Študija učinkov kalcitriola proti staranju na človeške naravne celice ubijalke in vitro

POVZETEK

Splošno velja, da ima vitamin D regulativni učinek na imunski sistem. Nekatere klinične raziskave so pokazale, da je povpraševanje povitamin D narašča s starostjo. Kalcitriol je biološko aktivna oblikavitamin D. Vendar njegov učinek na človeške naravne celice ubijalke (NK) ostaja nejasen. Zato smo v tej študiji raziskali učinke kalcitriola proti staranju in imunomodulatorne učinke na celice NK z vrsto imunoloških metod, da bi raziskali njegovo pomembno vlogo pri prirojeni imunosti. Ugotovili smo, da je kalcitriol obrnil izražanje s staranjem povezanih biomarkerjev v celicah NK in zaviral njihovo širjenje z vzdrževanjem teh celic v fazi G1, brez kakršne koli apoptoze in izčrpanosti. Kalcitriol je zaviral sproščanje z vnetjem povezanih citokinov, kot so interlevkin-5 (IL-5), interlevkin-13 (IL-13), interferon gama (IFN-), in faktor tumorske nekroze alfa (TNF-). Degranulacijo NK celic je znižal kalcitriol, ko so te celice gojili skupaj s tumorskimi celicami K562. Ugotovili smo tudi, da je kalcitriol povečal s staranjem povezano sirtuinsko 1- proteinsko/kinazno R-podobno endoplazmatsko retikulum kinazo (SIRT1/pERK) in ekspresijo SIRT1-deltaExon8 (SIRT1-∆Exon8). z aktiviranjem receptorja za vitamin D (VDR). Še več, kalcitriol bi lahko bil potencialni negativni regulator NK celicapoptozainmitohondrijsko inaktivacijoki je posledicaoksidativni stres. Tako se kaže kalcitriolučinki proti staranjuna človeške celice NK in vitro z aktiviranjem osi SIRT1-PERK inodpornost proti oksidativnemu staranju.

Kliknite tukaj, če želite dobiti dodatke proti staranju Cistanche

1. Uvod

Številne študije so pokazale, da staranje neposredno vpliva na več bolezni, kot so nalezljive bolezni, bolezni srca in ožilja, nevrodegenerativne bolezni, avtoimunske bolezni in rak. Staranje organizma spremlja oslabitev imunosti. Skupne značilnosti staranja vključujejo predvsem vneto staranje s kroničnim nizkim vnetjem [1], nestabilnost genoma, neravnovesje izražanja beljakovin, mitohondrijsko inaktivacijo, celično staranje in spremembe v medcelični komunikaciji [2]. Kot glavna komponenta prirojene imunosti imajo NK celice pomembno vlogo pri protiinfekcijskih in protitumorskih učinkih ter uravnavanju imunskega sistema [3]. NK celice lahko odstranijo tarčne celice neposredno ali prek protitelesno odvisne celične citotoksičnosti (ADCC), namesto da bi pokazale kakršne koli odzive, specifične za antigen ali protitelesa [4]. NK celice so povezane tudi s preobčutljivostnimi reakcijami in avtoimunskimi boleznimi [5]. Ko se imunski sistem stara, se izražanje površinskih aktivacijskih receptorjev, kot je naravni ubijalec skupine 2, član D (NKG2D) [6], ubijalski imunoglobulinu podoben receptor (KIR), površinski markerski grozd diferenciacije 57 (CD57) [7] se je povečala skupina diferenciacije 16 (CD16) [8]. Ta molekula bi lahko aktivirala funkcijo ubijanja NK celic, kar lahko povzroči celično neravnovesje in vnetje pri starejših. Medtem so se zaviralne molekule celic NK, kot so naravni član skupine 2 skupine ubijalcev A (NKG2A), član C skupine naravnih ubijalcev 2 (NKG2C) in naravni receptorji citotoksičnosti (NCR) [6] zmanjšale. Drugi označevalci celic NK, povezani s staranjem, so T-celični imunoglobulin in beljakovina 3, ki vsebuje domeno mucina (TIM3), ter povečana programirana celična smrt-1 (PD-1). Povečana regulacija PD-1 in TIM3 med imunosescenco lahko zavre delovanje celic NK in vodi do izčrpanja celic NK [9].

Drug dejavnik, ki vodi do imunosenescence, je imunsko vnetje [10]. Poročali so, da visoke ravni vnetnih citokinov, ki jih sproščajo celice NK, povzročajo poškodbe DNK, oksidativni stres in staranje celic. Poleg tega lahko celično neravnovesje celic NK in stanje vnetja povzročita avtoimunsko bolezen [11]. Ravni interlevkina-1 (IL-1), interlevkina-4 (IL-4), interlevkin-6 (IL-6), interlevkina -10 (IL-10) in faktor tumorske nekroze alfa (TNF-) sta višja pri starejših [12]. Čeprav se je število skupnih imunskih celic s staranjem zmanjšalo, se je populacija NK celic izjemno povečala, kar je lahko posledica infiltracije vnetnih celic [13].

Vitamin D v človeškem telesu obstaja v dveh aktivnih oblikah kot vitamin D2 (ergokalciferol) in vitamin D3 (kalcitriol). Primarna funkcija vitamina D je spodbujanje absorpcije kalcija in fosforja. Vitamin D uravnava tudi imunske funkcije [14]. Čeprav se številna poročila osredotočajo na njegove protiinfekcijske in protitumorske funkcije [15], kalcitriol kaže tudi protivnetne učinke [16]. Receptor vitamina D (VDR) se izraža na različnih imunskih celicah [17]. Zmanjšanje proizvodnje vnetnih citokinov prispeva k zmanjšanju vnetnih reakcij. Znano je, da kalcitriol zavira nastajanje TNF-, interlevkina-1 (IL-1), interlevkina-2 (IL-2), interferona gama (IFN-) in drugih vnetnih citokinov v celicah B in T. Prav tako lahko sprošča protivnetne citokine, kot sta IL-4 in IL-10 [18], in uravnava avtofagijo proti infiltraciji vnetnih celic [19].

Poročali so o antioksidativnih lastnostih kalcitriola pri depresiji, bolezni zamaščenih jeter [20], bolezni srca in ožilja ter drugih boleznih, povezanih z vnetjem. Med staranjem se v celicah in tkivih kopičijo tudi prosti radikali in reaktivne kisikove vrste (ROS). Objavljeni podatki so pokazali, da oksidativni stres vpliva na različne signalne poti v celicah [21], vključno s potmi SIRT1, mitogen-aktivirane proteinske kinaze (MAPK) in jedrskega faktorja κB (NF-κB). Gen SIRT1 velja za gen za dolgoživost in zatiranje tega gena povzroči motnje, povezane z izražanjem beljakovin, celičnim ciklom in metabolizmom [22]. SIRT1-ΔExon8 je nova izoforma SIRT1, ki je obstajala pri sesalcih z alternativnim spajanjem. SIRT1-ΔExon8 je veljal tudi za koregulacijski faktor SIRT1 celotne dolžine [23].

Doslej se zelo malo študij osredotoča na učinke staranja in oksidativnega staranja na celice NK. Prav tako niso poročali o učinkih kalcitriola na SIRT1-ΔExon8. Zato je bila ta študija namenjena raziskovanju učinkov kalcitriola na staranje in oksidativno staranje celic NK, saj te celice zasedajo osrednji položaj v človeškem prirojenem imunskem sistemu.

2. Materiali in metode

2.1 Celična kultura in reagenti

Trije vzorci človeške periferne krvi so bili pridobljeni od darovalcev, ki niso imeli nobene aktivne avtoimunske bolezni, akutne ali kronične vnetne bolezni, raka ali drugih imunsko pogojenih bolezni. Starost darovalcev je bila od 48 do 65 let. Mononuklearne celice periferne krvi (PBMC) smo izolirali z uporabo zdravila Lymphoprep Ficoll. Celice NK so bile razširjene in vzdrževane s kompletom za kulturo celic NK (MoreCell, Shenzhen, Kitajska) pri 37 stopinjah /5 odstotkih CO2.

2.2 Analiza s pretočno citometrijo

Po 72-urnem zdravljenju s kalcitriolom so bile NK celice obarvane z anti-humanimi FITC-CD3, PerCp-CD56, APC-CD16, PE-NKG2A, PE-TIM3, PE-PD1 in PE-KIR (BioLegend, Kalifornija, ZDA). Vsi testi FACS so bili izvedeni s pretočnim citometrom DxFLEX (Beckman, Kalifornija, ZDA).

2.3 Merjenje celične ekspanzije, sproščanje citokinov in test celičnega cikla

Širjenje celic je bilo določeno s kompletom za štetje celic-8 [24] (CCK8; Beyotime, Šanghaj, Kitajska). NK celice smo 48 ur obdelali s kalcitriolom in supernatant zbrali za test sproščanja citokinov. Ravni citokinov so pregledali s ploščo LEGEND Plex Human Inflammation Panel (BioLegend, Kalifornija, ZDA). Najprej so bile kroglice za zajemanje citokinov inkubirane s standardi ali vzorci in nato nadalje inkubirane z biotiniliranimi detekcijskimi protitelesi. Biotinilirana detekcijska raztopina za vezavo protiteles, streptavidin (SA)-PE, je bila naknadno dodana za zagotovitev fluorescentnega signala [25]. Ti signali so bili nato analizirani s testom FACS.

Celični cikel je bil izmerjen s kompletom za zaznavanje celičnega cikla (Beyotime, Šanghaj, Kitajska). NK celice smo 72 ur zdravili s kalcitriolom. Te celice so bile fiksirane v 70-odstotnem ledeno mrzlem etanolu in nato pobarvane z ribonukleazo A (RNase A) in propidijevim jodidom (PI) (Beyotime, Šanghaj, Kitajska) [26].

2.4 Test ubijanja celic NK

Človeške eritrolevkemične celice, celice K562 (ATCC, Virginia, ZDA), smo 15 minut inkubirali z 10 uM 3,3 -dioktadecil-oksakarbocianina (DIOBeyotime, Šanghaj, Kitajska) in nato dodali celicam NK, obdelanim s kalcitriolom. v različnih razmerjih (E/T'=1:1, 5:1 in 10:1) 4 ure, oziroma (27).

2.5 Indukcija oksidativnega staranja in analiza obarvanja z X-gal

In vitro model staranja celic NK z uporabo vodikovega peroksida (H2O2). Da bi ugotovili antioksidacijski učinek kalcitriola, smo NK celice najprej obdelali s kalcitriolom in jih nato 24 ur izpostavili 100 μM H2O2. Aktivnost -galaktozidaze je bila izmerjena z barvanjem z 5-bromo-4-kloro-3-indolil- -D-galaktopiranozidom (X-gal). Obdelane celice so bile fiksirane v 4-odstotnem paraformaldehidu in obarvane z raztopino za barvanje z -galaktozidazo (Beyotime, Šanghaj, Kitajska) čez noč pri 37 stopinjah [28]. Obarvane celice smo nato suspendirali v PBS in slike teh celic pridobili z uporabo fluorescenčnega inverzijskega mikroskopskega sistema Leica. Tri mikroskopske slike so bile naključno zbrane z različnih položajev pri 40-kratni povečavi za vsako skupino. Odstotek celic, obarvanih z X-gal, je bil izračunan in uporabljen za oceno staranja celic z uporabo programske opreme ImageJ V.1.45S.

2.6 Barvanje in analiza potenciala mitohondrijske membrane

Klorometil-X-Rozamin (CMXRos) in Hoechst (Beyotime, Šanghaj, Kitajska) sta bila uporabljena za oceno potenciala mitohondrijske membrane. Celična jedra (modra) so bila locirana z obarvanjem po Hoechstu, medtem ko je bil potencial mitohondrijske membrane določen z mitohondrijsko specifičnostjo, ki označuje fluorescentno barvilo, CMXRos. Celice Hoechst plus CMXRos (označene z belimi puščicami) so pokazale nizko aktivnost. Relativno stopnjo fluorescence smo izračunali tako, da smo število Hoechst-pozitivnih celic delili s CMXRos-pozitivnimi celicami [29]. Celice smo inkubirali z 200 nM CMXRos in Hoechst (30 min, 37 stopinj) in detektirali z invertnim mikroskopom Leica pri vzbujevalnih valovnih dolžinah 579 nm in 350 nm. Odstotek celic Hoechst plus CMXRos plus je bil izračunan, kot je opisano v razdelku 2.5.

2.7 Western blot

Celice smo lizirali z uporabo pufra za lizo radioimunoprecipitacijskega testa (RIPA) (Beyotime, Šanghaj, Kitajska) z inhibitorjem fosfataze PhosSTOP (Roche, Basel, Švica) in 1 μM fenilmetilsulfonil fluorida (PMSF) (Beyotime, Šanghaj, Kitajska). Celotne beljakovine so bile kvantificirane z uporabo kompleta Bradford Protein Assay Kit (TAKARA, Tokio, Japonska). Vzorce beljakovin smo ločili z elektroforezo v natrijevem dodecil sulfatu in poliakrilamidnem gelu (SDS-PAGE) in jih prenesli na membrane 0.22 μm poliviniliden fluorida (PVDF) (immobilon-P membrana; Millipore, Massachusetts, ZDA). Po blokadi so bile membrane testirane s primarnimi protitelesi in inkubirane s sekundarnimi protitelesi [30]. Membrane smo odkrili s sistemom Odyssey (LI-COR, Nebraska, ZDA).

2.8 Statistična analiza

Podatki so bili analizirani z enosmerno analizo variance (ANOVA) z uporabo GraphPad Prism in predstavljeni kot povprečje ± standardni odklon (SD). 6846 W. LI ET AL. Razlike so veljale za statistično pomembne pri P < 0,05. Rezultate smo analizirali tudi s programsko opremo GraphPad.

Vprašaj za več:

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com whatsapp: plus 86 15292862950