Majhni, a mogočni – eksosomi, novi medcelični posredniki pri nevrodegeneraciji 1. del

Preprost povzetek:

Eksosomi so biološki nanodelci, nedavno prepoznani kot medcelični prenašalci sporočil. Vsebujejo tovor lipidov, beljakovin in RNA. Svojo vsebino lahko prenesejo ne le v celice v bližini, temveč tudi v celice na daljavo.

Eksosomi so na novo odkrito medcelično komunikacijsko orodje, ki lahko sprosti majhne in občutljive vezikle v okoliške celice, s čimer dostavi nekatere beljakovine, signalne snovi in ​​druge snovi okoliškim celicam. Te snovi lahko pomagajo celicam spremeniti njihovo stanje in celo vplivajo na rast, razvoj, metabolizem in druge vidike drugih celic. V zadnjih letih so študije pokazale, da imajo eksosomi pomembno vlogo pri delovanju človeških možganov, zlasti pri ohranjanju in izboljšanju spomina.

Prvič, eksosomi lahko spodbujajo prenos signala med nevroni. Prenos informacij med nevroni je eden od nujnih pogojev za normalno delovanje živčnega sistema, eksosomi pa imajo vlogo prenašalcev sporočil, ki lahko poskrbijo za bolj gladek prenos informacij med nevroni in s tem izboljšajo možgansko kognicijo in spomin.

Drugič, eksosomi lahko uravnavajo tudi metabolizem nevronov. V procesu nevronov, ki proizvajajo in sproščajo eksosome, je vključenih veliko število presnovnih procesov, ki spodbujajo ravnovesje in regulacijo celičnega metabolizma. Ti procesi ne morejo samo povečati sposobnosti nevronov, ampak tudi pomagajo odstraniti presnovne odpadke in škodljive molekule ter ohranjati možganske celice zdrave.

Nenazadnje lahko eksosomi tudi pomagajo nevronom popraviti poškodbe. Številni proteini in nukleinske kisline, ki jih prenašajo eksosomi, so koristni za celično rast, popravilo in regeneracijo ter lahko spodbujajo popravilo in regeneracijo nevronov, s čimer izboljšajo sposobnost preživetja možganskih celic ter okrepijo spominske centre in kognitivne sposobnosti.

Če povzamemo, obstaja tesna povezava med eksosomi in spominom. Spomin otrok lahko spremenimo tako, da začnemo z dieto. Aktivno usmerjanje prehranske strukture otrok in uživanje več hrane, bogate s koristnimi sestavinami, kot so maščobne kisline, beljakovine in vitamini, lahko spodbudita proizvodnjo in sproščanje eksosomov, s čimer otrokom pomagata izboljšati njihove sposobnosti učenja in spomina. Otrokom lahko ponudimo tudi nekaj iger in vaj za treniranje možganov, da izzovejo in uveljavijo svoje mišljenje, spodbudijo potencial eksosomov in igrajo boljšo vlogo. Vidimo lahko, da moramo izboljšati spomin in Cistanche lahko bistveno izboljša spomin, saj je Cistanche tradicionalna kitajska medicina s številnimi edinstvenimi učinki, med katerimi je tudi izboljšanje spomina. Učinkovitost Cistanche izhaja iz različnih aktivnih sestavin, ki jih vsebuje, vključno s taninsko kislino, polisaharidi, flavonoidnimi glikozidi itd. Te sestavine lahko spodbujajo zdravje možganov na več načinov.

Kliknite Know za izboljšanje kratkoročnega spomina

Ta edinstvena sposobnost jim omogoča, da modulirajo fiziologijo prejemnih celic. V možganih igrajo eksosomi vlogo pri nevrodegenerativnih boleznih, kot sta Alzheimerjeva bolezen, Parkinsonova bolezen in amiotrofična lateralna skleroza.

Povzetek:

Eksosomi endosomskega izvora so en razred zunajceličnih veziklov, ki so pomembni pri medcelični komunikaciji. Eksosome sproščajo vse celice v našem telesu in njihov tovor, ki ga sestavljajo lipidi, beljakovine in nukleinske kisline, ima odtis, ki odraža njihov starševski izvor.

Eksosomski tovor ima moč modulirati fiziologijo prejemnih celic v bližini celic, ki sproščajo, ali celic na daljavo. Izkoriščanje potenciala eksosomov je odvisno od čistosti priprave eksosomov.

Zato je bilo razvitih veliko metod za izolacijo in nudimo kratek povzetek več metod. Kljub osamljenosti, ki jo povzroča krvno-možganska pregrada, celice v osrednjem živčevju niso imune na eksosomske intruzivne vplive. Tako nevroni kot gliar sproščajo eksosome, pogosto na način, ki je odvisen od aktivnosti.

Podan je kratek opis eksosomov, ki jih sproščajo različne celice v možganih, in njihova vloga pri vzdrževanju homeostaze CNS. Značilnost številnih nevrodegenerativnih bolezni je kopičenje beljakovinskih agregatov. Nedavne študije nakazujejo medcelično komunikatorsko vlogo eksosomov pri širjenju napačno zvitih proteinov, kar pomeni širjenje patologije.

V tem pregledu razpravljamo o možnih prispevkih eksosomov pri napredovanju Alzheimerjeve bolezni, Parkinsonove bolezni in amiotrofične lateralne skleroze.

Razumevanje prispevkov eksosomov v patogenezi nevrodegeneracije odpira polje za uporabo eksosomov kot terapevtskih sredstev za dostavo zdravil v možgane, saj eksosomi prehajajo krvno-možgansko pregrado.

Ključne besede: eksosomi; nevroni; glialne celice; centralni živčni sistem (CNS); nevrodegenerativne bolezni;Alzheimerjeva bolezen; Parkinsonova bolezen; amiotrofična lateralna skleroza.

1. Uvod in zgodovinski pogled

Medcelična komunikacija je zelo pomembna za embrionalni razvoj, regeneracijo/zamenjavo epitelija, gametogenezo in vzdrževanje homeostaze.

Z ultrastrukturnimi in biokemičnimi študijami je bilo ugotovljenih več mehanizmov medcelične komunikacije, kot sta endocitoza/eksocitoza in zajetje štrlečih citoplazemskih mehurčkov [1–3]. Identificiran je bil še en akter, zunajcelični vezikli, vendar njihova vloga v medcelični komunikaciji ni bila takoj cenjena [4].

Zunajcelični vezikli so bili odkriti po naključju med preiskavo sproščanja encimov, povezanih s plazemsko membrano, ekto-ATPaze in ekto-50-nukleotidaze v gojišče celične kulture. Leta 1981 so Tramsandovi sodelavci gojili normalne in neoplastične celične linije mišjega in človeškega izvora v mediju brez seruma, ker je bilo znano, da ima serum katalitično aktivnost ATPaze in 50-nukleotidaze.

Po odstranitvi lebdečih celic in ostankov smo kondicionirani medij centrifugirali pri hitrosti 310,000× g 90 minut v rotorju Spinco Ti-70 in pelete pregledali pod elektronskim mikroskopom. Odkriti sta bili dve populaciji z zunajcelično membrano obdanih veziklov, ena s povprečnim premerom med 500 in 1000 nm in druga, manjša populacija s premerom ~40 nm.

Ti vezikli, ki so jih avtorji sprva opisali kot "izluščeni vezikli", so vsebovali encimsko aktivnost 50-50-nukleotidaze in ATPaze. Poleg tega so izluščeni vezikli vsebovali RNA in fosfolipide, ki so se razlikovali od matičnih celic oziroma matične plazemske membrane.

Inkubacija odluščenih veziklov iz celic glioma C6 s celicami nevroblastoma, vnaprej označenimi s 32P, je spodbudila defosforilacijo proteinov nevroblastoma s sočasnim sproščanjem prostega radioaktivno označenega fosforja (32P).

Ti podatki so pokazali, da odluščeni vezikli niso le prenašalci celičnih odpadkov (encimov), temveč imajo fiziološko funkcijo. Tram in sodelavci so skovali izraz eksosomi, da bi opisali "odluščene vezikle" [5] (za zgodovino zunajceličnih veziklov si oglejte članek [6] pred letom 1981). Nekaj ​​let pozneje sta dve raziskovalni skupini neodvisno preučevali usodo transferinskega receptorja v retikulocitih z elektronsko mikroskopijo [7–9].

Zoreči retikulociti ne potrebujejo transferina, zato izgubijo receptorje za transferin. Obe skupini sta opazili, da gojeni retikulociti sproščajo majhne vezikle s premerom ~ 50 nm v zunajcelični prostor.

Ti majhni vezikli so vsebovali nerazgrajene transferinske receptorje. Leta 1987 so Johnston in sodelavci uporabili izraz eksosomi za opis majhnih veziklov, ki vsebujejo transferinske receptorje [10]. Po teh začetnih letih je bil uresničen potencial eksosomov kot novih medceličnih prenašalcev sporočil, ki lahko modulirajo fiziologijo ciljnih celic.

Zanimivo je, da se nastanek eksosomov začne z endocitozo (proces identificiran leta 1883; pregledal [3]) v celicah in sproščanje eksosomov v znotrajcelični prostor uporablja proces eksocitoze. Od njihovega začetnega odkritja zdaj vemo, da so eksosomi podvrsta zunajceličnih veziklov. endocitnega izvora z razponom velikosti 40–160 nm v premeru [11].

Sledilne študije so pokazale, da so makromolekule endocitozirane v s ščetinami prevlečenih (tj. s klatrinom prevlečenih) invaginacijah ali jamicah na celični površini. Te invaginacije se sčasoma ločijo od plazemske membrane in jih zaznamo v citoplazmi.

Po izgubi ščetin (tj. klatrina) endocitozirani obloženi vezikli postanejo gladki in se zlijejo z zgodnjimi endosomi za bodisi hitro recikliranje nazaj na celično površino (recikliranje endosomov na sliki 1) [12] ali pa dozorijo, da nastanejo pozni endosomi.

Zgodnji in pozni endosomi delujejo kot "središča za razvrščanje" za ustrezno usmerjanje njihove vsebine: (i) za retrogradni transport v trans-Golgijevo omrežje (tj. pridobivanje endosoma v TGN) [13,14]; (ii) na lizosome za razgradnjo makromolekul v preproste produkte za ponovno uporabo v celici [15,16]; in/ali (iii) za recikliranje na celično površino skozi multivezikularna telesa [17].

Med zorenjem zgodnjih endosomov v poznejše endosome je notranja endosomska membrana podvržena invaginaciji, kar povzroči nastanek intraluminalnih veziklov (zdaj označenih kot eksosomi). Specifične makromolekule, kot so citosolni proteini, nukleinske kisline in lipidi, so razvrščene v razvijajoče se eksosome.

Pozni endosomi, napolnjeni z eksosomi, so prepoznani kot multivezikularna telesa, ki migrirajo proti plazemski membrani. Po zlitju s plazemsko membrano multivezikularna telesa sproščajo eksosome v zunajcelični prostor skozi proces eksocitoze (slika 1) [18,19]. Velika podmnožica proteinov, ki se zaporedno rekrutirajo, igra odločilno vlogo v procesu endocitoze do zgodnjih endosomov, zorenja endosomov do poznih endosomov in njihove kasnejše znotrajcelične usode (pregled [17,18,20]).

Pomen teh proteinov je poudarjen z njihovo izgubo in/ali mutacijo(-ami), ki povzročajo različne bolezni. Na primer, proteini Strumpellin in SWIP so del kompleksa WASH, ki sodeluje pri polimerizaciji aktina, pa tudi pri fisiji in razvrščanju endosomov. Mutacije v genu Strumpellin povzročajo dedno spastično paraplegijo, za katero je značilna degeneracija motoričnih nevronov [21].

Enotočkovna mutacija (Pro1019Arg) v proteinu SWIP destabilizira kompleks WASH. Destabiliziran kompleks WASH zavira endolizosomsko premeščanje, kar povzroča strjevanje endosomov. Pomanjkljiv endosomski promet vpliva na kognicijo in delovanje motoričnih nevronov, simptomi pa so opisani kot nesindromska duševna zaostalost [22, 23].

V citoplazmi eksosomi izvirajo iz endosomov z uporabo endosomskih sortirnih kompleksov, potrebnih za transport (ESCRT), znanih tudi kot od ESCRT odvisen mehanizem biogeneze eksosomov (pregledal [18,20]).

Dve skupini sta neodvisno poročali o lipidno posredovani biogenezi eksosomov, mehanizmu, neodvisnem od ESCRT. Dva lipida, identificirana v teh študijah, sta bila bis(monoacilglicero)fosfat/lizobisfosfatidna kislina (BMP/LBPA) in ceramid [29,30].

Rab31 je še en od ESCRT neodvisen mehanizem za biogenezo eksosomov v citoplazmi. Aktivacija Rab31 stimulira tvorbo intraluminalnih veziklov [31]. Obstaja še en mehanizem, o katerem se trenutno premalo razpravlja in je premalo raziskan.

Ta mehanizem temelji na ultrastrukturnih opazovanjih, opravljenih v poznih 1950-ih do 1970-ih, ki so pokazala, da so celična jedra lahko mesto za nastanek multivezikularnih teles, polnih majhnih veziklov. Majhni vezikli, opisani v teh študijah, so bili morda eksosomi, vendar izraz eksosom takrat ni bil skovan. Kilarski in Jasinski sta v celicah plavalnega mehurja ribe ostriž, Perca fluviatilis L. (slika 2a) [24] opazila proces, imenovan jedrsko blebbing ali jedrska ekstruzija, z vsebino, podobno nukleolarkarioplazmi [32].

Ti avtorji so ugotovili, da je jedrsko mehurjenje mogoče spodbuditi z odstranjevanjem plina iz plavalnega mehurja rib ostriža [24]. Zdi se, da ima proces jedrskega blebbinga zasluge kot mesto izvora eksosomov, obogatenih z nukleinskimi kislinami in/ali ribonukleoproteinom.

Jedrski mehurčki so bili napolnjeni z majhnimi mehurčki, ki so nastali zaradi enkratnega zgibanja notranje membrane jedrnih mehurčkov (slika 2b), kar je proces, podoben tvorbi intraluminalnih veziklov v endosomih. Jedrski mehurčki, napolnjeni z 'majhnimi vezikli', so se sčasoma ločili od jeder in postali del citoplazme (slika 2c).

Kilarski in Jasinski sta v svojem rokopisu zaradi pomanjkanja boljše terminologije jedrske mehurčke označila za multivezikularna telesa. Nenamerno so imeli ti avtorji morda prav, saj so kasnejše študije poročale o prisotnosti multivezikularnih teles v jedrih celic [33]. Jedrni mehurčki, napolnjeni z majhnimi vezikli, imajo podobno morfologijo kot multivezikularna telesa, ki izvirajo iz endosomov v citoplazmi (sliki 1 in 2).

Zaradi podobnosti jedrnih multivezikularnih teles z virusnimi nukleokapsidi so raziskovalci svojo pozornost usmerili v virologijo, pojav jedrnega mehurčka in njegova celična funkcija pa sta ostala premalo raziskana [34].

Ne glede na način biogeneze so eksosomi sestavljeni iz alipidnega dvosloja in vsebujejo makromolekularno vsebino, ki jo sestavljajo lipidi, proteini in nukleinske kisline.

Nekatere makromolekule so skupne eksosomom, ki izvirajo iz vseh celic, in so zato razvrščene kot markerji eksosomov ter se uporabljajo kot potrditveno orodje za razlikovanje eksosomov od drugih zunajceličnih veziklov. Edinstvene makromolekule, prisotne v eksosomih, pogosto odražajo njihov starševski izvor in bodo zato verjetno označene kot biomarkerji.

Vse celice sproščajo eksosome v zunajcelični prostor. Iz zunajceličnega prostora se eksosomi znajdejo v različnih bioloških tekočinah in dosežejo celice lokalno in na daljavo. Celice, gojene in vitro, sprostijo svoje eksosome v gojišča. Nenehno sproščanje eksosomov v zunajcelični prostor naredi gojišče in biološke tekočine bogat vir za izolacijo eksosomov.

Eksosomi vsebujejo znatno količino kodirajočih in nekodirajočih RNA, dvoverižnih fragmentov genomske DNA in mitohondrijske DNA. Trams in sodelavci so bili prvi, ki so opisali prisotnost RNA v "izluščenih veziklih", mešanici eksosomov in mikrovezikul.

Ugotovili so, da "odluščeni vezikli ali eksosomi" vsebujejo 5% RNA [5]. Valadi in sodelavci so bili prvi, ki so sistematično analizirali RNA pakirane ineksosome. Eksosomske RNA so vključevale prevedljive mRNA in mikroRNA (miR) [35].

MikroRNA so razred nekodirajočih RNA (ncRNA). Dolgi so ~22 nukleotidov in uravnavajo izražanje genov na posttranskripcijski ravni z vezavo na 30-neprevedene regije svojih ciljnih messenger RNA [36]. Zanimivo je, da nekatere miRNA, obogatene z eksosomi, niso zaznane v matičnih celicah, kar kaže na selektivni sistem razvrščanja/pakiranja RNA med biogenezo eksosomov [35,37].

Za razliko od celic eksosomi vsebujejo malo ali nič ribosomske RNA, vsebujejo pa fragmente tRNA [38]. Razvrščanje RNK v eksosome je odvisno od (1) proteina, povezanega z kompleksom utišanja, ki ga povzroči RNK (RISC), (2) motivov zaporedja RNK in vodilnih proteinov, (3) dodatkov nukleotidov na 30. koncu miRNA, (4) celične razpoložljivosti miRNA in (5) ceramid [39,40].

Verjamemo, da je jedrsko blobbing še en celični proces, ki omogoča diferencialno razvrščanje RNA, kompleksov RNA-proteina in genomske DNA v eksosome. Obstaja več razlogov za to stališče: (1) vsebina 'intraluminalnih veziklov' je bila podobna nukleolarni karioplazmi [32] . intraluminalni vezikli' kot mesto sinteze RNA poleg tonukleola [41].

Proteins present in the vesicles may have been RNA-binding proteins and Dicer1 that were detected in exosomes [42] (unpublished data, Kumari Lab, Kansas State University, Manhattan, KS, USA). (2) Considering the nucleus as a site of exosome biogenesis can explain the presence of RNAs including precursor miRNAs (unpublished data, Kumari Lab) and double-stranded genomic DNA fragments ranging from 100 bp to >10 kbin eksosomov [43–47].

Mimogrede, genomsko DNK so odkrili samo v eksosomih, ki izhajajo iz rakavih celičnih linij, in ne v normalnih celicah [47]. Rakave celice imajo nenormalen kromatin zaradi preureditve/translokacije kromatina in morda ploidnosti [48], ki lahko povzroči fragmentacijo genomske DNA v jedrih rakavih celic. Te fragmente DNA je mogoče zlahka vključiti v MVB tipa II (in eksosome), ki se razvijajo v jedrih. (3) Način biogeneze 'majhnih veziklov' v jedrnih mehurčkih, ki sta ga opisala Kilarski in Jasinski [24], je podoben nastanku intraluminalnih veziklov v poznih endosomih v citoplazmi.

Trdno verjamemo, da je prisotnost genomske DNK v eksosomih patološka in se zato lahko njena prisotnost v eksosomih uporablja kot diagnostično orodje za razvoj nenormalnih (ali rakavih) celic v telesu. (4) Od aktivnosti odvisno povečanje števila eksosomov, ki jih sprostijo celice [49], je primerljivo s plinskimi celicami, ki so pokazale povečano jedrsko mehurčenje po odstranitvi plina iz plavalnega mehurja rib ostriža [24].

Pred kratkim so mitohondrijske proteine ​​in DNK odkrili v plazemskih eksosomih nekaterih bolnikov z rakom, njihova prisotnost pa je povezana z agresivnostjo raka [50,51].

Razgradnjo mitohondrijev pogosto opazimo v degeneriranih celicah [52, 53]. Mitohondrijske kriste, ki se sprostijo iz degeneriranih mitohondrijev, lahko ponotranjijo multivezikularna telesa in se na koncu zapakirajo v eksosome.

Ta ideja je podprta z ultrastrukturnimi slikami človeških limfoblastoidnih celic in lumnom acinov pavijanske prostate, ki so imeli 'mikrovezikle' (ali eksosome), ki izhajajo iz razgradnje krist mitohondrijev [54].

Na podlagi zgornje razprave in podpornih eksperimentalnih dokazov predlagamo, da heterogena narava eksosomov izvira iz biogeneze multivezikularnih teles in povezanih eksosomov na različnih subceličnih lokacijah in ne v celoti v citoplazmi, kot je naše trenutno prepričanje. Naš predlog lahko pojasni heterogenost eksosomov kot tudi neskladje med teoretičnimi izračuni in eksperimentalnimi podatki o številu majhnih RNA ali proteinskih molekul, ki jih vsebuje en eksosom, očiščen iz seruma [55].

Na podlagi teoretičnih izračunov z uporabo povprečne velikosti eksosoma so Li in njegovi sodelavci predvideli, da bo vsak eksosom sprejel približno 70–25000 majhnih molekul RNA ali beljakovin.

Vendar pa so njihovi eksperimentalni podatki pokazali prisotnost ene molekule RNA na eksosom, očiščen iz seruma [55]. Naša hipoteza zahteva nadaljnje raziskovanje jedrskih mehurčkov, jedrskih multivezikularnih teles in biogeneze eksosomov, ki vsebujejo RNA/ribonukleoprotein, v jedrnih multivezikularnih telesih. Lipidi so pomemben del eksosomskih membran in so asimetrično porazdeljeni med dvema eksosomskim membranskim lističem. Sestava lipidov se razlikuje med membrano matične celice in membrano eksosoma.

Na splošno so lipidi, obogateni z eksosomemembranami, sfingomielin, ceramid, holesterol in s holesterolom bogate lipidne raft mikrodomene, gangliozid GM3, desaturirani lipidi in fosfatidilserin [56–58]. Eksosomske proteine ​​sestavljajo tisti, ki so skupni večini eksosomov, kot tudi edinstvene beljakovine, specifične na določeno matično celico.

Vsebnost beljakovin v vseh eksosomih je na splošno obogatena za ciljne in fuzijske proteine, kot so tetraspanini, integrini, šaperonski proteini, npr. proteini toplotnega šoka (Hsp60, Hsp70 in Hsp90), majhni proteini HSP, ki prenašajo membrano, Rab proteini, ARF GTPaze, aneksini in beljakovine, ki sodelujejo pri tvorbi multivezikularnih teles, kot sta ALIX in TSG101 [59].

Novejše študije kažejo na prisotnost proteinov, ki vežejo RNA, ki tvorijo komplekse RNA-protein v eksosomih [38]. Več celičnih procesov, ki zagotavljajo nalaganje proteinov v eksosome, je (1) mehanizem ESCRT za proteine ​​z določenimi posttranslacijskimi modifikacijami, kot so ubikvitinacija, metilacija arginina, oksidacija, fosforilacija, glikozilacija in citrulinacija, stimulirana z Wnt; (2) avtofagija, posredovana s šaperonom (CMA), ki temelji na interakciji med 71 kDa proteinom, sorodnim toplotnemu šoku (HSC70) in proteini z motivom KFERQ.

Po vezavi HSC70 na proteine ​​z motivom KFERQ so proteini usmerjeni v multivezikularna telesa. Avtofagija, posredovana s šaperonom, običajno deluje za razgradnjo beljakovin v lizosomih. Novejši podatki kažejo, da ima CMA vlogo pri sproščanju eksosomov in z eksosomi posredovanem razširjanju beljakovinskih agregatov pri nekaterih nevrodegenerativnih boleznih [60–63].

Od devetdesetih let prejšnjega stoletja je prišlo do eksponentnega povečanja raziskav eksosomov in pridobljenih je bilo veliko podatkov o eksosomskem tovoru. Podatkovne baze so bile ustvarjene, da bi zagotovile dodatek eksosomskega tovora, preden postane pretežko upravljati velike nize podatkov.

Ponovljivost objavljenih podatkov o eksosomih je še en razlog, saj večina laboratorijev uporablja različice različnih metod, razvitih za izolacijo eksosomov. Na primer, Vesiclepedia je ročno pripravljena zbirka molekularnega tovora (lipidov, RNA in beljakovin), identificiranega v različnih razredih zunajceličnih veziklov [64]. Vesiklepedija je dragocen vir za raziskovalce.

Baza podatkov Vesiclepedia je javno dostopna in uporabnikom omogoča poizvedovanje in prenos eksosomskih podatkov o tovoru na podlagi iskalnih kriterijev, ki jih vnesejo uporabniki. EV pedia, Exocarta, ExoRbase in EV miRNA so dodatne baze podatkov, ki katalogizirajo eksosomske proteine ​​in RNA [64].

Baze podatkov poganjajo opombe skupnosti. Podatki, shranjeni v teh zbirkah podatkov, so pridobljeni z izolacijo eksosomov z uporabo različnih tehnik ločevanja, ki niso vključene v zbirko podatkov.

Vsebina eksosomskega tovora se tako lahko razlikuje glede na uporabljeno metodo izolacije, kar povzroča določeno stopnjo dvoumnosti v prijavljenih rezultatih. Za izboljšanje eksperimentalne ponovljivosti in preglednosti je bila razvita zbirka orodij EV-TRACK z odprto kodo. EV-TRACK zajema podatke o pripravi eksosomov in karakterizaciji eksosomov [65].

Ključna značilnost EV-TRACK je EV-METRIC, ki predstavlja poročanje eksperimentalnih parametrov kot odstotek izpolnjenih komponent seznama devetih [66]. Za te komponente se je odločil konzorcij EVTRACK in so se zdele potrebne za nedvoumno interpretacijo podatkov in reprodukcijo eksperimentalnih podatkov. Tako je bil EV-METRIC zasnovan za pomoč raziskovalcem in pregledovalcem pri zagotavljanju celovitega pregleda podatkov.

2. Trenutne metode za izolacijo eksosomov

Eksosomi predstavljajo bogat vir za odkrivanje biomarkerjev in za nove terapevtske strategije, vključno z regenerativno medicino. Za uspeh teh ciljev je najpomembnejša izolacija čistih eksosomov s ponovljivo metodo.

Izolacija funkcionalno kompetentnih eksosomov je še posebej kritična za potencialne terapevtske aplikacije. Eksosome so očistili iz različnih bioloških tekočin, kot so kri, plazma, cerebrospinalna tekočina, slina, urin in mleko. Vsaka biološka tekočina ima različne fizikalne in kemične značilnosti, ki jih je treba upoštevati pred izolacijo eksosoma.

V nekaterih primerih so morda potrebni posebni previdnostni ukrepi za izolacijo eksosoma. Končna uporaba prečiščenih eksosomov je še ena determinanta, ki vpliva na metodo izolacije eksosomov.

Do danes je bilo razvitih več metod izolacije eksosomov in nekatere od njih temeljijo na značilnostih eksosomov, kot so njihova velikost, gostota, površinski naboj in proteini, povezani s površino eksosomov (slika 3) [67].

Nekatere trenutno uporabljene metode izolacije eksosomov so navedene v tabeli 1. Večina jih ni samostojnih metod in zahtevajo predhodne korake obdelave po vzorcu. Pomembne metode so na kratko obravnavane spodaj.

Slika 3. Običajno uporabljene metode za izolacijo eksosomov in njihove nadaljnje uporabe. Več metod, razvitih do danes za izolacijo eksosomov, temelji na njihovi plovni gostoti, shema 1, 13 in 1,19 g/ml, metoda ultracentrifugiranja (UC) je bila nadalje izpopolnjena na izolirajte čiste pripravke eksosomov na podlagi njihove plavajoče gostote z izopikničnim ultracentrifugiranjem nad saharoznim ali jodiksanolnim gradientom gostote (DG).

Za odstranitev visoke vsebnosti beljakovin v proteinuriji smo metodo ultracentrifugiranja združili s kromatografijo za izključitev velikosti (SEC). Časovne omejitve, povezane z metodo ultracentrifugiranja, so pripeljale do razvoja metode filtracije (UF).

Prehajanje razredčenih vzorcev, kot sta gojišče in urin skozi nano- ali mikromembranski koncentrator, je omogočilo čiščenje eksosomov. Zaradi zamašitve membrane in slabega obnavljanja eksosomalnih beljakovin je ta metoda postala nepriljubljena za nadaljnje aplikacije, kot so izolacija RNK in aplikacije z visoko zmogljivostjo.

Druga metoda, razvita za izolacijo eksosomov iz zelo razredčenih bioloških tekočin, je hidrostatična filtracijska dializa (HFD *) v kombinaciji s centrifugiranjem. Pri metodi HFD se vzorec dializira skozi dializno membrano z mejno vrednostjo molekulske mase 1000 kDa pod hidrostatičnim tlakom, kar omogoča, da se iz vzorca odstranijo neželene makromolekule, eksosomi pa se pridobijo s centrifugiranjem.

Metoda obarjanja eksosomov, ki temelji na topnosti ali disperzibilnosti in agregaciji, je bila razvita za obdelavo več vzorcev hkrati. Komercialni kompleti za čiščenje eksosomov temeljijo na tej strategiji.

Pri tej metodi se urinski orasciti zmešajo s polietilen glikolom (PEG) 6000 ali v kombinaciji s protaminom (plus PEG35.000) in inkubirajo čez noč ali 1 uro na ledu.

Nastala motna zmes se centrifugira, da se pridobijo eksosomi, ki se uporabljajo za nadaljnje analize RNA in beljakovin. Drugi reagenti, ki se uporabljajo za obarjanje eksosomov, so (1) 0.1M natrijev acetat pH 4,75 (metoda izsoljevanja) (NaAc), (2) 4-kratni volumen hladnega acetona (–20 ◦C) ( PRotein Organic Solvent Precipitation in skrajšano PROSPR), (3) in mešanica raztopine PEG in dekstrana (do 1,5 %) (dvofazna metoda, ki omogoča ločevanje proteinov iz eksosomov).

Identifikacija eksosomskih površinskih proteinov je privedla do razvoja metod, ki temeljijo na imunoafinitetnem zajemanju in uporabljajo protitelesa proti eksosomskim površinskim proteinom, kot so Tim4, aneksin, EpCAM, običajni eksosomski površinski protein, CD63 in proteini toplotnega šoka (afinitetna interakcija). Afiniteta za lektin (ki se veže na glikoproteine ​​na površini eksosomov) in heparin (ki se veže na proteoglikane heparan sulfata na površini eksosomov) je bila izkoriščena za razvoj metod izolacije eksosomov.

Za metode čiščenja eksosomov, ki temeljijo na afiniteti, je bilo uporabljenih več platform, kot so magnetne kroglice, visoko porozne monolitne mikrokonice iz silicijevega dioksida, površina plastičnih plošč, celulozni filtri, membranski afinitetni filtri, agarozni sorbent in mikrofluidne naprave, ki imajo različne prednosti pri uporabi v diagnostični, prognostični, kot sistemi za dostavo zdravil ter odkrivanje in analize foreksosomskega tovora.

Prilagojeno z dovoljenjem Konoshenko MY, Lekchnov EA, Vlassov AV, Laktionov PP. Izolacija zunajceličnih veziklov: splošne metodologije in najnovejši trendi. Biomed Res Int. 30. januar 2018; 2018: 8545347. doi:10.1155/2018/8545347. PMID: 29662902; PMCID:PMC5831698; Avtorske pravice © 2022 Maria Yu. Konoshenko et al.

To je članek z odprtim dostopom, ki se distribuira pod licenco Creative Commons Attribution License, ki dovoljuje neomejeno uporabo, distribucijo in reprodukcijo v katerem koli mediju, če je izvirno delo pravilno citirano [67].

For more information:1950477648nn@gmail.com