Senescence ponovno poveže zaznavanje mikrookolja za spodbujanje protitumorske imunosti

POVZETEK

Celično staranje vključuje stabilno zaustavitev celičnega cikla skupaj s sekretornim programom, ki v nekaterih primerih stimulira imunski očistek starajočih se celic. Z uporabo imunsko kompetentnega modela raka jeter, pri katerem staranje sproži zavrnitev tumorja, posredovano s celicami CD8 T, smo pokazali, da staranje tudi preoblikuje proteom celične površine, da spremeni, kako tumorske celice zaznavajo okoljske dejavnike, kot je prikazano z interferonom tipa II (IFN). V primerjavi s proliferirajočimi celicami starajoče se celice povečajo uravnavanje receptorja IFN, postanejo preobčutljive za mikrookoljski IFN in močneje inducirajo učinke mehanizma za predstavitev antigena, ki so povzeti tudi v človeških tumorskih celicah, ki so podvržene staranju, povzročenem s terapijo. Motnje zaznavanja IFN v starajočih se celicah zmanjšajo njihovo imunsko posredovano očistek, ne da bi onemogočile stanje staranja ali njegov značilni sekretorni program. Naši rezultati kažejo, da imajo starajoče se celice izboljšano sposobnost pošiljanja in sprejemanja okoljskih signalov in nakazujejo, da je vsak proces potreben za njihov učinkovit imunski nadzor.

rastlina cistanche krepi imunski sistem

Kliknite tukaj za ogled izdelkov Cistanche Enhance Imunity

【Vprašajte za več】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com/Whats App: 0086 18599088692/Wechat: 18599088692

POMEMBNOST:

Naše delo razkriva medsebojno delovanje med preoblikovanjem tkiv in programi za zaznavanje tkiv, ki jih je mogoče vključiti s staranjem pri napredovalih oblikah raka, da postanejo tumorske celice bolj vidne prilagodljivemu imunskemu sistemu. Ta novi vidik staranja vzpostavlja recipročne heterotipske signalne interakcije, ki jih je mogoče inducirati terapevtsko za izboljšanje protitumorske imunosti.

UVOD

Celično staranje je program odziva na stres, za katerega sta značilna stabilna zaustavitev celičnega cikla in sekretorni program, ki je sposoben preoblikovati tkivno okolje (1). V normalnih tkivih staranje prispeva k homeostazi tkiva med celjenjem ran; v starih ali poškodovanih tkivih pa lahko aberantno kopičenje starajočih se celic povzroči kronično vnetje in zmanjšano sposobnost regeneracije tkiva (2–4). Pri raku je dokazano, da staranje posreduje tako koristne kot škodljive učinke na biologijo tkiva. Po eni strani staranje predstavlja oviro za tumorigenezo, ki jo sproži onkogen, in prispeva k protitumorski aktivnosti nekaterih terapij raka (5, 6). Po drugi strani pa lahko obstojnost starajočih se tumorskih celic po terapiji povzroči tkivno okolje, ki spodbuja ponovitev in metastaze (7, 8). Molekularne podlage teh nasprotujočih si bioloških učinkov ostajajo slabo razumljene. Eden od vidikov programa staranja, ki bo verjetno prispeval k tako raznoliki biologiji, je sekretorni fenotip, povezan s staranjem (SASP; ref. 9). SASP se aktivira prek globalnega procesa preoblikovanja kromatina, ki se razvija in ga nadzirajo ključni epigenetski regulatorji, kot je BRD4, in proinflamatorni transkripcijski faktorji, kot sta NF-κB in C/EBP- (10–12). To pa vodi do indukcije genov, ki kodirajo proteine ​​za preoblikovanje tkiva, kot so matrične metaloproteinaze, rastni faktorji in fibrinolitični faktorji, za katere je znano, da igrajo ključno vlogo v procesu celjenja ran (3, 13, 14). Druge komponente SASP vključujejo kemokine in citokine, ki lahko spremenijo sestavo in stanje imunskih celic v tkivu, kar vodi do imunsko posredovanega ciljanja in očistka samih starajočih se celic (15, 16). Kljub temu nenormalno kopičenje starajočih se celic v mnogih patoloških kontekstih pomeni, da imunsko posredovano očistek ni univerzalni rezultat staranja ali SASP, in povečuje možnost, da dodatni mehanizmi narekujejo paradoksalno koristne in škodljive učinke staranja v tkivni biologiji in imunskem nadzoru. (17–19).

Vsekakor ima lahko s staranjem povezan imunski nadzor močne učinke proti raku, čeprav se natančni efektorski mehanizmi razlikujejo glede na tip tkiva in celic (10, 15, 16, 20). V mišjih modelih hepatocelularnega karcinoma (HCC) se jetrne tumorske celice, ki so sprožile staranje, odstranijo z imunsko odvisnimi mehanizmi, ki jih vključi divji tip (WT) p53 (15). Strinjamo se, da je TP53 pogosto mutiran v človeškem HCC, zlasti pri tumorjih "razreda proliferacije", ki kažejo najslabšo prognozo (21, 22). Čeprav se imunoterapija in zdravila, ki ciljajo na TP53-, pojavljajo kot obetavne strategije za izboljšanje izidov bolezni, ostaja molekularna osnova za odziv in odpornost neznana (23–25). Zato lahko razumevanje mehanizmov, s katerimi postanejo stare jetrne tumorske celice vidne imunskemu sistemu, olajša strategije za pridobivanje protitumorske imunosti pri TP53-mutiranem HCC, ki se lahko razširi na druge vrste tumorjev.

Tukaj smo se odločili vzpostaviti načela, ki modulirajo imunsko prepoznavanje in očistek starajočih se celic, da bi identificirali delujoče mehanizme staranja, ki jih je mogoče izkoristiti za izboljšanje imunskega nadzora raka. V ta namen smo razvili nov "s staranjem inducibilen" model, v katerem je mogoče rakave celice jeter selektivno preklopiti v senescenčno stanje z genetsko modulacijo endogenega p53. Utemeljili smo, da bi to posnemalo učinke terapij, ki sprožijo staranje (26, 27), hkrati pa bi se izognili zmedenim učinkom terapij, ki povzročajo staranje, na imunske celice ali druge sestavine tkivnega okolja. Z uporabo tega modela in njegovo nato razširitvijo na druge sisteme razkrivamo, da poleg SASP staranje poganja veliko preoblikovanje proteoma celične površine in signalnih programov na način, ki je predviden za temeljito spremembo načina, kako celice zaznavajo in se odzivajo na okolje signale, ki so tukaj ponazorjeni s preobčutljivostjo na mikrookoljski IFN tipa II (IFN). Ta proces omogoča močnejšo regulacijo procesiranja in predstavitve antigenov v starajočih se tumorskih celicah, zaradi česar postanejo dovzetne za imunski nadzor in vivo. Tako naši rezultati razkrivajo preoblikovan program zaznavanja tkiva v starajočih se celicah, ki deluje skupaj s SASP za povečanje njihovega imunogenega potenciala in s tem olajša imunsko posredovano zavrnitev tumorja.

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

REZULTATI

P53-Obnovljivi imunokompetentni tumorski model za preučevanje nadzora staranja

Da bi preučili, kako staranje reprogramira celična in tkivna stanja, smo izkoristili tehniko hidrodinamične injekcije v repno veno (HTVI) (28), da smo ustvarili model raka jeter, ki ga povzroči staranje in ga nadzira tumorsko specifična, obnovljiva p53 RNA (shRNA). Natančneje, odrasli jetrni hepatociti imunokompetentnih miši Bl/6 so bili in vivo transficirani s transpozaznim vektorjem speče lepotice SB13 in dvema transpozonskima konstruktoma (ki kodirata NrasG12D-IRES-rtTA in TRE-tRFP-shp53 ali "NSP"), ki se integrirata v genom . V tem sistemu Tet-On je endogeni p53 potlačen v prisotnosti doksiciklina (Dox) z aktivacijo inducibilne shRNA, povezane z RFP (slika 1A), kar omogoča genetski nadzor staranja v uveljavljenih tumorjih. V skladu s sočasnim pojavom mutacij, ki inaktivirajo TP53 in aktivirajo signalne poti celične proliferacije (npr. kaskade PI3K/AKT in RAS/MAPK) v človeških jetrnih tumorjih, je sodelovanje med onkogenim RAS in supresijo p53 vodilo do transformacije hepatocitov, pri čemer je večina miši, pri katerih se 5 do 8 tednov po HTVI razvijejo tumorji s slabo diferenciranimi lastnostmi. Transkripcijsko profiliranje je pokazalo, da so ti mišji tumorji podobni "proliferacijskemu" razredu človeškega HCC (dodatna slika S1A–S1F), ki je tipičen razred človeškega HCC, ki vsebuje mutacije TP53 (21, 22, 29).

Na podlagi prejšnjega dela (15) smo predvidevali, da bo reaktivacija p53 v zgornjem sistemu sprožila staranje in vključila protitumorsko imunost. Skladno s tem je umik Doxa sprožil dramatično regresijo tumorja v več tednih, kar je vodilo do podaljšanega preživetja živali (sliki 1B in C). Analiza tumorjev 14 dni po odvzemu zdravila Dox je pokazala pričakovano znižanje regulacije p53 shRNA (kot je prikazano s povezanim poročevalcem RFP) in kopičenje -galaktozidaze, povezane s staranjem (SA- -gal), brez opaznih učinkov na RAS-efektor p-ERK (slika 1D). Podobno so opazili povečanje aktivnosti SA- -gal in transkripcijskih profilov, povezanih s SASP, skupaj s sočasno zaustavitvijo proliferacije, v eksplantiranih tumorskih celicah 6 do 8 dni po obnovitvi p53 (dodatna slika S2A–S2H). Opozoriti je treba, da je presaditev teh kultur (ohranjenih na Doxu za vzdrževanje utišanja p53) v imunokompetentne miši, hranjene z Doxom, povzročila sinhrone in žariščne sekundarne tumorje, ki so nazadovali s podobno kinetiko kot primarni tumorji po odvzemu Doxa (slika 1B; dopolnilna slika S3A– S3E). Kontrolni poskusi z uporabo sistema Tet-Off ali vključitvijo konstitutivne p53 shRNA so izključili možnost, da je imel Dox sam kakršen koli vpliv na obnašanje tumorja v našem modelu (dopolnilni sliki S3F in S3G). Zato ta sistem omogoča učinkovito indukcijo staranja v tumorskih celicah brez uporabe terapij, ki lahko spremenijo tudi imunski sistem gostitelja. Glede na njegovo dodatno prilagodljivost smo uporabili model ortotopne presaditve (v nadaljevanju "NSP") za številne mehanistične študije, opisane spodaj. Kot je bilo pričakovano, je bila zgoraj navedena izrazita regresija tumorja imunsko posredovana. Zato so tumorji NSP, ki so nastali po presaditvi v imunsko oslabljene miši Nude in Rag2-/-Il2rg-/- (R2G2), doživeli izrazit citostatični odziv, vendar niso nazadovali, pri čemer so živali R2G2 pokazale najgloblje okvare (sl. 1E-G; Dodatna sl. S3H in S3I). Ker imajo gole miši okvarjeno adaptivno imunost in je R2G2 ogrožen tudi za vidike prirojene imunosti, ti rezultati kažejo, da je adaptivni imunski sistem bistven za učinkovito regresijo tumorja v modelu in vzpostavitev dobro nadzorovanega eksperimentalnega konteksta za raziskovanje mehanistične osnove za te učinke.

rastlina cistanche krepi imunski sistem

Staranje sproži preklop z imunske utaje tumorja na imunsko prepoznavanje

Za karakterizacijo parakrinih učinkov staranja, ki zavirajo tumor, smo nato opisali imunsko mikrookolje tumorjev, ki vsebujejo p53-zatrte (imenovane "proliferirajoče") in p53-obnovljene (imenovane "stareče" ) tumorske celice po 1 tednu odvzema Doxa, čas, ko se vzpostavi staranje, vendar tumorji še niso nazadovali (dodatne slike S2, S3 in S4A). Lezije, ki vsebujejo starajoče se tumorske celice, so pokazale približno 1.8--kratno povečanje skupnih CD45+ imunskih celic v primerjavi s proliferirajočimi kontrolami (slika 2A; ref. 15, 16). Imunofenotipske in histološke analize (9. dan po odvzemu zdravila Dox) so pokazale, da je to vključevalo izrazito povečanje odstotka limfocitov (celic B, celic T CD4 in celic T CD8) in znižanje odstotka Gr1+ mieloične supresorske celice/nevtrofilci (CD11b+Gr1+Ly6Clo; slika 2B; dopolnilne slike S4B). Čeprav je delež makrofagov kot odstotek celotne populacije CD45 ostal nespremenjen, so se absolutne številke izrazito povečale (sliki 2A in B; dopolnilna slika S4C–S4E). Znotraj populacije T-celic so kopičenje celic CD8 T pokazale označevalce izkušenj z antigenom (CD44+, CD69+) in vsebovalo povečano populacijo efektorskih celic (CD44+CD62L−; slika 2C; ref. 30). To celotno preoblikovanje imunskega okolja je privedlo do znatnega povečanja razmerja CD3:nevtrofilci za tumorje, ki vsebujejo starajoče se celice (dopolnilna slika S4F), učinki, ki so skladni s podobnimi povečanji razmerja CD3:nevtrofilci, ki so bili povezani z imunsko reaktivnostjo pri ljudeh tumorji jeter (31). Preoblikovanje je bilo mogoče vizualizirati s 3D slikanjem po čiščenju tkiva (slika 2D; dopolnilni sliki S4G in S4H; dopolnilni video S1; ref. 32).

Slika 1. Model p53-obnovljivega tumorja za preučevanje imunskega nadzora staranja. A, Generacija p53-obnovljivega modela raka mišjih jeter, ki ga poganja NRAS, z uporabo sistema transpozonov Trnuljčice, dostavljenega prek HTVI. (Ustvarjeno z BioRender.com.) B, Reprezentativni ultrazvok HTVI in modelov ortotopskega injekcijskega raka jeter ob navedenem času po obnovitvi p53. C, Analiza preživetja miši v modelu HTVI. D, Reprezentativno barvanje s hematoksilinom in eozinom (H&E), imunofluorescenco (IF) in s staranjem povezano -galaktozidazo (SA- -gal) p53-zatrtega (p53 izključen) in -obnovljenega (p53 vključen za 14 dni) odseki tumorja, ustvarjeni iz modela HTVI. Lestvice, 5{{30}} μm. E–G, Ortotopna injekcija tumorskih celic NSP, transduciranih z vektorjem GFP-luciferaze, v jetra imunokompetentnih in imunsko pomanjkljivih sevov miši. E, sprememba velikosti tumorja, merjena z ultrazvokom po obnovitvi p53. R2G2, Rag2-Il2rg miška z dvojnim izločanjem. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SEM. n Večje ali enako 9 za vsak sev. F, Reprezentativne makroskopske slike po 21 dneh p53 na ali končni točki p53 zunaj tumorja. G, Reprezentativno IHC barvanje tumorskih celic, označenih z GFP, 21. dan po obnovitvi p53. Lestvice, 100 μm. **, P <0,01; ***, P <0,001.

Da bi natančno določili specifične vrste imunskih celic, ki so odgovorne za imunski nadzor starajočih se tumorskih celic, smo ustvarili vzporedne kohorte miši z ortotopskimi tumorji NSP in preučili vpliv izčrpavanja različnih populacij imunskih celic na regresijo tumorja po umiku Doxa. Medtem ko blokiranje protiteles, ki ciljajo na nevtrofilce/monocite (Gr1), celice naravne ubijalke (NK) (NK1.1) in celice T CD4 (GK1.5), ni imelo učinka, je zmanjšanje števila celic T CD8 (2,43) in makrofagov (z uporabo liposomskega klodronata) , ki selektivno cilja na makrofage (CD11b+F4/80+), ne pa tudi na klasične dendritične celice (CD11b−CD11c+MHC−II+CD103+; ref. 33, 34), izrazito oslabljeno regresijo tumorja (sl. 2E; Dodatna slika S4I). Da bi opisali, kako staranje tumorja, ki ga poganja p53-, povzroči produktivno protitumorsko imunost, smo izvedli analizo enocelične RNA-seq (scRNA-seq) sveže izoliranih celic CD45 iz proliferirajočih in starajočih se NSP tumorje zgodaj po odvzemu Doxa (8 dni; dopolnilni sliki S5A in S5B) in uporabil algoritem za testiranje diferencialne abundance Milo (35), da bi zajel premike stanj celic znotraj tipov imunskih celic, ki posredujejo ta proces (dodatna slika S5C–S5F). v skladu z njihovim prispevkom k regresiji tumorja so subpopulacije celic T in makrofagov CD8 pokazale izrazite spremembe v količini in stanju. Kar zadeva celice T, so bili proliferirajoči (p53-suprimirani) tumorji znatno obogateni s CD8 T stanji, ki kažejo visoko izraženost tako markerjev disfunkcije (Tox, Tigit, Lag3, Ctla4, Pdcd1/PD1 in Cd160) kot označevalcev aktivacije (Prf1 ; Sliki 2F in G; Dodatna slika S5G; Dodatna tabela S1). Te celice CD8 T so prav tako pokazale visoke ravni Tnfrsf9, markerja, za katerega je znano, da razmejuje podskupine T-celic, ki imajo sposobnost ponovne oživitve v človeškem HCC in drugih vrstah raka (36, 37). V ostrem nasprotju so bile pri starajočih (p53-reaktiviranih) lezijah populacije CD8 T videti zelo aktivirane, kar je pokazalo nizke ravni markerjev disfunkcije in visoko izraženost efektorskih citokinov (npr. Ifng, Tnf; dodatna tabela S1). Skladno s tem je transkripcijsko profiliranje masivnih tumorskih tkiv pokazalo imunsko aktivne in citotoksične znake pri starajočih se tumorjih, ki so bili podvrženi regresiji (dodatna slika S5H; ref. 38).

Slika 2. Staranje sproži preklop tumorja z imunskega izogibanja na imunsko prepoznavanje. A, Reprezentativne slike obarvanja CD45 in GFP, ki označuje imunske celice oziroma tumorske celice v p53-zatrtih in p53-obnovljenih tumorjih (7 dni po obnovitvi p53). Desno, kvantifikacija površine obarvanja s CD45+ je bila izračunana iz 3 naključnih polj na miško. Vsaka pika predstavlja miško. B, Analiza pretočne citometrije globalne imunske pokrajine v ortotopnem modelu jetrnega tumorja NSP. Imunofenotipizacija starajočih se tumorjev se izvede 9 dni po odvzemu Doxa, to je časovna točka, ko je stanje staranja v celoti vzpostavljeno, vendar še pred masivno regresijo tumorja. G-MDSC, granulocitne mieloidne supresorske celice; M-MDSC, monocitne mieloidne supresorske celice. Podatki so združeni iz dveh neodvisnih poskusov, z n=7 v proliferacijski skupini in n=9 v starajoči se skupini. Upoštevajte, da s povečanjem absolutnega števila celic CD45+ v starajočih se tumorskih lezijah NSP (A) narašča tudi skupno število navedenih vrst celic. C, Analiza celic CD8 T s pretočno citometrijo. Podatki so združeni iz dveh neodvisnih poskusov, z n=11 v proliferirajočih in n=10 v starajočih se skupinah. Poskusi so bili izvedeni 9 dni po odvzemu Doxa. D, Reprezentativne slike čiščenja tkiva ortotopskih NSP jetrnih tumorjev. Celice T, nevtrofilci in vaskulatura so označeni z obarvanjem s CD3, MPO oziroma CD31. Vzorci so bili zbrani 9 dni po odvzemu Doxa. E, Sprememba velikosti tumorja, merjena z ultrazvokom po obnovitvi p53 pri miših po izčrpavanju specifičnih tipov imunskih celic z uporabo protiteles ali zdravil. F, levo, krivulja enakomernega približevanja in projekcije (UMAP) celic CD8 T, izoliranih iz p53-zatrtih proliferirajočih (PRO) in p{{30}}reaktiviranih starajočih (SEN) tumorjev. Desno, analiza obogatitve genskega niza genov markerjev za izčrpanost celic T v CD8+ celicah T iz proliferirajočih (p53-zatrtih) proti starajočim (p53-reaktiviranim) tumorjem. NES, normaliziran rezultat obogatitve; Pval, vrednost P. G, graf UMAP izražanja izbranih genov (Cd8a, Cd44, Tnfrsf9, Cd69, Tox in Fasl) med CD8 celicami T, izoliranimi iz senescenčnih (p{{4{0}}reaktiviranih) in proliferirajočih (p{ {41}}zatrti) tumorji. H, Reprezentativne imunofluorescenčne slike CD8 T celic in F4/80-pozitivno barvanje makrofagov v ortotopičnem NSP jetrnem tumorju. Vzorci tumorjev so bili zbrani 9 dni po odvzemu Doxa. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SEM. Vse merilne palice, 100 μm. Uporabljen je bil dvostranski Studentov t-test. *, P <0,05; **, P <0,01.

Spremembe v predelu makrofagov so zagotovile nadaljnje dokaze, da je staranje tumorskih celic sprožilo preklop imunskega izogibanja na nadzor. Zato so scRNA-seq, imunofenotipizacija in histologija pokazali, da so fenotipi makrofagov, povezani s tumorjem, prešli iz F4/80lo; stanja CD11chi (grozd 8), vključno z imunsko supresivnimi populacijami PD-L1+ (značilno za humane HCC tumorje s slabo prognozo; ref. 39, 40) do F4/80hi; Stanja CD11c− (grozd 0), opredeljena z visoko ekspresijo genskega podpisa za predstavitev antigena (dodatne slike S5E–S5J ter S6A in S6B; dodatna tabela S1). Omeniti velja, da so ti F4/80hi, povezani s staranjem; Makrofagi CD11c− so bili še posebej občutljivi na zdravljenje z liposomskim klodronatom (dodatna slika S6C–S6E), kar je prav tako povzročilo znatno zmanjšanje deleža aktivnih celic CD8, vendar ne CD4 T celic (dodatna slika S6F in S6G), kar kaže na CD8 T-odvisen imunski odziv, ki vključuje sodelovanje z makrofagi. Skladno s tem so histološke analize potrdile, da so se kopičile CD8 T celice in F4/80+ makrofagi pogosto obogatili po indukciji staranja v tumorjih (slika 2H; dopolnilna slika S4D). Skupaj te biološke in molekularne analize podpirajo model, v katerem staranje tumorskih celic povzroči nenaden preklop od imunske utaje k imunskemu nadzoru, ki ga posredujejo spremembe v makrofagih in stanju T-celic CD8, kar vodi do produktivne protitumorske imunosti in na koncu do zavrnitve tumorja.

Senescence preoblikuje programe za zaznavanje tkiv in krajino celične površine

Nato smo se odločili izkoristiti zgornji model, da bi razumeli molekularne mehanizme, ki so odgovorni za prikazovanje starajočih se tumorskih celic v imunskem sistemu. Indukcija senesence vključuje program preoblikovanja kromatina, ki utiša proliferativne gene in aktivira številne gene, ki kodirajo faktorje SASP, pri čemer je slednji program v veliki meri odvisen od bralnika ojačevalcev BRD4 (10). Zato smo izvedli poskuse transkripcijskega profiliranja na celicah NSP v proliferirajočih (p53-zatrtih) v primerjavi s starajočimi (p53- obnovljenimi) pogoji v odsotnosti in prisotnosti JQ1, zdravila, ki zavira delovanje BRD4 (dodatna tabela S2 ). V skladu s pričakovanji je obnova p53 dramatično zmanjšala izražanje proliferativnih genov in povzročila izražanje dobro znanih faktorjev SASP (slika 3A; dopolnilna slika S7A; ref. 7), vključno z več citokini, za katere je znano, da stimulirajo celice T (Cxcl16, Il18). ) ali aktivacijo in rekrutacijo makrofagov (Csf2, kodirni protein GM-CSF) ali predhodno povezan s staranjem (Igfbp7, Igfbp3, Pdgfa). Kot je bilo pričakovano iz prejšnjega dela (10), je bilo veliko reguliranih transkriptov za kodiranje SASP (∼65 %) odvisnih od BRD4- (dopolnilna slika S7B). Podobno se je vrsta rastnih faktorjev in imunskih modulatorjev izločala iz starajočih se celic, kot je bilo ocenjeno z multipleksnimi testi citokinov, vključno s T-celičnimi in makrofagnimi atraktanti CCL5, CXCL9 in GMCSF ter faktorjem za preoblikovanje vaskulature VEGF (dopolnilna slika .S7C). Zato je staranje p53-obnovljenih tumorskih celic NSP povezano z robustnim SASP, skladnim z izrazitim preoblikovanjem imunskega ekosistema, opisanim zgoraj.

Presenetljivo je, da je preiskava podcelične lokalizacije za diferencialno izražene gene (DEG) pokazala, da starajoče se tumorske celice niso samo povečale svoje ekspresije izločenih ("zunajceličnih," EC) faktorjev SASP, ampak so pokazale tudi velike spremembe v nivojih izražanja transkriptov, ki kodirajo površinske proteine. ("plazemska membrana," PM; slika 3B). Dejansko je 25 % skupnih reguliranih DEG kodiralo proteine ​​PM, kar je pomembna obogatitev, ki je odstopala od naključne porazdelitve (15 %; slika 3B). Dinamični PM-DEG so bili povezani s signalno transdukcijo proteinske tirozin kinaze (Nrp1, Egfr), aktivnostjo citokinskih receptorjev (Ifngr1), receptorji zunajceličnega matriksa (Itgb3, Cd44) in ionskimi prenašalci (Slc12a1, Slc24a3) ter zajeli znane molekule, povezane s staranjem ( Cd44, Vcam1 in Itgb3), kar kaže, da imajo starejše celice lahko izboljšano sposobnost interakcije in zaznavanja svojega okolja (slika 3C; dopolnilna slika S7D; ref. 41–43). Zanimivo je, da je s staranjem povezano povečanje izražanja mnogih teh proteinov PM ublažil JQ1, kar kaže, da je njihova indukcija lahko del širšega programa preoblikovanja kromatina, povezanega s SASP (slika 3D; ref. 10). Omeniti velja, da so se globoke spremembe v transkripciji genov, ki kodirajo proteine ​​PM, pojavile tudi v tumorskih celicah NSP s pomanjkanjem p53-, zdravljenih s kombinacijo zdravil, ki povzročajo staranje, trametinib in palbociklib (dodatna slika S7E, zgornja plošča; dodatna tabela S2; ref. 20) in v nizu 13 genetsko raznolikih TP53 WT in TP53- mutantnih človeških rakavih linij, pridobljenih iz raka jeter, dojk, pljuč in debelega črevesa, ki so jih povzročili staranje z različnimi sprožilci (slika 3E; dopolnilna slika 2). S7F; ref. 44). To je bilo še posebej robustno za regulirane (vendar ne znižane) PM-DEG, kar spominja na učinke, opažene pri faktorjih EC SASP (slika 3E; dopolnilna slika S7E, spodnja plošča). Zato izrazito spremenjeno izražanje proteinov na celični površini, ki smo ga opazili v našem modelu, presega p53-inducirano staranje in je lahko znak starajočega se stanja.

Slika 3. Senescence preoblikuje programe za zaznavanje tkiv in krajino celične površine. A, Analiza obogatitve genskega niza (Reactome) podatkov RNA-seq iz proliferirajočih (PRO, p53 izklopljen) v primerjavi s starajočimi (SEN, p53 vklopljen 8 dni) NSP jetrnih tumorskih celic in vitro. NES, normaliziran rezultat obogatitve. B, Podcelična lokalizacija DEG (P < 0.05; sprememba gube > 2) v vseh odkritih genih [transkripti na milijon kilobaz (TPM) > 1] iz RNA-seq. C, Analiza genske ontologije (GO) DEG, ki kodirajo proteine ​​PM, regulirane navzgor v starajočih se celicah. TM, transmembranski. D, Transkriptomska analiza vseh DEG (proliferirajočih proti starajočim se) v prisotnosti ali odsotnosti zdravljenja z JQ1. Skupina C1 (v rdeči barvi) vsebuje gene, specifične za staranje, občutljive na JQ1, skupina C4 (v modri barvi) pa vsebuje gene, specifične za proliferacijo, občutljive na JQ1. E, Meta-analiza nabora podatkov RNA-seq iz SENESCopedia z izvajanjem podcelične lokalizacije DEG (enako kot slika 2D) in Fisherjevega natančnega testa za preučevanje relativne obogatitve navzgor in navzdol reguliranih EC/PM-DEG, ki so odstopali od naključne porazdelitve. Glejte tudi dodatni sliki S7E in S7F. F, Analiza z masno spektrometrijo (MS) proteoma, obogatenega s PM, v proliferirajočih in starajočih se celicah. Raven beljakovin se normalizira na povprečno izraženost beljakovin vseh vzorcev. Kontrole so vzorci brez biotinske oznake, ki služi kot ozadje. Rdeča in modra polja predstavljajo beljakovine, obogatene s starajočimi oziroma proliferirajočimi celicami. n=6 tako za poskusno skupino s senescenco kot proliferacijo in n=3 oziroma 4 za njihovo kontrolo. G, Porazdelitev navzgor in navzdol reguliranih GeneCards označenih PM proteinov, profiliranih z MS. NC, brez sprememb. H, Vulkanski prikaz proteinov PM, označenih z GeneCards, profiliran z MS.

Da bi potrdili globalno preoblikovanje faktorjev PM pri staranju na ravni beljakovin, smo izvedli površinsko proteomiko na izogenih proliferirajočih in starajočih se tumorskih celicah NSP z uporabo metode obogatitve z označevanjem biotina, pri kateri so bili proteini celične površine označeni z biotinom, neprepustnim za membrano, prečiščena in izpostavljena masni spektrometriji (slika 3F; dopolnilna slika S7G; ref. 45). Opažena je bila močna korelacija med biološkimi ponovitvami pod vsakim pogojem (dodatna slika S7H), pri čemer so bili odkriti proteini obogateni za označene proteine ​​PM za 60 % po indukciji p53-induciranega staranja. Od 887 proteinov, ki so bili ponovljivo odkriti, jih je bilo več kot 50 % različno izraženih. Večina diferencialno izraženih proteinov je dobro korelirala z usmerjenostjo, opaženo v naših podatkih o transkripcijskem profiliranju, čeprav so bili nekateri različno izraženi brez ustrezne spremembe ravni transkripta (dopolnilna slika S7I).

koristi cistanche za moške - krepitev imunskega sistema

Označeni proteini celične površine, odkriti z masno spektrometrijo po indukciji staranja, so vključevali več predhodno povezanih s staranjem (npr. CD44 in VCAM1), različne rastne faktorje in citokinske receptorje (npr. EGFR, ICAM1 in IFNGR1) ter druge manj značilne dejavnike (slika 3F–H; dodatni sliki S7J in S7K). Opozoriti je treba, da je nabor proteinov, obogatenih s celično površino, opredeljenih v našem modelu, pokazal omejeno prekrivanje s tistimi, ki so bili identificirani v človeških fibroblastih, ki so podvrženi staranju, ki ga povzroči onkogen (46), kar kaže na heterogenost med tipi celic ali sprožilci staranja. Ne glede na to pa ti rezultati kažejo, da so starejše celice poleg ponovnega ožičenja v svojem sekretornem programu podvržene globokim spremembam v vsebnosti in številčnosti proteinov celične površine in pomenijo, da starajoče celice pridobijo značilne lastnosti zaznavanja mikrookolja, ki lahko vplivajo na njihovo stanje in usodo in vivo .

Stare celice so pripravljene za zaznavanje IFNg in ojačanje signalizacije IFNg

Da bi identificirali poti, ki bi lahko funkcionalno vplivale na to, kako starajoče se celice zaznavajo svoje okolje, smo izkopali transkripcijske in proteomske nize podatkov za spremembe, povezane s staranjem, povezane s protitumorsko imunostjo. Zanimivo je, da je analiza genske ontologije (GO) pokazala, da je bil odziv tipa II na interferon gama (IFN) (47) med 5 najbolj označenimi potmi, obogatenimi med staranjem in odvisnimi od programov ojačevalcev, specifičnih za stanje celice (tj. JQ1-sensitive ; tj. "C1" na sliki 3D; dopolnilna slika S8A). Med spremenjenimi transkripti smo opazili več pozitivnih regulatorjev signalizacije IFN, vključno s podenoto receptorja IFN IFNGR1 (eden najbolj izrazito reguliranih proteinov iz naših proteomskih podatkov) in več efektorji interferona (Irf1, Irf7 in Irf9; ref. 47, 48). ; sl. 4A–C; dodatni sliki S8B in S8C). Poleg teh Brd4-občutljivih-povišano reguliranih genov so se transkripti, ki kodirajo negativne regulatorje signalizacije IFN (Ptpn2, Socs1 in Socs3), znatno zmanjšali (slika 4C; ref. 49, 50). Podobne spremembe so opazili v tumorskih celicah NSP, zdravljenih z različnimi induktorji staranja (slika 4C; dopolnilna slika S8D–S8G) in, širše, v skupini 13 človeških rakov dojke, pljuč, jeter in debelega črevesa. celične linije, ki so sprožile staranje (slika 4D; ref. 44). Zato so spremembe v izražanju signalnih komponent IFN tipa II splošna značilnost starajočih se celic, neodvisno od tipa celice, celičnega genotipa, vrste in narave induktorja staranja. Hkratno povečanje signalnih efektorjev IFN in zmanjšanje negativnih regulatorjev nas je pripeljalo do hipoteze, da postanejo starajoče se celice pripravljene za zaznavanje IFN v svojem okolju. Da bi neposredno preizkusili to hipotezo, smo obdelali proliferirajoče in starajoče celice NSP z rekombinantnim IFN in izvedli imunobloting analize aktivacije signala JAK-STAT. Čeprav je IFN dramatično povečal izhodiščne ravni STAT1 v obeh stanjih, so starajoče se celice kopičile več fosforiliranega STAT1, ne glede na sprožilec staranja (slika 4E; dopolnilna slika S8H). Poleg tega smo ugotovili tudi povečano raven fosforiliranega JAK1 v p53- obnovljenih starajočih se celicah, kar dodatno podpira našo ugotovitev o bolj aktivni signalni poti JAK-STAT v starajočih se celicah, ki zaznavajo IFN (dopolnilna slika S8I). Kot je bilo predvideno iz transkripcijskih analiz, je staranje sprožilo tudi zmanjšanje proteina PTPN2 (51), ne glede na prisotnost eksogenega IFN (slika 4E). Tako stare celice učinkoviteje aktivirajo signalizacijo IFN kot odgovor na omejevalno koncentracijo IFN v okolju.

Senescence in EC IFNg skupaj pospešujeta procesiranje in predstavitev antigenov

Da bi bolje razumeli funkcionalni prispevek zaznavanja IFN k programu staranja, smo nato primerjali fenotipska in transkripcijska stanja proliferirajočih in p53-obnovljenih starajočih se tumorskih celic NSP, zdravljenih z rekombinantnim IFN pri nizki (50 pg/mL) oz. višji (1 ng/ml) odmerek. Čeprav je imel dodatek eksogenega IFN proliferirajočim ali starajočim se tumorskim celicam zanemarljiv učinek na sposobnost preživetja, proliferacijo ali ekspresijo gena SASP katerega koli tipa celic pri testiranih odmerkih (slika 5A; dopolnilna slika S9A–S9D), so opazne spremembe v Opazili so gensko izražanje poti IFN, povezano s stanjem staranja. Natančneje, nadzorovano združevanje Hallmarkovega "odzivnega podpisa IFN" v proliferirajočih in starajočih se celicah je razkrilo tri module DEG: (i) gene, ki so med staranjem znižani, ne glede na IFN (vključno z zgoraj omenjenimi negativnimi regulatorji); (ii) geni, ki so med staranjem regulirani navzgor ne glede na IFN; in, zanimivo, (iii) znaten nabor DEG, ki so kooperativno inducirani s kombinacijo staranja in IFN (slika 5B). Zato staranje sproži kvantitativne in kvalitativne spremembe v transkripcijskem odzivu na IFN. Eden od dobro uveljavljenih rezultatov signalizacije IFN, ki uravnava dovzetnost celic za adaptivni imunski nadzor, je povečana zmogljivost za predstavitev antigena, ki jo posredujejo molekule MHC razreda I (MHC-I; ref. 47, 52). Dejansko so številni geni, regulirani navzgor v starajočih se celicah (geni razreda ii) ali superinducirani v prisotnosti eksogenega IFN (geni razreda iii), vključevali komponente mehanizma za predstavitev antigena. Med geni, induciranimi med staranjem (geni razreda ii), sta bila Tap1, prenašalci, povezani z obdelavo antigena, in Psme1, proteasomski faktor, povezan z obdelavo antigena (53). Tisti, preobčutljivi na eksogeni IFN (geni razreda iii), so vključevali Nlrc5, transkripcijski koaktivator genov MHC-I (54); faktor sestavljanja MHC-I Tapbp; in MHC-I podenota B2m. Dva druga gena razreda iii sta bila komponenti imunoproteasoma (Psmb8 in Psmb9), katerih delovanje lahko spremeni repertoar predstavljenih peptidov, če so prekomerno izraženi, in sta povezana z izboljšanim odzivom tumorja na blokado imunske kontrolne točke (55). Ta pomnoženi izhod IFN v starajočih se celicah je bil potrjen z RT-qPCR in je bil ohranjen na še višjih ravneh eksogenega IFN (slika 5C; dodatna tabela S3). V skladu z zgoraj opisanim večfaktorskim procesom tega učinka niso opazili pri proliferirajočih tumorskih celicah, niti pri tistih, ki prekomerno izražajo cDNA IFNGR1 in/ali zdravljenih z IFN (dodatna slika S10A–S10D).

Slika 4. Stare celice so pripravljene za zaznavanje in ojačanje signalizacije IFN. A in B, raven IFNGR1 na proliferirajočih in starajočih se celicah, profilirana z masno spektrometrijo (A) in potrjena s pretočno citometrijo (B). AU je poljubna enota. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SEM. n=6 za proliferirajoče in starajoče se skupine. C, Transkriptomska analiza izbranih genov, ki uravnavajo signalizacijo IFN iz podatkov RNA-seq 3 neodvisnih p53-obnovljivih celičnih linij (NSP, NSM2 in NSP5), ki obnavljajo p53 skupaj s celicami NSP, zdravljenimi z dvema drugima sprožilcema staranja. SEN/PRO, starajoč se/proliferira; T + P, trametinib plus palbociklib. D, izražanje mRNA izbranih genov, vključenih v signalizacijo IFN v človeških celičnih linijah, ki so sprožile staranje. Zdravljenje: Ali, alisertib; Eto, etopozid; številka označuje dolžino zdravljenja (dnevi). Podatki so pridobljeni iz javne zbirke podatkov SENESCopedia (44). E, Top, imunoblot analiza celic NSP pod različnimi sprožilci staranja v prisotnosti ali odsotnosti IFN (1 ng/mL). Spodaj, kvantifikacija intenzitete signala iz imunoblota. p-STAT1, fosfo-STAT1 (Tyr701).

Tudi skladno z zgoraj opisanimi spremembami izražanja genov so starajoče se tumorske celice močneje regulirale MHC-I kot odziv na nizke ravni eksogenega IFN v primerjavi s proliferirajočimi primerki. Medtem ko so bile ravni MHC-I na celični površini tako proliferirajočih kot starajočih se celic na začetku nizke in inducirane z eksogenim IFN, so stare celice pokazale znatno povečanje izražanja proteina MHC-I (slika 5D). Podobne sinergije so opazili za izražanje HLA na celični površini (identično MHC-I pri miših) v človeških rakavih celicah iz jeter in drugih vrstah raka, ki so sprožile staranje z Butlinom, ki vključuje ap53-odvisen program staranja (56) ali trametinib/palbociklib, ki prednostno cilja na tumorske celice z aktivirano potjo MAPK (dodatna slika S11A–S11D; ref. 20). Opozoriti je treba, da so kombinatorni učinki zdravljenja z zdravili in IFN na ekspresijo HLA zahtevali indukcijo staranja in se niso pojavili v celicah jetrnega tumorja, ki se niso starale zaradi spontane ali ustvarjene mutacije p53 (neodzivna na oris) ali nehiperaktivirane poti MAPK (neodzivna na trametinib/palbociklib). Poleg tega, čeprav odzivni poti IFN tipa I in II vključujeta prekrivajoče se komponente, zdravljenje z eksogenim IFN ni moglo nadomestiti IFN pri ustvarjanju močne indukcije MHC-I v starajočih se celicah niti močno diferencialne indukcije med proliferirajočimi in starajočimi se celicami v našem modelu obnove p53 ( Dodatni sliki S11E in S11F). Ti podatki kažejo, da mišje in človeške celice, ki se sprožijo k staranju, pridobijo povečano sposobnost za obdelavo in predstavitev antigena v prisotnosti omejenih količin IFN.

Stare tumorske celice hiperaktivirajo signalno pot IFNg in vivo

Da bi ugotovili in vivo posledice preoblikovanja signalizacije IFN, ugotovljene v starajočih se celicah, smo nato prilagodili reporterski sistem za zaznavanje IFN (IGS) za neposredno vizualizacijo intracelularne aktivacije signalizacije IFN v realnem času (57). Ta poročevalec je sestavljen iz serije konsenznih sekvenc, aktiviranih z IFN, ki ima specifičnost za IFN tipa II v primerjavi z drugimi signali (57), čemur sledi zaporedje cDNA, ki kodira fluorescentni protein ZsGreen1, in je povezano s konstitutivno izraženim transgenom RFP za vizualizacijo transduciranih celic ( Slika 6A). Tumorske celice NSP, ki izražajo ta konstrukt, so bile pozitivne na RFP in so pokazale od odmerka odvisno povečanje signala ZsGreen1 po zdravljenju z IFN in vitro, ki se je povečalo po indukciji p53 ali po zdravljenju z zdravili, ki inducirajo staranje (slika 6B; dopolnilni sliki S12A in S12B) .

Nato smo ta sistem uporabili za spremljanje signalne aktivnosti po indukciji staranja v tumorjih. Reporter transducirane tumorske celice (na Doxu), ki izražajo konstitutivni RFP, so bile vbrizgane v jetra singenih prejemnikov, hranjenih z Doxom, in po manifestaciji tumorja je bil Dox odstranjen, da inducira ekspresijo p53 in sproži staranje, kot je navedeno zgoraj (glej sliki 1 in 2). Regresivne tumorje smo izolirali 9 dni po odvzemu Doxa za 3D slikanje reporterske aktivnosti in vzporedno oceno signalizacije IFN v primerjavi s proliferirajočimi kontrolami (od miši, vzdrževanih na Doxu). Kot je prikazano na sliki 6C, so proliferirajoče tumorske celice pokazale malo, če sploh, izražanja reporterja, medtem ko so tumorske celice, ki so sprožile staranje in vivo, pokazale izrazitejši signal ZsGreen1 (sliki 6C in D; dodatni video S2). Ta učinek je sovpadel s specifičnim povečanjem ravni proteina IFN (vendar ne IFN tipa I) v ekstraktih tumorskega tkiva (slika 6E; dopolnilna slika S12C).

Da bi preizkusili, ali je spremenjena sestava imunskih celic v starajočih se tumorjih (slika 2; dodatne slike S5–S6) prispevala k povečanemu signalu poročevalca IGS, smo izvedli in vitro teste kokulture, ki so omogočili izpostavitev starajočih se ali proliferirajočih tumorskih celic enako število aktiviranih celic CD8 T, ki smo jih identificirali s podatki scRNA-seq kot prevladujoči celični vir IFN in vivo (sl. 6F–H). Stare celice so še vedno pokazale znatno povečanje signala ZsGreen1 v primerjavi s proliferirajočimi kontrolami (slika 6I). V skladu z necelično avtonomno signalno aktivacijo IFN ni bil zaznan v kondicioniranih medijih tumorskih celic NSP v proliferativnih ali starajočih se pogojih (dodatna slika S12D), vendar je bil IFN zlahka zaznan pri kokulturi s CD8 T celicami, učinek, ki je bil dodatno okrepljen z dodatkom makrofagov in povezan s povečanim MHC razreda I na starajočih se celicah kot tudi povečano aktivacijo CD8 T celic (dodatna slika S12E–S12J). Skupaj ti podatki podpirajo model, po katerem heterotipske interakcije med starajočimi se tumorskimi celicami in imunskimi celicami senzibilizirajo tumor na eksogeni IFN, kar vodi do izboljšane predstavitve antigena in učinkovitega imunskega nadzora.

Slika 5. Senescence in EC IFN sodelujeta pri uravnavanju strojev za predelavo in predstavitev antigena. A in B, izražanje mRNA genov v proliferirajočih in starajočih se celicah NSP in vitro v prisotnosti ali odsotnosti zdravljenja z IFN (50 pg/mL). Raven mRNA se normalizira na povprečno izraženost gena v vseh vzorcih. A, dejavniki SASP kodiranja DEG v našem modelu. B, geni za odziv IFN iz podatkovne baze podpisov Hallmark. C, RT-qPCR izbranih genov poti predstavitve antigena v proliferirajočih in starajočih se celicah, zdravljenih z nizko (50 pg/mL) ali visoko (1 ng/mL) koncentracijo IFN. Vzorci so iz 2 bioloških ponovitev. D, raven MHC-I proliferirajočih in starajočih se celic, zdravljenih z IFN 24 ur, izmerjena s pretočno citometrijo. MFI, srednja intenzivnost fluorescence. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SEM.

Slika 6. Staranje poveča heterotipsko signalizacijo, posredovano z IFN, od aktiviranih imunskih celic do tumorskih celic. Grafična ilustracija poročevalca IGS. (Ustvarjeno z BioRender.com.) B, levo, reprezentativne risbe pretočne citometrije, ki merijo signale ZsGreen1 v proliferirajočih in starajočih se celicah NSP, obdelanih z 1 ng/mL IFN. Desno, kvantifikacija odstotka ZsGreen1-pozitivnih celic po zdravljenju z IFN. MFI, srednja intenzivnost fluorescence. C in D, Reprezentativno 3D slikanje tkivno očiščenih tumorjev iz ortotopsko vbrizgane jetrne NSP celične linije, ki izraža reporter IGS (C). Kvantifikacija 3 naključno izbranih polj iz jetrnega tumorja vsake miši (D). n=5 in n=3 za proliferirajoče in starajoče se skupine (9 dni po obnovitvi p53). Lestvice, 100 μm. E, Top, test niza citometričnih kroglic za raven IFN iz vzorcev lizata tumorskega tkiva in vivo (7 dni po obnovitvi p53). Spodaj, prepisi navedenih genov iz RNA-seq množičnih vzorcev tumorjev in vivo, ki jih je ustvaril HTVI (PRO, p53 izklopljen; SEN, obnovitev p53 za 12 dni). TPM, milijon prepisov na kilobazo. Opaženi grozd Ifna/b vsebuje 14 podtipov Ifna in 1 gen Ifnb. F in G, izražanje Ifng v imunskih celicah, ki infiltrirajo tumor, profiliranih s scRNA-seq v modelu za presaditev NSP (kot na sliki 2, vzorec, zbran 8. dan po obnovitvi p53). H, Enoten približek kolektorja in projekcijski prikaz ekspresije Havcr2 (ki kodira TIM3) in Ifng v celicah CD8 T, pridobljenih iz proliferirajoče (P) in starajoče se (S) tumorske lezije. Zgornja plošča je povzeta s slike 2F (levo), da prikaže celice, ki ustrezajo vsakemu pogoju. I, Kvantifikacija intenzivnosti ZsGreen1 tumorskih celic NSP v poskusu kokulture T-celic OT-I in tumorskih celic, ki izražajo SIINFEKL (razmerje med efektorjem in ciljem, 5:1) po 20 urah kokulture. Signal izmerjen s pretočno citometrijo. T + P, trametinib plus palbociklib. Oglejte si eksperimentalne podrobnosti na dodatni sliki S12E. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SEM. Uporabljen je bil dvostranski Studentov t-test. *, P <0,05; **, P <0,01; ***, P <0,001.

Signalizacija IFNg v starajočih se tumorskih celicah je potrebna za imunski nadzor

Naši rezultati kažejo, da imunsko posredovano očistek starajočih se tumorskih celic NSP vključuje kombinirane učinke SASP, za katerega je znano, da stimulira rekrutacijo imunskih celic (10, 20, 58), skupaj s predhodno premalo cenjeno zmogljivostjo starajočih se celic za izboljšano zaznavanje in odziv na EC signali, kot je prikazano tukaj z IFN. Da bi testirali prispevek programa za zaznavanje IFN, povezanega s staranjem, k imunskemu nadzoru starajočih se tumorskih celic, smo preučili, kako motnja IFNGR v tumorskih celicah ali izčrpavanje IFN v gostitelju vpliva na očistek tumorskih celic NSP po indukciji staranja . Dejansko je bila regresija tumorja (vendar ne staranje per se; dopolnilna slika S13A–S13D) oslabljena po izločitvi (KO) IFNGR1 (sliki 7A in B; dopolnilna slika S14A–S14C), učinek, ki je bil še bolj izrazit pri IFNGR-intaktni tumorji, cepljeni v miši Ifng-/- (sl. 7C in D) in povezani s pričakovano izgubo površinskega MHC-I v tumorskih celicah (dopolnilni sliki S14D in S14E).

V skladu z znanim prispevkom signaliziranja IFN in MHC-I tumorskih celic k vključevanju CD8+ (59) so tumorji, ki nimajo IFNGR1 ali so se razvili pri prejemnikih Ifng−/−, vsebovali manj T celic CD8 kot njihovi primerki WT v obeh proliferirajočih in starajočih se stanj (dopolnilna slika S14F), medtem ko še vedno povzroča močan imunski infiltrat, vključno z obilnimi makrofagi (sliki 7E in F; dopolnilna slika S14G). Ne glede na to oslabljen fenotip nadzora staranja ni bil le posledica tega zmanjšanja CD8 T celic. Preizkusi kokulture, ki zagotavljajo enakomerno izpostavljenost tumorskih celic IFNGR1 KO in WT celicam T CD8 in makrofagom, so še vedno pokazali od IFNGR1-odvisno ubijanje starajočih se tumorskih celic (dodatna slika S15A–S15E) – odvisnost, ki je zahtevala prisotnost obeh T celic in makrofagov in tega niso opazili pri proliferirajočih tumorskih celicah pod enakimi pogoji. Skupaj ti podatki kažejo, da povečana sposobnost starajočih se celic, da zaznajo IFN iz mikrookolja, deluje skupaj z rekrutiranjem imunskih celic, ki jih spodbuja SASP, da omogoči medsebojno okrepljene heterotipske interakcije med tumorskimi celicami, makrofagi in aktiviranimi celicami T, ki izboljšajo predstavitev antigena in imunski nadzor. , kar vodi do močne regresije tumorja.

DISKUSIJA

Omogočeno z modelom mišjega tumorja, v katerem je imunski izmik raka proti staranju pod strogim genetskim nadzorom, razkrivamo, kako starajoče se celice dramatično spremenijo svojo sposobnost pošiljanja in sprejemanja okoljskih signalov (dodatna slika S16). V skladu z znanimi programi staranja je indukcija staranja, ki jo poganja p53-, povzročila utišanje proliferativnih genov in inducirala SASP. Vendar pa smo opazili tudi močan učinek na izražanje genov za PM proteine, vključno z vrsto receptorjev rastnega faktorja in citokinskih receptorjev, za katere se predvideva, da bodo drastično spremenili odziv starajočih se celic na okoljske signale. Pomembno je, da čeprav smo kot primarni eksperimentalni sistem uporabili model raka na jetrih, smo opazili podobno preoblikovanje v izražanju senzorjev celične površine in genskih programov, ki senzibilizirajo na okoljske signale, v širokem spektru mišjih in človeških tumorskih celic, zdravljenih z zdravilom, ki povzroča staranje. agentov, kar pomeni, da je spremenjen program zaznavanja splošen znak starajočega se stanja.

koristi cistanche za moške - krepitev imunskega sistema

Ena od pomembnih zaznavnih poti, spremenjenih v starajočih se celicah, vključuje signaliziranje IFN tipa II. V našem modelu raka jeter in v vseh stanjih staranja, ki smo jih pregledali, staranje spremljajo celično intrinzične transkripcijske spremembe in spremembe izražanja beljakovin, za katere je predvideno, da bodo okrepile signalizacijo iz eksogenega IFN. Dejansko so starajoče se celice robustneje aktivirale efektorje IFN kot odziv na IFN in vitro in in vivo, in tako nepoškodovana efektorska pot IFN kot IFN v okolju sta potrebna za učinkovit očistek starajočih se tumorskih celic, posredovan s celicami CD8 T. Čeprav analiza poti transkriptomov starajočih celic vedno identificira signalizacijo IFN tipa II kot obogateno značilnost, so prekrivanja med komponentami signalizacije tipa I in II ter dejstvo, da IFN običajno ni zaznan kot faktor SASP, pustila mehanistična vprašanja glede signalizacije IFN tipa II pri staranju večinoma neraziskana. Naše študije kažejo, da taka obogatitev signalnih podpisov IFN v starajočih se celicah odraža povečano zmogljivost zaznavanja IFN, katere rezultat je najbolj izrazit in vivo.

Slika 7. Signalizacija IFN v starajočih se tumorskih celicah je potrebna za imunski nadzor. A, Ifngr1 KO proliferirajočih in starajočih se celic NSP, validiranih s pretočno citometrijo. B, fenotip tumorske regresije Ifngr1 KO ali kontrolne tumorske celice, transficirane s sgRNA, ortotopsko injicirane v miši Bl/6N po obnovitvi p53. Kontrolna sgRNA, ki cilja na gensko puščavo, ki se nahaja na Chr8 (Ctrl KO), služi kot kontrola. C, Fenotip regresije tumorja starševskih tumorskih celic NSP, ortotopsko injiciranih v miši WT ali Ifng KO po obnovitvi p53. D, Reprezentativne makroskopske slike tumorja, zbrane 21. dan po obnovitvi p53 iz C. E, Analiza številčnosti CD45 CD45 v tumorju iz navedenih skupin s pretočno citometrijo. F, Reprezentativna imunofluorescenca v p{{10}}zatrtem (proliferirajočem) in p53-obnovljenem (starečem, 7 dni po obnovitvi p53) tumorju navedenega gostitelja. Tumorske celice NSP so bile transducirane z vektorjem, ki izraža GFP, za vizualizacijo. Lestvice, 50 μm. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SEM. Uporabljen je bil dvostranski Studentov t-test. **, P <0,01; ***, P <0,001.

Morda najbolj uveljavljen rezultat signalizacije IFN tipa II vključuje njegovo sposobnost induciranja mehanizma za predstavitev antigena. Dejansko je IFN induciral ekspresijo MHC-I (ali HLA v človeških celicah) na celični površini v našem modelu v pogojih proliferacije in staranja. Vendar pa je bila z IFN inducirana regulacija MHC-I bolj izrazita v starajočih se celicah, učinek, ki je bil povezan s povečano ekspresijo transporterja, povezanega z obdelavo antigena, drugimi faktorji obdelave antigena in strukturnimi komponentami MHC-I. Podobno preobčutljivost za IFN pri indukciji MHC-I/HLA so opazili pri celičnih linijah človeškega raka jeter in pljuč, ki so sprožile staranje. Ti rezultati kažejo, da lahko program staranja poveča predstavitev antigena v neimunskih celicah in s tem olajša imunski nadzor tumorja. Naši rezultati podpirajo model, po katerem končni vpliv starajočih se celic na biologijo tkiva narekujejo skupni učinki tega, kako pošiljajo in sprejemajo okoljske signale. Ne samo, da starajoče se celice inducirajo SASP, ki sproži preoblikovanje tkiva in spremeni celično stanje in sestavo imunskih celic v okolju, ampak tudi dramatično spremenijo svoj površinski element, kar vodi do diferencialne sposobnosti zaznavanja okoljskih dejavnikov, ki jih tukaj ponazarja IFN. Pomembno je, da prekinitev signalizacije IFN ni vplivala na indukcijo staranja ali SASP v našem sistemu, vendar je oslabila poznejšo regresijo tumorja, kar kaže, da spremenjeno okoljsko zaznavanje deluje usklajeno s SASP pri določanju končnega rezultata programa staranja - v tem primeru imunski nadzor. Zdi se, da so ti učinki del usklajenega epigenetskega programa, saj tako SASP kot programi zaznavanja kažejo izrazito odvisnost od faktorja preoblikovanja kromatina BRD4.

Čeprav je mehanizem imunskega nadzora v našem modelu odvisen od kooperativnih učinkov CD8 T-celic in populacij makrofagov, ki odražajo prehod iz "imunsko hladnega" v "imunsko vroče" tumorsko mikrookolje, lahko drugi prirojeni ali prilagodljivi tipi imunskih celic prepoznajo in čiste starajoče se celice v različnih kontekstih, ali pa do imunskega nadzora morda sploh ne pride (18, 19). Nedvomno nekatere od teh razlik odražajo heterogenost v izločanju faktorja SASP (13, 14), čeprav naši rezultati povečujejo možnost, da lahko obseg in narava spremenjenega zaznavanja okolja vpliva tudi na to, kako starajoče se celice vplivajo na biologijo tkiva. Čeprav sta izločitev zaznavanja IFN (prek Ifngr1 KO) in izbris MHC-I (B2M KO) v starajočih se tumorskih celicah oslabila njihov imunski nadzor in vivo, ni popolnoma odpravila regresije tumorja po indukciji staranja, kar kaže, da je zaznavanje IFN v starajočih se celicah ni edina pot, ki prispeva k regresiji tumorja. Ne glede na to dejstvo, da se lahko starajoče celice različno odzovejo na okoljske signale, pomeni, da bo njihovo končno molekularno stanje v tkivih drugačno kot v celični kulturi, kar poudarja potrebo po boljši karakterizaciji procesa in vivo.

Naši rezultati lahko pomagajo razložiti paradoksalne učinke biologije staranja v fiziologiji in boleznih ter imajo posledice za učinkovito uporabo terapevtikov, ki modulirajo staranje. Na primer, v našem modelu je bila razlika med očistkom starajočih se celic tumorja in obstojnostjo vsaj delno določena s prisotnostjo okoljskega IFN in celovitostjo signalizacije IFN tipa II v starajočih se celicah. To nakazuje, da bi variacije v sposobnosti starajočih se celic, da rekrutirajo in zaznavajo imunske celice, ki izločajo IFN, ali druge vrste imunskih celic lahko močno vplivale na očistek starajočih se celic, tako da bi zmanjšano okoljsko IFN ali zmanjšano signaliziranje IFN tipa II lahko omogočilo obstojnost starajočih celic v tkivih. V kontekstu raka lahko terapije, ki inducirajo staranje tumorskih celic - citostatični program - sprožijo imunsko posredovano regresijo tumorja ali ponovno senzibilizirajo tumorje za blokado imunske kontrolne točke, vendar to niso univerzalni rezultati. Kot taka lahko vpliva heterogenost v SASP (ki se lahko razlikuje med vrstami tumorskih celic in induktorji staranja) ali zaznavanjem in izločanjem IFN [na katerega morda vpliva delecija ali mutacija poti IFN ali komponent HLA (60) ali reverzibilnih transkripcijskih mehanizmov, ki so tukaj odkriti]. učinkovitost tovrstnih terapij pri bolnikih. V skladu s tem pojmovanjem indukcija specifičnih profilov SASP, ki jo poganja terapija, napoveduje izide bolnic v podskupini bolnic z rakom jajčnikov (61). Nasprotno pa lahko strategije za okrepitev imunskega nadzora starajočih se celic s povečanjem njihove občutljivosti na IFN (npr. z zaviralci PTPN2) pomagajo preusmeriti izhod programa proti zavrnitvi tumorskih celic. Predvidevamo, da lahko raziskovanje tega in drugih programov za preoblikovanje in zaznavanje tkiv v biopsijah tumorja pred in po zdravljenju (npr. s transkriptomskimi ali proteomskimi profili) razkrije nove odzivne biomarkerje in/ali kombinirane strategije za izboljšanje kliničnega obvladovanja raka.

REFERENCE

1. Di Micco R, Križhanovsky V, Baker D, d'Adda di Fagagna F. Cellično staranje pri staranju: od mehanizmov do terapevtskih priložnosti. Nat Rev Mol Cell Biol 2021; 22: 75–95.

2. Munoz-Espin D, Serrano M. Celično staranje: od fiziologije do patologije. Nat Rev Mol Cell Biol 2014;15:482–96.

3. Demaria M, Ohtani N, Youssef SA, Rodier F, Toussaint W, Mitchell JR, et al. Bistvena vloga starajočih se celic pri optimalnem celjenju ran z izločanjem PDGF-AA. Dev Cell 2014; 31: 722–33.

4. Xu M, Pirtshalava T, Farr JN, Weigand BM, Palmer AK, Weivoda MM, et al. Senolitiki izboljšajo telesno funkcijo in podaljšajo življenjsko dobo v starosti. Nat Med 2018; 24: 1246–56.

5. Serrano M, Lin AW, McCurrach ME, Beach D, Lowe SW. Onkogeni Ras izzove prezgodnje staranje celic, povezano s kopičenjem p53 in p16INK4a. Cell 1997; 88: 593–602.

6. Ewald JA, Desotelle JA, Wilding G, Jarrard DF. S terapijo povzročeno staranje pri raku. J Natl Cancer Inst 2010; 102: 1536–46.

7. Coppe JP, Desprez PY, Krtolica A, Campisi J. Sekretorni fenotip, povezan s staranjem: temna stran supresije tumorja. Annu Rev Pathol 2010; 5: 99–118.

8. Demaria M, O'Leary MN, Chang J, Shao L, Liu S, Alimirah F, et al. Celično staranje spodbuja škodljive učinke kemoterapije in ponovitev raka. Cancer Discov 2017; 7: 165–76.

9. Coppe JP, Patil CK, Rodier F, Sun Y, Munoz DP, Goldstein J, et al. Sekretorni fenotipi, povezani s staranjem, razkrivajo celično neavtonomne funkcije onkogenega RAS in tumorskega supresorja p53. PLoS Biol 2008; 6: 2853–68.

10. Tasdemir N, Banito A, Roe JS, Alonso-Curbelo D, Camiolo M, Tschaharganeh DF, et al. BRD4 povezuje preoblikovanje ojačevalca z imunskim nadzorom staranja. Cancer Discov 2016; 6: 612–29.

11. Chien Y, Scuoppo C, Wang X, Fang X, Balgley B, Bolden JE, et al. Nadzor sekretornega fenotipa, povezanega s staranjem, z NF-kappaB spodbuja staranje in poveča kemosenzitivnost. Genes Dev 2011; 25: 2125–36.

12. Kuilman T, Michaloglou C, Vredeveld LC, Douma S, van Doorn R, Desmet CJ, et al. Onkogeno povzročeno staranje, posredovano z vnetno mrežo, odvisno od interlevkina. Cell 2008; 133: 1019–31.

13. Basisty N, Kale A, Jeon OH, Kuehnemann C, Payne T, Rao C, et al. Proteomski atlas sekretomov, povezanih s staranjem, za razvoj biomarkerjev staranja. PLoS Biol 2020; 18: e3000599.

14. Hernandez-Segura A, de Jong TV, Melov S, Guryev V, Campisi J, Demaria M. Razkrivanje transkripcijske heterogenosti v starajočih se celicah. Curr Biol 2017; 27: 2652–60.

15. Xue W, Zender L, Miething C, Dickins RA, Hernando E, Križhanovsky V, et al. Staranje in očistek tumorja sproži obnova p53 v mišjih jetrnih karcinomih. Narava 2007; 445: 656–60.

16. Kang TW, Yevsa T, Woller N, Hoenicke L, Wuestefeld T, Dauch D, et al. Nadzor staranja predmalignih hepatocitov omejuje razvoj raka jeter. Narava 2011; 479: 547–51.

17. Ovadya Y, Landsberger T, Leins H, Vadai E, Gal H, Biran A, et al. Oslabljen imunski nadzor pospešuje kopičenje starajočih se celic in staranje. Nat Commun 2018; 9: 5435.

18. Lujambio A. Očistiti ali ne očistiti (stareče celice)? To je vprašanje. Bioeseji 2016; 38 Suppl 1: S56–64. 19. Di Mitri D, Toso A, Chen JJ, Sarti M, Pinton S, Jost TR, et al. Tumor, ki infiltrira Gr-1+ mieloidne celice, nasprotuje staranju pri raku. Narava 2014; 515: 134–7.

20. Ruscetti M, Leibold J, Bott MJ, Fennell M, Kulick A, Salgado NR, et al. Citotoksičnost, posredovana s celicami NK, prispeva k nadzoru tumorja s kombinacijo citostatikov. Znanost 2018; 362: 1416–22.

21. Llovet JM, Kelley RK, Villanueva A, Singal AG, Pikarsky E, Roayaie S, et al. Hepatocelularni karcinom. Nat Rev Dis Primers 2021; 7:6.

22. Chiang DY, Villanueva A, Hoshida Y, Peix J, Newell P, Minguez B, et al. Fokalni dobički VEGFA in molekularna klasifikacija hepatocelularnega karcinoma. Cancer Res 2008; 68: 6779–88.

23. Llovet JM, Castet F, Heikenwalder M, Maini MK, Mazzaferro V, Pinato DJ, et al. Imunoterapije za hepatocelularni karcinom. Nat Rev Clin Oncol 2022; 19: 151–72.

24. Sangro B, Sarobe P, Hervas-Stubbs S, Melero I. Napredek v imunoterapiji za hepatocelularni karcinom. Nat Rev Gastroenterol Hepatol 2021; 18: 525–43.

25. Levine AJ. Ciljanje na protein P53 za zdravljenje raka: translacijski učinek raziskav P53. Cancer Res 2022; 82: 362–4.

26. Xiao Y, Chen J, Zhou H, Zeng X, Ruan Z, Pu Z, et al. Kombinacija monoterapije p53 mRNA z blokado imunske kontrolne točke reprogramira imunsko mikrookolje za učinkovito zdravljenje raka. Nat Commun 2022; 13: 758.

27. Demir O, Barros EP, Offutt TL, Rosenfeld M, Amaro RE. Integriran pogled na dinamiko, funkcijo in ponovno aktivacijo p53. Curr Opin Struct Biol 2021; 67: 187–94.

28. Suda T, Liu D. Hidrodinamična dostava genov: njena načela in aplikacije. Mol Ther 2007; 15: 2063–9.

29. Hoshida Y, Nijman SM, Kobayashi M, Chan JA, Brunet JP, Chiang DY, et al. Integrativna analiza transkriptoma razkriva običajne molekularne podrazrede človeškega hepatocelularnega karcinoma. Cancer Res 2009; 69: 7385–92.

30. Kaech SM, Hemby S, Kersh E, Ahmed R. Molekularno in funkcionalno profiliranje diferenciacije spominskih CD8 T celic. Cell 2002; 111: 837–51.

31. Bruix J, Cheng AL, Meinhardt G, Nakajima K, De Sanctis Y, Llovet J. Prognostični dejavniki in napovedovalci koristi sorafeniba pri bolnikih s hepatocelularnim karcinomom: analiza dveh študij faze III. J Hepatol 2017; 67: 999–1008.

32. Adrover JM, Aroca-Crevillen A, Crainiciuc G, Ostos F, Rojas-Vega Y, Rubio-Ponce A, et al. Programirana 'razorožitev' proteoma nevtrofilcev zmanjša obseg vnetja. Nat Immunol 2020; 21: 135–44.

33. Zeisberger SM, Odermatt B, Marty C, Zehnder-Fjallman AH, Ballmer-Hofer K, Schwendener RA. Izčrpavanje makrofagov, povezanih s tumorjem, posredovano s klodronatom in liposomom: nov in zelo učinkovit pristop antiangiogene terapije. Br J Rak 2006; 95: 272–81.

34. De Simone G, Andreata F, Bleriot C, Fumagalli V, Laura C, Garcia-Manteiga JM, et al. Identifikacija podmnožice Kupfferjevih celic, ki je sposobna obnoviti disfunkcijo celic T, ki jo povzroča hepatocelularno pripravo. Imuniteta 2021; 54: 2089–100.

35. Dann E, Henderson NC, Teichmann SA, Morgan MD, Marioni JC. Diferencialno testiranje številčnosti na enoceličnih podatkih z uporabo k-grafov najbližjih sosedov. Nat Biotechnol 2022; 40: 245–53.

36. Kim HD, Park S, Jeong S, Lee YJ, Lee H, Kim CG, et al. 4–1BB prikazuje izrazito aktivacijsko stanje izčrpanih celic CD8(+) T, ki se infiltrirajo v tumor, v hepatocelularnem karcinomu. Hepatologija 2020; 71: 955–71.

37. Li Y, Wang Z, Jiang W, Zeng H, Liu Z, Lin Z, et al. Tumorsko infiltrirane celice TNFRSF9(+) CD8(+) T opredeljujejo različne podskupine svetloceličnega karcinoma ledvičnih celic s prognozo in imunoterapevtskim odzivom. Onkoimunologija 2020; 9: 1838141.

38. Bindea G, Mlečnik B, Tosolini M, Kirilovsky A, Waldner M, Obenauf AC, et al. Prostorsko-časovna dinamika intratumorskih imunskih celic razkriva imunsko pokrajino pri človeškem raku. Imuniteta 2013; 39: 782–95.

39. Kuang DM, Zhao Q, Peng C, Xu J, Zhang JP, Wu C, et al. Aktivirani monociti v peritumoralni stromi hepatocelularnega karcinoma spodbujajo imunski privilegij in napredovanje bolezni skozi PD-L1. J Exp Med 2009; 206: 1327–37.

40. Lu LG, Zhou ZL, Wang XY, Liu BY, Lu JY, Liu S, et al. Blokada PD-L1 sprosti intrinzične protitumorske lastnosti glikolitičnih makrofagov v hepatocelularnem karcinomu. Gut 2022; 71: 2551–60.

41. Milanovic M, Fan DNY, Belenki D, Dabritz JHM, Zhao Z, Yu Y, et al. Reprogramiranje, povezano s staranjem, spodbuja razvoj raka. Narava 2018; 553: 96–100.

42. Yousef H, Czupalla CJ, Lee D, Chen MB, Burke AN, Zera KA, et al. Stara kri škoduje hipokampalni nevralni prekurzorski aktivnosti in aktivira mikroglijo preko možganske endotelne celice VCAM1. Nat Med 2019; 25: 988–1000.

43. Rapisarda V, Borghesan M, Miguela V, Encheva V, Snijders AP, Lujambio A, et al. Integrin beta 3 uravnava celično staranje z aktiviranjem poti TGF-beta. Cell Rep 2017; 18: 2480–93.

44. Jochems F, Thijssen B, De Conti G, Jansen R, Pogacar Z, Groot K, et al. Rak SENESCopedia: opis staranja rakavih celic. Cell Rep 2021;36:109441.

45. Perna F, Berman SH, Soni RK, Mansilla-Soto J, Eyquem J, Hamieh M, et al. Vključevanje proteomike in transkriptomike za sistematično kombinatorno zdravljenje himernih antigenskih receptorjev AML. Cancer Cell 2017; 32: 506–19.

46. ​​Hoare M, Ito Y, Kang TW, Weekes MP, Matheson NJ, Patten DA, et al. NOTCH1 posreduje preklapljanje med dvema različnima sekretomoma med staranjem. Nat Cell Biol 2016; 18: 979–92.

47. Castro F, Cardoso AP, Goncalves RM, Serre K, Oliveira MJ. Interferon-gama na križišču tumorskega imunskega nadzora ali izogibanja. Front Immunol 2018; 9: 847.

48. Platanias LC. Mehanizmi signalizacije, posredovane z interferonom tipa I in tipa II. Nat Rev Immunol 2005;5:375–86.

49. Manguso RT, Pope HW, Zimmer MD, Brown FD, Yates KB, Miller BC, et al. In vivo CRISPR presejanje identificira Ptpn2 kot tarčo imunoterapije raka. Narava 2017; 547: 413–8.

50. Song MM, Shuai K. Zaviralec signalizacije citokinov (SOCS) 1 in SOCS3, vendar ne SOCS2 proteini, zavirajo protivirusne in antiproliferativne aktivnosti, ki jih posreduje interferon. J Biol Chem 1998; 273: 35056–62.

51. Kleppe M, Soulier J, Asnafi V, Mentens N, Hornakova T, Knoops L, et al. PTPN2 negativno uravnava onkogeni JAK1 pri T-celični akutni limfoblastni levkemiji. Blood 2011; 117: 7090–8.

52. Zhou F. Molekularni mehanizmi IFN-gama za izboljšanje obdelave in predstavitve antigena MHC razreda I. Int Rev Immunol 2009; 28: 239–60.

53. McCarthy MK, Weinberg JB. Imunoproteasom in virusna okužba: kompleksni regulator vnetja. Front Microbiol 2015; 6:21.

54. Yoshihama S, Vijayan S, Sidiq T, Kobayashi KS. NLRC5/CITA: ključni igralec pri imunskem nadzoru raka. Trends Cancer 2017; 3: 28–38.

55. Kalaora S, Lee JS, Barnea E, Levy R, Greenberg P, Alon M, et al. Izražanje imunoproteasomov je povezano z boljšo prognozo in odzivom na terapije kontrolnih točk pri melanomu. Nat Commun 2020; 11:896.

56. Efeyan A, Ortega-Molina A, Velasco-Miguel S, Herranz D, Vassilev LT, Serrano M. Indukcija p53-odvisnega staranja z antagonistom MDM2 nutlin-3a v mišjih celicah fibroblasta izvor. Cancer Res 2007; 67: 7350–7.

57. Hoekstra ME, Bornes L, Dijkgraaf FE, Philips D, Pardieck IN, Toebes M, et al. Modulacija tumorskih celic opazovalcev na dolge razdalje z IFNgamma, ki ga izločajo celice CD8(+). Nat Rak 2020; 1: 291–301.

58. Ruscetti M, Morris JPt, Mezzadra R, Russell J, Leibold J, Romesser PB, et al. Vaskularno preoblikovanje, ki ga povzroča staranje, ustvarja terapevtske ranljivosti pri raku trebušne slinavke. Celica 2020; 181: 424–41.

59. Dighe AS, Richards E, Stari LJ, Schreiber RD. Izboljšana in vivo rast in odpornost proti zavrnitvi tumorskih celic, ki izražajo dominantne negativne receptorje IFN gama. Imuniteta 1994; 1: 447–56.

60. Gao J, Shi LZ, Zhao H, Chen J, Xiong L, He Q, et al. Izguba genov poti IFN gama v tumorskih celicah kot mehanizem odpornosti na terapijo proti CTLA-4. Celica 2016; 167: 397–404.

61. Paffenholz SV, Salvagno C, Ho YJ, Limjoco M, Baslan T, Tian S, et al. Indukcija staranja narekuje odziv na kemoterapijo in imunoterapijo v predkliničnih modelih raka jajčnikov. Proc Natl Acad Sci USA 2022; 119: e2117754119.

62. Shao DD, Xue W, Krall EB, Bhutkar A, Piccioni F, Wang X, et al. KRAS in YAP1 se združita, da uravnavata EMT in preživetje tumorja. Celica 2014; 158: 171–84.

63. Zhu C, Kim K, Wang X, Bartolome A, Salomao M, Dongiovanni P, et al. Aktivacija hepatocitnega zareza povzroči fibrozo jeter pri nealkoholnem steatohepatitisu. Sci Transl Med 2018;10:eaat0344.

64. Susaki EA, Tainaka K, Perrin D, Yukinaga H, Kuno A, Ueda HR. Napredni protokoli CUBIC za čiščenje in slikanje celih možganov in celega telesa. Nat Protoc 2015; 10: 1709–27.

65. Bolger AM, Lohse M, Usadel B. Trimmomatic: prilagodljiv prirezovalnik za podatke zaporedja Illumina. Bioinformatika 2014; 30: 2114–20. 66. Dobin A, Davis CA, Schlesinger F, Drenkow J, Zaleski C, Jha S, et al. STAR: ultra hitri univerzalni RNA-seq aligner. Bioinformatika 2013; 29: 15–21.

67. Anders S, Pyl PT, Huber W. HTSeq-ogrodje Python za delo s podatki zaporedja z visoko zmogljivostjo. Bioinformatika 2015; 31: 166–9.

68. Love MI, Huber W, Anders S. Moderirana ocena spremembe gube in disperzije za podatke RNA-seq z DESeq2. Genome Biol 2014; 15: 550.

69. Chen EY, Tan CM, Kou Y, Duan Q, Wang Z, Meirelles GV, et al. Enrichr: interaktivno in sodelovalno orodje za analizo obogatitve seznama genov HTML5. BMC Bioinf 2013; 14: 128.

70. Foroutan M, Bhuva DD, Lyu R, Horan K, Cursons J, Davis MJ. Točkovanje molekularnih fenotipov z enim vzorcem. BMC Bioinf 2018; 19: 404.

71. Binder JX, Pletscher-Frankild S, Tsafou K, Stolte C, O'Donoghue SI, Schneider R, et al. PREDELKI: poenotenje in vizualizacija dokazov o subcelični lokalizaciji beljakovin. Podatkovna zbirka (Oxford) 2014;2014:bau012.

72. Raziskovalna mreža atlasa genoma raka. Celovita in integrativna genomska karakterizacija hepatocelularnega karcinoma. Celica 2017; 169: 1327–41.

73. Colaprico A, Silva TC, Olsen C, Garofano L, Cava C, Garolini D, et al. TCGAbiolinks: paket R/Bioconductor za integrativno analizo podatkov TCGA. Nucleic Acids Res 2016; 44: e71.

74. Hanzelmann S, Castelo R, Guinney J. GSVA: analiza variacije nabora genov za podatke mikromrež in RNA-seq. BMC Bioinf 2013; 14:7.

75. Bankhead P, Loughrey MB, Fernandez JA, Dombrowski Y, McArt DG, Dunne PD, et al. QuPath: odprtokodna programska oprema za digitalno analizo slik patologije. Sci Rep 2017; 7: 16878.

76. Bernstein NJ, Fong NL, Lam I, Roy MA, Hendrickson DG, Kelley DR. Solo: identifikacija dubleta v enocelični RNA-Seq prek delno nadzorovanega globokega učenja. Cell Syst 2020; 11: 95–101.

77. Satija R, Farrell JA, Gennert D, Schier AF, Regev A. Prostorska rekonstrukcija podatkov o ekspresiji enoceličnega gena. Nat Biotechnol 2015; 33: 495–502.

78. McInnes L, Healy J, Melville J. UMAP: aproksimacija enotnega kolektorja in projekcija za zmanjšanje dimenzij. arXiv: 1802.03426 [Predtisk]. 2018. Dostopno prek: https://doi.org/10.48550/arXiv.1802.03426.

79. Traag VA, Waltman L, van Eck NJ. Od Louvaina do Leidna: zagotavljanje dobro povezanih skupnosti. Sci Rep 2019; 9: 5233.

80. Korsunsky I, Millard N, Fan J, Slowikowski K, Zhang F, Wei K, et al. Hitra, občutljiva in natančna integracija enoceličnih podatkov s Harmony. Nat metode 2019; 16: 1289–96.