Kloniranje genov, funkcionalna identifikacija, strukturna in ekspresijska analiza saharozne sintaze iz Cistanche Tubulosa Ⅱ

Rezultati in analiza

1 Kopanje genov za saharozno sintazo v Cistanche tubulosa in kloniranje gena CtSus

Using the amino acid sequence of the identified Arabidopsis thaliana sucrose synthase AtSus1 as a template[16], the sequence was aligned in the Cistanche tubulosa transcriptome database by local Blastp. At the same time, two sucrose synthase gene sequences with FPKM values greater than 10 were screened out in combination with transcriptome gene annotation and gene expression abundance data. They were named CtSus and CtSus1, respectively. The comparative transcriptome data of different parts of Cistanche (haustoria, underground parts and aerial parts) were further analyzed. The distribution of chemical components in different parts of Cistanche plants has been studied in depth. The results showed that glycoside compounds represented by phenylethanoid glycosides in Cistanche are mainly present in its underground parts, with the highest content in the haustoria[22]. In the early stage of this study, the content of phenylethanoid glycosides in plant materials used for comparative transcriptome sequencing of different parts was also determined, confirming that the content of phenylethanoid glycosides in different parts of Cistanche tubulosa was different in the following manner: haustorium>underground part>>zračni del.

Visokokakovostna Cistanche Tubulosa za moško zdravje

Zato so bile vrednosti FPKM ravni ekspresije dveh kandidatov za gena za saharozno sintazo, pridobljene pri začetnem presejanju podatkov o transkriptomih različnih delov Cistanche tubulosa, normalizirane z Z-Score in izvedena je bila diferencialna analiza (slika 1A). Rezultati so pokazali, da ima gen CtSus najvišjo stopnjo ekspresije v haustoriju, raven ekspresije v podzemnem delu pa je višja od tiste v nadzemnem delu, kar je bilo skladno z vzorcem kopičenja glikozidnih spojin v različnih delih Cistanche tubulosa, medtem ko je bila raven izražanja gena CtSus1 v haustoriju nizka. Zato je bil na podlagi zgornjih rezultatov gen CtSus izbran za naknadno pomnoževanje zaporedja, eksogeno izražanje in funkcionalno identifikacijo. Z uporabo cDNA Cistanche tubulosa kot predloge je bil po pomnoževanju PCR pridobljen produkt z enim pasom pri ~2500 bp (slika 1B). Produkt PCR je bil pridobljen iz gela in ligiran na vektor za kloniranje, s sekvenciranjem pa je bila pridobljena kodirna regija celotne dolžine ciljnega gena. Dolžina zaporedja CtSus je bila 2418 bp.

Slika 1 Raziskovanje genov in kloniranje CtSus iz C. tubulosa in bioinformatska analiza njegovega kodiranega proteina. A: Stopnje izražanja genov CtSus in CtSus1 v različnih delih C. tubulosa, normalizirane kot Z-rezultati na podlagi njihovih vrednosti FPKM; B: Gensko pomnoževanje CtSus; M: DNA marker; C: Konzervativna domena proteina CtSus, predvidena s SMART; D: Večkratna poravnava zaporedja CtSus in saharoznih sintaz, identificiranih iz drugih rastlin, vključno z Arabidopsis thaliana, Solanumtuberosum in Albuca bracteata. Domena sinteze saharoze in domena prenosa sladkorja sta predstavljeni z rdečimi oziroma modrimi okvirji; E: Filogenetska analiza CtSus in saharozesintaz drugih rastlin; F: SDS-PAGE analiza heterologne ekspresije CtSus z uporabo vektorja pCold™ I v E. coli. Proga 1: Proteinski marker; Proga 2: frakcija supernatanta; Proga 3: Frakcija oborine. Rdeča puščica prikazuje protein CtSus. G: PCR kolonije enega klona, ​​ki vsebuje oba dva rekombinantna plazmida. M: marker DNA; 1: pET-28a-UGT71BD1; 2: pCold™ I-CtSus

Tabela 2 Podobnosti zaporedja aminokislin med CtSus in saharoznimi sintazami, identificiranimi iz druge rastline

2.3 Filogenetska analiza

Filogenetsko drevo, izdelano s programsko opremo MEGA, je bilo uporabljeno za analizo filogenetskega razmerja med saharozno sintazo CtSus iz Cistanche tubulosa in drugimi rastlinskimi saharoznimi sintazami. Rezultati so prikazani na sliki 1E. Sintaze saharoze, pridobljene iz rastlin, kažejo izrazite evolucijske veje pri dvokaličnicah (regiji I in II) in enokaličnicah (regija III). CtSus je v veji dvokaličnic in zaporedja, ki so najtesneje povezana s CtSus, so vsa iz rastlin Lamiaceae (Cistanche tubulosa je rastlina Lamiaceae Orobanchaceae), medtem ko je druga veja v glavnem sestavljena iz rastlin Solanales, kar dodatno kaže na visoko ohranjenost in homologija rastlinskih genov za saharozno sintazo v evoluciji rastlin v enakem vrstnem redu. Med njimi je sintaza saharoze PrSus (AEN79500.1) iz Phelipanche ramosa iz rastline Orobanchaceae najtesneje povezana s CtSus.

3 Eksogena ekspresija in analiza aktivnosti CtSus

3.1 Eksogena ekspresija gena CtSus Plazmidi pET-28a-CtSus, pET-24b-CtSus in pCold™ I-CtSus, preverjeni s sekvenciranjem, so bili preneseni v ekspresijsko kompetentno E. coli Transetta (DE3), in pozitivne klone smo pregledali s PCR kolonije za preverjanje sekvenciranja. Dobljene rekombinantne ekspresijske seve smo inducirali z nizko temperaturo IPTG za ekspresijo proteina, bakterije smo zbrali s centrifugiranjem in dodali lizni pufer, da smo razbili bakterije, da smo dobili supernatant in oborino, za detekcijo pa smo izvedli SDS-PAGE. Rezultati so pokazali, da ko sta bila pET-28a in pET-24b uporabljena kot ekspresijska vektorja, CtSus ni bil izražen v E. coli, medtem ko je bil pCold™ I uporabljen kot ekspresijski vektor, jasen CtSus pas rekombinantnega proteina je bil odkrit v območju ~100 kDa, kar je bilo skladno z njegovo teoretično predvideno relativno molekulsko maso 92,2 kDa (slika 1F).

3.2 Celocelična transformacija

Da bi predhodno preverili katalitično funkcijo CtSus, je bil konstruiran koekspresijski sev CtSus in gena glikoziltransferaze UGT71BD1. UGT71BD1 je bil kloniran in identificiran iz Cistanche tubulosa in je UDP-glukoziltransferaza, ki lahko široko sprejme aromatske spojine, kot so feniletanoidni glikozidi, različne vrste flavonoidov, stilbena in kumarina, kot receptorje ter katalizira reakcijo glukozilacije substratne fenolne hidroksilne skupine z uporabo UDP-glukoze kot darovalec sladkorja [18]. Uvedba CtSus lahko teoretično zagotovi več zadostnega glikozilnega donorja UDP-glukoze za reakcijo glukozilacije, ki jo katalizira UGT71BD1, s ​​čimer spodbuja reakcijsko ravnovesje, da se pomakne proti tvorbi produktov glikozilacije, s čimer se poveča izkoristek produktov glikozilacije. Plazmid pCold™ I-CtSus in plazmid pET-28a-UGT71BD1 sta bila istočasno transformirana v ekspresijsko kompetentno E. coli Transetta (DE3). Posamezni kloni, ki so vsebovali oba rekombinantna plazmida, so bili pregledani s kolonijsko PCR in pozitivni rekombinantni ekspresijski sevi so bili pridobljeni s preverjanjem sekvenciranja (slika 1G). Sočasno izražanje dvojnega gena je bilo inducirano in vitro, sev ekspresije enega gena pET-28aUGT71BD1 pa je bil uporabljen kot kontrolna skupina. Aktivnost CtSus pri kataliziranju generiranja UDP-glukoznega donorja je bila predhodno preverjena s transformacijo celih celic. Rezultati HPLC in masne spektrometrije visoke ločljivosti so pokazali, da je bila pri izvedbi reakcije transformacije celih celic z akonitinom 1 in resveratrolom 2 kot substratom zaznana proizvodnja očitnih produktov glikozilacije po 24 urah transformacije, kot je prikazano na sliki 2.

Slika 2 Celocelična biotransformacija substrata 1 ali 2 s spajanjem rekombinantnega seva, ki vsebuje UGT71BD1, ali rekombinantnega seva, ki vsebuje UGT71BD1, s ​​CtSus. A: HPLC-kromatogrami biotransformacije celotne celice substrata 1. Valovna dolžina detekcije je bila 360 nm; B: HRESI-MS in MS2 spektra produkta 1a; C: HPLC kromatogrami biotransformacije celotne celice substrata 2; Valovna dolžina detekcije je bila 330 nm. D: HRESI-MS spektri produktov 2a in 2b

Ko je 1 (m/z 179.034 4 [M+H]+, molekulska formula C9H6O4) smo uporabili kot substrat, kromatografski vrh produkta 1a (m/z 341.087 2 [M+H]+, predvidena molekulska formula C15H16O9) smo zaznali pri 5,39 min, kar je bilo skladno z UV vpojnost substrata in kontrolni izdelek. Istočasno je bil v spektru MS2 1a zaznan vrh fragmenta m/z 179.033 4 [M+H]+, ki je nastal z izgubo molekule glukoze (162 Da) pri 1a, kar kaže, da 1a je bil produkt substrata 1, povezanega z molekulo glukoze. Stopnja pretvorbe je bila izračunana z integracijo površine vrha. Ugotovljeno je bilo, da je bila stopnja pretvorbe celih celic UGT71BD1, ki katalizira substrat 1 za generiranje glikoziliranega produkta 1a, 71,87 %, medtem ko je dodatek CtSus povečal stopnjo pretvorbe reakcije na 95,84 %, kar je 1,3-krat več kot pri kontrolni skupini. Ko je bil substrat spojina 2 (m/z 227.072 5 [MH]-, molekulska formula C14H12O3), ima produkt kromatografske vrhove 2a (m/z 389.123 4 [MH]-, predvidena molekulska formula C20H22O8) in 2b (m/z 575.175 9 [M+Na]+, predvidena molekulska formula C26H32O13), skladna z značilno UV absorpcijo substrata in kontrolni produkt, sta bila zaznana pri 10,32 oziroma 6,52 min. . Vrh fragmenta je bil zaznan pri 3 [MH]-, ki je nastal zaradi izgube ene molekule glukoze (162 Da), kar kaže, da je bil 2a produkt substrata 2, povezanega z eno molekulo glukoze. S primerjavo s podatki v literaturi [18] in podatki napovedi masne spektrometrije je bilo ugotovljeno, da je produkt 2b produkt substrata 2, povezanega z dvema molekulama glukoze. Stopnja pretvorbe je bila izračunana z uporabo integrirane površine vrha. Ugotovljeno je bilo, da lahko dodatek CtSus poveča stopnjo pretvorbe reakcije glikozilacije substrata 2 s 64,01 % na 78,51 %, med katerimi se je izkoristek monosaharidnega produkta 2a povečal s 45,09 % na 63,58 % in izkoristek disaharidnega produkta 2b. spremenil iz 18,92 % na 14,93 %.

3.3 Čiščenje rekombinantnega proteina CtSus in identifikacija in vitro encimske aktivnosti

Rezultati eksperimenta transformacije celotne celice kažejo, da ima CtSus aktivnost kataliziranja proizvodnje UDP-glukoze aktivnega donorja glukoze. Da bi dodatno neposredno preverili to katalitično aktivnost z in vitro encimsko katalitično reakcijo, smo fuzijski protein gena CtSus v ekspresijskem sistemu pCold™ ločili in očistili z afinitetno kromatografijo. Rezultati so pokazali, da se je pri uporabi pCold™ I kot ekspresijskega vektorja rekombinantni protein izražal v velikih količinah, vendar večinoma v oborini. Ko je bil pCold™ TF uporabljen kot ekspresijski vektor, je bil gen CtSus izražen v velikih količinah v E. coli (slika 3A). Fuzijski protein je bil prečiščen z afinitetno kromatografijo HisTrap FF in podvržen in vitro encimski katalitični reakciji. Rezultati so prikazani na sliki 3B. Ko sta bila kot substrata uporabljena saharoza in UDP, je bil v primerjavi z negativno kontrolno skupino zaznan nov vrh produkta pri 10,32 min. Njegov retencijski čas in UV absorpcija sta bila skladna z UDP-glukozo. V primerjavi s standardom je bilo dokazano, da je produkt UDP-glukoza. Ker pa fuzijski protein, izražen z ekspresijskim vektorjem pCold™ TF, vsebuje velik topni tag sprožilnega faktorja (velikost tag proteina je 48 kDa), bo imel velik vpliv na katalitično aktivnost proteina. Zato je bila oznaka fuzijskega proteina dodatno razrezana z encimom faktorja Xa in beljakovina CtSus brez eksogenih oznak je bila prečiščena (slika 3A). Protein je bil podvržen in vitro encimski katalizi in rezultati so pokazali, da se je izkoristek UDP-glukoze povečal s 3,53 % na 10,66 %.

(Slika 3B). Zgornji rezultati so potrdili aktivnost CtSus pri kataliziranju proizvodnje UDP-glukoze z in vitro encimsko katalizo in tudi pokazali, da je prisotnost velike afinitetne oznake ugodna za topno izražanje CtSus, vendar bo tudi pomembno vplivala na vitro katalitično aktivnost encima.

Slika 3 Heterologno izražanje in funkcionalna identifikacija CtSus. A: SDS-PAGE analiza proteinov CtSus. Proga 1: Proteinski marker; Proga 2: Rekombinantni CtSus s sprožilnim faktorjem; Proga 3: cepitev oznake sprožilnega faktorja z uporabo proteaze faktorja Xa, da dobimo protein CtSus, označen z rdečo puščico. B: Invitro encimski testi z uporabo fuzijskega proteina in CtSus proteinov brez sprožilnega faktorja za kataliziranje sinteze UDP-glukoze v prisotnosti saharoze oziroma UDP z referenčno standardno UDP-glukozo. Kuhane beljakovine smo uporabili kot kontrolno skupino pod enakimi pogoji. Valovna dolžina detekcije je bila 260 nm