosintezo bioaktivnih komponent (kot je 6- deoksikatalpol) [70]. Ugotovili smo, da so geni, vključeni v biosintezo fenilpropanoidne in terpenoidne hrbtenice, v C. deserticola zelo bogati. Še pomembneje pa je, da je odkritje dobro predstavljenih poti biosinteze lignina (slika 3) pokazalo aktivni presnovni proces lignina v steblu C. deserticola. Ugotovljeno je bilo, da so vsi znani encimski geni, vključeni v biosintezo lignina (slika 3), izraženi, štirje ključni encimi, vključno s PAL, CCR, HCT in F5H, pa so imeli nižjo ekspresijo (FPKM 26,47, 3,89, 3,4 oziroma 3,83) v primerjavi z drugi encimski geni (tabela 6). Ne glede na to, ali bi lahko sprememba izražanja teh treh genov vplivala na proizvodnjo lignina v C. deserticola, je vredno nadaljnje študije. PAL je ključni encim v biosintezi lignina in je vključen tudi v biosintezo fenilpropanoida, resveratrola, flavonoida in kumarina [71–74]. Odkrili smo štiri različne gene PAL v genomu C. deserticola (S2 slika), kar je sovpadalo s tem, da je bil PAL kodiran z majhno multigensko družino [39, 43, 45–49], in dodatno dokazali, da lahko igra pomembno vlogo pri presnovnem pretoku ogljika .

PhG je primarna aktivna sestavina v C. deserticola. Geni, vključeni v biosintezo feniletanola, so pomembni za kakovost C. deserticola. Ugotovili smo dve različni poti biosinteze fenil etanola in 17 encimskih genov, vključenih v biosintezo PhG v steblu C. deserticola. Na podlagi strukturne formule intermediatov in katalitičnih lastnosti ustreznih encimov so bili prvič izpeljani tudi možni procesi po kofeinski/ferulinski kislini (slika 3), pri katerih bi se kofeinska/ferulna kislina najprej oksidirala v derivat fenilpiruvata; nato so karboksilno skupino odvzele dekarboksilaze; končno je bila aldehidna skupina pretvorjena nazaj v alkoholno skupino z dehidrogenazo. To je prva uporaba tehnologije sekvenciranja na seznanjenem koncu Illumina za raziskovanje celotnega transkriptoma C. deserticola in za sestavljanje odčitkov RNA-seq brez referenčnega genoma. Ta študija bo zagotovila uporabne vire in genske sekvence za funkcionalne raziskave genomike in proteomike na C. deserticola v prihodnosti.

Sklepi

V tej študiji smo profilirali transkriptom stebla C. deserticola na podlagi podatkov o visoko zmogljivem sekvenciranju, identificirali gene, ki sodelujejo pri biosinteznih poteh lignina, in tudi prvič sklepali na potencialno biosintezno pot PhG, kar bo zagotovo pospešilo razumevanje dvoumnih fizioloških procesov in velike medicinske vrednosti na molekularni ravni. Do zdaj je to prvi poskus de novo sestavljanja celotnega transkriptoma stebla C. deserticola in odkrivanja poti biosinteze zdravilnih komponent z uporabo podatkovnih nizov sekvenciranja, ki temeljijo na Illumini. Naša študija lahko spodbuja razvoj naravnih zdravil in izbiro kultivarjev z zdravilnimi lastnostmi.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA IZBOLJŠANJE SPOLNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%