Enocelična transkriptomika razkriva motene interakcije med celicami ledvičnega filtra po zgodnji in selektivni poškodbi podocitov

Kronične ledvične bolezni (CKD)še vedno prizadene 700 milijonov ljudi po vsem svetuspeciFic terapijeprimanjkuje.1 velikoledvične bolezni izvirajo in theglomerul, theFifiltracijska enota ledvic. Glomerul je sestavljen iz (i) podocitov, specializiranih postmitotičnih celic z izdelanimi nožnimi izrastki, ki se prepletajo med prsti in tvorijo diafragme z režami ter se ovijajo okoli glomerularnih kapilar; (ii) endotelijskih celic, ki ležijo nasproti podocitov na skupni glomerularni bazalni membrani (GBM); (iii) mezangialne celice, ki tvorijo matriks, ki zagotavlja strukturno podporo za glomerul; in (iv) parietalnih epitelijskih celic (PEC), ki obdajajo Bowmanovo kapsulo.2 Zlasti poškodba podocitov vodi do številnih zelo razširjenih progresivnih bolezni ledvic, vključno z diabetično ledvično boleznijo (DKD), žariščno segmentno glomerulosklerozo (FSGS) in nefrotskim sindromom (tako idiopatskim kot genetskim). Kanonični vzorec poškodbe povzroči izgubo interdigitacijskih podocitnih stopalnih procesov, znanih kot izbris nožnih procesov, ki ga povzroči preureditev aktinskega citoskeleta. Ta izbris vodi do motenj režaste diafragme, fizične pregrade, ki deluje kotFilter, čemur sledi odstop podocitov ali smrt.3,4 Po drugi strani pa sta poleg nepoškodovanih podocitov tvorba in vzdrževanjeglomerularniFifiltracijska pregradazahtevatiintraglomerularna komunikacija, ki je strogo nadzorovana z vrsto avtokrinih in parakrinih signalnih mehanizmov. Na primer, vaskularni endotelijski rastni faktor A (VEGFA) je signal za preživetje endotelijskih celic, ki jih izločajo podociti, rastni faktor B, pridobljen iz trombocitov (PDGFB), pa je signal za preživetje za mezangialne celice, ki jih izločajo endotelne celice.5 Motnje teh medceličnih interakcij so pogosto opažene pri množici glomerulnih bolezni, vključno s FSGS in DKD.6 Zato lahko prepoznavanje najzgodnejših motečih sprememb glomerulusa ponudi nove cilje in priložnost za optimizacijo terapevtskega uspeha zazdravljenje bolezni ledvic.

NOVA ZELIŠČA ZAZDRAVLJENJE LEDVIČNIH BOLEZNI

Podprt s strani Nacionalnega inštituta za sladkorno bolezen, prebavne in ledvične bolezni Nacionalnega inštituta NIH, dodeljuje DK103658, DK099465 in DK095045 (AG).intraglomerularna komunikacija, ki je strogo nadzorovana z vrsto avtokrinih in parakrinih signalnih mehanizmov. Vaskularni endotelijski rastni faktor A (VEGFA) je na primer signal za preživetje endotelijskih celic, ki jih izločajo podociti, rastni faktor B, pridobljen iz trombocitov (PDGFB), pa je signal za preživetje za mezangialne celice, ki jih izločajo endotelne celice.5 Motnje teh celičnih celic celične interakcije pogosto opažamo pri množici glomerulnih bolezni, vključno s FSGS in DKD.6 Zato lahko odkrivanje najzgodnejših motečih sprememb glomerulusa ponudi nove cilje in priložnost za optimizacijo terapevtskega uspeha pri zdravljenju ledvičnih bolezni

Sekvenciranje enocelične RNA (scRNAseq) je revolucioniralo sposobnost preučevanja posameznih tipov celic kompleksnih tkiv in stanj celic po specifičnih motnjah.7,8 Nedavne študije scRNAseq na ledvicah so zagotovile vpogled v transkripcijske profile vrst ledvičnih celic pri zdravih miših in človeških vzorcev kot tudi pri nekaterih boleznih, vključno z DKD in lupusnim nefritisom.9e12 Vendar so bile podrobne študije stanj glomerulnih celic omejene zaradi majhnega števila celic, ki so na voljo za analizo. Poleg tega najzgodnejše spremembe, specifične za vrsto celic, ki se pojavijo v vseh glomerularnih celicah ob poškodbi podocitov, niso bile spremljane in jih je treba še definirati.

Ablacija podocitov prek podocitno specifične inducibilne delecije esencialne endogene beljakovine, CTCF, vodi do progresivne proteinurične ledvične bolezni in kronične ledvične bolezni.13 Zgodovinsko so bili mišji modeli kronične ledvične bolezni ustvarjeni z induciranjem poškodbe ledvic z eksogenimi toksini ali kirurškimi posegi, suboptimalnimi sistemi, ki ne dosegajo rekapitulacijo zaporednih mehaničnih sprememb. Izbris CTCF, esencialne endogene molekule, povzroči hitro izgubo podocitov, hudo progresivno albuminurijo, spremembe presnove kostnih mineralov, odpoved ledvic in prezgodnjo smrt.13 Model inducibilne za podocite specifične delecije CTCF (iCTCFpod / ) nudi edinstveno priložnost za študij spremembe intraglomerularnih medceličnih interakcij kot posledica inducirane poškodbe podocitov. Ekspresije CTCF v podocitih ni mogoče zaznati na najzgodnejši časovni točki, po 1 tednu indukcije Cre z doksiciklinom v iCTCFpod/miši.13 Pomembna in progresivna izguba podocitov, merjena s histološko analizo, se začne 2 tedna po indukciji Cre. V trenutni študiji je bila izvedena podrobna analiza v 1-tedenski časovni točki, da bi identificirali najzgodnejše spremembe v medsebojnih interakcijah intraglomerularnih celic, ki jih poganja poškodba podocitov in ki končno vodijo do kronične ledvične bolezni.

Materiali in metode

Nega živali

To študijo je odobril Odbor za nego in uporabo živali pri Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School. Vse študije na živalih so bile izvedene v skladu s smernicami, ki jih je določil in odobril Odbor za nego in uporabo živali pri Brigham and Women's Hospital, Harvard Medical School. Miši iCrepod-Ctcfwt/fl so bile ustvarjene, kot je opisano prej13, in sorodstveno vzrejene, da so bile miši iCrepod-Ctcffl/fl (iCTCFfl/fL) in iCrepod-Ctcfwt/wt [divjega tipa (WT)]. V tej študiji so bili uporabljeni mišji samci in samice. Doksiciklin (4 g/L) (Sigma D9891) so neprekinjeno dajali v pitno vodo, ki je vsebovala saharozo (50 g/L) (VWR BDH0308) tako iCTCFfl/fL (generira iCTCFpod/miši) kot WT kontrolnim mišem iz legla (6 do 8 tedna starosti na začetku uporabe doksiciklina), da spodbudi ekspresijo Cre posebej v podocitih.

Glomerularna obogatitev iz cele ledvice

Miši iCTCFpod / in WT smo žrtvovali po 1 tednu zdravljenja z doksiciklinom, ledvice pa hitro razrezali in sprali z ledeno hladno Hanksovo uravnoteženo raztopino soli (kataloška številka 14170112, Thermo Scientific, Waltham, MA). Po odstranitvi ledvičnih kapsul smo glomerule obogatili pri 4 C s tehniko sejanja14 s siti 180- mm, 75- mm in 53- mm. Frakcije, obogatene z glomeruli, zbrane iz sita 53- mm, so bile sprane z ledeno mrzlo 1 Hanksovo uravnoteženo raztopino soli in postavljene na led.

Priprava enoceličnih suspenzij

Obdelava podatkov in nadzor kakovosti

A Cellranger toolkit (version 2.1.1) was used to perform demultiplexing using the cellranger mkfastq command and the cellranger count command for alignment to the mouse transcriptome, cell barcode partitioning, collapsing unique molecular identifier (UMI) to transcripts, and gene-level quantification. Cells were filtered to include cells expressing a minimum of 500 genes and a maximum of 4000 genes. Furthermore, the percentage of reads mapping to mitochondrial genes was capped at 12%. DoubletFinder was used to identify potential doublets.15 Clusters with >75 % celic, razvrščenih kot dvojniki z visoko stopnjo zaupanja, je bilo odstranjenih iz nadaljnje analize. Preostale celice, razvrščene kot dvojniki z visoko stopnjo zaupanja, so bile prav tako odstranjene iz nadaljnje analize. Analiza je vključevala zmanjšanje vzorčenja števila celic, da bi upoštevali to razliko. Na primer, če je bilo v določenem tipu celic manj celic WT, je bil za analizo diferencialne ekspresije uporabljen naključni vzorec celic iCTCF, ki je enak številu celic WT.

Nenadzorovano združevanje v gruče in zmanjšanje dimenzionalnosti

Privzete nastavitve v paketu Seurat R16 različice 3.0 so bile uporabljene za normalizacijo (NormalizeData) števila genskih ekspresij, identifikacijo spremenljivih genov (FindVariableGenes), iskanje integracijskih sider (FindIntegrationAnchors) in integracijo vzorcev (IntegrateData) . Do neželene variacije je prišlo zaradi števila UMI in razmerja odčitkov, preslikanih na mitohondrijske gene (ScaleData). Zmanjšanje dimenzionalnosti je bilo izvedeno z analizo glavnih komponent (RunPCA) na zelo variabilnih genih. Funkcija PCElbowPlot() je bila uporabljena za razlikovanje glavnih komponent za nadaljnjo analizo. Za združevanje vseh celic v gruče so prve 40 glavne komponente zadostno zajele vso varianco. Molekularno ločeni grozdi so bili identificirani s privzetimi parametri (FindClusters) in ločljivostjo 0.4 (FindNeighbors). Podatki so bili obdelani in prilagojeni, kot je opisano zgoraj, po podskupini glomerularnih celic. Skupaj 30 glavnih komponent je bilo uporabljenih za nizvodno združevanje v gruče pri ločljivosti 0,3 (FindNeighbors).

Klasifikacija tipov celic

Geni, obogateni z grozdi ali markerji, so bili izračunani z uporabo Wilcoxonovega testa vsote rangov (FindAllMarkers) za diferencialno izražanje genov v celicah grozdov v primerjavi z vsemi drugimi celicami in izbiro tistih genov, ki prestanejo mejno vrednost prilagojene vrednosti P (stopnja lažnega odkritja) {{1 }}.05 kot predstavnik grozda. Identiteta grozda je bila dodeljena s primerjavo genov, ki temeljijo na podatkih, s seznamom genov, izbranih v literaturi, za vrste zrelih ledvičnih celic.

Diferencialna analiza izražanja genov

Analiza diferencialne ekspresije v parih v Seuratu (FindMarkers) je bila uporabljena s pragom spremembe gub dnevnika, nastavljenim na {{0}}.01, in privzetimi parametri za analizo diferencialne ekspresije med iCTCFpod / in celicami WT v določeni gruči. Znotraj FindMarkers je bil ident.1 nastavljen na iCTCFpod / celice, specifične za gručo, ident.2 pa na ustrezne celice WT, specifične za gručo. Geni s prilagojenim P <0,05 so veljali za pomembne.

Analiza prevelike zastopanosti

Analiza prekomerne zastopanosti je bila uporabljena za določitev, ali so bile katere koli znane biološke funkcije ali procesi preveč zastopani ali obogateni na seznamu(-ih) različno izraženih genov.17 Za analizo prekomerne zastopanosti je bil uporabljen R paket clusterProfiler,18 natančneje funkcija enrichGO. Uporabljeni so bili privzeti parametri, z izjemo ont Z BP, pvaluecutoff Z 0.25 in qvaluecutoff Z 0.25. Nato je bil uporabljen R paket enrichplot (GitHub, https://github.com/YuLab-SMU/enrichplot, zadnji dostop 30. avgusta 2021), natančneje funkcija emaplot, za vizualizacijo rezultatov obogatitve z izrisom najvišjih pogojev obogatitve.

Analiza ligandnega receptorja

iTALK19 je bil uporabljen za preslikavo receptorjev na ligande, ki so bili različno izraženi v iCTCFpod/podocitih. Natančneje, rawParse je bil uporabljen za izračun povprečne izraženosti vsakega gena z uporabo prilagojenih podatkov iz Seurata. FindLR z uporabo podatkovnega tipa Z meancount je bil uporabljen za identifikacijo parov liganda in receptorja. Zanimivi pari ligandov in receptorjev so bili narisani z uporabo privzetih parametrov LRPlot. Debelina črt kaže relativno povprečno izraženost liganda, velikost konice puščice pa relativno povprečno izraženost receptorja.

NicheNet analiza

Paket R NicheNet20 je bil uporabljen za napovedovanje interakcij ligandreceptorjev, ki bi lahko povzročile spremembe izražanja genov v vrsti celice, ki nas zanima. Za to analizo so bili združeni vsi grozdi podocitov in vsi endotelijski grozdi. Uporabljeni so bili vsi privzeti parametri z izjemo nastavitve spodnjega mejnega praga 0.11 za vizualizacijo pripravi_liganda_tarče_. Obdelava slik HCR in kvantifikacija Slike so bile obdelane s programsko opremo ImageJ2 (NIH, Bethesda, MD; http://imagej.nih.gov/ij). Za datoteke ImageJ je bila uporabljena različica 2.1.0/1.53c (http://imagej.net/ Contributors (zadnji dostop 2. avgusta 2020). Neobdelane datoteke ND2 so bile odštete iz ozadja z metodo Rolling Ball (kotaleči se Z 50 drseči sklad) Srednje intenzivnosti slik Z-sklada so bile nato projicirane, kanali slik pa so bili razdeljeni in shranjeni ločeno. DAPI kanala in za merjenje integrirane intenzivnosti fluorescence v preostalih kanalih so bili ovrednoteni štirje WT in štirje iCTCFpod/miši za statistično analizo.

Podporna storitev Wecistanche-največjega izvoznika cistanche na Kitajskem:

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/telefon:+86 15292862950

Nakupujte za več podrobnosti o specifikacijah:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

KLIKNITE TUKAJ ZA NARAVNI ORGANSKI IZVLEČEK CISTANCHE S 25 % EHINAKOZIDA IN 9 % AKTEOZIDA ZA DELOVANJE LEDVIC