Študija o vplivu acteosida (aktivna sestavina v Cistanche puščavci) na NAFLD z indukcijo avtofagije

Izvleček:

 

Objekti:Za raziskovanje funkcije, ki povzroča avtofagijo, aktivne sestavine acteozida (ACT) v Cistanche Desericte in njen vpliv na brezalkoholno bolezen maščobnih jeter (NAFLD).

MetodeZa jemanje ehinakozida in delovati kot raziskovalni predmeti, 1 0 0}} µmol/l Act in ehinakozid (ECH) kombiniramo z zaviralcem avtofagije-lizosom Bleomicin A1 za intervencijsko zdravljenje. Za zaznavanje relativne ekspresijske ravni avtofagijskega markerja mikrotubula, povezanega z beljakovinami, povezan z beljakovinami 1 svetlo verigo 1 3 (LC {5}} II), smo uporabili beljakovinsko imunobloting. Celice HepG2 smo intervenirali z različnimi koncentracijami ACT in vitro in odkrili celično sposobnost preživetja z metodo tetrazolijeve soli. In vitro intervencijo celic HepG2 z različnimi koncentracijami ACT v kombinaciji z balofloksacinom A1 in odkrivanjem LC {9}} II izražanja beljakovin z uporabo imunolonske tehnologije. Model NAFLD, zgrajen in vitro z intervencijo zdravil, je bil uporabljen za obarvanje lipidnih kapljic z uporabo metode obarvanja z rdečo olje in zaznavanje ravni znotrajceličnih trigliceridov. Opazujte lokalizacijo kapljic beljakovin in lipidov LC3 s pomočjo imunofluorescenčne tehnologije. Rezultati Act lahko znatno povzroči avtofagijo v celicah HepG2, stopnja izražanja LC 3- II pa se znatno poveča v primerjavi s kontrolno skupino (obdelano samo z ACT) (1,36 0. 11, {21} {28} {2 {28}}. oziroma), s statističnim pomenom (P0.05). 50 μmol/L ACT je pomembno povzročil avtofagijo v celicah HepG2, stopnja ekspresije LC 3- II proteina pa se je znatno povečala (1,83 ± 0,53, 0,35 ± 0,18). Raven TG celic HEPG2 v intervencijski skupini ACT (19,11 ± 1,68) je bila bistveno nižja kot v skupini modelov NAFLD in vitro (34,15 ± 1,90), razlike pa so bile statistično pomembne (P<0.05). The number of positive lipid droplets in HepG2 cells in the ACT intervention group decreased significantly, and the number of autophagosomes inside the cells increased significantly, showing clear co localization with lipid droplets in space. Conclusion Cistanche deserticola ACT has significant autophagy induction ability, and it may have potential preventive and therapeutic effects on NAFLD.

 

Ključne besede:Brezalkoholna bolezen maščobnih jeter;Cistanche DesertIcola;Acteosid; Avtofagija

 

TCM Herb Cistanche za zdravljenje brezalkoholnih maščobnih bolezni jeter (NAFLD)

Kliknite sliko, da dobite več podrobnosti

 

V zadnjih nekaj desetletjih je brezalkoholna maščobnaJetrna bolezen(NAFLD) je postal najpogostejšiKronična bolezen jeter, z globalno razširjenostjo približno 25% odrasle populacije in velja za tesno povezano s presnovnim sindromom [1]. Čeprav je verjetnost zapletov, povezanih z jetri pri bolnikih z NAFLD, manjša od 10%, je NAFLD dejavnik tveganja za bolezni, povezane z jetri, kot sta ciroza in primarni rak jeter, kar nalaga veliko gospodarsko breme bolnikom [2-5]. Kljub vse večji pozornosti, ki je namenjena NAFLD, NAFLD kot pomembna kronična bolezen ni bila deležna dovolj pozornosti. Zato je nadaljnje poglobljeno razumevanje patogeneze NAFLD in iskanja učinkovitih strategij zdravljenja postalo nujne težave, ki jih je treba rešiti [6-7].

Nedavne študije so pokazale, da ima celična avtofagija pomembno vlogo pri fiziologiji in patologiji jeter [8]. Avtofagijska disfunkcija ali disregulacija je povezana z različnimi jetrnimi boleznimi, kot soJetrna bolezen, povezana z alkoholom[9], NAFLD [10], brezalkoholni steatohepatitis [11] in hepatocelularni karcinom [12]. Patološke značilnosti NAFLD so prekomerno odlaganje trigliceridov (TG) in drugih nevtralnih lipidnih kapljic (LD) v hepatocitih pod nealkoholno stimulacijo. Za jetra sta dve glavni poti, ki uravnavata katabolizem teh LDS, lipoliza in avtofagija.
Pot lipolize je regulirana s citoplazemskimi nevtralnimi lipazami, kot sta hormonsko občutljiva lipaza in adipozna TG lipaza. Na ustrezni poti lipoavtofagije se lahko LDS selektivno prevzamejo z neposredno zaposlovanjem avtofagijskih beljakovin, da tvorijo avtofagosome, nato pa LD-je, ki jih zajejejo avtofagosomi, dodatno dovajajo lizosomom in jih v lisosomih razgradijo s kislino lipazo. Zato je aktiviranje lipoavtofagije v hepatocitih postalo učinkovita strategija za preprečevanje in zdravljenje NAFLD.
Cistanche Deserecticola je dragoceno kitajsko zeliščno zdravilo, ki se v tradicionalnih kitajskih zdravilih pogosto uporablja v klinični praksi. Hkrati se že dolgo uporablja kot doplačilo za zdravje. Cistanche Deserickola vsebuje različne bioaktivne sestavine, od katerih je najpomembnejše cistanche deserthela fenylethanol glikozidi. Kot predstavniki feniletanoidnih glikozidov, ehinakozida (ECH) in verbaskozida (ACT), imajo številne pomembne biološke aktivnosti, kot so antioksidant, nevroprotektivna, imunomodulacijska in jetrna zaščita [13]. Glede na zaščito jeter so študije pokazale, da lahko ECH zaščiti jetra z zmanjšanjem vnetnih mediatorjev, zavira transformirani rastni faktor in zmanjšanje ravni ekspresije genov, povezanih z jetrno fibrozo. ACT ima pomemben zaščitni učinek na kemične in zdravila, ki jih povzročajo droge, kot so alkohol, ogljikov tetraklorid in lipopolisaharid. ACT zmanjšuje oksidativni stres, ki ga povzročajo strupene kemikalije, odstranjuje reaktivni kisik, kopičen v jetrih, in zmanjša koncentracijo malondialdehida. Hkrati znatno poveča aktivnost jetrne superoksidne dismutaze in zmanjša vsebnost glutationa in znatno izboljša histopatološko poškodbo in apoptozo jeter. Vendar pa ni ustreznega poročila o literaturi o tem, ali so v proces avtofagije pri izvajanju jeter vključeni feniletanoidni glikozidi Cistanche Desericle. Na podlagi tega je ta študija uporabila običajne celične biološke metode in in vitro celični model, da je predhodno raziskovala učinek cistančev, ki povzroča avtofagijo, feniletanoidnih glikozidov, in raziskala njene možne farmakološke funkcije, s katerimi je bila zagotoviti znanstveno podlago za prihodnji razvoj zdravil.

 

1 materiali in metode

1.1 Materiali

1.1.1 Raziskovalni subjekti ECH in ACT so bili uporabljeni kot raziskovalni subjekti.

1.1.2 Materiali so bile kupljene celice HEPG2 pri Wuhan Punosai Life Science Co., Ltd., ECH (Številka šarže: B21209) in ACT (Številka serije: B20715, HPLC čistost, večja ali enaka 98%), so bili kupljeni od Shanghai Yuanye Biologicate Srednje, DMEM GLUCOSE SREDNJ in tripsin so bili kupljeni pri podjetju Hyclone Company, ZDA, fetalni goveji serum (številka serije: 04-002-1 a) je bila kupljena pri BI Company, Izrael, penicilin/streptomicin (številka serije: SV30010.01) je bila kupljena od podjetja Hyclone Company, ZDA, MTT (Batch številka: M8180) (Batch številka: M8180) (Batch številka: M8180). Peking, Kitajska, TG (Številka serije: BC0625) Komplet za odkrivanje je bil kupljen pri podjetju Solebao, Peking, Kitajska, naftna rdeča O (številka sklopa: O {{14} G), dimetil sulfoksid (številka sklopa: BCBZ1685) so bili od Sigma-Aldrich, USA; Zaviralec avtofagije-lizosoma Bafilomicin A1 (BAFA1, številka serije: TLRL-BAF1) je bil kupljen pri Invitrogenu, ZDA; Avtofagijski aktivator rapamicin (številka sklopa: S17098) je bil kupljen pri Shanghai Yuanye Biotechnology Co., Ltd., Kitajska; Protein, povezan z mikrotubuli, 1 lahka veriga 3 (LC3, Številka sklopa: L7543, Vrste: Rabbit, Razmerje redčenja: 1: 1 000) in -actin (številka sklopa: ZRB1312, Vrste: Rabbit, Redtion Ratio: 1: 5 000) so bili Antibadiji; sekundarno protitelo, označeno s hrenom, označeno s peroksidazo (številka sklopa: 4010-05, Vrste: kozji anti-rabbit, razmerje redčenja: 1: 1 000) je bilo kupljeno od južnega biotehnega, ameriškega podjetja, alexa fluor fluoresses, ki je označeno s fluorom: 1: 43328, valovno dolžnost: 43328, valovno dolžino: 43328, valovno dolžino: 43328, valovno dolžino: 43328, valovno dolžino: 43328, valovno energijo, sekundarno protibodij Kupljeno pri podjetju Sigma-Aldrich Company, ZDA, in Bodipy 493/501 (številka sklopa: D3922) je bilo kupljeno pri podjetju Invitrogen Company, ZDA.

 

1.2 Metode

1.2.1 Celična kultura

Celice HepG2 smo gojili v Dulbeccovem spremenjenem eagle visokem glukoznem mediju, ki vsebuje 10% fetalni goveji serum, 100 u/ml penicilina in 100 ug/ml streptomicina v 37 -stopinjskem 5% inkubatorju ogljikovega dioksida. Ko je celično sotočje doseglo 85%, so bile izvedene subkulture, obloge, intervencije in druge operacije.

 

1.2.2 Imunoblotiranje beljakovin

1.2.2.1 ACT IN ECH

LC 3- ⅱ Stopnja ekspresije proteina v celicah Hepg2 BAFA1 kot zaviralec protonske črpalke lahko povzroči, da se LC 3-} protein združi v velikih količinah v celicah in s tem poveča sposobnost indukcije avtofagije. Zato lahko kombinirano uporabo BAFA1 uporabimo kot sistem za spremljanje avtofagije za oceno indukcijske sposobnosti avtofagije. Celice HEPG2 v fazi logaritmične rasti so bile prenesene na 3,5 cm jedi celične kulture za kulturo čez noč. 100 μmol/L ACT, ECH in BAFA1 smo uporabili za intervencijo 12 ur. Celice smo sprali s predhodno hladno raztopino fosfatnega pufra (PBS) in takoj lizirali v puferju za lizo beljakovin RIPA 10 minut. Supernatant smo centrifugirali in skupno koncentracijo beljakovin določili z uporabo kompleta za koncentracijo koncentracije beljakovin bicinhoninske kisline. Po količinski določitvi z natrijevim dodecil sulfatnim pufrom smo vzorec segreli na 95 stopinj 10 minut, da smo denaturirali protein. Nato smo vzeli 30 μl vzorca z mikropipeto in elektroforezirali na poliakrilamidnem gelu.
Po elektroforezi smo beljakovine prenesli iz gela v nitrocelulozno membrano, blokirano z 1 0% mleka čez noč, inkubirali s specifično primarno protitelo pri sobni temperaturi 1 uro, izprali s fosfatnim puferjem, ki vsebuje 0,5% tritona in inkubirano s posebnim antibodijem na 1 h. Za razvoj barv je bila uporabljena metoda ECL. Postavljeni so bili kot prazna kontrolna skupina, Rapamicin Group, ECH Group, ACT Group, Rapamicin+BAFA1 Group, ECH+BAFA1 Group in ACT+BAFA1 Group.

 

1.2.2.2 Različne koncentracije ACT so posredovale stopnjo ekspresije LC 3- ⅱ Protein v celicah HepG2

Celice logaritmične rasti HEPG2 so bile prenesene na 3,5 cm jedi celične kulture za kulturo čez noč, 25, 50 in 100 μmol/L Act v kombinaciji z BAFA1 pa za intervencijsko zdravljenje 12 ur, in stopnjo ekspresije LC 3- proteina smo odkrili z imunolontiranjem beljakovin. Nadzorni so bili kontrolni skupini (CON Group, prazna kontrola), skupina stradanja (skupina STA, zdravljenje s stradanjem Hepg2), 25, 50 in 100 μmol/L ACT, in BAFA1 v kombinaciji s 25, 50 in 100 μmol/L ACT skupine.

1.2.3 MTT metoda za odkrivanje hitrosti preživetja celic HEPG2, zdravljenih z različnimi koncentracijami ACT 24 in 48 ur
Celice HepG2 v fazi logaritmične rasti so bile inokulirane v 96- plošči z zmerno gostoto inokulacije in gojene v inkubatorju 12 ur. 2 0, 40, 60, 80 in 100 μmol/l ACT smo dodali 24 in 48 ur. V temnem okolju smo dodali 0,5 mg/ml raztopine MTT in inkubirali v inkubatorju. Po 4 urah smo supernatant zavrgli, v vsako jamico dodali 100 μl dimetil sulfoksida in celice stresali v konstantnem temperaturnem stresalniku pri 37 stopinjah 10 minut. Vrednost optične gostote (OD) pri valovni dolžini 490 nm smo zaznali z encimskim markerjem in izračunali hitrost preživetja celic.

 

1.2.4 in vitro konstrukcija modela celic NAFLD

Določeno težo palmitinske kisline (PA) smo stehtali in v celoti raztopili v določeni prostornini izopropanola, da smo pripravili 100 mmol/l PA zalog raztopine, ki smo jo nato razdelili in shranili v hladilniku -20 za kasnejšo uporabo. Raztopino PA zalog razredčimo na 100 μmol/L s celotnim gojiščem in dodamo 1% govejega albumina brez maščobnih kislin. Celice smo inkubirali v 37 stopinjah 3 ure, da smo pripravili indukcijsko raztopino. Celice HEPG2 v fazi logaritmične rasti so bile prenesene v 3,5 cm celično kulturo kulture z ustrezno gostoto za kulturo čez noč, nato pa je bila za intervencijo uporabljena pripravljena indukcijska raztopina.

 

1.2.5 ACT INTERVENCIJA NAFLD in vitro celični model TG odkrivanje in olje rdeče O obarvanje

 

1.2.5.1 TG odkrivanje

Celice HEPG2 v fazi logaritmične rasti so bile v skladu s prazno kontrolno skupino, modelno skupino in intervencijsko skupino za kulturo prenesene v 3,5 cm celično kulturo za kulturo. Modelno skupino je bila inducirana s 100 μmol/L PA indukcijsko raztopino, intervencijsko skupino ACT pa je bila inducirana s 100 μmol/L PA indukcijsko raztopino in hkrati dodamo 50 μmol/L ACT. Čas intervencije je bil 24 ur. Nežno odstranite stari gojišče, počasi operete celično površino z vnaprej ohlajenimi PBS enkrat, dodajte 100 μl/posodo vnaprej ohlajene raztopine za lizijo, v celoti lizirajte na ledu 15 minut, centrifugirate v 4 stopinj in {{12} r/min za 10 minut, zbirate 10 μl, ki za encimsko detektino odvzamete 10 μL za encimsko detektiranje, odvzemite 10 μL za encimsko stopnjo, ki za encimsko detektivo odtegne 10 μL za encimsko detektiranje. Na navodila za komplet TG in na koncu popravite raven TG na mg beljakovin.

1.2.5.2 Olje rdeče o obarvanje

Celice HEPG2 v fazi logaritmične rasti so bile prenesene v 3,5 cm kulturne posode, prekrite s sterilnim pokrovom za kulturo čez noč. 100 μmol/L PA je povzročil celice, da tvorijo kapljice lipidov. Hkrati smo 24 ur dodali 50 μmol/L ACT za intervencijo.
The cell slides were collected, washed 3 times with pre-cooled PBS, fixed with 4% formaldehyde at room temperature for 10 min, washed the cell surface with PBS, added the prepared Oil Red O staining working solution, stained at room temperature in the dark for 15 min, aspirated the Oil Red O staining solution, washed the excess staining solution with double distilled water, rinsed with 60% isopropanol, washed with double Destilirana voda in zapečatena in fotografirana pod mikroskopom.

 

1.2.6 Imunofluorescenčna opazovanja avtofagosomov in lipidnih kapljic po zdravljenju

Celice HEPG2 v fazi logaritmične rasti so bile prenesene v 3,5 cm kulturne posode, prekrite s sterilnim pokrovom za kulturo čez noč. 1 0 0 μmol/L Pa smo uporabili za indukcijo tvorbe lipidnih kapljic v celicah. Hkrati smo za interventno zdravljenje dodali ACT 24 ur. The cell slides were collected, washed 3 times with pre-cooled PBS, fixed at room temperature for 10 min with 4% formaldehyde, permeabilized at room temperature for 15 min with a permeabilization buffer containing 0.1% saponin, blocked at room temperature for 1 h with goat serum, incubated at room temperature for 1 h with LC3-specific primary antibody, washed 3 times with PBS in dodamo s specifičnim fluorescentno označenim sekundarnim protitelesom, inkubirano pri sobni temperaturi in stran od svetlobe 1 uro. Po inkubaciji protiteles smo diapozitive 3-krat oprali s PBS, kontrastainirali z lipidno kapljico, specifično za sondo, 10 minut pri sobni temperaturi, 10 minut, speremo s PBS in zatesnjeni s protimisnim tesnilnim medijem, v temi, ki so jih opazili z laserskim konfokalnim mikropopom in zabeleženi. Postavljena so bila prazna kontrolna skupina, skupina za zdravljenje rapamicina in intervencijska skupina ACT.

 

1.3 Statistična analiza

SPSS25. 0 statistična programska oprema je bila uporabljena za analizo podatkov. Kvantitativni podatki so bili izraženi kot x ± s. Uporabljena je bila enosmerna analiza variance in testa LSD-T. Str<0.05 was considered statistically significant.