Swertiajaponin zavira pigmentacijo kože z dvojnimi mehanizmi za zatiranje tirozinaze 2. del

Cistancheje navadno zelišče, ki je znano kot »čudežno zelišče, ki podaljšuje življenje«. Njegova glavna sestavina je cistanozid, ki ima različne učinke, kot so antioksidativni, protivnetni in spodbujanje imunske funkcije. Mehanizem med cistanho in beljenjem kože je v antioksidativnem učinku cistanche glikozidov.

Melanin v človeški koži nastane z oksidacijo tirozina, ki jo katalizira tirozinaza, oksidacijska reakcija pa zahteva sodelovanje kisika, zato radikali brez kisika v telesu postanejo pomemben dejavnik, ki vpliva na proizvodnjo melanina.Cistanchevsebuje cistanozid, ki je antioksidant in lahko zmanjša nastajanje prostih radikalov v telesu ter tako zavira nastajanje melanina.

Kliknite na Cistanche Tubulosa za izboljšanje beljenja kože

Vprašaj za več:

david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

poleg tegacistancheima tudi funkcijo spodbujanja proizvodnje kolagena, ki lahko poveča elastičnost in sijaj kože ter pomaga obnoviti poškodovane kožne celice.

CistancheFeniletanolni glikozidi imajo pomemben uravnalni učinek na aktivnost tirozinaze, učinek na tirozinazo pa je kompetitivno in reverzibilno zaviranje, kar lahko zagotovi znanstveno osnovo za razvoj in uporabo belilnih sestavin v Cistancheju.

zatocistancheima ključno vlogo pribeljenje kože. Lahko zavira proizvodnjo melanina, da zmanjša razbarvanje in otopelost; in spodbuja proizvodnjo kolagena za izboljšanje elastičnosti in sijaja kože. Zaradi splošnega priznanja teh učinkov cistanche so številni izdelki za beljenje kože začeli vsebovati zeliščne sestavine, kot je cistanche, da bi zadovoljili povpraševanje potrošnikov, s čimer se je povečala komercialna vrednost cistanche v izdelkih za beljenje kože.

Če povzamemo, je vloga cistanche pri beljenju kože ključna. Njegov antioksidativni učinek in učinek na proizvodnjo kolagena lahko zmanjšata razbarvanje in otopelost, izboljšata elastičnost in lesk kože ter tako dosežetabelilni učinek. Poleg tega široka uporaba Cistanche v izdelkih za beljenje kože dokazuje, da njene vloge pri komercialni vrednosti ni mogoče podcenjevati.

Swertiajaponin zavira aktivacijo MAPK, ki jo povzroči UVB

Pokazalo se je, da oksidativni stres spodbuja melanogenezo s povečano regulacijo transkripcijskega faktorja, povezanega z mikroftalmijo (MITF), transkripcijskega faktorja, ki inducira izražanje gena tirozinaze [4, 14]. Preučevali smo, ali lahko antioksidativni učinek swertiajaponina uravnava aktivnost MITF. Podatki Western blottinga so pokazali, da je izpostavljenost UVB povečala fosforilirani MITF, aktivno obliko MITF, medtem ko ga je zdravljenje s swertiajaponinom pri 10 μM zmanjšalo (slika 6A). Dosledno se je z zdravljenjem s swertiajaponinom zmanjšalo povečanje ravni proteina tirozinaze, posredovano z UVB (slika 6A). Ker je bilo dokazano, da oksidativni stres aktivira MITF prek mitogen-aktivirane protein kinaze (MAPK) [15, 16], so raziskali, ali lahko swertiajaponin nadzoruje signalizacijo MAPK. Izpostavljenost UVB je močno povečala fosforilacijo ERK, JNK in p38 (slika 6B), kar je povezano z UVB inducirano proizvodnjo ROS in ONOO v celicah B16F10 (slika 5C- 5D). Zdravljenje s swertiajaponinom samo pri 10 μM je zmanjšalo raven beljakovin MAPK (slika 6B). Ta rezultat je skladen z antioksidativno aktivnostjo swertiajaponina, ker je bilo zmanjšanje z UVB povzročenega celičnega oksidativnega stresa jasno le pri 10 μM swertiajaponina (slika 5C-5D).

Čeprav je swertiajaponin glavna spojina celotnega zelišča Swertia japonica, ki se uporablja kot japonsko zdravilo, naša študija ni pokazala prepričljivih dokazov o varnosti swertiajaponina za njegovo nanašanje na človeško kožo. Vendar pa swertiajaponin ni pokazal citotoksičnosti v celičnih linijah Hs27 (človeški fibroblast), HaCat (človeški keratinocit) in B16F10 (mišji melanom) v našem eksperimentalnem okolju. Poleg tega ni bilo vidnih znakov citotoksičnosti, vključno s tvorbo celičnih ostankov ali odvajanjem celic na podlagi mikroskopskega opazovanja, ko je bil swertiajaponin zdravljen v modelu človeške kože s koncentracijami, ki niso pokazale citotoksičnosti v celičnih linijah. Glede na to, da so varnostna vprašanja glavni problem spojin za beljenje kože, ki so trenutno na voljo, so potrebne nadaljnje študije in vivo, da se preveri njihova fiziološka varnost.

Skupaj je swertiajaponin zaviral kopičenje melanina do zadovoljive meje tako v celicah kot v modelih človeške kože z dvojnimi mehanizmi za zatiranje tirozinaze z neposredno vezavo in kompetitivnim zaviranjem tirozinaze ter zaviranjem signalizacije MAPK/MITF, ki jo povzroča oksidativni stres (slika 7). Glede na škodljive učinke in pomanjkanje dolgoročne učinkovitosti znanih sredstev za beljenje kože, kot sta kojična kislina in arbutin [17], bi se lahko swertiajaponin bolj varno uporabljal za zatiranje pigmentacije kože in bi bil nov dodatek za belilno kozmetiko.

MATERIALI IN METODE

Test aktivnosti tirozinaze z uporabo gobje tirozinaze

Swertiajaponin in kojična kislina (50 µM) smo naložili v 96-mikroploščo z vdolbinicami (Nunc, Danska) v tirozinaznem pufru (200 µL), ki je vseboval gobjo tirozinazo (1000 U), 1 mM raztopino L-tirozina in 50 mM fosfata pufer (pH 6,5) [5]. Ploščo smo inkubirali pri 37 stopinjah 15 minut in dopakinon ovrednotili s spektrofotometrijo (450 nm). Na podlagi meritve je bil izračunan IC50 z uporabo log-linearnih krivulj in njihovih enačb.

Simulacija priklopa swertiajaponina in tirozinaze

AutoDock Vina je bil uporabljen za simulacijo priklopa protein-ligand in silico. Tridimenzionalna struktura tirozinaze je bila uporabljena v kristalni strukturi Agaricus bisporus (PDB ID: 2Y9X). Vnaprej določeno mesto vezave tirozina je bilo uporabljeno kot priklopni žep. Po izvedbi simulacij priklopa med tirozinazo in swertiajaponinom ali kojično kislino je bila uporabljena programska oprema LigandScout 3.0 za napovedovanje vezavnih ostankov med različnimi spojinami in tirozinazo.

Kinetična analiza inhibicije tirozinaze s swertiajaponinom

L-DOPA je bila pripravljena v koncentracijah 4, 2, 1, 0.5, 0.25, 0.125 in 0.0625 mM ter swertiajaponin je bil pripravljen pri 20, 40 in 80 μM. Raztopino reakcijske zmesi smo pripravili v 96-plošči z vdolbinicami, v katero smo dodali 20 μL substrata tirozinaze (L-DOPA), 10 μL vodne raztopine tirozinaze gob (200 U) in 50 mM pufra kalijevega fosfata (pH 6.5). Hitrost proizvodnje dopakroma reakcijske zmesi smo izmerili pri valovni dolžini 450 nm z uporabo bralnika mikroplošč. Stopnjo inhibicije tirozinaze swertiajaponina smo nato izračunali z analizo grafa Lineweaver-Burk. Michaelisova konstanta (Km) in največja hitrost (Vmax) sta bili izračunani tudi z Lineweaver-Burk ploskvami z različnimi koncentracijami substrata L-DOPA [3].

Celična kultura in test sposobnosti preživetja

Celice melanoma B16F10 so bile kupljene pri Korea Cell Line Bank. Celice smo gojili v Dulbeccovem modificiranem Eagleovem mediju (DMEM) s 5 odstotki fetalnega govejega seruma (FBS) in 1 odstotkom penicilina, streptomicina, L-glutamina in natrijevega piruvata. Celice so vzdrževali pri 37 stopinjah v vlažnem ozračju 95 odstotkov zraka/5 odstotkov CO2. Za test viabilnosti celic smo celice zasejali v 96-plošče z vdolbinicami. Celice melanoma B16F10 smo 48 ur zdravili s swertiajaponinom v različnih koncentracijah. V vsako vdolbinico smo dodali Ez-Cytox (10 μL) in inkubirali 2 uri. Nastale kristale formazana smo izmerili s spektrofotometrijo pri 450 nm. Preživetje celic je bilo izračunano z uporabo celic brez zdravljenja s swertiajaponinom kot kontrolne skupine.

Vsebnost melanina v celicah B16F10

Raven melanina je bila izmerjena z uporabo predhodno opisane metode z manjšimi spremembami [18]. Celicam B16F10 smo pustili, da so zrasle do 70-80 odstotkov sotočja v 6-ploščah z jamicami. Celice so bile predhodno obdelane s swertiajaponinom ali kojično kislino 2 uri. Nato smo MSH ali UVB obdelali z medijem, ki je vseboval swertiajaponin ali kojično kislino, in inkubirali nadaljnjih 48 ur. Po izpiranju s PBS smo celice ločili z uporabo tripsina in raztopili v 90 μL 1 N raztopine NaOH, ki je vsebovala DMSO (5 odstotkov). Po inkubaciji pri 60 stopinjah 1 uro smo vsebnost melanina določili z merjenjem absorbance pri 405 nm. Komercialno dostopna UV-komora (Boteck UV X000, UV-AB, LAB24, Koreja) je bila uporabljena za izpostavljenost celic B16F10 UVB.

Western blotting

Vzorce beljakovin, izolirane iz celic B16F10 (30 ug), smo ločili z elektroforezo v natrijevem dodecil sulfat-poliakrilamidnem gelu z uporabo 10-12 odstotkov akrilamidnih gelov in prenesli na membrane iz poliviniliden fluorida, ki smo jih nato takoj dali v blokirni pufer ( 5 odstotkov nemastnega mleka) v 10 mM Tris (pH 7,5), 100 mM NaCl in 0,1 odstotka Tween 20. Membrano smo 30 minut izpirali v TBS-Tween pufru in nato inkubirali s specifičnimi primarnimi protitelesi (1:1{ {24}} razredčitev), kot je navedeno v legendah na slikah, pri 4 stopinjah čez noč. Po izpiranju s pufrom TBS-Tween smo membrano inkubirali s protitelesom proti miši, konjugiranim s hrenovo peroksidazo (Santa Cruz, 1:10,000), protitelesom proti kuncem (Santa Cruz, 1:10, 000) ali protitelesom proti kozam (Santa Cruz, 1: 10.000) pri 25 stopinjah 1 uro. Imunoblote smo vizualizirali z raztopino Western Bright Peroxide (Advansta, CA, ZDA) in slikovnim sistemom ChemiDoc Touch (Bio-Rad, ZDA) v skladu z navodili proizvajalca. Protitelesa, uporabljena v tej študiji, so naslednja: p-CREB (Santa Cruz-81486), CREB (Santa Cruz-81486), tirozinaza (Cell Signaling-104976), pMITF (Abcam{{40) }}), MITF (Abcam-20663), p-p38 (Celično signaliziranje-921L), p38 (Celično signaliziranje-9212S), pERK (Celično signaliziranje-4370L ), ERK (Celično signaliziranje-9201L), pJNK (Celično signaliziranje-9251L), JNK (Celično signaliziranje-9252S) in -aktin (Santa Cruz-47778) .

Merjenje ravni ROS in ONOO-

Antioksidativno aktivnost swertiajaponina so preučevali z uporabo fluorescentnega 2,7-diklorodihidrofluorescein diacetata (DCFDA) za ROS in dihidro rodamina (DHR) 123 za ONOO-. Na kratko, za določitev ravni ROS je bil celičnim homogenatom dodan DCFDA (25 μM) za končni volumen 250 ul. Za merjenje ravni ONOO- smo 10 ul celičnih homogenatov dodali k raztopini rodamina (50 mM natrijevega fosfatnega pufra, 90 mM natrijevega klorida, 5 mM dietilentriaminpentaocetne kisline [DTPA] in DHR123). Pri obeh testih smo fluorescenco merili vsakih 5 minut 30 minut na bralniku fluorescenčnih plošč, pri čemer sta bili valovni dolžini vzbujanja in emisije nastavljeni na 485 oziroma 530 nm.

Kopičenje melanina v modelu človeške kože

Za preučevanje antimelanogenega učinka swertiajaponina v modelu človeške kože je bila uporabljena sposobna življenja, rekonstituirana, tridimenzionalna človeška povrhnjica (Neoderm-ME, Tego Science). Model človeške kože je bil 1 uro predhodno obdelan z DMSO (nosilec) ali swertiajaponinom in 5 dni gojen v vzdrževalnem mediju, ki ga je zagotovilo podjetje, z obdelavo z DMSO ali swertiajaponinom. Mikroskopska analiza je bila opravljena od 1. do 5. dneva za opazovanje pigmentacije kože. Mikroskopske slike so bile analizirane s programsko opremo Image J za delno kvantificiranje temnenja kože. Za barvanje po Fontana-Massonu so vzorce kože fiksirali v 4-odstotnem paraformaldehidu čez noč pri sobni temperaturi, vzorce pa je analiziralo komercialno dostopno podjetje (Garam Meditech, Južna Koreja).

Statistična analiza

Vsi podatki so predstavljeni kot povprečje ± SEM. Različne skupine so primerjali z enosmerno analizo variance, ki ji je sledil Dunnettov post-test. P < 0.05 je veljalo za statistično pomembno.

NASPROTJA INTERESOV

Ni navzkrižij interesov, ki bi jih bilo treba prijaviti.

FINANCIRANJE

To delo je podprl Grant K17281 s Korejskega inštituta za orientalsko medicino, Ministrstvo za izobraževanje, znanost in tehnologijo (MEST), Republika Koreja.

REFERENCE

1. Bradford PT. Kožni rak v barvi kože. Dermatol Nurs. 2009; 21: 170-7, 206.

2. Briganti S, Camera E, Picardo M. Kemični in instrumentalni pristopi k zdravljenju hiperpigmentacije. Pigment Cell Res. 2003; 16: 101-10.

3. Kang KH, Lee B, Son S, Yun HY, Moon KM, Jeong HO, Kim DH, Lee EK, Choi YJ, Kim DH, Chun P, Moon HR, Chung HY. (Z)-2-(Benzo[d]tiazol-2-ilamino)-5- (substituiran benziliden) derivati ​​tiazol-4(5H)-ona kot novi inhibitorji tirozinaze. Biol Pharm Bull. 2015; 38: 1227-33.

4. Lee B, Moon KM, Kim SJ, Kim SH, Kim DH, An HJ, Jeong JW, Kim YR, Son S, Kim MJ, Chung KW, Lee EK, Chun P, et al. (Z)-5-(2,4-dihidroksi benziliden) tiazolidin- 2,4-dion preprečuje z UVB povzročeno melanogenezo in nastajanje gub z zaviranjem oksidativnega stresa v HRM{{7} } brezdlake miši. Oxid Med Cell Longev. 2016; 2016: 2761463.

5. Lee B, Moon KM, Son S, Yun HY, Han YK, Ha YM, Kim DH, Chung KW, Lee EK, An HJ, Ullah S, Chun P, Moon HR, et al. (2R/S,4R)-2-(2,4-dihidroksi fenil) tiazolidin- 4-karboksilna kislina preprečuje nastajanje gub zaradi UV-žarkov z zaviranjem vnetja, ki ga posreduje NF-kappaB. J Dermatol Sci. 2015; 79: 313-6.

6. Kubo I, Kinst-Hori I, Chaudhuri SK, Kubo Y, Sanchez Y, Ogura T. Flavonoli iz Heterothece vključujejo: inhibitorno aktivnost tirozinaze in strukturna merila. Bioorg Med Chem. 2000; 8: 1749-55.

7. Olivares C, Garcia-Borron JC, Solano F. Identifikacija ostankov aktivnih mest, vključenih v vezavo kovinskega kofaktorja in stereospecifično prepoznavanje substrata v tirozinazi sesalcev. Posledice katalitskega cikla. Biokemija. 2002; 41: 679-86.

8. Kim D, Park J, Kim J, Han C, Yoon J, Kim N, Seo J, Lee C. Flavonoidi kot zaviralci gobove tirozinaze: študija dušenja fluorescence. J Agric Food Chem. 2006; 54: 935-41.

9. Orhan IE, Khan MT. Flavonoidni derivati ​​kot močni zaviralci tirozinaze – pregled nedavnih ugotovitev med 2008-2013. Curr Top Med Chem. 2014; 14: 1486-93.

10. Komatsu M, Tomimori T, Makiguchi Y. Študije o sestavinah Swertia japonica. II. Izolacija in struktura novega flavonoida, swertiajaponina. Chem Pharm Bull (Tokio). 1967; 15: 1567-72.

11. Kimura Y, Sumiyoshi M. Učinki ekstrakta Swertia japonica in njegove glavne spojine swertiamarin na praznjenje želodca in gibljivost prebavil pri miših. Fitoterapija. 2011; 82: 827-33.

12. Park JI, Lee HY, Lee JE, Myung CH, Hwang JS. Zaviralni učinek 2-metil-nafto[1,2,3-de]kinolin-8-one na melanosomski transport in pigmentacijo kože. Sci Rep. 2016; 6: 29189.

13. Cotelle N. Vloga flavonoidov pri oksidativnem stresu. Curr Top Med Chem. 2001; 1: 569-90.

14. Sim MO, Ham JR, Lee MK. Mladi listi trstičja (Phragmites communis) zavirajo melanogenezo in oksidativni stres v celicah melanoma B16F10. Biomed Pharmacother. 2017; 93: 165-71.

15. D'Mello SA, Finlay GJ, Baguley BC, Askarian-Amiri ME. Signalne poti v melanogenezi. Int J Mol Sci. 2016; 17.

16. Huang HC, Liao CC, Peng CC, Lim JM, Siao JH, Wei CM, Chen CC, Wu CS, Chang TM. Dihidromiricetin iz Ampelopsis grossedentata zavira melanogenezo z znižano regulacijo signalnih poti MAPK, PKA in PKC. Chem Biol Interact. 2016; 258: 166-74.

17. Hsu KD, Chen HJ, Wang CS, Lum CC, Wu SP, Lin SP, Cheng KC. Izvleček micelija Ganoderme formosanum kot zelo močan zaviralec tirozinaze. Sci Rep. 2016; 6: 32854.

18. Bilodeau ML, Greulich JD, Hullinger RL, Bertolotto C, Ballotti R, Andrisani OM. BMP-2 stimulira ekspresijo gena za tirozinazo in melanogenezo v diferenciranih melanocitih. Pigment Cell Res. 2001; 14: 328-36.