Študija o nevroendokrino-imunski funkciji Cistanche Deserticola in njenih izdelkov za kuhanje riževega vina na modelu podgan, povzročenih z glukokortikoidi -Ⅰ

1. Uvod

Cistanche puščava, ki se imenuje "puščavski ginseng", je tradicionalna kitajska medicina, ki se že stoletja uporablja kot jang tonik zapoživljanje ledvic in krepitev janga[1]. Osem vrst in ena različicaCistanche Herba so bili zabeleženi samo na KitajskemCistanche deserticolaYC Ma inCistanche tubulosa(Schenk) Wight so zapisane v Kitajski farmakopeji [2]. Farmakološke študije so to pokazaleCistanches Herbadokazano nevroprotektivno [3], imunomodulatorno [4], kardioprotektivno [5], proti utrujenosti [6], protivnetno [7], hepatoprotektivno [8], antioksidativno [9], protibakterijsko [10], odvajalo [11] in protitumorsko učinki [12]. Širok spekter poročanih bioloških aktivnosti tega rodu je bil pripisan njegovi kompleksni in raznoliki fitokemični sestavi.Cistanche deserticolavsebuje feniletanol glikozide, iridoide, polisaharide [13] itd. Vsebnost feniletanoidnih glikozidov je največja v originalnih zdravilnih snoveh [14].

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA POŽIVITEV LEDVIC PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Obdelava kitajske Materia Medica (CMM) je tradicionalna farmacevtska tehnika za izpolnjevanje različnih zahtev za zdravljenje, razdeljevanje in izdelavo pripravkov v skladu s teorijo tradicionalne kitajske medicine. Ti predelani proizvodi se imenujejo decokcijski kosi, ki se uporabljajo v klinikah. Cilj predelave je povečati učinkovitost za zmanjšanje toksičnosti surovih zdravil. Kitajska farmakopeja iz leta 2015 je zapisala, da se lahko debele rezine Cistanche (CD) in Cistanche (WCD), kuhane v riževem vinu, uporabljajo kot decoction v kliniki. Naša raziskovalna skupina je pokazala, da je bil odvajalni učinek oslabljen, učinek proti staranju in poživitveni učinek na ledvice pa sta bila okrepljena, potem ko je bil Cistanche poparjen z riževim vinom [15].

Delovanje osi hipotalamus-hipofiza-nadledvična žleza-timus (HPAT) je moteno pri sindromu pomanjkanja ledvice-janga [16]. Bolniki s pomanjkanjem ledvičnega janga imajo tudi obsežno imunsko disfunkcijo. Disfunkcija osi HPA je tesno povezana z imunsko pomanjkljivostjo. Teorija nevroendokrinega imunskega omrežja (NEI) kaže, da imata imunski in nevroendokrini sistem veliko skupnih ligandov in receptorjev [17], hipotalamus pa velja za središče povezave med nevroendokrinim in imunskim sistemom.

V tej študiji smo ponovili pomanjkanje ledvičnega janga pri modelih podgan z eksogeno injekcijo kortikosteroida in raziskali mehanizem pomanjkanja ledvičnega janga kot odziv na različne predelane produkte Cistanche deserticola z vidika endokrino-imunske funkcije.

2. Materiali in metode

2.1. Materiali in reagenti

Cistanche deserticola je bil zbran pri Alashanu Neimengguju leta 2019.5 in ga je prof. Yanjun Zhai (Farmacevtska fakulteta Univerze tradicionalne kitajske medicine Liaoning, Kitajska) identificiral kot posušena mesnata stebla Cistanche deserticola YC Ma. Vzorci vavčerjev so bili ohranjeni v Liaoning Processing Engineering Technology Center.

Standardne spojine ajugola so bile kupljene pri Chengdu Pure Chem-Standard Co., Ltd. (Chengdu, Kitajska); cistanozid F,ehinakozid, cistanozid A in izoakteozidso bili kupljeni pri Must Company (Sichuan Kitajska); akteozid je bil kupljen pri Dalian Meilun Bio. Co., Ltd. (Dalian, Kitajska). Acetonitril in metanol razreda MS sta bila kupljena pri Merck KGaA (Darmstadt, Nemčija). Mravljična kislina stopnje HPLC je bila kupljena pri Merck KGaA (Darmstadt, Nemčija). Riževo vino je bilo kupljeno pri Zhejiang Brand Tower Shaoxing Wine Co., Ltd. (Zhejiang, Kitajska).

Kortikosteron (CAS: 50-22-6, čistost > 98 %, TCI Shanghai Development Ltd. Co.), tablete chinkuei shin chewan (Beijing Tongrentang Technology Development Co., Ltd.), podganji ACTH, CRH, T, IL{{ 2}}, IFN-c, TNF-, IL-2 in IL-10 ELISA kompleti so bili kupljeni pri Nanjing Jiancheng Co., Ltd. Komplet ELISA kortizola za podgane je zagotovil BOSK Co., podganja protitelesa CD4, protitelesa CD8a (št. 561833 in 559976), lizat eritrocitov (Solarbio, R1010), puferska raztopina PBS (Solarbio, P1020-500), TRIzol (MAN0001271), CaM in -aktin navzgor in navzdol priskrbel Guangzhou Invitrogen Co. Komplet za reverzno prepisovanje (št. RR037A) in komplet za sintezo cDNA (št. 10000068167) priskrbel Bole Life Medicine Products (Shanghai) Co., Ltd. Kloroform, izopropanol, 75 % etanol in uretan vse raztopine so bile analitično čiste in jih je proizvedel Sinopharm Chemical Reagent Co., Ltd. Ultračista voda je bila proizvedena s sistemom Milli-Q (18,2 MΩ, Millipore, MA, ZDA).

2.2. Eksperimentalni instrumenti

Encimski označevalec (Thermo, model 3530911931), samodejni pralnik plošč (model HBS- 4009), digitalni zaslon potisni-potegni merilnik sile (model VICTOR- 50N), visokohitrostna zamrzovalna centrifuga (model Sigma 3k15 ), ultramikro spektrofotometer (model B-50Q), genski ojačevalec (model L96G), kvantitativni PCR s fluorescenco v realnem času (model StepOne), pretočni citometer (model AC66051710132), parafinski mikrotom (model Laika), mikroskop (Olympus , model BS-53) in instrument za čisto vodo (model F7JA36507).

2.3. Priprava vzorcev za UPLC-Q-TOF-MS in farmakološke poskuse

WCD je bil obdelan iz iste serijeCistanche puščavav našem laboratoriju. Za pripravo WCD smo suhe kose CD-ja (debeline 5 mm) (100 g) prepojili z riževim vinom (30 ml), parili pri visokem tlaku (1, 25 kPa) 4 ure in nato posušili pri 55 stopinjah.

Grobi praški CD in WCD so bili 10-krat namočeni v 95% etanolu za 0,5 ure, ekstrahirani z refluksom 3-krat po 1 uro in filtrirani, filtrati pa so bili 3-krat združeni. Etanol smo pridobili pod znižanim tlakom in dobili ekstrakt za dajanje. Ekstrakt (1 mL) je bil dodan 50 % metanolu, s čimer je skupna prostornina dosegla 20 mL, in shranjen pri 4 stopinjah za analizo vsebnosti.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA IZBOLJŠANJE SPOLNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.4. Pogoji UPLC-QqQ-MS za analizo izvlečkov CD in WCD

2.4.1. Analitični pogoji LCThMS

Za zajem in obdelavo podatkov je bil uporabljen sistem UPLC-MSThMS s programsko opremo MassLynx 4.1 Analyst. Analitska kolona je bila Acquity UPLC BEH C18 (1{{10}}0 mm × 2,1 mm, 1,7 μm) pri temperaturi 40 stopinj C. Mobilna faza je bil 0.1 % vodna raztopina mravljinčne kisline (A) in acetonitril, ki vsebuje 0,1 % mravljinčne kisline (B). Gradient elucije je bil 0.00–1.00 min s 3 % B, 1,01–2.00 min s 3 %–11,5 % B, 2,01–3.{{29 }} min z 12 % B, 3,01–4.00 min s 15 % B, 4,01–5.00 min z 20 % B, 5,01–6.00 min z 22 % B, 6,01–8.00 min s 25 % B in 8,01–9.00 min z 10 % B. Hitrost pretoka je bila 0,3 mLTh min, injicirani volumen pa 1,0 μL.

Waters trojni štirikratni masni spektrometer (Xevo TQD, Waters Corp., Milford, MA, ZDA), opremljen z virom ionizacije z elektrosprejem (ESI), je bil uporabljen v načinu negativnih ionov. Desolvatacijski plin je bil dušik s pretokom 500 LThh pri temperaturi 250 stopinj. Vse odkrite spojine so bile izmerjene v načinu spremljanja več reakcij (MRM); Tabela 1 prikazuje energijske parametre, tabela 2 pa kalibracijske krivulje za analizirane komponente.

2.4.2. Priprava referenčnih snovi

Tubulozid A (3.02 mg), ehinakozid (3.00 mg), 2'-acetilakteozid (2,34 mg), akteozid (2,45 mg), izoakteozid (0,61 mg), cistanozid F ( 2,14 mg), salidrozid (3,39 mg), genipozidno kislino (2,84 mg), ajugol (1,58 mg) in katalpol (2,39 mg) raztopimo v metanolu, da pripravimo osnovno raztopino. Osnovno raztopino smo razredčili z metanolom, da smo dobili ustrezne koncentracije za delovne standardne raztopine. Vse pripravljene raztopine smo pred uporabo shranili pri 4 stopinjah.

2.5. Priprava in združevanje živalskih modelov

Podganji samci SD (180–220 g) so bili kupljeni pri Liaoning Changsheng Biotechnological Co., številka dovoljenja za živali: SCXK (Liao) 2015–0001. Vse podgane so imele prost dostop do hrane in vode pri 25 stopinjah in relativni vlažnosti 30–50 %. Živali so bile pred poskusi nameščene 7 dni.

Sto podgan je bilo naključno razdeljenih v 10 skupin: skupina s slepo kontrolo (BC), skupina z modelno kontrolo (MC), skupina s pozitivno kontrolo (PC), skupina z riževim vinom (WC), skupina z visokim odmerkom CD (CD -HD), skupina CD s srednjim odmerkom (CD-MD), skupina CD z nizkim odmerkom (CD-LD), skupina WCD z visokim odmerkom (WCD-HD), skupina WCD s srednjim odmerkom (WCD-MD) in skupina WCD z nizkimi odmerki (WCD-LD). Odmerki CD-HDThWCD-HD, CD-MDTh WCD-MD in CD-LDThWCD-LD so bili 5,48 gTh (kg ∙ d), 2,74 gTh (kg ∙ d) oziroma 1,37 gTh (kg ∙ d). Odmerek za skupino PC je bil 1,646 gTh (kg ∙ d), za skupino WC pa 1 mLTh100 g za 40 dni. 6. dan po dajanju so podganam subkutano injicirali vodno suspenzijo kortikosterona (kortikosteron + 0.1 % dimetil sulfoksid + 0.1 % Tween-80 + 0.9 % natrijev klorid), razen za skupino BC [18]. Koncentracija kortikosterona je bila 5 gThL, odmerek pa 0,1 mLTh100 g. Podgane v skupini BC so dobile običajno fiziološko raztopino + 0.1% dimetil sulfoksid + 0.1% Tween- 80 + 0.9% natrijev klorid z injekcijo v istem odmerku.

2.6. Določanje funkcij osi HPA

2.6.1. Test teže, temperature in zadrževalne moči

Test teže je bil opravljen vsake 3 dni, temperatura pa je bila izmerjena vsakih 6 dni. med poskusom. 39. dan je bila največja moč zadnje okončine izmerjena z merilnikom prijema. Podgane so postavili na gladke ploščadi, zaradi česar so njihove zadnje okončine zgrabile drog. Podgane bodo nagonsko zgrabile kateri koli predmet, da preprečijo premikanje nazaj, ko povlečejo rep, dokler vlečna sila ne preseže oprijema. Ko je podgana izgubila oprijem, je lahko predojačevalnik samodejno zabeležil največjo silo prijema.

2.6.2. Določanje ravni T, CRH, ACTH, CORT in kortizola v serumu

Eno uro po zadnjem dajanju smo podgane anestezirali z intraperitonealno injekcijo uretanske raztopine (20 gTh100 ml). Nato smo zbrali vzorce krvi, centrifugirali pri 3500 r 15 minut, da smo dobili serum, in shranili pri -20 stopinjah. Koncentracije T, CRH, ACTH, CORT in kortizola so bile izmerjene s kompleti ELISA za podgane po navodilih proizvajalca.

2.6.3. Opazovanja pod mikroskopom

Morfološko strukturo tkiva nadledvične žleze smo opazovali z HE barvanjem. Tkivo nadledvične žleze smo fiksirali v 10 % paraformaldehidu, dehidrirali v etanolu, naredili prozorno z raztopino ksilena, vdelali s konvencionalnimi metodami, narezali na 4 μm debele rezine, razvoskali z raztopino ksilena, hidrirali z gradientom etanola in nato obarvali s hematoksilinom in eozinom raztopina za barvanje. Potem ko je bila plošča prozorna s ksilenom, je bila plošča zaprta z nevtralno gumo in opazovana pod mikroskopom.

2.6.4. Imunohistokemično obarvanje izražanja beljakovin Bax, Bcl-2, kaspaze-3, Fas in FasL v nadledvični žlezi

S formalinom fiksirani, v parafin vgrajeni nadledvični odseki podgan so bili deparafinizirani in rehidrirani po rezanju na debelino 4 μm. Za blokiranje aktivnosti endogene peroksidaze so bili odseki predhodno inkubirani v bloku vodikovega peroksida 10 min. Sekcije smo potopili v 0.01 M citrat (pH 6,0) in segreli do vrelišča. Postopek se ponovi po 5-10 minutah. Po ohlajanju smo odseke 1–2-krat sprali s PBS (pH 7,2–7,6), pustili pri sobni temperaturi približno 5 minut in 2–3-krat sprali s PBS (pH 7,2–7,6). Dodali smo 5 % raztopino za blokiranje BSA pri sobni temperaturi in odvečno tekočino na rezu otresli 20 minut kasneje. Dodali smo razredčena primarna protitelesa, specifična za FasTh FasL, Bcl-2ThBax in kaspazo-3 (1:100, razredčena s PBS), in jih inkubirali pri 37 stopinjah 1 uro ali 4 stopinje čez noč. Odseke smo 2–3-krat sprali s PBS (pH 7,2–7,6). Nato smo dodali biotinilirane kozje protimišje IgG in odseke sušili pri 20–37 stopinjah 20 minut in jih sprali s PBS (pH 7,2–7,6) 4-krat po 5 minut. Po temeljitem izpiranju v PBS so rezine inkubirali z mešanico reagentov A in B 30 minut, inkubirali s PBS 45 minut in končno razvili s substratom DAB (DAKO) 30 minut, preden so jih rahlo protibarvali s hematoksilinom, dehidrirali, in nameščen.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA VEČJO SPOLNEGA OBČUTA PHGS75% ECH 30% ACT 12%

2.7. Določanje imunskih funkcij

2.7.1. Izračun indeksa imunskega organa

Eno uro po zadnjem dajanju so podgane anestezirali z intraperitonealno injekcijo uretanske raztopine (20 gTh100 mL), nato pa odstranili vranico in timusno žlezo ter ju takoj stehtali v sterilnem pokrovu. Masni koeficienti vranice ali timusa (%) � teža vranice ali timusa (mg) Telesna teža (g).

2.7.2. Odkrivanje podskupin limfocitov T v periferni krvi

Splenocite in hemocite smo inkubirali z monoklonskimi protitelesi anti-CD4 (PE) in anti-CD8 (FITC) 30 minut v temi. Dodali smo 2 mL lizata eritrocitov in raztopino premešali z vrtinčenjem. Raztopino pustimo 10 minut v temi in centrifugiramo 5 minut. Supernatant smo zavrgli, nato pa raztopino 3-krat sprali z ledeno mrzlim PBS in resuspendirali v raztopini za permeabilizacijo PBS. Vsaj 10 000 celic je bilo analiziranih s pretočno citometrijo v 1 uri po vsakem barvanju z Mab.

2.7.3. Določanje ravni IL-10, IL-6, IL-2, TNF- in IFN-c v serumu

Eno uro po zadnjem dajanju smo podgane anestezirali z intraperitonealno injekcijo uretanske raztopine (20 gTh100 ml) in vzeli kri iz abdominalne aorte. Kri smo centrifugirali pri 3500 r 15 minut, da smo dobili serum in shranili pri -20 stopinjah. Koncentracije IL-10, IL-6, IL-2, TNF- in IFN-c so bile odkrite s kompleti ELISA za podgane v skladu z navodili proizvajalca.

2.8. Izražanje CaM v tkivih hipotalamusa in hipofize

Celotno RNK smo ekstrahirali iz tkiv hipotalamusa in hipofize s TRIzolom. Reverzna transkripcija je bila izvedena na 10 μL celotne RNA v skladu z navodili proizvajalca. Enake količine cDNA smo analizirali s qPCR v prisotnosti barvila, ki veže dsDNA (Promega, ZDA) in sistema CFX 96 Real-time PCR (Bio-Rad, ZDA), da bi pogledali različne gene v pogojih začetne aktivacije pri 95 stopinj za 10 minut, 40 ciklov denaturacije pri 95 stopinjah za 15 s in podaljšanje žarjenja pri 60 stopinjah za 1 minuto.

Primerji za CaM in -aktin so podani v tabeli 1, -aktin pa je bil uporabljen kot notranja kontrola. Vsak vzorec je bil normaliziran z uporabo razlike v kritičnih pragovih (Ct) med ciljnim genom in -aktinom. Za opis rezultata je bila uporabljena naslednja enačba: ΔΔCt � (Ct ciljni gen − Ct -aktinski gen) eksperimentalna skupina − (Ct ciljni gen − Ct -aktinski gen) kontrolna skupina. Ravni mRNA vsakega vzorca smo nato primerjali z uporabo izraza 2- ΔΔCt ciljnega gena. Rezultati vsake skupine so bili povprečeni (tabela 3).

2.9. Statistična analiza

Vsi podatki so bili analizirani s programsko opremo SPSS (različica 19.0, SPSS Institute Inc., Chicago, IL). Razlike med skupinami so bile analizirane z enosmerno analizo variance s ponavljajočimi se meritvami (ANOVA). Rezultati so bili izraženi kot povprečje ± standardni odklon (SD) z uporabo programske opreme GraphPad Prism (različica 6.0, San Diego, CA, ZDA). Razlike z vrednostjo P, manjšo od 0,05, so veljale za statistično pomembne.

3. Eksperimentalni rezultati

3.1. Analiza UPLC-QqQ-MS

Da bi dosegli najboljše ločevanje, obliko vrha in kratek čas analize, smo v našem predhodnem poskusu proučevali kromatografske pogoje, vključno s kolono, mobilno fazo in gradientnim programom. Tipični kromatogrami z načinom MRM so predstavljeni na sliki 1.

Iz tabele 4 lahko vidimo, da se je vsebnost feniletanoidnih glikozidov v WCD povečala v primerjavi s tistimi v CD, zlasti za ehinakozid in akteozid, medtem ko se je vsebnost iridoidov v WCD zmanjšala.

3.2. Uredba za funkcijo osi HPA

3.2.1. Test teže, temperature in zadrževalne moči

Pri podganah iz skupine MC in poskusnih skupin so se po dajanju kortikosterona postopoma pojavili simptomi pomanjkanja ledvičnega janga. Simptomi, kot so izguba teže, hipotermija, izguba sijaja las, upadlost duha, zakasnitev odziva ter znatno zmanjšanje porabe vode in aktivnosti, so se močno izboljšali v skupinah CD in WCD. Slika 2(a) prikazuje spremembe teže. Teža vsake od skupin zdravil se je povečala, zlasti v skupinah CDHD in WCD-HD. Najnižji je bil porast telesne mase v skupini MC. Slika 2(b) prikazuje temperaturne spremembe, ki so bile najnižje v skupini MC, temperatura pa se je povečala v skupinah WCD-HD, WCD-MD in WCD-LD.

Slika 2(c) kaže, da se je zadrževalna moč povečala za skupino BC in vsako od eksperimentalnih skupin, skupina WCD-MD pa je bila najvišja, kar je pokazalo, da so se znaki šibkosti, ki jih povzroča pomanjkanje ledvičnega janga, izboljšali po dajanju.

3.2.2. Ravni T, CRH, ACTH, CORT in kortizola

Slika 3 prikazuje, da se je v primerjavi s tistimi v skupini BC raven T, CRH, ACTH in CORT v serumu podgan znižala (P < 0.01), raven kortizola pa znižala (P < 0.05) v skupini MC. V primerjavi s tistimi v skupini MC se je povečala raven T v skupinah WCD-HD in WCD-MD (P < 0.01), raven CRH v WCD-LD, Skupini WCD-MD in WC sta se izboljšali (P < 0.01), vsebnost ACTH se je povečala v skupinah CD-HD, WCD-MD in WCD-HD (P < 0,01), raven CORT je bila povišana v skupini Skupine CD-MD, WCD-MD in WCD-HD (P <0,01) in povečane v skupinah CDHD in WCD-LD (P <0,05), raven kortizola pa se je povečala v vsaki od skupin zdravil.

3.2.3. Rezultati opazovanja pod mikroskopom

Tkivo nadledvične žleze lahko razdelimo na kortikalno plast in medulno plast. Kortikalne plasti vključujejo globularne, snopne in retikularne plasti. Celice vsebujejo več lipidov, plast medule pa je sestavljena večinoma iz celic feokromocitoma in majhne količine fibroznega tkiva. Kot je prikazano na sliki 4, smo ugotovili, da je bilo vse normalno v skupini BC, medtem ko je imela v skupini MC nadledvična skorja očitno hiperplazijo, celično atrofijo in naraščajočo gostoto. Bulbozni trak se je odebelil, prosojna fascikularna cona, ozka retikularna cona in manjše celice pa so pokazale neenakomerno obarvanost in kapilarno kongestijo. V skupini PC so bile vidne kortikalne in medularne meje. Celice kroglastih in snopnih pasov so bile enakomerno razporejene, morfološka struktura pa je bila obnovljena. Enako boljšo obnovo so opazili v skupinah WCD in učinki v skupini WCD-MD so bili boljši kot pri skupinah WCD-HD in WCD-LD. Morfologija nadledvične žleze v skupinah CD ni bila tako dobra kot v skupinah WCD.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA IZBOLJŠANJE SPOLNE FUNKCIJE PHGS75% ECH 30% ACT 12%