Zatiranje z vnetjem povezanih poškodb ledvic po presaditvi z uporabo novega lovilca prostih radikalov PrC-210 pri podganah
Mar 18, 2022
Torsten R. Goesch 1, Nancy A. Wilson2, Weifeng Zeng2, Bret M. Verhoven2, Weixiong Zhong2,Maya M. Coumbe Gitter3in William E. Fahl1,3,*
Povzetek:
Alograftledvicapresaditev, ki sproži gostiteljsko celično in protitelesno posredovano zavrnitevledvica, pomembno prispeva k poškodbi ledvic med presaditvijo. Tukaj smo vprašali, ali bi PRC-210 zaviral škodo, opaženo pri presaditvi ledvic z alograftom. Ledvice rjave norveške podgane (BN) so bile perfundirane in situ (raztopina UW) z ali brez dodanega 30 mM PrC-210 in nato takoj presajene v podgane Lewis (LEW). 20 ur kasneje so analizirali presajene BN ledvice in plazmo LEWrat.Ledvicahistologijo in ravni ledvic/seruma več citokinov, povezanih z vnetjem, so izmerili za oceno patologije ledvic, povezane z neusklajenostjo, in zaščitne učinkovitosti PrC-210. Dvajset ur po presaditvi alogenskega presadka: (i) v ledvicah presadka so opazili pomembno histološko poškodbo ledvičnih tubulov in infiltracijo mononuklearnih vnetnih celic; (ii)ledvicafunkcijske metrike (kreatinin in BUN) so bile znatno povišane; (iii) opažene so bile pomembne spremembe ključnih citokinov, tj. TIMP-1, TNF-alfa in MIP-3A/CCL20, ter ravni kaspaze, aktivirane v ledvicah. Pri LRK-210-zdravljenih ledvicah in prejemnih podganah sta se (i) histološka poškodba ledvic (Banffova ocena) in mononuklearna infiltracija zmanjšali na ravni nezdravljenega ozadja; (ii) kreatinin in BUN sta bila znatno znižana; in (iii) spremembe aktivirane kaspaze in citokinov so se znatno zmanjšale, nekatere v ozadju. Skratka, rezultati kažejo, da bi PrC-210 lahko zagotovil široko uporabno zaščito organov za številna stanja presaditve alogenskega presadka; lahko bi zaščitil presajene ledvice med in po vseh stopnjah postopka presaditve – od darovanja organov, prek transporta, ponovne vsaditve in pooperativnega vnetja –, da bi zmanjšal akutno in kronično zavrnitev.
Kejwords: ledvicaalograft; zavrnitev ledvic; ishemija
Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com
maca ginseng cistanche
1. Uvod
Končna odpoved ledvic povzroči več kot 1,2 milijona smrti letno po vsem svetu [1].Ledvicapresaditev je prednostno zdravljenje za bolnike s končno odpovedjo ledvic. Vsako leto se po vsem svetu izvede več kot 90 000 presaditev ledvic.
Sam proces presaditve povzroči znatno poškodbo celic in organovledvica, kar zmanjšuje dolgoročno preživetje organa. Tri primarne poškodbe ledvice med presaditvijo alografta so (i) poškodbe, ki jih povzročijo reaktivne kisikove in dušikove vrste (ROS in RNS) med hladno ishemijo („hladilno shranjevanje“) [2], (ii) poškodbe, ki jih povzročijo ROS ob vsadku. ('poškodba ponovne perfuzije') [3] in (iii) vnetje po presaditvi alografa, ki sproži prirojeni imunski odziv in s protitelesi posredovano zavrnitev (ABMR) [4].
Nevtrofilci in makrofagi migrirajo v poškodovani presadek v 6 urah po reperfuziji in stimulirajo sintezo kemokinov v rezidenčnih dendritičnih celicah, ki nato aktivirajo limfocite T in rekrutirajo adaptivne imunske celice. Ko se te imunske celice infiltrirajo v epitelne celice proksimalnih tubulov, proizvajajo mieloperoksidazo v nevtrofilcih in nikotinamid adenin dinukleotid fosfat (NADPH) oksidazo v makrofagih, ki oba prispevata k lokalni produkciji prostih radikalov. Ti vnetni procesi vodijo do aktivacije poti komplementa in nadaljnjega preoblikovanja in lize celic vledvicaalotransplantat [5]. ABMR se lahko pojavi kot posledica enega ali obeh predhodno oblikovanih aloprotiteles proti presadku ali zaradi de novo razvoja protiteles, specifičnih za darovalca (dnDSA) [5–7]. Akutni (min/dnevi), ki prehaja v kronični (dnevi/tedni), vnetni odziv znotraj alogenske ledvice z neprekinjeno proizvodnjo ROS in vnetnih citokinov lahko povzroči resen, samoponavljajoč se odziv, ki povzročiledvicaodpoved organa.
Za boljše razumevanje celičnih in molekularnih poti, vključenih v patogenezoledvicavnetje in zavrnitev alogenskega presadka, smo razvili in karakterizirali podganji model, ki posnema večino kliničnih kriterijev prirojenega imunskega odziva, ABMR in izgube ledvičnih organov [8]. Ta model je bil uporabljen za oceno številnih novih strategij presaditve po alografiji.
Dva trenutno priznana pristopa za zmanjšanje akutnega in dolgoročnega imunskega odziva protiledvicaalotransplantata so: (i) povečati možnost iskanja navzkrižno ujemajočega se darovalca in (ii) odstraniti že obstoječa protitelesa protiledvicaalograftom z uporabo protokolov desenzibilizacije [9,10].
V delu, opisanem v tem rokopisu, smo vprašali, ali bi bil tretji pristop za zatiranje resnosti akutnega in dolgotrajnejšega vnetja koristen. Takoj delujoči lovilec prostih radikalov, PRC-210, smo aplicirali v vsajeni alogenski presadekledvicain podgani prejemnici, da bi ugotovili, ali je mogoče preprečiti poškodbe ROS, povezane z vnetjem. Čeprav koncept zatiranja ROSin, povezanega z vnetjemledvicapresaditev ni nova, tukaj je uporaba novega PRC-210 ROSscavenger s takojšnjim delovanjem. Takojšnje kot kronično čiščenje in inaktivacija prostih radikalov, ki povzročajo vnetje, in ustvarjenih prostih radikalov znotraj novo presajenega alogenskega presadkaledvicawould significantly enhance the existing strategies to suppress allograft rejection and would provide another pathway to reduce post-transplant kidney cell damage, and with it, suppress Delayed Graft Function to improve survival of the kidney allograft.PRC-210 is a new small-molecule, aminothiol, free radical scavenger [11]; it has no measurable nausea/emesis nor hypotension side effects [12]. Unlike traditional antioxidants that act indirectly over hours to days via NrF-2 to activate the expression of protective genes [13], PRC-210 directly scavenges ROS to confer 100% protection in seconds [11]. PRC- 210 was the most potent of the 13 commonly studied "antioxidants" screened in an assay that scored the ability of molecules to prevent x-ray-induced damage to naked DNA; the majority of the tested "antioxidants" showed no protection [14,15]. In a related essay, the addition of PrC-210 30 s before a 60 s pulse of •OH to naked DNA provided complete protection against the •OH insult that induced >95-odstotna poškodba DNK pri nezaščitenih kontrolah [16]. V dveh predhodnih študijah presaditve ledvic pri glodalcih [16,17] je bilo dokazano, da PRC-210 zavira z ROS povzročeno poškodbo ledvic, povzročeno med (i) 30-urnim shranjevanjem v hladilnici [17] in (ii) reperfuzijsko poškodbo po vsadku [16]. ] na raven ozadja, s čimer odstranimo dva pomembna vira poškodbe presajenih ledvic. Pokazalo se je tudi, da molekula PRC-210 zavira poškodbe, ki jih povzročajo prosti radikali, v več drugih okoljih organov [15,18]. Tako smo domnevali, da bi moral biti PrC-210 tudi sposoben zaščititi alogenski presadek pred oksidativnim stresom, ki nastane zaradi (i) celično in (ii) zavrnitvenih procesov, posredovanih s protitelesi, ki proizvajajo proste radikale kot stranski produkt.
Da bi raziskali to hipotezo, smo razvili nov model podgan, ki se je izognil indukciji večjih ishemičnih in reperfuzijskih dogodkov in dajal PrC-210 tako pred in po implantaciji. Ledvice rjave podgane so bile sprane z raztopino UW, ki je vsebovala PrC-210, in takoj presajene v singenske prejemnike podgan Lewis. Čas hladne ishemije je bil praktično odpravljen. Takoj po vsaditvi in še 8 ur po vsaditviledvicapodgane prejemnice so prejele sistemske injekcije PrC-210 v odmerkih, ki bi omogočili neprekinjeno lovljenje prostih radikalov v presadkuledvica. Presajene ledvice in krvna plazma so bile nato pobrane 20 ur po presaditvi, da se omogoči merjenje PrC-210-za (i) zaviranje stranskih produktov vnetja in (ii)ledvicazaščita.
maca ginseng cistanche
2. Materiali in metode
2.1. Živali
Odrasli (200–250 g) samci podgan Lewis in BN so bili kupljeni pri Envigo (Indian-napolis, IN, ZDA) in nameščeni v objektu za oskrbo živali na Univerzi Wisconsin v Madisonu, WI, ZDA. Vsi postopki so bili izvedeni v skladu s pravilnikom o oskrbi in uporabi živali na Univerzi v Wisconsinu. Vzdrževanje zdravja živali, vključno s smrtjo živali, sobno temperaturo, 12-urnimi cikli svetlobe/teme in čiščenjem kletk, med drugimi sanitarnimi nalogami, je dnevno opravljalo osebje za nego živali. Hrana in voda sta bili na voljo ad libitum. To raziskavo sta prospektivno odobrila Medicinska fakulteta in Odbor za institucionalno oskrbo in uporabo živali na Univerzi v Wisconsinu (Protokol za živali št. M005204). Vse skupine so vsebovale 4–6 živali.
2.2. Materiali
Sinteza PrC-210 HCl aminotiola, predklinične molekule, je bila opisana ločeno [19,20]. PrC-210 HCl kristali (3-(metilamino)-2-(metil monometil)propan-1- tiol) so shranjeni v atmosferi dušika pri –20 ◦C in celo z rutinsko odtaljevanju, uporabi in ponovnem shranjevanju je kristalni PrC-210 popolnoma stabilen več kot 4 leta po analizi masne spektrometrije. Druge kemične reagente smo pridobili pri Sigma Aldrich (St. Louis, MO, ZDA). UW Organ Preservation Solution je bila kupljena pri Bridge to Life, Columbia, SC, ZDA.
2.3. Kirurški in eksperimentalni postopek
Postopek presaditve, uporabljen v teh poskusih, je prikazan na sliki 1. Pri podgani darovalci BN je po dvojni ligaciji aorte, ligaciji desne ledvične arterije in vene ter kirurškem odseku leve ledvične vene leva podganaledvicaje bil perfundiran in situ z uporabo 5 ml UW raztopine sobne temperature (v obdobju 15 s). Perfuzat je bila samo raztopina UW (za skupine »0 h« in »20 h brez zdravljenja«) ali raztopina UW, kateri je dodana kristalna PrC-210, da se doseže 30 mM [17], je bil dodan, takoj raztopljen in nato pH naravnan na pH začetne UW raztopine 7,4 z dodatkom 0,0619 µL 5N NaOH na µmol PrC-210 HCL soli (FW: 220). Razpolovna doba PrC-210 tiola (aktivna oblika) je približno 3,5 h v fizioloških pH raztopinah, kot sta UW raztopina in človeška kri [14]. Po perfuziji in situ levi BNledvicaje bil kirurško odstranjen in nato zašit s topo anastomozo žil in sečevoda v izpraznjeno mesto leve ledvice podgane prejemnice LEW. Pravi LEWledvicaje bil podvezan in odstranjen tik pred tem. Pet minut po kirurškem zaprtju podgane LEW je podgana prejela sistemski odmerek PrC{{0}} (121 ug PrC-210 HCl na gram telesne teže, kar je enako 0).24 X največji tolerirani odmerek) z intraperitonealno injekcijo. Kot je prikazano na shemi na sliki 1, je podgana prejela tudi intraperitonealne injekcije PrC-210 (0,24 MTD) plus 4 ure in plus 8 ur po presaditvi. Podgane so bile evtanazirane plus 20 ur po presaditvi inledvicein vzorci plazme so bili zbrani za analizo. V vsaki zdravljeni skupini je bilo najmanj pet podgan.
2.4. Meritve BUN in kreatinina v serumu
BUN in kreatinin sta bila izmerjena v vzorcih seruma s tehnologijo Catalyst One AnalyzerTechnology (IDEXX Laboratories, Westbrook, ME, ZDA).
2.5. Encimski imunosorbentni testi
Testi so bili izvedeni, kot je opisano v protokolih kompleta ELISA (Podgana TIMP-1, Kat. št. RTM- 100; Podgana MIP3-A, Kat. št. DY540; Podgana TNF-alfa, Kat. št. RTA{ {5}}; R&D Systems, Minneapolis, MN, ZDA). Na kratko, razredčine podganje plazme smo dodali na predhodno obložene plošče, inkubirali 2 uri pri 37 О C. Nato smo dodali z biotinom konjugirano protitelo, specifično za analizirani protein, in inkubirali 1 uro pri 37 О C, sprali, konjugirali z avidinom dodali smo hrenovo peroksidazo, čemur je sledilo pranje in dodajanje substrata TMB. Reakcijo smo inkubirali 10–30 minut, zaustavili z žveplovo kislino in odčitali pri 450 nm.
2.6. Niz citokinov podgane Proteome Profiler
Testi so bili izvedeni v bistvu, kot je opisano v protokolu izdelka. Na kratko, plazmo smo inkubirali z nitroceluloznimi membranami, na katerih so bila zajeta in kontrolna protitelesa. Po inkubaciji smo membrane sprali in inkubirali s streptavidin HRP. V odstopanju od protokola smo za kemiluminiscenčno detekcijo uporabili SuperSignal West Femto (ThermoFisher, Madison, WI, ZDA; kat. št. 34094), saj je dal močnejši signal. Bloti so bili vizualizirani na sistemu FotoDyne gel doc.
2.7. Histologija
Fiksirana s formalinom (10 odstotkov formalina), vdelana v parafin,ledviceso bili razrezani na dele 5 um. Predmetna stekelca smo deparafinizirali, rehidrirali iz ksilena skozi stopnjevane serije etanola v vodo in nato obdelali, kot je opisano spodaj. Diapozitivi so bili skenirani z objektivom 20- v Aperio Digital Pathology Slide Scanner. Vse preparate H&E je pregledal dr. Weixiong Zhong, MD, PhD, transplantacijski patolog, in jih ocenil za PTC, glomerulitis (g), vaskulitis (v)/intimalni arteritis, intersticijsko vnetje (I) in obarvanje s C4d, glede na Banff 2009 [21].
Posebej je bila diapozitivom dodeljena slepa številka in neprekrivajoče se digitalne slike ledvičnih tubulov so bile posnete na vmesniku med medulo in skorjo iz vsakega H/E diapozitiva. Pazili smo, da ne vključimo lumnov velikih žil in glomerulov. Avtomatizirano kvantificiranje rdečih in modrih slikovnih pik v vsakem 10-ledvicaslika je bila izvedena z uporabo makra po meri, napisanega v programski opremi ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/index.html
dostopno 13. aprila 2021). Rdeče slikovne pike so odsevale proksimalno cevasto debelino, vključno s čopičem. Jedra so bila kvantificirana v modrem kanalu. Razmerje med modrimi jedrnimi slikovnimi pikami in rdečimi tubuli je zagotovilo oceno vnetne infiltracije za infiltracijo belih krvnih celic po presaditviledvice. Rezultati so bili povprečeni in narisani z uporabo Graphpad Prism.
2.8. Aktivirana aktivnost encima kaspaze
Aktivirana aktivnost kaspaze 3 in 7 vledvicahomogenatni supernat je bil določen z uporabo fluorescenčnega substrata Apo-ONE (Promega, Madison, WI, ZDA) [16]. Na kratko, odmrznjenoledvicesmo zmešali s 8-kratnim presežkom liznega pufra, ki je vseboval 50 mM Na HEPES, pH 7,4, 100 mM NaCl, 1 mM EDTA, 10 mM DTT, 10 odstotkov glicerola in homogenizirali pri 4 О C 30 s s homogenizatorjem tkiva Omni . Homogenat ledvic centrifugiramo pri 4ОC (16,000- g) v mikrofugi Eppendorf 20 minut. Supernate smo takoj testirali na aktivnost kaspaze in vsebnost beljakovin po Bradfordovi metodi z uporabo govejega serumskega albumina kot standarda. Test aktivirane kaspaze smo izvedli na naslednji način: 5 uL supernata (~40 ug supernatnega proteina) smo razredčili na skupni volumen 50 uL z zgornjim pufrom za lizo in zmešali s 50 uL nerazredčenega substrata Apo-ONE v vdolbinici. črne, neprozorne plošče s 96 vdolbinicami za začetek 60-minutne reakcije. Plošče stresamo pri 200 RPM pri 37 О C 60 minut. Cepitev peptidnega substrata kaspaze DEVD smo izmerili z uporabo bralnika fluorescentnih plošč BMG Clariostar pri valovni dolžini vzbujanja 499 nm in valovni dolžini emisije 521 nm. V vsak poskus je bil vključen standard kaspaze.
2.9. Mitohondriji podganjih ledvic
Očiščeno mitohondrijsko frakcijo pripravimo iz homogenizirane podganeledvices standardno tehniko centrifugiranja [22]. Očiščene mitohondrije smo suspendirali v 0.15 M Tris HCl pufru, pH 7,4.
Da bi ugotovili, ali dodatek eksogenega PrC{{0}} zavira fragmentacijo mitohondrijske DNA, ki jo povzroči ROS [22], smo v reakcijski prostornini 25 uL (v epruveti PCR) dodali: 1{{29} } uL prečiščenih mitohondrijev, 5 uL PrC-210 razredčitve ali vode (PrC-210 je bil dodan 10 minut pred generatorjem Fe plus plus plus ADP plus H2O2 ●OH) in 10 uL, ki vsebuje FeCl2 (2,5 mM; FW: 127), natrijeva sol adenozin 5'-difosfata (10 mM; FW: 427) in H2O2 (0,003 odstotka končne koncentracije). Po 20 minutah pri 37 О C smo 10 uL reakcije zmešali s 5 uL 6- barvila za nalaganje gela, ki je vsebovalo 0,3 odstotka SDS; epruvete so 1 minuto sedele v vodi pri 60 О C, 10 ul smo nato naložili v jamico 1-odstotnega agaroznega TAE gela in po 60 minutah pri 60 voltih smo gele obarvali in fotografirali. Za vsako preskusno točko so bile opravljene najmanj tri ponovitve, da se omogoči statistična primerjava.
2.10. Statistična analiza
Podatki so izraženi kot povprečje plus /一 spolno prenosljive bolezni. S programsko opremo GraphPad Prism 7.03 so bili uporabljeni Studentovi t-testi za določitev statistične razlike in vrednosti p. p-vrednosti, manjše od 0,05, so veljale za pomembne.
3. Rezultati
3.1. PrC-210 Zatiranje patologije ledvičnega alotransplantata
20 ur po presaditvi histologija presajenega BNledvice(Slika 2A–D), zdravljeni samo z raztopino UW, so jasno pokazali povečane ocene po Banffu za tubulitis in peritubularni kapilaritis (rdeče in rumene puščice); seštevek rezultatov patologije je prikazan na plošči E. BNledviceperfundirano z raztopino PrC{{0}}, ki vsebuje UW raztopino, in prejemanje intraperitonealnih sistemskih odmerkov PrC-210 po vsaditvi (slika 2D) je pokazalo jasno potlačeno vnetno patologijo ledvic in zmanjšano Banffovo oceno za tubulitis in peritubularni kapilaritis enak Banffovim rezultatom kontrolne BN skupine "0 h" (slika 2E). Dajanje PrC-210 je povzročilo znatno zmanjšanje označevalcev poškodbe ledvic kreatina (p=0.032) in BUN (p=0.046).
3.2. Aktivirane ravni kaspaze v ledvicah po presaditvi
Ravni aktivirane kaspaze v BNledvicahomogenatov je bilo v alotransplantatu BN znatno zmanjšanoledviceki niso bili izpostavljeni zdravljenju s PrC{{0}} v 20 urah po presaditvi (slika 5). Perfuzija BN ledvic z raztopino UW, ki vsebuje PrC-210-, in presaditev v podgane Lewis, ki so prejele sistemske odmerke PrC-210, sta povzročila enako aktivirano aktivnost kaspaze, kot jo opazimo pri kontrolnih ledvicah "0 h".
3.3. Vnetne ravni citokinov po alotransplantaciji ledvice BN
V presejalnih poskusih,ledvicahomogenizirajte supernat iz 0 h kontrol in 20 h brez zdravljenjaledviceso bili pregledani s citokinskim nizom Proteome Profiler 29, da bi odkrili spremenjene, z vnetjem povezane ravni izražanja citokinov in kemokinov 20 ur po presaditvi. Kot je prikazano na dveh vstavkih mikromrež na sliki 6, so opazili spremembe v TIMP-1, TNF-alfa in MIP-3a/CCL20. Posamezne plošče ELISA so bile nato uporabljene za kvantificiranje teh sprememb v homogenatih ledvic in serumih, zdaj pa vključujejo tudi podgane, zdravljene s PrC-210. Tako ravni TIMP-1 kot TNF-alfa sta se povečali 20 ur po presaditvi in v obeh primerih sta se njuni ravni znižali v prisotnosti PrC-210 (slika 6A–C). Ravni MIP-3a/CCL20 so se povečale po 20 urah, vendar so se znatno povečale pri podganah, zdravljenih s PrC-210- (slika 6D).
3.4. PrC-210 Zaščita mitohondrijev ledvic podgan
Trajno delovanje mitohondrijev med in poledvicapresaditev je potrebna za preživetje presajenega organa. ROS, ki nastane med ishemijo, povezano s presaditvijo, ishemijo-reperfuzijo in vnetjem po vsaditvi, lahko vpliva na mitohondrijsko delovanje in preživetje ledvic. Zaradi pomembne vloge mitohondrijev smo izolirali mitohondrije iz ledvic podgan in ugotovili, ali lahko PrC-210 v dosegljivih farmakoloških koncentracijah zaščiti te organele pred napadi ROS.
Na sliki 7 prečiščena podganaledvicamitohondrije smo inkubirali z ●OH generatorjem [23]. Po kratki reakciji smo opazili pomembno ROS fragmentacijo mitohondrijske DNA podganje ledvice. Po napadu ROS je bil alikvot mitohondrijev raztopljen v pufru za nalaganje gela, ki je vseboval SDS, mitohondrijska DNA pa je bila ločena in "odmerjena" s kromatografijo v agaroznem gelu (slika 7). Poškodba ROS je jasno zmanjšala povprečno velikost mitohondrijske DNK podganje ledvice (proga b), dodatek PrC-210 mitohondrijem pa je preprečil zlom DNK (proge c–g) v PrC-210 odvisno od koncentracije.
maca ginseng cistanche
4. Razprava
Alograftledvicapresaditev, ki sproži celično in protitelesno posredovano zavrnitev ledvice prirojenega gostitelja, pomembno prispeva k kratkoročnim in dolgoročnimledvicapoškodbe med presaditvijo in s tem povezano zapoznelo delovanje presadka opazimo pri do 50 odstotkih presajenih ledvic. To študijo smo izvedli, da bi ugotovili, ali bi bil PrC-210 učinkovit pri zatiranju resnosti škode, povzročene po presaditvi ledvice alogenskega presadka v modelu podgan, ki v veliki meri odpravi ishemični čas presaditve in z njim povezan oksidativni stres. Naša predpostavka je bila, da bi nam moral ta pristop omogočiti, da vidimo vpliv PrC-210 na posttransplantacijski vnetni inzult z minimalno interferenco ishemije.
Povečanje TNF-alfa in znatna mononuklearna infiltracija kažeta, da presaditev ledvice z alograftom povzroči izrazito akutno vnetje v 20 urah po presaditvi, kar je bilo povezano s poškodbo ledvičnih tubularnih celic, opaženih vledvicahistologija (Banff Scores). TNF-alfa večinoma proizvajajo aktivirani makrofagi in je celični signalni protein, ki sodeluje pri akutnem vnetju. Tesno je povezan s patogenezo akutne in kronične zavrnitve alogenskega presadka [24].
V nasprotju z zgornjimi ugotovitvami pri nezdravljeni BNledvice, PrC-210, dan kot del raztopine UW in sistemsko dajan pri podganah po presaditvi, je zmanjšal raven TNF-alfa in ledvično infiltracijo z mononuklearnimi celicami, kar sta znaka zmanjšanega akutnega vnetja. PrC-210 je zmanjšal poškodbo ledvic, kot je razvidno iz rezultatov histološke poškodbe ledvic (Banff Scores), na nezdravljene osnovne ravni in znižal ravni obeh funkcijskih rezultatov ledvične patologije, kreatinina in BUN.
Vnetje nezdravljenih BN ledvic je bilo povezano s povečanjem TIMP-1 in MIP-3A/CCL20. Za primerjavo smo videli, da je zdravljenje s PrC-210 znatno znižalo raven TIMP-1 in znatno povečalo raven MIP-3A/CCL20.
Tkivni zaviralec metaloproteinaze-1 (TIMP-1) je pomemben regulator sinteze in razgradnje zunajceličnega matriksa (ECM). Prekomerno kopičenje ECM je glavni patološki mehanizem razvoja fibroze med in po akutni poškodbi ledvic. V bistvu ni izraza TIMP-1 v normalnemledvicatkivo [25], opažanje, ki je potrjeno na naši sliki 6A, B, vendar je znano, da se TIMP-1 izraža v poškodovanih ledvicah, predvsem v epitelijskih celicah ledvičnih tubulov, bazalni membrani ledvičnih tubulov in citoplazmi intersticija celice. Povečana ekspresija TIMP-1 je bila v pozitivni korelaciji s sočasnim poslabšanjem delovanja ledvic [26]. Podgane, zdravljene s PrC-210, so pokazale globoko znižanje ravni TIMP-1 (p=0.001), tako v homogenatu ledvic kot v plazmi; to pomeni, da ima PrC-210 močan zaščitni učinek proti reorganizaciji zunajceličnega matriksa ledvic, ki jo povzroči presaditev.
Kemokin MIP-3a/CCL20 aktivira receptor CCR6, ki se izraža zlasti na regulatornih T-celicah (Tregs). CCL20 izražajo tubularne endotelne in intersticijske celice in je tudi povečan v ledvicah z akutno ledvično poškodbo. Pot CCL20–CCR6 igra ključno vlogo pri pridobivanju T-celic v ledvicah, ki jih posreduje Treg, in opisano je, da ima Treg pozitivno vlogo priledvicapopravilo, toleranco za presaditev in preživetje ledvic. Tako blokiranje protiteles na poti CCL20–CCR6 kot tudi uporaba miši s pomanjkanjem CCR6-pri akutnemledvicaposkusi s poškodbami so pokazali, da povečujejo resnost odpovedi ledvic in umrljivost [27]. To nakazuje, da sta lahko klinično izboljšanje poti CCL20–CCR6 in aktivacija Treg možna terapevtska pot za omejevanje akutnega in kroničnegaledvicapoškodba [28]. V naši študiji (slika 6D) je bila raven MIP-3a/CCL20 znatno višja pri podganah, zdravljenih s PrC-210-, kot pri nezdravljenih podganah. Špekuliramo, da je to eden od razlogov za (i) občutno nižjo rekrutacijo mononuklearnih celic v ledvicah (slika 3C) in (ii) znatno zmanjšano poškodbo ledvic (slika 2) pri podganah, zdravljenih s PrC-210-. .
Normalna ledvična mitohondrijska funkcija in, kar je pomembno, poškodbe le-te med koraki shranjevanja ledvic, vsadka in vnetja po vsadku so pomembne determinante poškodbe ROS in odpovedi ledvic med presaditvijo. Zato je bilo pomembno, da se je pokazalo, da PrC-210 zagotavlja popolno zatiranje fragmentacije mitohondrijske DNA (slika 7) pri koncentracijah (2–4 mM), ki so bile dosežene v plazmi miši in podgan, ki so jim dajali intraperitonealno ali peroralni sistemski 0.5 MTD odmerki PrC-210, ki so jih prenašali brez zaznavnih toksičnosti [29].
V naših prejšnjih študijah, povezanih s presaditvijo ledvic [16,17], smo opazili znatno povečanje aktivirane kaspaze v ledvicah, izpostavljenih "hladni ishemiji" in "ishemično-reperfuzijski poškodbi". Te z ishemijo povzročene poškodbe ledvic so bile zmanjšane v ozadje z zdravljenjem s PrC-210 (slika 8). V študijah tega rokopisa (slika 5), v katerih sta bili hladna ishemija in ishemija-reperfuzija v bistvu odpravljeni s takojšnjo presaditvijo, ni bilo povečanja aktivirane kaspaze v presajenih ledvicah. Namesto tega se je aktivirana kaspaza znatno zmanjšala pri plus 20 h pri kontrolah "brez zdravljenja z zdravili", zdravljenje s PrC-210 pa je to zmanjšanje kaspaze popolnoma odpravilo pri plus 20 h podganah in ohranilo raven kaspaze stabilno. Naša razlaga teh zanimivih rezultatov je, da odsotnost kakršnih koli pomembnih z ishemijo povzročenih prostih radikalov zaradi ROS in RNS na po presaditviledvice, ni povezanih markerjev celične smrti in apoptoze, kot so aktivirane kaspaze. Namesto tega pri teh alogenskih presadkih ledvic vnetni signali iz na novo izraženih cito- in kemokinov zdaj uravnavajo celični metabolizem, kar vključuje vplivanje na pot apoptoze. Literatura opisuje, da čezmerna ekspresija TIMP-1 vodi do supresije apoptoze [26]. Naši rezultati kaspaze (slika 5) podpirajo ta opisani učinek TIMP-1 in kažejo, da je TIMP-1 pomemben pri uravnavanju patofiziologije celične poškodbe po presaditvi ledvičnega alogenskega presadka. V potrditev prejšnje PrC-210 supresije ekspresije TIMP-1 (slika 6A, B) je zdravljenje s PrC-210 popolnoma odstranilo spremembo kaspaze in ohranilo ravni kaspaze na enaki ravni kot pri kontrolne ledvice "0 h". Ker znižane ravni PrC-210 serumskega TIMP-1 pri plus 20 h (slika 6B) natančno odražajo pomembno supresijo alogenskega presadka: (i) apoptoza (slika 5), (ii) histološka patologija (sliki 2 in 3) in (iii) infiltracija vnetnih celic (slika 3), pričakujemo, da bo spremljanje serumskih ravni TIMP-1 pri prejemnikih človeških ledvičnih alogenskih presadkov logičen način za spremljanje klinične učinkovitosti PrC-210 v prihodnjih kliničnih preskušanjih .
V našem dosedanjem delu [16,17] smo pokazali, da lahko PrC-210 zaščiti presajene ledvice tako pred posledicami hladne ishemije kot ishemije in reperfuzije. V tej študiji zdaj vidimo, da PrC-210 ščiti tudi ledvice alogenskega presadka pred neishemičnimi vnetnimi inzulti, ki se pojavijo po vsaditvi ledvice. PrC-210 znatno zmanjša ravni akutnih vnetnih citokinov, kot je TNF-alfa, in zavira izražanje kemokina TIMP-1. Pričakovati je, da bosta oba dogodka in potencialno dodatno podprta z dodatno ekspresijo CCL20: (i) zmanjšala poškodbo ledvic alogenskega presadka, (ii) zavirala novačenje T-celic v ledvicah in (iii) zavirala aktivacijo prirojenih in adaptivni imunski sistem. Na sliki 8 povzemamo te ugotovitve v podporo vlogi, ki jo po našem mnenju lahko igra PrC- 210 pri presaditvi človeške ledvice; zavira: (i) poškodbe ozadja zaradi hladne ishemije zaradi reaktivnih kisikovih zvrsti (ROS) in reaktivnih dušikovih zvrsti (RNS) [17],
(ii) ishemično-reperfuzijska poškodba ROS v ozadju [16] in (iii) poškodba vnetja alogenskega presadka, v nekaterih primerih bistveno v ozadju. Ker je primarni mehanizem delovanja PrC-210 za PrC-210 lovljenje prostih radikalov kisika in dušika, to pomeni, da ti prosti radikali pomembno prispevajo k poškodbi ledvic, opaženi v neishemičnih stanjih, tj. vnetje, povezano z alotransplantatom, ki ga proučujemo v tem rokopisu.
Če povzamemo, to nakazuje, da bi PrC-210 lahko zagotovil široko uporabno zaščito organov za številna stanja presaditve alogenskega presadka; lahko bi zaščitil presajene ledvice med in po vseh stopnjah postopka presaditve – od darovanja organa, preko transporta, ponovne vsaditve in pooperativnega vnetja –, da bi zmanjšal akutno in kronično zavrnitev.
Cistanche tubulosa preprečuje bolezni ledvic, kliknite tukaj za vzorec
Avtorski prispevki:Pri izvedbi raziskave in analizi podatkov so sodelovali NAW, WZ (Weifeng Zeng), WZ (Weixiong Zhong), BMV in MMCG; TRG in NAW sta sodelovala pri načrtovanju raziskave in analizi podatkov; WEF in TRG sta sodelovala pri načrtovanju raziskave, izvedbi raziskave, analizi podatkov in pisanju prispevka. Vsi avtorji so prebrali in se strinjali z objavljeno različico rokopisa.
Financiranje:To raziskavo je financiral Inštitut UW za klinične in translacijske raziskave in dodelil UL1TR002373 UW ICTR iz NIH/NCATS, Ameriškega združenja transplantacijskih kirurgov (133 AAA1552), Ameriškega kolegija kirurgov (133 AAB2176) in dodelil podporo WEF (# R03CA176799).
Izjava institucionalnega nadzornega odbora: To raziskavo je prospektivno odobril Odbor za institucionalno oskrbo in uporabo živali Medicinske fakultete in javnega zdravja na Univerzi v Wisconsinu (Protokol za živali št. M005204).
Izjava o razpoložljivosti podatkov:Podatki študije so v celoti na voljo v tem rokopisu. Navzkrižje interesov: Avtorji izjavljajo, da ni navzkrižja interesov.
Reference
1. Wang, H.; Naghavi, M.; Allen, C.; Barber, RM; Bhutta, ZA; Casey, DC; Charlson, FJ; Chen, AZ; Coates, MM; Coggeshall, M.; et al. Globalna, regionalna in nacionalna pričakovana življenjska doba, umrljivost zaradi vseh vzrokov in umrljivost zaradi specifičnih vzrokov za 249 vzrokov smrti, 1980–2015: sistematična analiza za študijo globalnega bremena bolezni 2015. Lancet 2016, 388, 1459–1544. [CrossRef]
2. Zdravilo, E.; Chow, E.; Peipert, JD; Vodnik, A.; Kwan, L.; Massie, AB; Thomas, AG; Bowring, MG; Leeser, D.; Flechner, S.; et al. Pošiljanje ledvic živih darovalcev in rezultati prejemnikov presadka. Arabec. Arheol. Epigr. 2017, 18, 632–641. [CrossRef] [PubMed]
3. Teža, SC; Bell, PR; Nicholson, ML Ledvična ishemija-reperfuzijska poškodba. Br. J. Surg. 1996, 83, 162–170. [PubMed]
4. Sellarés, J.; De Freitas, GD; Mengel, M.; Reeve, J.; Reinecke, G.; Sis, B.; Hidalgo, LG; Famulski, K.; Matas, A.; Halloran, PF Razumevanje vzrokov za odpoved ledvičnega presadka: prevladujoča vloga s protitelesi posredovane zavrnitve in nenadzorovanosti. Am. J. Presaditev. 2012, 12, 388–399. [CrossRef]
5. Siedlecki, A.; Irish, W.; Brennan, DC Odloženo delovanje presadka pri presaditvi ledvice. Arabec. Arheol. Epigr. 2011, 11, 2279–2296. [CrossRef]
6. Hidalgo, LG; Campbell, PM; Sis, B.; Meinecke, G.; Mengel, M.; Chang, J.; Sellars, J.; Reeve, J.; Halloran, PF; Hidalgo, LG; et al. Protitelesa, specifična za de NovoDonor v času biopsije presaditve ledvice, so povezana z mikrovaskularno patologijo in pozno odpovedjo presadka. Arabec. Arheol. Epigr. 2009, 9, 2532–2541. [CrossRef]
7. Loupy, A.; Hill, GS; Jordan, SC Vpliv za darovalca specifičnih protiteles proti HLA na pozno odpoved ledvičnega alogenskega presadka. Nat. Rev. Nephrol. 2012, 8, 348–357. [CrossRef]
8. Huang, G.; Wilson, NA; Reese, SR; Jacobson, LM; Zhong, W.; Djamali, A. Karakterizacija s transfuzijo izzvane akutne zavrnitve, posredovane s protitelesi, pri podganjem modelu presaditve ledvic. Arabec. Arheol. Epigr. 2014, 14, 1061–1072. [CrossRef] [PubMed]
9. Jordanija, SC; Pescovitz, MD Presenzibilizacija: problem in njegovo upravljanje. Clin. J. Am. Soc. Nefrol. 2006, 1, 421–432. [CrossRef] [PubMed]
10. Stegall, M.; Gloor, J.; Winters, J.; Moore, S.; DeGoey, S. Primerjava plazmafereze v primerjavi z desenzibilizacijo z visokimi odmerki IVIG pri prejemnikih ledvičnega alotransplantata z visokimi ravnmi donorjev specifičnih aloprotiteles. Arabec. Arheol. Epigr. 2006, 6, 346–351. [CrossRef] [PubMed]
11. Peebles, DD; Soref, CM; Fahl, WE ROS-lovilec in radioprotektivna učinkovitost novega PrC-210 aminotiola. Radiat. Res. 2012, 178, 57–68. [CrossRef]
12. Soref, CM; Heker, TA; Fahl, WE Nov peroralno aktiven aminotiolni radioprotektor brez stranskih učinkov slabosti in hipotenzije pri najvišjih radioprotektivnih odmerkih. Int. J. Radiat. Oncol. 2012, 82, e701–e707. [CrossRef]
13. Techapiesancharoenkij, N.; Fiala, JL; Navasumrit, P.; Croy, RG; Wogan, GN; Groopman, JD Sulforafan, kemopreventivno sredstvo proti raku, inducira poti, povezane z membransko biosintezo kot odgovor na poškodbo tkiva z aflatoksinom B1. Toxicol. Appl. Pharmacol. 2015, 282, 52–60. [CrossRef] [PubMed]
14. Jermušek, F.; Benedikt, C.; Dreischmeier, E.; Brand, M.; Under, M.; Jeffery, JJ; Ranallo, FN; Fahl, WE Pomembna supresija poškodbe DNK, ki jo povzroči sevanje CT, v normalnih človeških celicah s PrC-210 radioprotektorjem. Radiat. Res. 2018, 190, 133–141. [CrossRef] [PubMed]
15. Heker, TA; Diarra, G.; Fahl, BL; Nazaj, S.; Kaufmann, E.; Fahl, WE Znatno zmanjšanje celične smrti zaradi ishemije in reperfuzije pri mišjih miokardnih infarktih z uporabo takoj delujočega čistilca ROS PrC-210. Pharmacol. Res. Perspektiva. 2019, 7, e00500. [CrossRef]
16. Bath, NM; Fahl, WE; Redfield, RR. Znatno zmanjšanje celične smrti mišje ledvične ishemije in reperfuzije z uporabo takoj delujočega lovilca reaktivnih kisikovih vrst PrC-210. Presaditev. Neposredno. 2019, 5, e549–e555. [CrossRef] [PubMed]
17. Verhoven, BM; Karim, AS; Bath, NM; Fahl, CJS; Wilson, NA; Redfield, RR; Fahl, WE Znatno izboljšanje hladnega shranjevanja ledvic podgan z uporabo raztopine za ohranjanje organov UW, dopolnjene s takoj delujočim lovilcem prostih radikalov PrC-210. Presaditev. Direct 2020, 6, e578. [CrossRef]
18. Giese, APJ; Guarnaschelli, JG; Ward, JA; Choo, DI; Riazuddin, S.; Ahmed, ZM Radioprotektivni učinek aminotiola PrC-210 na obsevano notranje uho morskega prašička. PLoS ONE 2015, 10, e0143606. [CrossRef]
19. Copp, RR; Peebles, DD; Fahl, WE Sinteza in aktivnost regulacije rasti prototipa člana nove družine aminotiolnih radioprotektorjev. Bioorganic Med. Chem. Lett. 2011, 21, 7426–7430. [CrossRef]
20. Fahl, WE; Peebles, D.; Copp, RR Aminotiolne spojine in sestavki za uporabo v povezavi s terapijo raka. Patent ZDA 7,314,959, 12. april 2004.