Ciljanje na napredovalega raka prostate z imunoterapijo T-celic s himernim antigenskim receptorjem STEAP1 in tumorsko lokalizirano imunoterapijo IL-12

Šest transmembranski epitelijski antigen prostate 1 (STEAP1) je celični površinski antigen za terapevtsko ciljanje pri raku prostate. Tukaj poročamo o široki ekspresiji STEAP1 v primerjavi s prostato specifičnim membranskim antigenom (PSMA) pri smrtonosnem metastatskem raku prostate in o razvoju T-celične terapije s himernim antigenskim receptorjem (CAR), usmerjenim na STEAP1-. Celice STEAP1 CAR T kažejo reaktivnost pri nizki gostoti antigena, protitumorsko aktivnost v modelih metastatskega raka prostate in varnost pri človeškem modelu miši STEAP1. Pobeg antigena STEAP1 je ponavljajoči se mehanizem odpornosti na zdravljenje in je povezan z zmanjšano obdelavo in predstavitvijo tumorskega antigena. Uporaba terapije s tumorsko lokaliziranim interlevkinom-12 (IL-12) v obliki fuzijskega proteina kolagen-vezavne domene (CBD)-IL-12 v kombinaciji s STEAP1 CAR T-celično terapijo izboljša protitumorsko učinkovitost s preoblikovanjem imunološko hladnega tumorskega mikrookolja raka prostate in bojem proti uhajanju antigena STEAP1 z vključevanjem imunosti gostitelja in širjenjem epitopov.

Kitajska rastlina cistanche - protitumorska

Metastatic prostate cancer represents an incurable disease responsible for over 33,000 deaths per year in the United States1. Prostate cancer is critically reliant on androgen receptor (AR) signaling and thus the suppression of gonadal androgen production through surgical or chemical castration (androgen deprivation therapy) has been a mainstay of treatment for advanced disease. However, metastatic prostate cancer inevitably develops resistance to androgen deprivation therapy and enters a stage called metastatic castration-resistant prostate cancer (mCRPC). mCRPC is currently incurable and is considered the end stage of the disease and is associated with a median overall survival of three years2. In the past decade, multiple therapies including an inhibitor of extragonadal androgen synthesis (abiraterone acetate)3, second-generation AR antagonists (enzalutamide)4, radioactive isotope (radium-223)5, and a prostate-specific membrane antigen (PSMA)-specific radioligand therapy (lutetium Lu 177 via votide tetraxetan)6 have been approved for mCRPC. Each of these agents extends survival on average by several months but long-term remissions are rare. Strategies to reprogram the immune system to combat prostate cancer first gained traction with the clinical approval of the dendritic cell vaccine sipuleucel-T for asymptomatic mCRPC7. More recently, several types of immunotherapies including immune checkpoint inhibitors, a DNA cancer vaccine, antibody-drug conjugates (ADC), T cell engaging bispecific antibodies (T-BsAb), and chimeric antigen receptor (CAR) T cell therapies have been under active clinical investigation8,9. CARs are synthetic receptors that leverage the potency, expansion, and memory of T cells and can be engineered against virtually any tumor-associated cell surface antigen. The adoptive transfer of CAR T cells has rapidly become an established treatment for hematologic malignancies with exceptional response rates leading to six clinical approvals in the last five years10. In contrast, CAR T cell therapies targeting solid tumors have lagged due to additional challenges related to the lack of bona fide tumor-specific antigens, inhospitable tumor microenvironments, and poor trafficking, persistence, and expansion of CAR T cells11. Despite the challenges observed in driving effective immune responses toward solid tumors, recent early-phase clinical trials investigating CAR T cell therapies targeting PSMA in mCRPC have reported safety and evidence of significant biochemical and radiographic responses12,13. These preliminary results serve to embolden efforts to develop and optimize new CAR T cell therapies for prostate cancer. While PSMA is the preeminent target for therapeutic and diagnostic development in prostate cancer, recent work indicates that PSMA expression may be quite heterogeneous in mCRPC14. Tumor antigen heterogeneity, especially in the context of single antigen-targeted CAR T cell therapies for solid tumors like prostate cancer, is an important barrier to therapeutic efficacy15. Thus, identifying cell surface antigens with broad and relatively homogeneous expression in prostate cancer is imperative. In addition, very few if any tumor-associated antigens demonstrate tumor-restricted expression—most also exhibit low-level expression in normal tissues that could represent liabilities for CAR T cell therapies due to on-target off-tumor toxicities which can lead to devastating consequences including death16. We previously performed integrated transcriptomic and cell surface proteomic profiling of human prostate adenocarcinoma cell lines and identified six transmembrane epithelial antigens of the prostate 1 (STEAP1) as one of the most highly enriched cell surface antigens17. STEAP1 was first described over two decades ago18 and was recognized as being highly expressed in prostate cancer. STEAP1 is strongly expressed in >80 % mCRPC s prizadetostjo kosti ali bezgavk19, 62 % Ewingovega sarkoma20 in več drugih vrst raka21. STEAP1 spada v družino STEAP reduktaz Metallo, ki lahko tvorijo homotrimere ali heterotrimere z drugimi proteini STEAP22. STEAP1 ima uveljavljeno funkcionalno vlogo pri spodbujanju proliferacije rakavih celic, invazije in prehoda iz epitelija v mezenhim–26.

Prednosti cistanche tubulosa-Antitumor

Poleg tega STEAP1 kaže omejeno izražanje v normalnem tkivu27, zaradi česar je zelo prepričljiva tarča za zdravljenje raka. Razvitih je bilo več imunoterapevtskih učinkovin, ki ciljajo na STEAP1, vendar nobena ni klinično odobrena. V kliničnem preskušanju faze I pri mCRPC je bilo ugotovljeno, da ima ADC vandor tuzumab ved otin (DSTP3086S), sestavljen iz humaniziranega protitelesa IgG1 proti STEAP1, povezanega z monometil auristatinom E, sprejemljiv varnostni profil, vendar so opazili malo objektivnih tumorskih odzivov28. Trenutno se ocenjuje T-BsAb, ki vključuje dve domeni za vezavo fragmenta antigena (Fab) proti STEAP1, variabilni fragment z enojno verigo anti-CD3 (scFv) in domeno, ki se lahko kristalizira (Fc), imenovano AMG 509 in nima efektorske funkcije. v kliničnem preskušanju faze I (NCT04221542) pri mCRPC29. Pred kratkim so poročali tudi, da asimetrično dvojno bivalentno T-BsAb, imenovano BC261, kaže močno protitumorsko aktivnost v več predkliničnih modelih raka prostate in Ewingovega sarkoma30. Poleg tega se je pokazalo, da T-celični receptor (TCR) razreda I, omejen s človeškim levkocitnim antigenom (HLA), specifičen za peptid STEAP1, zavira lokalno in metastatsko rast Ewingovega sarkoma v predkliničnem modelu ksenografta po posvojitvenem prenosu transgenih T-celic31. V tej študiji izvajamo primerjalno analizo relativne ekspresije STEAP1 in PSMA v smrtonosnem mCRPC, da bi raziskali uporabnost ciljanja na STEAP1 v trenutni dobi teranostike PSMA. Izdelujemo in pregledujemo drugo generacijo STEAP1 CAR za antigensko specifično aktivacijo T-celic in citolizo ciljnih celic, da dobimo glavnega kandidata za nadaljnjo karakterizacijo. Ugotavljamo specifičnost funkcionalnega epitopa STEAP1 CAR T celic in profiliramo ekspanzijo in imunofenotip STEAP1 CAR T celičnih produktov več darovalcev. Nato ugotovimo moč in predhodno varnost terapije s celicami T STEAP1 CAR v ustreznih predkliničnih modelih raka prostate, vendar opazujemo ponavljajočo se izgubo izražanja antigena STEAP1 kot mehanizem odpornosti na zdravljenje. Da bi rešili to težavo, ocenjujemo sočasno dajanje CBD-IL-12, ki preoblikuje imunosupresivno tumorsko mikrookolje raka prostate in vključi endogeno imunost za razširitev protitumorskih odzivov. Skupaj te študije zagotavljajo močno utemeljitev za klinični prevod terapije s celicami T STEAP1 CAR na moške z mCRPC in usmerjajo strategije za premagovanje potencialnih mehanizmov terapevtske odpornosti.

Prednosti cistanche tubulosa-Antitumor

Rezultati

STEAP1 je široko izražen v tkivih mCRPC, odpornih na zdravljenje

We first set out to determine the pattern and extent of STEAP1 expression relative to PSMA in advanced metastatic prostate cancer. We performed immunohistochemical (IHC) staining on a duplicate set of tissue microarrays consisting of 121 metastatic tumors (each with up to three cores represented) collected from 44 men with lethal mCRPC patients collected by rapid autopsy between the years 2010 and 2017 through the University of Washington Tumor Acquisition Necropsy Program32 (Fig. 1a). Plasma membrane staining for STEAP1 and PSMA in each tissue was scored by a research pathologist and semiquantitative H-scores were determined based on the staining intensity (Supple mentary Fig. 1a) multiplied by the percentage of cancer cells staining at each intensity (Supplementary Fig. 1b). By implementing a minimal staining threshold with an H-score cut-off of 30, we found that 87.7% of evaluable matched mCRPC tissues (100 of 114) demonstrated staining for STEAP1 compared to only 60.5% (69 of 114) for PSMA (Fig. 1b). In addition, 28.1% of mCRPC tissues (32 of 114) showed STEAP1 but not PSMA staining (Fig. 1b, c) whereas only 0.9% (one of 114) exhibited PSMA but not STEAP1 staining. Based on these results, we used a linear mixed statistical model to determine that the odds of non-zero (H-score >{{0}}) obarvanje je bilo 22--krat (95-odstotni IZ 6-173) višje za STEAP1 kot za PSMA in možnosti H-rezultata večje ali enake 3{{ 27}} so 84--krat (95 % IZ 30-317) višje za STEAP1 kot za PSMA. Povprečni STEAP1 H-rezultat v kosteh (193; 95 % IZ 171 do 215) je bil značilno višji kot pri metastazah v bezgavkah (razlika –48; 95 % IZ od –21 do –76; p < 0.001) in značilno višji kot pri visceralnih metastazah (razlika −59; 95 % IZ od −42 do −77; p < 0,001). Med povprečnim rezultatom H STEAP1 pri metastazah v bezgavkah v primerjavi z visceralnimi metastazami ni bilo bistvene razlike (razlika 11; 95 % IZ -16 do 39; p=0.4) (dodatna slika 1c). Opazili smo tudi več primerov s heterogenim izražanjem PSMA znotraj jeder (slika 1d), kar je skladno z nedavnim poročilom o intratumorski heterogenosti PSMA v biopsijah mCRPC14. Analiza na ravni bolnika z uporabo povprečnega praga H-rezultata Večji ali enak 30 in McNemarjevega testa je pokazala, da je imelo 95 % ocenljivih bolnikov (42 od 44) ​​tumorje z izražanjem STEAP1, medtem ko jih je bilo 68 % (30 od 44) ​​pozitivnih na PSMA (Dodatna slika 1d). Za preučevanje vzorcev heterogenosti med pacienti in znotraj pacientov, povezanih z izražanjem STEAP1 in PSMA, smo uporabili H-rezultate STEAP1 in PSMA za ovrednotenje hipergeometričnih, Simpsonovih in Shannonovih rezultatov raznolikosti. Opazili smo dva vzorca izražanja STEAP1 (slika 1e), pri čemer je 68 % (30/44) bolnikov pokazalo izražanje STEAP1 na vseh metastatskih mestih (visok STEAP1) in 32 % (14/44) bolnikov, ki so kazalo metastatska mesta z ali brez izražanja STEAP1 (heterogeni STEAP1). Identificirali niso nobenega bolnika, pri katerem vsa metastatska tkiva niso izražala STEAP1. Podobna analiza izražanja PSMA v isti kohorti je razkrila 45 % (20/44) bolnikov z visokim izražanjem PSMA, 32 % (14/44) s heterogenim izražanjem PSMA in 23 % (10/44) brez izražanja PSMA. Na podlagi molekularne podrazvrstitve tkiv mCRPC z uporabo AR in ekspresije nevroendokrinega markerja sinaptofizina (SYP), ocenjene z IHC, je imela večina bolnikov z visoko ali heterogeno ekspresijo STEAP1 in PSMA AR-pozitivnega raka prostate (AR+/SYP- ali AR+/SYP+), medtem ko so tisti brez izražanja PSMA so imeli AR-null raka prostate (AR-/SYP+ ali AR-/SYP-). Identificirali smo pozitivno korelacijo med izražanjem STEAP1 in AR (p <0,001) z vgrajenim linearnim mešanim modelom z naključnim učinkom v primerih, predstavljenih na tkivnem mikromrežu (dodatna slika 2a, b), kar je bilo pričakovano glede na to, da je STEAP1 androgen -reguliran gen33,34. V nasprotju s tem je bil cenjen negativen trend med izražanjem STEAP1 in SYP (dopolnilna slika 2c). Te ugotovitve kažejo, da se lahko, tako kot PSMA35, izraz STEAP1 izgubi z nevroendokrino transdiferenciacijo raka prostate.

Fig. 1 | Comparative analysis of STEAP1 and PSMA in lethal, metastatic castration-resistant prostate cancer (mCRPC). a Characteristics of the mCRPC tissues represented on University of Washington Tissue Acquisition Necropsy Tissue Microarray 92 (UW TAN TMA92). b Contingency table showing the frequency of mCRPC tissues with STEAP1 or PSMA IHC staining above or below an H-score threshold of 30. Micrographs of select mCRPC tissues after STEAP1 and PSMA IHC staining to highlight the (c) absence of PSMA but the presence of STEAP1 expression and (d) intratumoral heterogeneity of PSMA expression but not STEAP1. Scale bars = 50 µm. For panels (c, d) n = 332 mCRPC cores were immunostained for STEAP1 and PSMA. e Dot and box plot showing the distribution of STEAP1 (top) and PSMA (bottom) H-scores in 44 patients from the UW TAN TMA92 cohort. Each dot represents a tumor specimen/core (n = 319 cores for PSMA and 333 cores for STEAP1) and the color indicates the molecular subtype: AR+/SYP+ (red), AR+/SYP− (green), AR−/SYP+ (yellow) and AR−/SYP− (purple). Gray rectangles show interquartile ranges spanning the 25th to the 75th percentiles of PSMA H-scores from each patient. Bar plots (on the right) summarize the frequencies of patients classified based on STEAP1 and PSMA expression as no expression (all cores with H-score ≤30, light grey), heterogeneous expression (at least one core with H-score ≤30 and H-score >30, mid grey) and high expression (all cores with H-scores >30, temno siva). Izvorni podatki so navedeni v datoteki Izvorni podatki.

Razvmožnost močnega, za antigen specifičnega STEAP1 CAR

Glede na razširjeno izražanje STEAP1 v pozni fazi mCRPC in njegovo poročano funkcionalno vlogo pri napredovanju raka27,36,37 smo nato začeli razvijati CAR druge generacije, specifične za STEAP1-. Uporabili smo lentivirusno ogrodje pCCL-c-MNDU3-X38, ki se pogosto uporablja za gensko terapijo s hematopoetskimi matičnimi celicami39, in pokazalo se je, da je izražanje CAR v celicah T, ki ga poganja notranji promotor MNDU3, višje od tistega, ki ga dosežemo z Promotor EFS40. Prednost je imela 4-1kostimulatorna domena BB zaradi njene povezanosti s tvorbo spomina T-celic in podaljšane obstojnosti41, uvedena pa je bila transmembranska domena CD28, saj se je izkazalo, da zmanjšuje antigenski prag za drugo generacijo 4-1BB CAR T-celična aktivacija42. Vključili smo popolnoma humaniziran scFv, pridobljen iz vandor tuzumab vedotina, ADC, ki cilja na STEAP1, katerega razvoj je bil prekinjen po kliničnem preskušanju faze I28. Ta scFv je humanizirana različica mišjega monoklonskega protitelesa (mAb 120.545), ki ga je prvotno razvilo podjetje Agensys, Inc., ki kaže afiniteto 1 nM v testih vezave na celici43. Da bi potencialno prilagodili aktivnost CAR, smo implementirali tri različne dolžine tečajev/distančnikov, vključno s kratkimi (tečaji IgG4), srednjimi (tečaji IgG4-CH3) in dolgimi (tečaji IgG4-CH2- CH3). Dolgi distančnik je bil zasnovan s predhodno opisanimi mutacijami 4/2- NQ44 v domeni CH2, da bi preprečili vezavo na receptor Fc-gama in z aktivacijo povzročeno celično smrt, ki se pojavi z adoptivnim prenosom T-celic dolgega distančnika CAR v miši z imunsko pomanjkljivostjo. Trije kandidati za CAR so bili klonirani v lentivirusni vektor (slika 2a), ki prav tako so-izraža okrnjeni receptor epidermalnega rastnega faktorja (EGFRt) kot transdukcijski marker. Lentivirusi so bili ustvarjeni in uporabljeni za transdukcijo človeških CD4 in CD8 T celic, obogatenih iz mononuklearnih celic periferne krvi človeka (PBMC), zbranih s ferezo. Razširjene CD4 in CD8 CAR T celice so bile imunofenotipizirane (dopolnilna slika 3a) in rekonstituirane v celične produkte določene sestave z normalnim razmerjem CD4/CD8, da bi ocenili njihove funkcionalne aktivnosti. Za nadzor ekspresije STEAP1 na izogeni način smo se osredotočili na celično linijo raka prostate 22Rv1, ki prikazuje nativno ekspresijo STEAP1, in izvedli izločitev STEAP1 (ko) z urejanjem genoma CRISPR/Cas9. Nato smo ustvarili rešilno linijo STEAP1 iz 22Rv1 STEAP1 ko s transdukcijo z lentivirusom, ki izraža STEAP1 (slika 2b). Te linije so bile nato uporabljene za presejanje treh kratkih, srednjih in dolgih distančnih celic STEAP1 CAR T v testih sokulture z odčitavanjem sproščanja interferona gama (IFN-) kot indikatorja aktivacije celic T. Samo T-celice STEAP1 CAR z dolgim ​​presledkom (v nadaljevanju imenovane STEAP1-BBζ CAR T-celice) so pokazale pričakovani za antigen specifičen vzorec sproščanja IFN, medtem ko kratke in srednje T-celice STEAP1 CAR T niso (slika 2c). , dopolnilna slika 3b, c). Poleg tega so T-celice STEAP1-BBζ CAR pokazale znatno od odmerka odvisno citolizo celic 22Rv1 v primerjavi z netransduciranimi celicami T (slika 2d) in so pokazale relativno varčevanje celic 22Rv1 STEAP1 ko (slika 2e). Podobne študije so bile nato izvedene v DU145 človeški celični liniji raka prostate, ki nima naravne ekspresije STEAP1, vendar je bila zasnovana za ekspresijo STEAP1 (DU145 STEAP1) z lentivirusno transdukcijo (dopolnilna slika 4a). V tej nastavitvi je bila aktivacija celic STEAP1-BBζ CAR T opažena samo v sokulturah s celicami DU145 STEAP1 in ne s starševskimi celicami DU145 (dopolnilna slika 4b). Citolitična aktivnost je bila cenjena samo s celicami STEAP1-BBζ CAR T in ne z netransduciranimi celicami T v sokulturah s celicami DU145 STEAP1 (dopolnilna slika 4c). Kasneje smo analizirali večjo skupino celičnih linij človeškega raka prostate, da bi z imunoblot analizo označili njihovo nativno ekspresijo STEAP1. Celične linije z znano ekspresijo/aktivnostjo AR (LNCaP, 22Rv1, VCaP in LNCaP95) so pokazale različne ravni ekspresije STEAP1, medtem ko ni bilo videti, da celične linije AR-null (PC3, DU145, MSKCC EF1 in NCI-H660) ne izražajo zaznavne ravni STEAP1 (slika 2f). Nadaljevali smo s sokulturami STEAP1-BBζ CAR T s temi linijami, da bi dodatno potrdili njihovo antigensko specifično aktivacijo na podlagi sproščanja IFN (slika 2g). Vendar smo opazili neskladno ugotovitev, da je linija PC3, ki ni pokazala očitne ekspresije proteina STEAP1 (slika 2f), povzročila znatno aktivacijo celic T STEAP1-BBζ CAR. Predhodna literatura je nakazovala, da je STEAP1 izražen v celični liniji PC3 na nizkih ravneh45. Dejansko je dolgotrajna izpostavljenost imunoblotu pokazala pas, ki kaže na prisotnost zelo nizke ekspresije STEAP1 (slika 2h). Da bi potrdili, ali je bila aktivacija celic STEAP1-BBζ CAR T posledica te manjše ekspresije STEAP1 v celicah PC3, smo ustvarili tri podlinije PC3 STEAP1 ko (slika 2h) in ponovno izvedli sokulture s STEAP{{133} }BBζ CAR T celice. STEAP1 ko v liniji PC3 je povzročil razveljavitev aktivacije T-celic STEAP1-BBζ CAR (slika 2i), s čimer je dodatno potrjena specifičnost in zagotovila dokaze o občutljivosti T-celic STEAP1-BBζ CAR na nizko pogoji gostote antigena.

Pomanjkanje navzkrižne reaktivnosti STEAP1-BBζ CAR z mišjim Steap1 in človeškim STEAP1B

koristi dodatka cistanche-povečanje imunosti

V skladu s protičloveško specifičnostjo vandor tuzumab vedotina celice STEAP1-BBζ CAR T niso pokazale navzkrižne reaktivnosti z mišjim Steap1 (dodatna slika 4a, d, e). Vendar smo to uporabili kot priložnost za individualno rekonstitucijo treh človeških zunajceličnih domen STEAP1 (ECD) na mišji Steap1 (dodatna slika 4f), da bi ugotovili, kateri ECD so kritični za prepoznavanje epitopa s celicami STEAP1-BBζ CAR T. Poskusi sokulture so bili izvedeni s celicami STEAP1-BBζ CAR T in celicami DU145, izdelanimi za izražanje mišjega Steap1 z individualno zamenjavo mišjih ECD s človeškimi ECD. Ugotovili smo, da je bil človeški STEAP1 ECD2, ne pa ECD1 ali ECD3, povezan z aktivacijo T celic STEAP1-BBζ CAR (dopolnilna slika 4g). Zanimivo je, da sta človeški STEAP1 in mišji Steap1 ECD2 pokazala 93,9 % (31/33 aminokislin) homologijo (dodatna slika 4h), kar kaže, da sta Q198 in/ali I209 človeškega STEAP1 ključna za produktivno prepoznavanje s STEAP1-BBζ CAR T celice. Pokazalo se je, da Q198 medsebojno deluje s Fab 120.545 kot del interakcijske vroče točke, ki temelji na nedavni strukturi, razrešeni s kriogeno elektronsko mikroskopijo22. Od človeške družine proteinov STEAP ima STEAP1B največjo homologijo s STEAP145. Identificirani so bili trije transkripti STEAP1B, od katerih vsi kažejo popolno ohranitev aminokislinskega zaporedja človeškega STEAP1 ECD2 (dopolnilna slika 5a). Algoritem za napoved topologije konsenzne membrane TOPCONS46 je predvidel sekvence domene ECD2 kot zunajcelične v treh izoformah proteina STEAP1B (dodatna slika 5b), čeprav z rezultati nizke zanesljivosti za STEAP1B v primerjavi s hSTEAP1 zaradi pomanjkanja soglasja med petimi modeli napovedi topologije (OCTOPUS, Philius, PolyPhobius, SCAMPI in SPOCTOPUS), ki jih uporablja TOPCONS (dopolnilna slika 5c). Predhodna analiza z uporabo drugega in silico skritega orodja za napovedovanje topologije na osnovi Markovega modela TMHMM47 je prav tako nakazovala, da bi lahko bilo to zaporedje znotrajcelično in ne zunajcelično v izoformah 1 in 245 proteina STEAP1B. Vendar kristalna struktura STEAP1B še ni bila ugotovljena, da bi neposredno utemeljila te napovedi. Da bi funkcionalno ocenili, ali so celice STEAP1- BBζ CAR T morda tudi reaktivne proti STEAP1B, smo izvedli sokulture z uporabo linij DU145, zasnovanih za izražanje vsake od treh izooblik STEAP1B. Nismo odkrili dokazov o aktivaciji celic T STEAP1-BBζ CAR (dopolnilna slika 5d), kar kaže na to, da epitop STEAP1, ki ga prepoznajo celice T STEAP1-BBζ CAR, morda ni predstavljen kot del ektodomene s STEAP1B kljub navidezni homologiji zaporedja.

Slika 2|Preverjanje druge generacije 4-1BB himernih antigenskih receptorjev (CAR) za identifikacijo vodila za terapijo s T-celicami STEAP1 CAR. Shema lentivirusne konstrukcije STEAP1 CAR in različica, ki temelji na kratkih, srednjih in dolgih distančnikih. Dolga končna ponovitev LTR, regija U3 virusa mišje levkemije MNDU3 Moloney, scFv enoverižni variabilni fragment, VL variabilna lahka veriga, VH variabilna težka veriga, tm transmembrana, EGFRt okrnjeni receptor za epidermalni rastni faktor, 4/2 NQ {{1{{28 }}}} Mutacije domene CH2 za preprečevanje vezave na receptorje Fc-gama. b Imunobloti STEAP1 v starševskih celicah 22Rv1, izločenih (ko) celicah STEAP1 in ko celicah STEAP1 z rešitvijo STEAP1. c IFN-encimski imunski test (ELISA) je rezultat kokultur netransduciranih celic T ali celic T STEAP1-BBζ CAR z vsako od podlinij 22Rv1 v razmerju 1:1 po 24 urah (p < 0.001). Relativna viabilnost celic ciljnih celic (d) 22Rv1 in (e) 22Rv1 STEAP1 ko skozi čas, izmerjena s fluorescenčnim slikanjem živih celic po sokulturi s celicami (levo) STEAP1-BBζ CAR T (p < 0,001) ali ( desno) netransducirane celice T pri spremenljivem razmerju celic efektor proti tarči (E: T). f Imunobloti, ki dokazujejo izražanje STEAP1 v celičnih linijah raka prostate s pozitivnim androgenim receptorjem (AR), vendar ne v celičnih linijah raka prostate, negativnih na AR. g IFN-kvantifikacija z ELISA iz sokultur bodisi netransduciranih celic T ali celic STEAP1- BBζ CAR T z vsako od celičnih linij človeškega raka prostate v (f) v razmerju 1:1 po 24 urah. h Imunobloti za STEAP1 v podlinijah 22Rv1, PC3 in PC3 STEAP1 ko. I IFN-kvantifikacija z ELISA iz sokultur netransduciranih celic T ali celic STEAP1- BBζ CAR T z vsako celično linijo v (h) v razmerju 1:1 po 24 urah (p < 0,001). Za plošče (c–e, g in i) je bilo uporabljenih n=4 bioloških ponovitev na pogoj in vrstice napak predstavljajo povprečje s SEM. Plošča (b, f, h) prikazuje rezultate, ki so reprezentativni za n=3 bioloških ponovitev. GAPDH je bil uporabljen kot kontrola nalaganja beljakovin. Za plošči (c) in (i) je bila uporabljena dvosmerna ANOVA s Sidakovimi testi večkratne primerjave. Za panela (d) in (e) je bila uporabljena dvosmerna ANOVA s Tukeyjevim testom večkratnih primerjav. Izvorni podatki so navedeni v datoteki Izvorni podatki.

Karakterizacija izdelkov T celic STEAP1-BBζ CAR pri nizu darovalcev

Nato smo profilirali ekspanzijo, učinkovitost transdukcije in imunofenotip STEAP1-BBζ CAR T celičnih izdelkov z uporabo treh neodvisnih nizov mononuklearnih celic periferne krvi (PBMC), zbranih od zdravih darovalcev. Na splošno smo opazili 20- do 40-kratno razširitev STEAP1-BBζ CAR T celic v 11 dneh gojenja (dopolnilna slika 6a). Odstotek celic T EGFRt+ CD8 je bil v razponu od 24,3 do 54,2 %, medtem ko je bil odstotek celic T EGFRt+ CD4 višji in je znašal od 60,1 do 74,9 % v naših izdelkih celic T STEAP1-BBζ CAR (dopolnilna slika 6b). Pregledali smo izražanje označevalcev izčrpanosti T-celic PD-1 in LAG-3 v netransduciranih in STEAP1- podskupinah T celic BBζ CAR in opazili nismo pomembnega povečanja izražanja (dopolnilna slika 6c ). Ta ugotovitev je nakazovala nizko ali odsotno tonično signalizacijo s STEAP1-BBζ CAR, kar je bilo spodbudno, saj lahko konstitutivna signalizacija CAR negativno vpliva na efektorsko funkcijo CAR T celic48. Oba fenotipa T celic spomina matičnih celic (Tscm) in T celic centralnega spomina (TCM) sta bila povezana s terapevtsko učinkovitostjo terapije s celicami CAR T, saj spodbujata trajno proliferacijo in obstojnost in vivo 49–51. Imunofenotipizacija netransduciranih in STEAP1-BBζ CAR podskupin T celic je pokazala višje frekvence Tscm celic v primerjavi s podskupinami T celic v donorskih PBMC, iz katerih so bili izpeljani celični produkti (dopolnilna slika 6d). Ta učinek je verjetno posledica dodatka IL-7 in/ali IL-15 medijem za ekspanzijo celic T, saj je bilo dokazano, da ti citokini ohranjajo in krepijo diferenciacijo Tscm51,52. Naša analiza je pokazala tudi obogatitev populacij Tcm, zlasti v celicah CD8 STEAP1-BBζ CAR T (dopolnilna slika 6e).

T-celice STEAP1-BBζ CAR kažejo znatne protitumorske učinke v modelih diseminiranega raka prostate z nativno ekspresijo STEAP1, ugotovljeno pri miših z imunsko pomanjkljivostjo

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

Kot začetni zaslon za protitumorsko aktivnost in vivo smo vzpostavili 22Rv1 subkutane ksenograftske tumorje pri samcih miši NOD scid gama (NSG). Ko so tumorji zrasli na približno 100 mm3, so miši zdravili z eno samo intratumorsko injekcijo bodisi 5 × 106 netransduciranih celic T ali celic T STEAP1-BBζ CAR. Intratumorsko zdravljenje s celicami STEAP1- BBζ CAR T je bilo povezano s pomembnim zaviranjem rasti tumorja, ki je bilo statistično značilno do 18. dne zdravljenja (slika 3a). Miši so žrtvovali 25. dan in preostali tumorji miši, zdravljenih s STEAP1-BBζ CAR T-celicami, so pokazali velika področja nekrotičnih ostankov in regije živega tumorja so bile infiltrirane s CD3+ STEAP1-BBζ Celice CAR T (dopolnilna slika 7a). Ekspresija STEAP1 je bila ohranjena v tumorjih v vseh zdravljenih skupinah (dopolnilna slika 7b). Transducirali smo celice 22Rv1 z lentivirusom, da bi okrepili izražanje luciferaze kresničke (Luc), celice 106 22Rv1-fLuc pa smo vbrizgali v repne vene samcev miši NSG. Metastatsko kolonizacijo smo vizualizirali z živim bioluminiscenčnim slikanjem (BLI) po dveh tednih, na kateri točki smo miši zdravili z eno samo intravensko injekcijo bodisi 5 × 106 netransduciranih T celic ali STEAP1-BBζ CAR T celic (slika 3b) . Serijski BLI je razkril hitro napredovanje bolezni pri miših, zdravljenih z netransduciranimi T-celicami, medtem ko so tiste, ki so prejemale STEAP1-BBζ CAR T-celice, pokazale znatno zamudo pri napredovanju tumorja (sl. 3c, d) in podaljšanje preživetja (97 dni v primerjavi z 31 dnevi). , p=0.0018 z log-rank testom, slika 3e). Med zdravljenimi kraki ni bilo bistvene razlike v uteži miši (dopolnilna slika 7c). IHC barvanje tumorjev na koncu študije je pokazalo znatno zmanjšanje ekspresije STEAP1 (dopolnilna slika 7d), kar kaže, da je uhajanje antigena mehanizem odpornosti. Vendar je bilo to malo verjetno posledica transdiferenciacije v variantno stanje raka prostate, saj nismo cenili morfoloških sprememb, izgube izražanja AR in PSMA53 ali povečanja izražanja SYP (dodatna slika 7d). Da bi raziskali globalni vpliv izgube STEAP1 pri raku prostate, smo izvedli profiliranje transkriptoma izogenih 22Rv1 divjega tipa (wt), 22Rv1 STEAP1 ko in 22Rv1 STEAP1 ko + reševalnih celičnih linij, ki smo jih predhodno pripravili (slika 2b). Analiza diferencialne genske ekspresije, ki je primerjala celice 22Rv1 STEAP1 ko s celicami 22Rv1 wt, je odkrila ~1700 genov, ki so znatno znižani (FDR manj kot ali enako 0,05, kratna sprememba<2) with STEAP1 knockout. Rescue of STEAP1 expression in the 22Rv1 STEAP1 ko cells revealed that ~600 genes were significantly upregulated (FDR ≤ 0.05, fold-change>2) z dodatkom STEAP1 (dopolnilna slika 8a). Analiza obogatitve genskega nabora (GSEA) je imenovala več bioloških poti, ki bi jih lahko motila regulacija z modulacijo izražanja STEAP1. Med temi so bili vidni napredek celičnega cikla in številni presnovni procesi, vključno s Krebovim ciklom in glikolizo, ki so bili negativno obogateni z izločitvijo STEAP1 in rešeni po dodajanju STEAP1 (dopolnilna slika 8b). Za naše podatke smo uporabili validiran 31-podpis napredovanja genskega celičnega cikla (CCP)54, ki je pokazal znatno znižanje podpisa CCP, povezanega z izločitvijo STEAP1 z rezultatom −0.8, ki se je bistveno povečal na {{ 14}}.5 z rešitvijo izraza STEAP1 (dopolnilna slika 8c). Ti podatki so v skladu s prejšnjo objavo, ki kaže, da knockdown STEAP1 v celični liniji raka prostate LNCaP poslabša celično sposobnost preživetja in proliferacijo, medtem ko inducira apoptozo37. Opazili smo tudi, da je bila predelava in predstavitev antigena ena od najpomembnejše razbogatenih poti KEGG z izločitvijo STEAP1 (dopolnilna slika 8b). Opazili smo pomembno znižano regulacijo genov, vključno s PSME1 (podenota aktivatorja proteasoma 1), ki je član imunoproteasomskega kompleksa, TAP1 (transporter 1, član poddružine kasete, ki veže ATP), ki je ključnega pomena za peptid razreda I glavnega histokompatibilnega kompleksa (MHC). nakladalni kompleks in več MHC genov razreda I in II, kot je MR1 (glavni kompleks histokompatibilnosti, povezan z razredom I), HLA-DQ-B1 in HLA-DQB2 (dopolnilna slika 8d). Nadalje smo raziskali tumorje, zbrane iz diseminiranih modelov 22Rv1, zdravljenih s STEAP1- BBζ CAR T celično terapijo, ki je pokazala izgubo antigena (slika 3c, dopolnilna slika 7d) z analizo transkriptoma. Analiza diferencialne genske ekspresije in kasnejša GSEA primerjava metastatskih tumorjev 22Rv1 pri miših, zdravljenih s T-celično terapijo STEAP1-BBζ CAR, in tistih, zdravljenih z netransduciranimi T-celicami, je pokazala negativno obogatitev poti, vključenih v MHC, citotoksične limfocite in aktivacijo T-celic ( Dodatna slika 9a, b). Posebej smo ovrednotili tudi izražanje genov MHC razreda I in II ter opazili njihovo izrazito znižano regulacijo pri tumorjih 22Rv1, zdravljenih s STEAP1-BBζ CAR T-celično terapijo (dopolnilna slika 9c). Ta rezultat je bil dodatno utemeljen s pomembnim zmanjšanjem obarvanja HLA-A, B, C z IHC v teh tumorjih (dopolnilna slika 9d). Potencialna posledica teh podatkov je, da lahko zdravljenje s STEAP1-BBζ CAR T-celično terapijo in posledična izguba izražanja tumorskega antigena STEAP1 pri raku prostate povzroči nadaljnjo imunoterapevtsko odpornost zaradi oslabljene obdelave in predstavitve antigena. Prav tako smo cepili samce miši NSG s celicami C4-2B-fLuc z injekcijo v repno veno. C4-2B je na kastracijo odporna podlinija LNCaP55 s kinetiko rasti, ki je bolj v skladu s tipičnim rakom prostate. Štiri tedne po injiciranju je bila metastatska kolonizacija potrjena z BLI in miši so bile zdravljene z eno samo intravensko injekcijo bodisi 5 × 106 netransduciranih T celic ali STEAP1-BBζ CAR T celic (slika 3b). Serijski BLI je pokazal popoln odziv pri vseh miših, ki so prejele celice T STEAP1-BBζ CAR v petih tednih zdravljenja (slika 3f, g). Ugotovili smo trend povečane izgube teže v skupini za zdravljenje z netransduciranimi T-celicami (dopolnilna slika 10a), vendar to ni bilo statistično pomembno. Obdukcija miši, zdravljenih s celicami STEAP1-BBζ CAR T, ni pokazala nobene makroskopske bolezni in ex vivo BLI organov ni razkril nobenega signala (dodatna slika 10b), kar kaže, da so bile te miši verjetno ozdravljene. Identificirali smo periferno obstojnost celic STEAP1-BBζ CAR T na koncu poskusa na podlagi prisotnosti zaznavnih splenocitov CD3+ EGFRt+ (slika 3h).

Slika 3|Protitumorska aktivnost STEAP1-BBζ CAR T celične terapije in vivo pri modelih raka prostate z nativno ekspresijo STEAP1. a Volumni podkožnih tumorjev 22Rv1 pri miših NSG (n=4 za skupino netransduciranih celic T in n=5 za skupino celic T STEAP1-BBζ CAR) skozi čas po enkratni intratumorski injekciji 5 × 106 netransduciranih celic T ali celic STEAP{{10}}BBζ CAR T pri normalnih razmerjih CD4/CD8. p < 0.0001 na dan 20 in 25. Vrstice predstavljajo povprečje s SEM. b Shema poskusov izzivanja tumorja za diseminirana modela 22Rv1 (zgoraj) in C4-2B (spodaj). Luciferaza kresničke Luc, bioluminiscenčno slikanje BLI. c Serijsko živo bioluminiscenčno slikanje (BLI) miši NSG z cepljenimi metastazami 22Rv1-fLuc in zdravljenih z eno samo intravensko injekcijo 5 × 106 netransduciranih celic T ali celic T STEAP1-BBζ CAR pri normalnem CD4/ Razmerja CD8 na dan 0. Rdeči X označuje poginule miši. Prikazana je lestvica sevanja. d Graf, ki prikazuje kvantifikacijo celotnega toka skozi čas iz BLI v živo vsake miši v (c). e Kaplan–Meierjeve krivulje preživetja miši v (c) s statistično značilnostjo, določeno z log-rank (Mantel-Cox) testom. Za plošče (c–e) je bilo uporabljenih n=5 miši na stanje. f Serijski živi BLI miši NSG, ki so jim bile cepljene metastaze C4-2B in zdravljene z eno samo intravensko injekcijo 5 × 106 netransduciranih celic T ali celic T STEAP1-BBζ CAR pri normalnem razmerju CD4/CD8 na dan 0. Rdeči X označuje poginule miši. Prikazana je lestvica sevanja. g Graf, ki prikazuje kvantifikacijo celotnega toka skozi čas iz BLI v živo vsake miši v (f). Za plošče (f, g) smo uporabili n=4 miši v skupini netransduciranih celic T in n=5 miši v skupini celic T STEAP1-BBζ CAR. h Kvantifikacija CD3+ EGFRt+ STEAP1-BBζ CAR T celic s pretočno citometrijo iz splenocitov miši, zdravljenih s STEAP1-BBζ CAR T celicami (n=4) na koncu poskusa na dan 49. Vrstice predstavljajo povprečje. Za panel (a) je bila uporabljena dvosmerna ANOVA s Sidakovim večkratnim primerjalnim testom. Izvorni podatki so navedeni v datoteki Izvorni podatki.

Študije T-celic STEAP1 CAR pri miših v miših dokazujejo protitumorsko terapevtsko učinkovitost

Aktivacija in citolitična aktivnost celic STEAP1-BBζ CAR T, opažena v kontekstu celične linije PC3 z zelo nizko gostoto antigena STEAP1 (~1500 molekul/celico) (sl. 2g–i, dopolnilna slika 11a, b ) in dokazi in vivo protitumorske aktivnosti v diseminiranem modelu tumorja PC3-fLuc (dodatna slika 11c–e) predstavljajo zaskrbljenost glede možnosti za tarčno toksičnost zunaj tumorja. Za ovrednotenje potencialne toksičnosti v organizmu, ki ga je mogoče prilagoditi modelu, smo izdelali človeško STEAP1 knock-in (hSTEAP1-KI) miško, v kateri je bil človeški gen STEAP1 vstavljen v lokus mišjega gena Steap1 na ozadju C57Bl/6 ( Slika 4a). Mišja kolonija je bila ustanovljena z genotipizacijo, izvedeno z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) repne DNA (slika 4b). Tako homozigotne kot heterozigotne miši hSTEAP1-KI niso pokazale očitnih fenotipskih ali reproduktivnih nepravilnosti v primerjavi z divjimi sorodniki iz legla. Raziskava tkiva za ekspresijo človeškega STEAP1 na podlagi kvantitativne reverzne transkripcije PCR (qRT-PCR) je bila izvedena na samcih in samicah heterozigotnih hSTEAP1-KI (hSTEAP1-KI/ +) miši in je pokazala največjo relativno ekspresijo v prostati, sledita maternica in nadledvična žleza (slika 4c). Nadaljnja analiza in situ s STEAP1 IHC moške hSTEAP1-KI/ + prostate in nadledvične žleze je pokazala ekspresijo človeškega STEAP1, omejeno na luminalne epitelne celice prostate (slika 4d) in ekspresijo v skorji nadledvične žleze (slika 4e). . Murinizirana različica STEAP1 CAR, imenovana STEAP1-mBBζ CAR, v kateri sta bila ohranjena distančnik scFv in IgG4 tečaj-CH2-CH3, vendar transmembranska domena CD28, 4-1BB kostimulatorna domena , in aktivacijska domena CD3ζ je bila nadomeščena z njihovimi mišjimi ortologi in je bila klonirana v gamaretrovirusni konstrukt (sl. 4f). Poleg tega je bil človeški transdukcijski marker EGFRt nadomeščen s skrajšanim mišjim CD19 (mCD19t), da se zmanjša potencialna imunogenost. Potrdili smo učinkovito retrovirusno transdukcijo celic T, obogatenih iz mišjih splenocitov (slika 4g), in dokazali sposobnost mišjih STEAP1-mBBζ CAR T celic, da inducirajo citolizo celične linije RM9 mišjega raka prostate56, zasnovane za izražanje človeškega STEAP1 (RM9- hSTEAP1) z lentivirusno transdukcijo (slika 4h). In vivo učinkovitost mišjih STEAP1-mBBζ CAR T celic je bila potrjena v modelu diseminiranega tumorja RM9-STEAP1-fLuc pri miših NSG (dopolnilna slika 12a). En teden po injiciranju celic RM9-STEAP1-fLuc v repno veno so miši z injekcijo v repno veno zdravili bodisi s 5 × 106 netransduciranih mišjih T celic ali mišjih STEAP1-mBBζ CAR T celic . Miši, ki so prejele netransducirane mišje T celice, so pokazale nenadzorovano napredovanje bolezni, medtem ko so tiste, ki so bile zdravljene s STEAP1-mBBζ CAR T celicami, enakomerno pokazale hitro regresijo bolezni, ki ji je deset dni kasneje sledil recidiv (dodatna slika 12b, c). STEAP1-mBBζ CAR T-celično zdravljenje je bilo povezano s statistično značilno koristjo preživetja (22 dni v primerjavi z 12 dnevi, p=0.0039 z log-rank testom, dopolnilna slika 12d). Izguba teže je bila očitna v obeh zdravljenih skupinah, saj se je obremenitev tumorja povečala pred smrtjo (dodatna slika 12e, f). Analiza mišjih splenocitov, zbranih pri nekropsiji, je pokazala periferno obstojnost celic T STEAP1-mBBζ CAR z detekcijo celic mCD3+ mCD19t+ do 24 dni po posvojenem prenosu (dodatna slika 12g). Pljuča so bila pridobljena iz miši v obeh zdravljenih skupinah in STEAP1 IHC je pokazala izgubo izražanja STEAP1 v pljučnih metastazah miši, zdravljenih s STEAP1-mBBζ CAR T celicami (dodatna slika 12h). Kasneje smo razširili klonske linije RM9-STEAP1-fLuc, da bi ugotovili, ali bi lahko bil opazovani pobeg tumorskega antigena posledica že obstoječe heterogenosti v izražanju STEAP1. Poskus smo ponovili s klonskim, diseminiranim modelom tumorja RM9-STEAP1- fLuc pri miših NSG (dopolnilna slika 13a). V tem kontekstu so miši, zdravljene s STEAP1-mBBζ CAR T celicami, pokazale hiter in trajen popoln odziv (dodatna slika 13b–d). Te ugotovitve poudarjajo moč celic STEAP1-mBBζ CAR T pri izkoreninjenju raka prostate STEAP1+ in nadalje kažejo, da so morda potrebne dodatne terapevtske strategije za premagovanje odpornosti v podskupinah bolnikov z napredovalim rakom prostate, kjer je heterogenost STEAP1 izraz je prisoten (slika 1e).

koristi cistanche za moške - krepitev imunskega sistema

Kliknite tukaj za ogled izdelkov Cistanche Enhance Imunity

【Vprašajte za več】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com/Whats App: 0086 18599088692/Wechat: 18599088692

Terapija s T celicami STEAP1 CAR je varna v humaniziranem mišjem modelu STEAP1

Da bi raziskali predklinično varnost in učinkovitost terapije s celicami STEAP1-mBBζ CAR T, smo samce heterozigotnih miši hSTEAP1-KI cepili s singenim, neklonskim RM9-STEAP{{4} }fLuc celice z injekcijo v repno veno (slika 5a). Po potrditvi metastatske kolonizacije z BLI približno teden dni kasneje so miši prejele predkondicioniranje ciklofosfamida 100 mg/kg z intraperitonealno injekcijo57. Dan kasneje so miši randomizirali na zdravljenje bodisi s 5 × 106 netransduciranih mišjih T celic ali mišjih STEAP1-mBBζ CAR T celic z injekcijo v repno veno. Vse miši, ki so prejele mišje celice STEAP1-mBBζ CAR T, so pokazale zmanjšanje tumorske obremenitve v prvem tednu po začetku zdravljenja na podlagi BLI (sl. 5b, c). Opaženi odziv je bil kratkotrajen, vendar je privedel do skromnega podaljšanja preživetja (21 dni v primerjavi z 12 dnevi, p=0.0138 po log-rank testu, slika 5d) – podobno kot ugotovitve iz neklonskega RM 9-STEAP1-fLuc poskusi pri miših NSG (dodatna slika 12d). Pri tej ravni odmerka ni bilo hudih toksičnosti ali prezgodnjih smrti, posebej povezanih z mišjo terapijo s celicami STEAP1-mBBζ CAR T, kjer so opazili jasne dokaze protitumorske učinkovitosti. Izguba teže je bila povezana s povečano obremenitvijo s tumorjem, vendar je bila skupna obema krakoma zdravljenja (sl. 5e, f). Za nadaljnjo oceno potencialne toksičnosti terapije s celicami STEAP1-mBBζ CAR T je bil vzporedno izveden podoben poskus pri heterozigotnih miših hSTEAP1-KI, ki so nosile tumorje RM9-hSTEAP1 in niso imele tumorjev. Miši brez tumorja, zdravljene z netransduciranimi celicami T ali celicami STEAP1- mBBζ CAR T, niso pokazale nobenih razlik v preživetju (dopolnilna slika 14a) ali velike toksičnosti, vključno z izgubo telesne teže (dopolnilna slika 14b). Ker je STEAP1-BBζ CAR sestavljen iz modificiranega distančnika IgG4, ki bi lahko bil imunogen, smo ovrednotili odziv mišjih protiteles proti človeškim protitelesom (MAHA) z zbiranjem retroorbitalnih krvavitev miši v tem poskusu. V serumih miši 8. dan po zdravljenju s celicami STEAP1-BBζ CAR T (dopolnilna slika 14c) niso odkrili protiteles proti človeškim IgG in IgM.

Pomembno je, da heterozigotne miši hSTEAP1-KI, zdravljene s STEAP1-mBBζ CAR T celicami, niso pokazale očitne motnje tkiva ali povečane infiltracije CD3+ T celic v prostati (dodatna slika 15a, b ) ali nadledvične žleze (dodatna slika 15c, d) glede na njihove primerke, zdravljene z netransduciranimi celicami T, kar kaže na odsotnost tarčne toksičnosti zunaj tumorja. Pljuča, zbrana na koncu poskusa, so pokazala izražanje človeškega STEAP1 v pljučnih metastazah RM9-hSTEAP1 z regionalno heterogenostjo pri miših, zdravljenih z netransduciranimi mišjimi T celicami (slika 5g). Po drugi strani so tumorji miši, zdravljenih z mišjimi celicami STEAP1-mBBζ CAR T, ponovno pokazali odsotnost izražanja človeškega STEAP1 (slika 5h). Da bi ocenili, ali zdravljenje z mišjimi STEAP1- mBBζ CAR T celicami in izguba človeškega antigena STEAP1 lahko vplivata tudi na predstavitev antigena v tumorjih RM9-hSTEAP1, smo izvedli IHC za mišji beta-2-mikroglobulin (B2m ), ki je ključna sestavina molekul MHC razreda I. Opazili smo znatno znižano regulacijo ekspresije B2m v progresivnih tumorjih po zdravljenju z mišjimi STEAP1-mBBζ T celicami CAR v primerjavi z netransduciranimi T celicami (dodatna slika 15e, f), skladno z našimi ugotovitvami v modelu 22Rv1.

Slika 4|Vzpostavitev sistema miška v miški s človeškim modelom miške STEAP1 (hSTEAP1-KI) in muriniziranim STEAP1 CAR. Shema, ki prikazuje strategijo homologne rekombinacije z uporabo ciljnega vektorja za vbijanje človeških eksonov STEAP1 2–5 v mišji lokus Steap1 na ozadju C57Bl/6. Tarča za prepoznavanje FRT Flippase. b Vizualizacija produktov PCR iz genotipizacije konice repa divjih (+/+), heterozigotnih (KI/+) ali homozigotnih (KI/KI) miši z uporabo parov primerjev, namenjenih pomnoževanju delov alelov divjega tipa ali hSTEAP1-KI . Nadzor ničelne predloge NTC. Reprezentativna slika gela iz n=3 biološko neodvisnih poskusov. c qPCR za izražanje človeškega STEAP1, normalizirano na izražanje 18 S v raziskavi tkiv miši hSTEAP1-KI/+. n=3 za spolno specifične organe in n=6 za običajne organe. Vrstice predstavljajo povprečje s SEM. Fotografske mikrografije STEAP1 IHC barvanja (d) tkiv prostate iz (levo) +/+ in (desno) KI/+ miši in (e) nadledvične žleze iz KI/+ miši. Lestvica=50 µm. Za ploščo (d, e) je bilo imunsko barvanje STEAP1 izvedeno na n=3 biološko neodvisnih vzorcih. f Shema retrovirusno muriniziranega konstrukta STEAP1 CAR. Virus mišje levkemije MuLV, mišji skrajšani CD19 mCD19t. g Kvantifikacija učinkovitosti retrovirusne transdukcije aktiviranih mišjih T celic iz treh neodvisnih poskusov na podlagi pogostnosti mišjih CD3+ CD19t+ celic s pretočno citometrijo (p {{40}}.0003). h Relativna celična sposobnost preživetja ciljnih celic RM9 ali RM9-hSTEAP1 skozi čas, izmerjena s fluorescenčnim slikanjem živih celic po sokulturi v razmerju 1:1 z mišjimi STEAP1-mBBζ T celicami CAR ali netransduciranimi T celicami (p < 0,0001). n=4 bioloških ponovitev na stanje. Vrstice napak predstavljajo povprečje s SEM. Za ploščo (g) je bil uporabljen neparni dvostranski Studentov t-test z Welchovim popravkom. V panelu (h) je bila uporabljena dvosmerna ANOVA s Sidakovim večkratnim primerjalnim testom. Izvorni podatki so navedeni v datoteki Izvorni podatki.

Slika 5|Ugotavljanje učinkovitosti in varnosti mišjih STEAP1-mBBζ CAR T celic pri miših hSTEAP1-KI, ki nosijo singeni, diseminirani rak prostate.

Fuzijski citokin vezavne domene kolagena-IL-12 izzove protitumorske odzive prek okrepljenega signaliziranja T-celičnega receptorja in predstavitve antigena

IL{{0}} je heterodimerni citokin, sestavljen iz podenot p40 in p35, ki uravnava odzive celic T in vodi do proizvodnje IFN-. Osupljivi protitumorski odzivi, povezani s sistemskim dajanjem IL-12, so bili dokazani v več predkliničnih modelih58,59, vendar je prevod tega terapevtskega pristopa na kliniko zastal zaradi toksičnosti, ki omejujejo odmerek, in neučinkovitosti6{69}}–63. Alternativne strategije za izogibanje tem težavam so bile usmerjene v lokalizacijo IL{{10}} na tumorje, bodisi z intratumorsko dostavo ali inženiringom IL-12 fuzijskih proteinov, da bi izkoristili edinstvene lastnosti tumorskega mikrookolja. Eden od nedavno opisanih pristopov je zlitje z domeno von Willebrandovega faktorja A3, ki služi kot domena za vezavo kolagena (CBD, slika 6a) in omogoča vezavo fuzijskih proteinov na izpostavljeni kolagen v neurejeni tumorski vaskulaturi64. Pokazalo se je, da sistemsko zdravljenje s CBD-IL-12 preoblikuje tumorsko mikrookolje imunološko "hladnega" mišjega raka dojke in modelov melanoma prek izboljšane signalizacije IFN in sodeluje z anti-PD{{20}} zaviranje imunske kontrolne točke za induciranje izkoreninjenja tumorja65. Vprašali smo, ali je CBD-IL-12 lahko učinkovit pri pretvorbi raka prostate iz "hladnega" v "vročega" in induciranju protitumorskih odzivov. Subkutani, singeni tumorji RM9 in Myc-CaP so bili ugotovljeni pri mišjih samcih C57Bl/6 oziroma FVB, miši pa so bile randomizirane na zdravljenje z vehiklom, anti-PD-1 ali CBD-IL-12 . Sistemsko dajanje CBD-IL-12 je povzročilo znatno inhibicijo rasti tumorja tako pri singenih tumorskih modelih RM9 kot Myc-CaP, ki so se sicer slabo odzivali na terapijo z anti-PD-1 (slika 6b, dopolnilna slika 16a) . Da bi pridobili nadaljnji vpogled v mehanizme delovanja CBD-IL-12, smo izvedli enocelično RNA-seq (scRNA-seq) analizo tumorjev RM9 pri miših, zdravljenih bodisi z vehiklom ali CBDIL-12. Grafi enotne aproksimacije in projekcije razdelilnika so pokazali znatno zmanjšanje predelkov tumorskega epitelija, fibroblastov in endotelijskih celic (dopolnilna slika 16b), ki je skladno s protitumorsko aktivnostjo. Profiliranje podskupin prirojenih in adaptivnih imunskih celic na podlagi markerjev (sl. 6c,d) v podatkih scRNA-seq je pokazalo znatno povečanje CD8+ T celic (7,55 v primerjavi s 0,76 %). , celice z navzkrižno predstavitvijo antigenov, vključno z XCR1+ IRF8+ konvencionalno dendritično celico tipa 1 (cDC1, 1,33 v primerjavi z 0 %), CD86+ INOS2+ M1 polariziranimi makrofagi ( 2,26 v primerjavi z 0 %) in CD64+ F4/ 80+ monocitov/makrofagov (29,2 v primerjavi s 4,43 %) v tumorjih iz skupine za zdravljenje s CBDIL-12 v primerjavi s kontrolno skupino z vehiklom. Zmanjšanje imunosupresivnih CD163+ CD206+ M2 polariziranih makrofagov (0 v primerjavi z 0,25 %) in nevtrofilcev Ly6G+ (0,52 v primerjavi z 1,08 %) je bilo prav tako povezano s terapijo s CBD-IL-12. Analiza IHC je potrdila, da tumorji RM9, zdravljeni z nosilcem, na splošno nimajo CD8+ T celic, medtem ko so tisti, zdravljeni s CBD-IL-12, pokazali vidno pomembno infiltracijo CD8+ T celic (dodatna slika 16c) . Tumorske celice so pokazale obogateno izražanje proteasomskih in imunoproteasomskih podenot Psmb8 in Psmb9 ter genov H2-K1, H2-D1 in B2m glavnega kompleksa histokompatibilnosti razreda I (MHC I), skladno s povečano regulacijo procesiranja antigenov in predstavitveni stroji (slika 6e, dodatna slika 16d). Vzporedno so T celice pokazale okrepljeno izražanje genov, povezano s signalizacijo T-celičnega receptorja in imunoregulacijskimi interakcijami med limfoidno in nelimfoidno celico (slika 6f, dopolnilna slika 16e). Celice mononuklearnega fagocitnega sistema (MPS) so pokazale obogateno izražanje genov, povezano z obdelavo in navzkrižno predstavitvijo antigena ter signalizacijo citokinov (dopolnilna slika 16f, g). Te študije so pokazale protitumorsko delovanje CBD-IL- 12 na modelih raka prostate z reprogramiranjem tumorskega mikrookolja in vključitvijo tako prirojenega kot adaptivnega imunskega sistema.

Izboljšan nadzor tumorja s sočasno terapijo STEAP1-mBBζ CAR T celic in CBD-IL-12

Nato smo domnevali, da bi razširitev protitumorskega imunskega odziva s terapijo s CBD-IL-12 lahko izboljšala terapevtsko učinkovitost terapije s celicami STEAP1-mBBζ CAR T pri raku prostate z bojem proti heterogenosti tumorskega antigena in reševanjem procesiranja antigena ter predstavitev. Zato smo vzpostavili singenske, neklonske metastaze RM9-STEAP1-fLuc pri moških heterozigotnih miših hSTEAP1-KI in jih randomizirali na zdravljenje s 5 × 106 netransducirane mišje T-celice ali mišje STEAP1-mBBζ CAR T-celice z injekcijo v repno veno z ali brez tedenske terapije s CBD-IL-12 z injekcijo v retroorbitalni sinus. Skupine, ki so prejemale samo terapijo s CBD-IL-12 ali v kombinaciji s terapijo STEAP1-mBBζ CAR T, niso prejele ciklofosfamida, ki izčrpava limfo (slika 7a). Serijski BLI je razkril hitro napredovanje bolezni pri miših, zdravljenih z netransduciranimi celicami T in CBD-IL-12, medtem ko so tiste, ki so prejemale celice T STEAP1-BBζ CAR v kombinaciji s terapijo s CBD-IL-12, pokazale pomembno zakasnitev napredovanja tumorja (slika 7b, c). Pomembno je, da je bilo kombinirano zdravljenje z mišjimi celicami STEAP1- mBBζ CAR T in tedenskim CBD-IL-12 povezano s statistično značilnim podaljšanjem celotnega preživetja v primerjavi z vsemi drugimi zdravljenimi skupinami (slika 7d). Analiza citokinov v plazmi pri retroorbitalnih krvavitvah, zbranih 0. in 8. dan zdravljenja, je pokazala znatno povečanje ravni proinflamatornih citokinov IFN-, TNF-, IL-6 in IL-4 (slika 7e, dopolnilna slika 17) pri miših, zdravljenih s celicami STEAP1-mBBζ CAR T in CBD-IL-12. Ostanke tumorjev so zbrali ob nekropsiji in STEAP1 IHC je pokazal izgubo antigena pri tumorjih miši, zdravljenih tako s celicami STEAP1- mBBζ CAR T samo kot v kombinaciji s CBD-IL-12 (slika 8a). Poleg tega smo opazili povečanje ekspresije tumorja B2m (slika 8a), povezano s terapijo s CBD-IL-12. CD3+ T-celic je bilo prav tako povečano (slika 8b) v tumorskih stanjih, podvrženih IL-12 terapiji, vendar, čeprav je bil trend cenjen, nismo našli statistično pomembnega povečanja intratumorskih T-celic med STEAP1-mBBζ CAR T celice in kombinirane skupine zdravljenja STEAP1-mBBζ CAR T celice in CBD-IL-12. Preostali tumorji, vključno s tistimi iz miši, zdravljenih s kombinirano celico STEAP1-mBBζ CAR T in CBD-IL-12, zbrani pri največjem odzivu na zdravljenje (nadir) 10. dan in pri sočutnih končnih točkah za napredovanje tumorja (ponovitev), so bili disociirane na posamezne celice in podskupine imunskih celic so bile označene z multiparametrično pretočno citometrijo (dodatna slika 18). V skladu z našimi rezultati scRNA-seq je zdravljenje s CBD-IL-12 bodisi samo ali v kombinaciji s STEAP1-mBBζ CAR T celicami povzročilo znatno povečanje CD11b+ Ly6C-/+F4/{{68 }} MHC-II+ makrofagi (sl. 8c, d, dopolnilna slika 19a). Celice CD11b+ Ly6CF4/80+ MHC-II+ predstavljajo zrele makrofage, ki predstavljajo antigen66, in ta populacija je bila prednostno obogatena in je pokazala povečano izražanje inducirane sintaze dušikovega oksida (iNOS) kot označevalca vnetne polarizacije M1 s CBD-IL{{84} } terapija. Opazili smo tudi širitev populacije cDC1 in zmanjšanje konvencionalne populacije dendritičnih celic tipa 2 (cDC2) (slika 8e, dopolnilna slika 19b). cDC1 je bil vpleten v aktivacijo protitumorskih citotoksičnih celic CD8+ T in potencialne mehanizme terapevtske odpornosti. Nismo našli znakov migracije celic v tumor, medtem ko so cDC2 pomembni za aktivacijo pomembne razlike v razmerjih KLRG1+ in KLRG1- naravnih ubijalcev celic T CD4+, vključno s Tregs67 . V skladu z ugotovitvami cDC2 so celice v skupinah zdravljenja (dodatna slika 19d). Frekvenčno profiliranje CD4+ FOXP3+ Tregs je razkrilo zmanjšanje Tregs asso- F40/80+ SiglecF+ eozinofilcev je bilo povečanih, medtem ko je bil Ly6G+ nevciiran s CBD-IL-12 terapijo (dopolnilno Slika 19c). Zanimivo je, da so se trofili zmanjšali z dodatkom CBD-IL-12 k STEAP1-. Opazili smo, da so pri ponovitvi tumorjev po kombinirani terapiji s celicami STEAP1-mBBζ mBBζ CAR T (slika 8f, g). Predvsem pri zdravljenju s temi CAR T celicami in CBD-IL-12 je prišlo do zmanjšanja cDC1 in s tumorjem povezanih nevtrofilcev, ki so bili povečani pri zdravljenju s povečanjem Tregs, kar kaže na zmanjšano pripravo citotoksičnega CD8 STEAP{{120 }}mBBζ T-celic CAR v primerjavi z netransduciranimi T-celicami (54 v primerjavi s T-celicami in obogatitvijo imunosupresivnega signaliziranja Treg kot 34 %), zmanjšano v pogojih s CBD-IL-12 terapijo, vendar povečano ob ponovitvi tumorja po kombiniranem STEAP Terapija 1-mBBζ CAR T celic in CBD-IL-12 (19 do 42 %). Te ugotovitve kažejo, da lahko imunosupresivne lastnosti nevtrofilcev, povezanih s tumorjem, igrajo pomembno vlogo pri posredovanju odpornosti na zdravljenje in napredovanju tumorja. Na splošno te analize kažejo, da zdravljenje s CBD-IL-12 vrne sovražno imunosupresivno tumorsko okolje v pro-vnetno stanje in razširi protitumorsko aktivnost v povezavi z adaptivno preneseno terapijo s celicami STEAP1-mBBζ CAR T. Nadalje smo izvedli analizo repertoarja TCR z uporabo sekvenciranja beta verige TCR na podlagi multipleksne PCR68 na tumorjih, ki nosijo pljuča, zbranih iz vsake zdravljene skupine ob nekropsiji. Opazili smo znatno zmanjšanje Simpsonove klonalnosti v vzorcih miši, zdravljenih samo s CBD-IL-12 in v kombinaciji s STEAP1-mBBζ CAR T-celično terapijo, kar je kazalo na povečano intratumorsko T-celično raznolikost (sl. 8h). Te ugotovitve dokazujejo, da je lahko dodajanje CBD-IL-12 kot dodatka terapiji s T celicami STEAP1 CAR koristno s preoblikovanjem mikrookolja tumorja raka prostate, izboljšanjem obdelave in predstavitve antigena ter vključevanjem imunosti gostitelja za spodbujanje širjenja epitopa.

Slika 6|Terapija s fuzijo citokinov s sistemsko domeno, ki veže kolagen IL-12 (CBD-IL-12), zavira rast tumorja raka prostate in reprogramira tumorsko imunsko mikrookolje. Shema CBD-IL-12, sestavljena iz podenot p35 in p40, spojenih s CBD iz domene von Willebrandovega faktorja A3. b Volumni podkožnih tumorjev RM9 pri singenih miših C57Bl/6 skozi čas z zdravljenjem z vehiklom, anti-PD-1 (klon 29 F.1A12) 200 Μg z intraperitonealno injekcijo vsakih 5 dni ali CBD-IL-12 25 Μg z intravensko injekcijo vsakih 5 dni z začetkom na dan 0. n=7 miši v skupinah, zdravljenih z vehiklom in CBD-IL-12 ter n=8 miši v anti -Skupina, zdravljena s PD1. p < 0,0001 9. in 12. dan. Vrstice predstavljajo povprečje s SEM. P-vrednosti so izpeljane iz dvosmerne ANOVA z Dunnettovim testom večkratnih primerjav, ns ni pomembno. c Grafi Uniform Manifold Approximation and Projection (UMAP) različnih podskupin imunskih celic (zgoraj) iz analize enocelične RNA-seq (scRNA-seq) petih tumorjev RM9, od katerih je bil vsak združen iz miši, zdravljenih z vehiklom ali CBD-IL{{41} }. Grafe UMAP, obarvane z gensko ekspresijo markerjev, specifičnih za podmnožico imunskih celic, za pan-monocite/makrofage, polarizirane makrofage M1 in M2, običajne dendritične celice tipa 1 (cDC1), celice naravne ubijalke (NK) in pomočnike T tipa 1 (Th1) celice. d Grafi, ki prikazujejo pogostost specifičnih populacij imunskih celic (v primerjavi z imunskimi celicami CD45 +), identificiranih z analizo scRNA-seq, vključno s celicami CD4+ in CD8+ T, Th1 (Infg+ Tbx{ {56}} ) in Th2 (cMAF+ Gata3+ ) celice, Ly6C+/− monociti/makrofagi (Ly6C+/− Adgre1+ ), M1 makrofagi (CD80+ CD{{67} } INOS2+ ), makrofagi M2 (CD163+ Mrc1+ cMAF+ ), cDC1 (XCR1+ IRF8+ ), konvencionalne dendritične celice tipa 2 (cDC2 , CD1+ IRF4+ ), selitvene CD103+ dendritične celice (Itgae+ ), eozinofilci (SiglecF+), nevtrofilci (Ly6G+) in NK celice (Klrb1c+ Ncr1+ ) pri tumorjih, zdravljenih z vehiklom ali CBDIL-12. Grafi vulkana, ki prikazujejo diferencialno izražanje genov v (e) tumorskih celicah in (f) celicah T iz tumorjev RM9 miši, zdravljenih s CBD-IL-12 glede na tiste, zdravljene z vehiklom. Sprememba zgiba FC, stopnja lažnega odkrivanja FDR. Izvorni podatki so navedeni v datoteki Izvorni podatki.

Diskusija

Učinkovitost zdravljenja s celicami CAR T in drugih imunsko usmerjenih terapevtikov je močno odvisna od dosledne ekspresije antigena na vseh ali večini celic, ki sestavljajo tumorsko populacijo pri posameznem bolniku. Vendar pa je heterogenost antigena izrazita pri solidnih tumorjih, vključno z rakom prostate, kjer sta napredovanje v mCRPC in odpornost na zdravljenje povezana s pojavom divergentnih podtipov bolezni, ki jih zaznamujejo različni transkripcijski programi–71 in izražanje antigena na celični površini. Medtem ko PSMA velja za enega najpomembnejših biomarkerjev pri raku prostate s pomembno prekomerno ekspresijo, ugotovljeno v celotnem spektru napredovanja bolezni, naše delo potrjuje ugotovitve iz nedavne objave14, ki kaže, da je izražanje PSMA heterogeno pri smrtonosnem mCRPC. Pokažemo, da je STEAP1 v tej nastavitvi širše izražen kot PSMA, vendar nikakor ni enakomerno izražen na visokih ravneh v vseh tkivih mCRPC. Nobena posamezna terapija, usmerjena na antigen, vključno s terapijo s celicami CAR T, morda ne bo mogla premagati že obstoječe heterogenosti tumorskega antigena pri mCRPC. Zato je ključnega pomena, da se temeljito potrdijo dodatne terapevtske tarče, kot je STEAP1 v mCRPC, ki lahko omogočijo kombinirane terapije, ki izvajajo nepremostljiv terapevtski pritisk. Ti vključujejo terapije s celicami CAR T z dvojnim ciljanjem na antigene (npr. PSMA in STEAP1) ali multimodalne strategije, ki združujejo terapije s celicami CAR T z ADC, T-BsAbs ali drugimi zdravljenji, ki močno spodbujajo od antigena neodvisno in odvisno uničenje tumorja. Izdelali smo STEAP1-ciljno terapijo s T-celicami CAR, ki je visoko antigensko specifična in funkcionalno lokalizira epitop, ki ga prepozna CAR, na drugi ECD STEAP1. Naše T-celice STEAP1-BBζ CAR izkazujejo znatno protitumorsko aktivnost proti več modelom diseminiranega raka prostate tako v študijah pri ljudeh v miših kot miših v miših. Pomembno je, da je naš STEAP1-BBζ CAR sposoben inducirati aktivacijo celic T in citolizo ciljnih celic tudi v pogojih nizke gostote antigena, kar dokazuje reaktivnost proti modelu raka prostate PC3. Vendar pa je lahko ta občutljivost STEAP1-BBζ CAR T celic na nizke ravni izražanja STEAP1 koristna z vidika izboljšanja protitumorske učinkovitosti, lahko pa tudi poudari odgovornosti zaradi ciljne toksičnosti zunaj tumorja. Prej so poročali, da sistemsko izražanje STEAP1 praktično ni prisotno v normalnih človeških tkivih 18, 72 razen v prostati, kjer je bilo opisano membransko izražanje v epitelnih celicah prostate 27. Da bi se poglobili v varnost terapije s T-celicami STEAP1-BBζCAR v predkliničnem okolju, smo ustvarili humaniziran model miši STEAP1. Mišji model hSTEAP1-KI je povzel ekspresijo človeškega STEAP1 v prostati in pokazal ekspresijo v skorji nadledvične žleze. Prepričljivo je, da zdravljenje s T celicami STEAP1-BBζ CAR v odmerku, ki zadostuje za induciranje protitumorske aktivnosti, ni povzročilo očitne sistemske toksičnosti pri miših hSTEAP1-KI, vključno s toksičnostjo proti tumorju na ciljnih mestih na mestih človeškega STEAP1 izražanje. Ponavljajoči se mehanizem ponovitve in napredovanja raka prostate po terapiji s celicami T STEAP1-BBζ CAR v naših študijah je bil umik tumorskega antigena. Po eni strani ta ugotovitev poudarja splošno učinkovitost STEAP1-BBζ CAR T-celične terapije. Vendar pa ni jasno, ali je izguba izražanja tumorskega STEAP1 izključno posledica inherentne heterogenosti tumorskega antigena ali pa obstaja tudi prilagodljiva znižana regulacija izražanja STEAP1. Nedavna objava je pokazala, da metilacija promotorja STEAP1 modulira ekspresijo STEAP1 in epigenetska deregulacija z DNA metiltransferazo in inhibicijo histonske deacetilaze zadostuje za znatno povečanje ekspresije STEAP173. Zdravljenje z epigenetskimi zaviralci v kombinaciji s celično terapijo STEAP1 CAR T bi lahko hkrati povečalo ekspresijo STEAP1 tumorja in reprogramiralo celice CAR T v ugodna stanja diferenciacije, odporna na izčrpanost 74, 75, s čimer bi ublažili izgubo tumorskega antigena in povečali protitumorsko učinkovitost pri raku prostate. Naša študija prav tako nakazuje, da ima STEAP1 funkcionalno vlogo pri uravnavanju napredovanja celičnega cikla in celičnega metabolizma pri raku prostate. STEAP1 je edinstven od drugih članov družine STEAP (STEAP2, 3 in 4) po tem, da nima znotrajcelične oksidoreduktazne domene22, ki je potrebna za aktivnost metalo reduktaze. Posledično homotrimerji STEAP1, ne pa heterotrimerji z drugimi proteini STEAP, nimajo encimske funkcije za redukcijo Fe3+ v Fe2+ in Cu2+ v Cu1+. Ali in kako vpletenost STEAP1 v kovinske ione in celični metabolizem spodbuja napredovanje raka, je še treba ugotoviti in je vredno nadaljnje preiskave. Imunološko 'hladno' tumorsko mikrookolje raka prostate je glavna ovira za učinkovitost imunoterapije raka. Na primer, raziskovalne študije, povezane s kliničnim preskušanjem faze I terapije s celicami PSMA CAR T, ki so oklepljene za izražanje receptorja dominantno negativnega transformirajočega rastnega faktorja (TGF R-DN) v mCRPC, so pokazale, da se izražanje imunosupresivnih signalnih molekul v tumorskem mikrookolju poveča po infuziji CAR T13. V naših študijah je bila kritična ugotovitev povezava med izgubo izražanja STEAP1 in zmanjšano regulacijo procesiranja in predstavitve antigena, tako v izločenih celicah STEAP1 kot tumorjih z izgubo antigena STEAP1 po terapiji s celicami STEAP1-BBζ CAR T. Tako izguba antigena STEAP1 pri raku prostate spodbuja ne samo neposredno odpornost na terapijo s celicami STEAP1-BBζ CAR T, ampak lahko tudi omeji gostiteljsko prilagodljivo protitumorsko imunost. Izgubo ekspresije ciljnega tumorskega antigena in pretvorbo v bolj imunosupresivno stanje s povečano infiltracijo Tregs in večjo ekspresijo imunosupresivnih molekul so opazili tudi v študiji faze I celic T EGFR-vIII CAR pri udeležencih s ponavljajočim se glioblastomom76. Dodatno delo bo potrebno za razumevanje funkcionalnih mehanizmov, na katerih temelji izguba antigena STEAP1, in na splošno, kako lahko dinamični učinki adoptivne terapije s celicami CAR T prispevajo k izgubi antigena in imunskemu urejanju z modulacijo tumorsko-imunsko-stromalnih interakcij v solidnih tumorjih.

Slika 7|Kombinacija CBD-IL-12 s STEAP1-mBBζ CAR T celično terapijo poveča splošno preživetje in vnetne ravni citokinov. Shema poskusa izzivanja tumorja za diseminirani model RM9-hSTEAP1 pri miših hSTEAP1-KI/+, ki preiskujejo kombinacijo CBD-IL-12 s STEAP{{1{{18} }}}mBBζ CAR T celična terapija. Cy ciklofosfamid (za predkondicioniranje). Ustvarjeno z BioRender.com. b Serijski BLI v živo hSTEAP1-KI/ + miši, ki so jim bile cepljene metastaze RM9-hSTEAP1- fLuc in zdravljene z eno samo intravensko injekcijo 5 × 106 mišjih netransduciranih T-celice ali STEAP1-mBBζ CAR T-celice na dan 0 z ali brez zdravljenja s CBD-IL- 12 vsak teden. Rdeči X označuje poginule miši. Prikazana je lestvica sevanja. (c) Graf, ki prikazuje kvantifikacijo celotnega toka skozi čas iz BLI v živo vsake miši v (b). d Kaplan–Meierjeve krivulje preživetja miši v (b) s statistično značilnostjo, določeno z log-rank (Mantel-Cox) testom (p=0.002). e Grafi, ki prikazujejo serumske ravni citokinov IFN- (levo, p=0.002) in TNF- (desno, p < 0,0001) na podlagi imunskih testov ProcartaPlex iz retroorbitalnih krvavitev miši hSTEAP1-KI/+ ( n=4 miši na skupino), ki imajo metastaze RM9-hSTEAP1-fLuc pred (0. dan) in po zdravljenju (8. dan) z netransduciranimi mišjimi T celicami ali mišjim STEAP{{38} }mBBζ CAR T celice z ali brez CBD-IL-12 terapije. Vrstica napak predstavlja povprečje s SEM. Za ploščo (e) so bile p-vrednosti izpeljane iz dvosmerne ANOVA s Sidakovim testom večkratnih primerjav. Izvorni podatki so navedeni v datoteki Izvorni podatki.

Slika 8|Kombinacija CBD-IL-12 s STEAP1-mBBζ CAR T celično terapijo reprogramira tumorsko imunsko mikrookolje in spodbuja predstavitev antigena in širjenje epitopa. a Mikrografske fotografije STEAP1 (zgoraj), B2m (na sredini) in CD3 (spodaj) IHC obarvanja pljučnih tumorjev RM9-hSTEAP1 po zdravljenju z mišjimi netransduciranimi celicami T ali celicami T STEAP1-mBBζ CAR z ali brez zdravljenja s CBD-IL-12. Lestvica=50 µm. b Palični diagram, ki prikazuje IHC kvantifikacijo CD3 pozitivnih celic, ki se infiltrirajo v metastatske pljučne tumorje (n=4 tumorjev na skupino). Enosmerna ANOVA p=0.{{80}}021. Vrstica napak predstavlja povprečje s SD. Grafi, ki prikazujejo frekvence (c) Ly6C− F4/{{20}} MHC-II+ (levo, enosmerna ANOVA p=0.00{ {98}}5) in Ly6C − F4/80+ iNOS2+ (desno, enosmerna ANOVA p=0.0017) makrofagi, (d) Ly6C+ F4/ {{36} } MHC-II+ (levo, enosmerna ANOVA p=0.0038) in Ly6C+ F4/80+ iNOS2+ (desno, enosmerna ANOVA p=ns) makrofagi, (e) CD11b+ XCR1+ cDC1 (enosmerna ANOVA p=0.0003), (f) F4/80+ SiglecF+ eozinofili (enosmerna ANOVA p=0. 0008) in (g) nevtrofilcev Ly6G+ (enosmerna ANOVA p=0.0035), normaliziranih na skupno število celic CD45+, kot je določeno z multiparametrično pretočno citometrijo po zdravljenju z netransduciranimi celicami T, STEAP{{67 }}mBBζ CAR T celice, netransducirane T celice in CBD-IL-12 in STEAP1- mBBζ CAR T celice in CBD-IL-12 pri največjem odzivu na zdravljenje (nadir) in ponovitvi tumorja (ponovitev). h Stolpčni diagrami, ki predstavljajo Simpsonovo klonalnost kot merilo 'enakomernosti' repertoarja TCR, analiziranega s sekvenciranjem TCRB na celicah, ki infiltrirajo tumor, zbranih pri miših v (a). n=4 tumorjev na skupino. P-vrednosti za netransducirane celice T + CBD-IL-12 v primerjavi z netransduciranimi celicami T in celicami T STEAP1-mBBζ CAR so 0,008 oziroma 0,02; in STEAP1-mBBζ CAR T celice + CBD-IL-12 v primerjavi z netransduciranimi in STEAP1-mBBζ CAR T celicami so 0,004 oziroma 0,01. Vrstica napak predstavlja povprečje s SD. Za plošče (c–g) n=3 tumorjev na skupino, *p < 0,05; **p < 0,01, ***p < 0,001, p-vrednosti na ploščah (b–h) so iz enosmerne ANOVE z Dunnovim testom večkratnih primerjav. Izvorni podatki so navedeni v datoteki Izvorni podatki.

Da bi razširili protitumorski odziv, smo raziskali sistemsko dajanje CBD-IL-12 v kombinaciji s STEAP1-BBζ CAR T-celično terapijo v modelu diseminiranega, singenega tumorja RM9-hSTEAP1 v hSTEAP 1-KI miši za približek imunosupresivne narave mCRPC na podlagi predhodne karakterizacije RM9 kot slabo imunogenega modela57,77. Sočasno zdravljenje s CBD-IL12 je privedlo do izboljšav splošnega preživetja, proizvodnje citokinov, predstavitve tumorskega antigena in intratumorske T-celične raznolikosti, skladne s širjenjem epitopa. Natančna preiskava tumorskega imunskega mikrookolja je pokazala, da dodajanje CBD-IL-12 k STEAP1-BBζ CAR T-celični terapiji inducira reverzijo strome tumorja in poveča aktivirane makrofage in cDC1, medtem ko zmanjša število nevtrofilcev, povezanih s tumorjem. Vendar v naših študijah ozdravitev ni bila dosežena in izpostavljamo potencialne kompenzatorne, prilagoditvene mehanizme odpornosti in napredovanja tumorja, vključno s povečano pogostnostjo imunosupresivnih nevtrofilcev in cDC2, ki lahko spodbujajo indukcijo Treg. Pomembno je omeniti, da bo morda potrebna nadaljnja optimizacija odmerka in razporeda dajanja CBD-IL-12 za maksimiranje protitumorskih odzivov. Vendar pa ti rezultati podpirajo preiskavo kombinatornih imunoterapevtskih pristopov, kot je oklep T-celic CAR za izražanje rekombinantnih citokinov78 (npr. IL-2, IL-12, IL-15 ali IL{{24 }}), sočasno zdravljenje z imunomodulatorji (npr. anti-PD-1/PD-L1 ali anti-CTLA4) ali proti tumorju usmerjeno radioterapijo za preoblikovanje tumorskega mikrookolja raka prostate in izboljšanje efektorske funkcije T-celic CAR. Medtem ko je bil ta rokopis v pripravi, je študija skupine na Norveškem poročala o predkliničnem razvoju STEAP1 CAR T celične terapije s protitumorsko aktivnostjo v subkutanem modelu 22Rv1 pri miših z oslabljenim imunskim sistemom79. Sporočeni STEAP1 CAR se razlikuje od STEAP1-BBζ CAR, saj vključuje sintetični scFv, imenovan Oslo1, in CD8 tečaj in transmembransko domeno. Druga značilnost razlikovanja je, da so celice T STEAP1-BBζ CAR pripravljene kot definiran produkt z normalnim razmerjem celic T CD4/CD8, medtem ko celice T Oslo1 STEAP1 CAR niso. O mehanizmih odpornosti in varnostnih študijah, povezanih s terapijo s T-celicami Oslo1 STEAP1 CAR, niso poročali. Vendar pa bo zanimivo videti, kako lahko te razlike v inženiringu CAR in sestavi celičnih produktov vplivajo na protitumorsko učinkovitost, obstojnost in varnost pri obeh T-celični terapiji Oslo1 STEAP1 CAR in naši STEAP1-BBζ CAR T-celični terapiji programi so prevedeni na kliniko. Ugotovitve naših študij so pripeljale do partnerstva s programom eksperimentalne terapije Nacionalnega inštituta za raka (NCI) (NExT) za prenos STEAP1-BBζ CAR T-celične terapije v prvo preskušanje na ljudeh pri moških z mCRPC. Signali o varnosti in učinkovitosti iz tega kliničnega preskušanja v zgodnji fazi bodo pomagali ugotoviti, ali bi lahko bilo raziskovanje tega terapevtskega pristopa koristno tudi za druge vrste raka, ki močno izražajo STEAP1.

Reference

1. Siegel, RL, Miller, KD, Fuchs, HE & Jemal, A. Statistika raka, 2022. CA: Cancer J. Clinicians 72, 7–33 (2022).

2. Armstrong, AJ et al. Napoved petletnega preživetja in varnostni rezultati z enzalutamidom pri moških z metastatskim, na kastracijo odpornim rakom prostate, ki še niso bili zdravljeni s kemoterapijo, iz preskušanja PREVAIL. EUR. Urol. 78, 347–357 (2020).

3. Fizazi, K. et al. Abirateron in prednizon pri metastatskem raku prostate, občutljivem na kastracijo. N. angl. J. Med. 377, 352–360 (2017).

4. Scher, HI et al. Povečano preživetje z enzalutamidom pri raku prostate po kemoterapiji. N. angl. J. Med. 367, 1187–1197 (2012).

5. Parker, C. et al. Alfa emiter radij-223 in preživetje pri metastatskem raku prostate. N. angl. J. Med. 369, 213–223 (2013).

6. Sartor, O. et al. Lutecij-177–PSMA-617 za metastatski rak prostate, odporen na kastracijo. N. angl. J. Med. 385, 1091–1103 (2021).

7. Kantoff, PW et al. Imunoterapija Sipuleucel-T za rak prostate, odporen na kastracijo. N. angl. J. Med. 363, 411–422 (2010).

8. Jackson, HJ, Rafiq, S. & Brentjens, RJ Vožnja CAR T-celic naprej. Nat. Rev. Clin. Oncol. 13, 370–383 (2016).

9. Weiner, GJ Gradimo boljše terapevtike na osnovi monoklonskih protiteles. Nat. Rev. Rak 15, 361–370 (2015).

10. Chavez, JC, Bachmeier, C. & Kharfan-Dabaja, MA CAR T-celična terapija za B-celične limfome: rezultati kliničnih preskušanj razpoložljivih izdelkov. Terapevtski adv. Hematol. 10, 2040620719841581 (2019).

11. Sterner, RC & Sterner, RM CAR-T celična terapija: trenutne omejitve in možne strategije. Krvni rak J. 11, 69 (2021).

12. Slovin, SF et al. Študija 1. faze celic P-PSMA-101 CAR-T pri bolnikih z metastatskim na kastracijo odpornim rakom prostate (mCRPC). J. Clin. Oncol. 40, 98–98 (2022).

13. Narayan, V. et al. T-celice CAR T, ki ciljajo na PSMA in so neobčutljive na TGF, pri metastatskem raku prostate, odpornem na kastracijo: preskušanje 1. faze. Nat. med. 28, 724–734 (2022).

14. Paschalis, A. et al. Heterogenost membranskega antigena, specifičnega za prostato, in okvare popravljanja DNK pri raku prostate. Evro. Urol. 76, 469–478 (2019).

15. Chen, N., Li, X., Chintala, NK, Tano, ZE & Adusumilli, PS Vožnja CAR na neenakomerni poti heterogenosti antigenov v solidnih tumorjih. Curr. Opin. Immunol. 51, 103–110 (2018).

16. Morgan, RA et al. Poročilo o primeru resnega neželenega dogodka po dajanju celic T, transduciranih s himernim antigenskim receptorjem, ki prepozna ERBB2. Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther. 18, 843–851 (2010).

17. Lee, JK et al. Sistemsko površinsko profiliranje identificira tarčne antigene za imunsko temelječo terapijo pri podtipih napredovalega raka prostate. Proc. Natl. Akad. Sci. ZDA 115, E4473–e4482 (2018).

18. Hubert, RS et al. STEAP: za prostato specifičen celični površinski antigen, ki je močno izražen v človeških tumorjih prostate. Proc. Natl Acad. Sci. ZDA 96, 14523–14528 (1999).

19. Nolan-Stevaux, O. Povzetek DDT02-03: AMG 509: Novo, humanizirano, podaljšano razpolovno dobo, bispecifično STEAP1 × CD3 celice T, rekrutirajoče XmAb® 2+1 protitelo. Cancer Res. 80, DDT02-03-DDT02-03 (2020).

20. Grunewald, TG et al. Visoka ekspresija STEAP1 je povezana z izboljšanimi rezultati pri bolnikih z Ewingovim sarkomom. Ann. Oncol. Izključeno. J. Eur. Soc. med. Oncol. 23, 2185–2190 (2012).

21. Moreaux, J., Kassambara, A., Hose, D. & Klein, B. STEAP1 je čezmerno izražen pri raku: obetavna terapevtska tarča. Biochem. Biophys. Res. Komun. 429, 148–155 (2012).

22. Oosterheert, W. & Gros, P. Struktura krioelektronske mikroskopije in potencialna encimska funkcija človeškega šest transmembranskega epitelijskega antigena prostate 1 (STEAP1). J. Biol. Chem. 295, 9502–9512 (2020).

23. Jiao, Z. et al. Šest-transmembranski epitelijski antigen ekspresije prostate 1 spodbuja metastaze raka jajčnikov s pomočjo pri napredovanju prehoda iz epitelija v mezenhim. Histochem. Cell Biol. 154, 215–230 (2020).

24. Gomes, IM, Arinto, P., Lopes, C., Santos, CR & Maia, CJ STEAP1 je prekomerno izražen pri raku prostate in lezijah intraepitelijske neoplazije prostate in je pozitivno povezan z oceno Gleason. V urološki onkologiji: seminarji in izvirne preiskave. vol. 32, 53.e23–53.e29 (Elsevier, 2014).

25. Huo, S.-f. et al. STEAP1 olajša metastaziranje in epitelno-mezenhimski prehod pljučnega adenokarcinoma preko signalne poti JAK2/STAT3. Biosci. Rep. 40, BSR20193169 (2020).

26. Gomes, IM et al. Knockdown STEAP1 zavira rast celic in inducira apoptozo v celicah raka prostate LNCaP, kar preprečuje učinek androgenov. med. Oncol. 35, 1–10 (2018).

27. Gomes, IM, Maia, CJ & Santos, CR STEAP proteini: od strukture do uporabe pri zdravljenju raka. Mol. Cancer Res. MCR 10, 573–587 (2012).

28. Danila, DC et al. Študija I. faze DSTP3086S, konjugata protitelo-zdravilo, ki cilja na šest-transmembranski epitelijski antigen prostate 1, pri metastatskem raku prostate, odpornem na kastracijo. J. Clin. Oncol. Izključeno. J. Am. Soc. Clin. Oncol. 37, 3518–3527 (2019).

29. Kelly, WK et al. Študija I. faze AMG 509, imunskega zdravljenja z XmAb 2+1, ki pridobiva celice T STEAP1 x CD3, pri bolnikih z metastatskim rakom prostate, odpornim na kastracijo (mCRPC). J. Clin. Oncol. 38, TPS5589–TPS5589 (2020).

30. Lin, T.-Y., Park, JA, Long, A., Guo, H.-F. & Cheung, N.-KV Novo močno bispecifično protitelo proti STEAP1 za preusmeritev celic T za imunoterapijo raka. J. Immunother. Rak 9, e003114 (2021).

31. Schober, SJ et al. Transgene CD4(+) T celice MHC razreda I, omejene na TCR, proti STEAP1 posredujejo lokalni nadzor tumorja Ewingovega sarkoma in vivo. Celice 9, 1581 (2020).

32. Roudier, MP et al. Fenotipska heterogenost končnega stadija karcinoma prostate, metastatskega v kosti. Hum. Pathol. 34, 646–653 (2003).

33. Gomes, IM, Santos, CR, Socorro, S. & Maia, CJ Šest transmembranski epitelijski antigen prostate 1 uravnavajo spolni hormoni v celicah prostate. Prostata 73, 605–613 (2013).

34. Sharp, A. et al. Različica spajanja androgenih receptorjev-7 se pojavi z odpornostjo na kastracijo pri raku prostate. J. Clin. Investirajte. 129, 192–208 (2019).

35. Bakht, MK et al. Nevroendokrina diferenciacija raka prostate vodi do supresije PSMA. Endocr.-Relat. Rak 26, 131–146 (2018).

36. Ihlaseh-Catalano, SM et al. Prekomerna ekspresija proteina STEAP1 je neodvisen marker za biokemično ponovitev pri karcinomu prostate. Histopatologija 63, 678–685 (2013).

37. Gomes, IM et al. Knockdown STEAP1 zavira rast celic in inducira apoptozo v celicah raka prostate LNCaP, kar preprečuje učinek androgenov. med. Oncol. 35, 40 (2018).

38. Logan, AC et al. Dejavniki, ki vplivajo na titer in infektivnost lentivirusnih vektorjev. Hum. Gene Ther. 15, 976–988 (2004).

39. Morgan, RA, Gray, D., Lomova, A. & Kohn, DB Genska terapija s hematopoetskimi matičnimi celicami: napredek in pridobljene izkušnje. Celične matične celice 21, 574–590 (2017).

40. Larson, SM et al. Predklinični razvoj genske modifikacije hematopoetskih matičnih celic s himernimi antigenskimi receptorji za imunoterapijo raka. Hum. Cepivo Immunother. 13, 1094–1104 (2017).

41. Salter, AI et al. Fosfoproteomska analiza signalizacije himernega antigenskega receptorja razkriva kinetične in kvantitativne razlike, ki vplivajo na delovanje celice. Sci. Signal. 11, eaat6753 (2018).

42. Majzner, RG et al. Uravnavanje zahteve po gostoti antigena za aktivnost T-celic CAR. Rak Discov. 10, 702–723 (2020).

43. Challita-Eid, PM et al. Monoklonska protitelesa proti šestim transmembranskim epitelijskim antigenom prostate-1 zavirajo medcelično komunikacijo in vitro in rast ksenograftov človeških tumorjev in vivo. Cancer Res. 67, 5798–5805 (2007).

44. Hudecek, M. et al. Nesignalna ekstracelularna distančna domena himernih antigenskih receptorjev je odločilna za protitumorsko aktivnost in vivo. Imunol proti raku. Res. 3, 125–135 (2015).

45. Gomes, IM, Santos, CR & Maia, CJ Izražanje STEAP1 in STEAP1B v celičnih linijah prostate in domnevna regulacija STEAP1 s post-transkripcijskimi in post-translacijskimi mehanizmi. Genes Cancer 5, 142–151 (2014).

46. ​​Bernsel, A., Viklund, H., Hennerdal, A. & Elofsson, A. TOPCONS: konsenzna napoved topologije membranskega proteina. Nucleic Acids Res. 37, W465–W468 (2009).

47. Krogh, A., Larsson, B., Von Heijne, G. & Sonnhammer, EL Napovedovanje transmembranske proteinske topologije s skritim Markovljevim modelom: uporaba za popolne genome. J. Mol. Biol. 305, 567–580 (2001).

48. Long, AH et al. 4-1Kostimulacija BB izboljša izčrpanost celic T, ki jo povzroči tonično signaliziranje himernih antigenskih receptorjev. Nat. med. 21, 581–590 (2015).

49. Berger, C. et al. Adoptivni prenos efektorskih celic CD8+ T, pridobljenih iz centralnih spominskih celic, vzpostavlja obstojni T-celični spomin pri primatih. J. Clin. Raziskati. 118, 294–305 (2008).

50. Gattinoni, L. et al. Podmnožica T-celic človeškega spomina z lastnostmi, podobnimi matičnim celicam. Nat. med. 17, 1290–1297 (2011).

51. Xu, Y. et al. Tesno povezane matične celice T-spomina so v korelaciji z in vivo ekspanzijo CAR. CD19-celice T ohranjata IL-7 in IL-15. Blood 123, 3750–3759 (2014).

52. Cieri, N. et al. IL-7 in IL-15 dajeta navodila za generiranje izvornih celic T človeškega spomina iz naivnih predhodnikov. Blood 121, 573–584 (2013).

53. Hansel, DE et al. Skupna mutacija gena TP53 pri morfološko in fenotipsko ločenem sočasnem primarnem drobnoceličnem nevroendokrinem karcinomu in adenokarcinomu prostate. Prostata 69, 603–609 (2009).

54. Cuzick, J. et al. Prognostična vrednost podpisa izražanja RNA, pridobljenega iz genov proliferacije celičnega cikla pri bolnikih z rakom prostate: retrospektivna študija. Lancet Oncol. 12, 245–255 (2011).

55. Chen, ME, Lin, SH, Chung, LW & Sikes, RA Izolacija in karakterizacija PAGE-1 in GAGE-7. Novi geni, izraženi v modelu napredovanja raka prostate LNCaP, ki imajo homologijo z antigeni, povezanimi z melanomom. J. Biol. Chem. 273, 17618–17625 (1998).

56. Baley, PA, Yoshida, K., Qian, W., Sehgal, I. & Thompson, TC Napredovanje do androgene neobčutljivosti v novem in vitro mišjem modelu za raka prostate. J. Steroid Biochem. Mol. Biol. 52, 403–413 (1995).

57. Murad, JP et al. Predkondicioniranje spremeni TME za povečanje učinkovitosti CAR T celic solidnega tumorja in endogene zaščitne imunosti. Mol. Ther. J. Am. Soc. Gene Ther. 29, 2335–2349 (2021).

58. Brunda, MJ et al. Protitumorska in antimetastatska aktivnost interlevkina 12 proti mišjim tumorjem. J. Exp. med. 178, 1223–1230 (1993).