Usmerjanje laktat dehidrogenaze A s katehinom ponovno senzibilizira želodčne rakave celice SNU620/5FU na 5-fluorouracil, 1. del

Prosim kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza več informacij

Povzetek:Odpornost proti terapevtikom proti raku se pojavi pri skoraj vseh vrstah raka in postane glavna težava pri zdravljenju raka. Čeprav je 5-fluorouracil (5FU) prva izbira zdravljenja raka želodca, je njegova učinkovitost omejena zaradi odpornosti na zdravila. Nedavno je bil spremenjeni metabolizem raka, vključno z Warburgovim učinkom, prednost glikolizi namesto oksidativni fosforilaciji za proizvodnjo energije, sprejet kot ključni mehanizem za uravnavanje odpornosti na kemoterapijo. Tako smo raziskali podroben mehanizem in možno uporabnost antiglikolitikov pri izboljšanju odpornosti na 5FU z uporabo uveljavljenih celičnih linij raka želodca SNU620 in SNU620/5FU. SNU620/5FU, rakava celica želodca, ki je odporna na 5FU, je pokazala veliko večjo proizvodnjo in izražanje laktata odencimi, povezani z glikolizo, kot je laktat dehidrogenaza A (LDHA), kot tiste iz matičnih celic SNU620. Za omejitev glikolize smo pregledali katehin in njegove derivate, ki so znaniprotivnetnoin naravne izdelke proti raku, ker so že poročali o epigalokatehin galatu kot zaviralcu izražanja LDHA. Katehin, najpreprostejša spojina med njimi, je imel največji zaviralni učinek na nastajanje laktata in aktivnost LDHA. Poleg tega je kombinacija 5FU in katehina pokazala dodatno citotoksičnost in inducirano apoptozo, posredovano z reaktivnimi kisikovimi vrstami (ROS), v celicah SNU620/5FU. Tako na podlagi teh rezultatov predlagamo katehin kot kandidata za razvoj novega adjuvantnega zdravila, ki zmanjšuje kemorezistenco na 5FU z omejevanjem LDHA.

Ključne besede:5-fluorouracil;kemorezistenten; glikoliza; laktat dehidrogenaza; katehin

Za več informacij kliknite tukaj

1. Uvod

Izjemen napredek je bil dosežen pri zdravljenju raka želodca s kirurško resekcijo primarnega tumorja in kombinirano kemoterapijo na osnovi 5-fluorouracila (5FU), kot so epirubicin, cisplatin in fluorouracil ter docetaksel, oksaliplatin in 5FU[1]. ,21 Do danes ostaja 5FU, analog uracila, ki blokira sintezo DNK z zaviranjem timidilat sintaze [3], pogosto uporabljeno kemoterapevtsko zdravilo za zdravljenje raka želodca [1, A4]. Vendar pa je bila klinična učinkovitost kemoterapije nezadovoljiva zaradi ponovitve primarnega ali metastatskega raka, povezanega z odpornostjo na zdravila [1, 5].

Cistanche lahko izboljša imuniteto

Številni celični procesi veljajo za ključne mehanizme, na katerih temelji kemorezistentnost, vključno z aktivacijo ali inaktivacijo zdravil, mehanizmi za popravilo poškodb DNK, modifikacijami tarč zdravil, inaktivacijo apoptotičnih poti in povečano avtofagijo [6,7]. Rak je heterogen in različni raki za presnovo energije uporabljajo tako glikolizo kot oksidativno fosforilacijo [8]. Vendar pa je presnovno reprogramiranje, zlasti nenormalna aerobna glikoliza, poročali kot ključni akter pri razvoju odpornosti na kemoterapevtska zdravila, vključno s 5FU, pri raku želodca [9]. Laktat dehidrogenaza A (LDHA) in piruvat dehidrogenaza kinaze (PDK) sta znani kot ključni regulatorji aerobne glikolize, ki proizvaja laktat iz piruvata [10,11]. Kombinacija dikloroacetata, uveljavljenega zaviralca PDK, obnovi občutljivost na 5FU [12]. Poleg tega so poročali, da je LDHA, ključni encim, ki katalizira pretvorbo piruvata v laktat, potencialna tarča za zdravljenje raka želodca [13,14]. Zmanjšanje izražanja LDHA v rakavih celicah zavira tumorigenost s povečanjem dihanja mitohondrijev in zmanjšanjem sposobnosti preživetja celic [15]. Več zaviralcev LDHA, kot so FX11, PSTMB in GSK 2837808A, zmanjša raven ATP in povzroči oksidativni stres ter končno povzroči apoptotično celično smrt [16-18]. Čeprav je študija pokazala, da je inhibicija LDHA z mikroRNA-34a obnovila odpornost proti 5FU pri raku debelega črevesa [19], nobena predhodna študija ni poročala o učinkih genetskih ali farmakoloških zaviralcev LDHA na kemorezistenco.

Polifenoli zelenega čaja, vključno s katehinom (CA), epikatehinom (EC), galokatehinom (GC), epigalokatehinom (EGC), epikatehin-3-galatom (EKG) in epigalokatehin-3-galatom (EGCG), spodbujajo človeško zdravje s preprečevanjem in zdravljenjem številnih bolezni, vključno z vnetji, sladkorno boleznijo, srčno-žilnimi boleznimi in malignim rakom [20,21]. Med polifenoli EGCG poveča 5FU kemosenzitivnost pri kolorektalnem raku in celicah hepatocelularnega karcinoma z aktiviranjem poti AMPK in omejevanjem izvora raka [22, 23]. Poleg tega so poročali, da EGCG zavira LDHA z zatiranjem njegovega izražanja v rakavih celicah dojke in trebušne slinavke [24, 25].

V tej študiji smo domnevali, da bi CA lahko bil kandidat za adjuvantno zdravilo za zmanjšanje odpornosti na 5FU v želodčnih rakavih celicah. Ugotovljeno je bilo, da zaviralni učinek CA in/ali njegove kombinacije s 5FU na aktivnost LDHA povzroči mitohondrijske reaktivne kisikove vrste (ROS) in apoptotično celično smrt v celicah, odpornih na 5FU.

2. Rezultati

2.1. Glikolitične značilnosti celic, odpornih na 5FU

Izboljšana proliferacija je značilnost kemorezistentnosti, vključno z rakavimi celicami, odpornimi na 5FU [26, 27]. Najprej smo potrdili odpornost na 5FU in dolgoročne stopnje rasti celic SNU620 in SNU620/5FU. Ko so te celice gojili z navedenimi koncentracijami 5FU 48 ur, je bil ocenjeni odmerek, ki je povzročil 50-odstotno inhibicijo rasti (Gl50) v celicah SNU620/5FU (100,63 uM), veliko višji od tistega, ki je povzročil GIso v njegovih starševskih celicah SNU620 （28,88 μM ）（Slika 1A in dodatna slika S1）. Poleg tega so bile stopnje rasti celic SNU620/5FU hitrejše kot pri celicah SNU620 (slika 1B in dodatna slika S2). Ker bi kemorezistentnost in hitro rastoče lastnosti lahko bile povezane s povečanimi glikolitičnimi lastnostmi v želodčnih rakavih celicah [28], so bile stopnje zunajcelične zakisanosti (ECAR) in stopnje porabe kisika (OCR) izmerjene v obeh celicah v prisotnosti oksamata, dobro znanega zaviralec glikolize ali ne. Rezultati so pokazali, da celice SNU620/5FU znatno izločajo več laktata kot tistega, ki ga izločajo celice SNU620, in nato zakisajo gojišče (slika 1C in dodatna slika S3). Vendar med temi celicami niso opazili pomembne spremembe OCR (slika 1D). Izmerili smo nivoje ekspresije mRNA in beljakovin LDHA. Izražanje LDHA je bilo večje v celicah SNU620/5FU kot v celicah SNU620 (slika 1E, F). Nadalje smo pregledali ravni ekspresije mRNA in beljakovin izotipov PDK in ugotovili, da so bile ravni PDK2 in PDK3 višje v celicah SNU620/5FU kot v celicah SNU620 (dodatna slika S4A, B). Ocenjena je bila tudi fosforilacija podenote E1 piruvat dehidrogenaze (PDHA1), ki so jo povečali PDK, in ugotovili, da je višja v celicah SNU620/5FU kot v celicah SNU620 (dodatna slika S4C). Poleg tega smo uporabili oksamat kot zaviralec LDHA za premagovanje odpornosti na 5FU v celicah SNU620/5FU. Ta spojina je zavirala celično rast v celicah SNU620 in SNU620/5FU (dodatna slika S5). Poleg tega je sočasno zdravljenje z oksamatom in 5FU zaviralo rast celic v primerjavi s posameznim zdravljenjem z oksamatom ali 5FU v celicah SNU620/5FU (slika 1G). Ti podatki kažejo, da celice SNU620/5FU močno izražajo LDHA, inhibicija aktivnosti LDHA pa lahko premaga odpornost celic SNU/5FU na 5FU.

Slika 1. Glede na rezultate imajo 5-celice, odporne na fluorouracil (5FU), povečano glikolitično značilnost: celice (A)SNU620 in SNU620/5FU so bile 48 ur obdelane z navedenimi koncentracijami 5FU. Sposobnost preživetja teh celic je bila ovrednotena s testom MTT; (B) stopnje rasti celic SNU620 in SNU620/5FU so bile izmerjene vsak dan 4 dni s testom MTT; (C, D) celice SNU620 in SNU620/5FU so bile obdelane z oksamatom ( 5 mM) ali ne 24 ur, vrednosti ECAR in OCR pa so bile ovrednotene z analizatorjem Seahorse XF; (E, F) izražanje LDHA v celicah SNU620 in SNU620/5FU je bilo odkrito s qRT-PCR in Western blot analizo; (G) Celice SNU620 in SNU620/5FU so bile 48 ur obdelane z oksamatom (25 mM) in/ali 5FU（10 μM）. Rezultati so prikazani kot povprečje ± SEM.**p<0.01><><><0.01,and ##=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" ecar,="" extracellular="" acidification="" rates;="" ocr,="" oxygen="" consumption="" rates;="" ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

2.2. CA zavira aktivnost LDHA

Proizvodnja laktata je bila analizirana s CA in njegovimi derivati, vključno z EC, GC, EGC in EGCG, v celicah SNU620/5FU. V primerjavi s temi derivati ​​je CA učinkoviteje zmanjšal proizvodnjo laktata (slika 2A). Poleg tega je bila in vitro potrjena aktivnost LDHA in CA je pokazal močnejši zaviralni učinek na aktivnost LDHA kot tisti njegovih derivatov (slika 2B). Zaviralne učinke CA na aktivnosti LDHA in LDHB in vitro so merili v odvisnosti od odmerka. CA je zaviral aktivnost LDHA, ne da bi vplival na aktivnost LDHB (slika 2C, D). Poleg tega sta bili aktivnosti LDHA in LDHB izmerjeni z EGCG, za katerega je znano, da zavira aktivnost LDHA, in ugotovljeno je bilo, da se je odvisno od odmerka zmanjšal (dodatna slika S6A, B). Poleg tega so bile znotrajcelične aktivnosti LDHA in LDHB ocenjene z navedenimi koncentracijami CA v celicah SNU620/5FU. CA je in vitro zaviral aktivnost LDHA na način, ki je odvisen od odmerka, ne pa tudi aktivnosti LDHB (slika 2E, F). Ravni ekspresije beljakovin p-PDHA1, PDK2, PDK3 in LDHA so bile izmerjene tudi v celicah SNU620/5FU po zdravljenju s CA (dodatna slika S7) in opazili smo, da to zdravljenje nanje ni vplivalo. Ti rezultati kažejo, da CA uravnava aktivnost LDHA, ne da bi vplivala na njeno izražanje.

2.3. Način delovanja zaviranja LDHA s CA

Za analizo inhibicijskega mehanizma aktivnosti LDHA na CA in njegovih derivatih smo izvedli molekularno modeliranje vezne interakcije med človeškim rekombinantnim LDHA in CA (slika 3A, B). Rezultati so pokazali, da lahko CA medsebojno deluje z ostanki T94, A95, Q99, R105, S136, R168, H192 in T247 LDHA. Med njimi so R105, S136 in R168 kritični za vezavo substrata (piruvata). Tako smo domnevali, da bi CA lahko motil mesta vezave substrata. Nasprotno, EGCG je vezan na LDHA prek drugega mesta. Da bi dodatno preverili način delovanja inhibicije LDHA s CA, sta bili diagrami Michaelis-Menten in Lineweaver-Burk potrjeni z različnimi koncentracijami piruvata in CA. Aktivnost LDHA se je povečala v odvisnosti od odmerka piruvata. Vendar pa se je obrnilo s povečanjem CA. Tako so rezultati grafov Michaelis-Menten in Lineweaver-Burk pokazali, da je CA nekonkurenčni zaviralec LDHA (slika 3C, D). Poleg tega so podatki izotermalne titracijske kalorimetrije (ITC) pokazali, da se CA fizično veže na LDHA s Kd vrednost 197 uM (dodatna slika S8). Ti rezultati zagotavljajo vpogled, da CA zavira aktivnost LDHA z vezavo na mesto vezave substrata LDHA.

2.4. CA ponovno poveča odpornost na 5FU z zmanjšanjem aktivnosti LDHA

Ocenili smo citotoksične učinke CA na celice SNU620 in SNU620/5FU in ugotovili, da je CA zaviral rast v obeh skupinah celic (slika 4A). Da bi preverili, ali je bila inhibicija rasti povezana z zatiranjem aktivnosti LDHA, je bila ekspresija LDHA ukinjena s kratko ostrino ribonukleinsko kislino (shRNA) za LDHA (shLDHA) in njena ekspresija je bila obnovljena s transfekcijo plazmida, ki izraža LDHA (dodatna slika S9A, B ). V celicah SNU620/5FU, transficiranih s shLDHA, proizvodnja laktata in viabilnost celic nista bili opazno spremenjeni z zdravljenjem s CA v primerjavi z lažno transficiranimi celicami (slika 4B, C). Poleg tega je bil učinek CA na zaviranje rasti povečana z obnovitvijo ekspresije LDHA v celicah SNU620/5FU, ki jih je razbil LDHA (slika 4D). Nadalje so bile celice SNU620 in SNU620/5FU pregledane po zdravljenju s CA in 5FU posamično ali kombinacijo obeh. Sočasno zdravljenje s CA in 5FU je znatno zaviralo rast celic SNU620/5FU (slika 4E). Poleg tega so kombinirane učinke CA in 5FU raziskali v več drugih celičnih linijah, kot so celice AGS raka želodca pri ljudeh, raka trebušne slinavke Panic-1, MIA PaCa-2 in celice raka debelega črevesa LS174T in RKO, v primerjavi z celice SNU620 in SNU620/5FU. Proizvodnja laktata in izražanje LDHA sta pokazala dobro medsebojno korelacijo in te glikolitične lastnosti so relativno visoke pri SNU620/5FU, AGS in RKO (dodatna slika S10A, B). Poleg tega je kombinirano zdravljenje s CA in 5FU znatno zmanjšalo sposobnost preživetja celic v primerjavi z enim samim zdravljenjem s 5FU v glikolitičnih celicah, vključno z AGS in RKO (dodatna slika S10C). Vendar pa sočasno zdravljenje s CA in 5FU ni bistveno zaviralo rasti celic SNU620, Panic-1, MIA PaCa-2 in LS174T, ki so pokazale nizko izražanje LDHA. Ti rezultati kažejo, da bi lahko bil senzibilizirajoči učinek CA na 5FU-odporne celice povezan z njegovim zaviralnim učinkom na aktivnost LDHA.

Slika 2. Katehin (CA) zavira aktivnost LDHA, ne pa tudi njegove ekspresije: (A) proizvodnja laktata SNU620/5FU je bila izmerjena po zdravljenju z derivati ​​CA （10 µM） 24 ur; (B) aktivnost LDHA in vitro je bila ocenjena po zdravljenju z derivati ​​CA (10 uM) in oksamatom (20 mM); (C, D) in vitro so bile aktivnosti LDHA in LDHB ocenjene z navedenimi koncentracijami CA; (E, F) celice so bile 24 ur obdelane z navedenimi koncentracijami CA. Znotrajcelični aktivnosti LDHA in LDHB smo merili z uporabo celičnih lizatov kot vira encima. Rezultati so prikazani kot povprečje ± SEM. **str<0.01><0.001, compared="" to="" the="" control="" (1st=""><><0.01,and><0.001,compared to="" the="" negative="" control="" (second="" column).ldha,="" lactate="" dehydrogenase="" a;="" ldhb,="" lactate="" dehydrogenase="" b.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Slika 4. Preživetje celic je bilo zavrto s sočasnim zdravljenjem s katehinom (CA) in 5-fluorouracilom (5FU) v celicah, odpornih na 5FU: (A) preživetje celic SNU620 in SNU620/5FU je bilo ocenjeno po zdravljenju z navedenimi koncentracijami CA 48 ur;（B）SNU620/5FU-pLKO.1 in SNU620/5FU-shLDHA celice so bile 24 ur obdelane s CA（10 μM）. Proizvodnja laktata je bila izmerjena v gojiščih celic SNU620/5FU-pLKO.1 in SNU620/5FU-shLDHA; (C, D)SNU620/5FU-pLKO.1, SNU620/5FU-shLDHA, SNU620/5FU-shLDHA plus EV , in celice SNU620/5FU-shLDHA plus LDHA#2 smo 48 ur obdelali z navedenimi koncentracijami CA. Preživetje celic je bilo izmerjeno s testom MTT; (E) celice SNU620 in SNU620/5FU so bile 48 ur obdelane s CA (10 μM) in/ali 5FU (10 μM). Sposobnost preživetja teh celic smo izmerili s testom MTT. Rezultati so prikazani kot povprečje±SEM.*str<><0.01,and**><><0.05, ##=""><0.01, and="" ##t=""><0.001, compared="" with="" the="" respective="" control.="" the="" experiments="" were="" independently="" performed="" in="">

Ta članek je izvleček iz Int. J. Mol. Sci. 2021, 22, 5406. https://doi.org/10.3390/ijms22105406 https://www.mdpi.com/journal/ijms