Potencial neohesperidina proti staranju in njegovi sinergistični učinki 2. del

Prosim kontaktirajteoscar.xiao@wecistanche.comza več informacij

2.4. In vitro antioksidativna aktivnost neohesperidina je bila razmeroma šibka

Na voljo je veliko metod za merjenje in vitro antioksidativne zmogljivosti in večina raziskovalcev uporablja enega ali več testov, saj vsaka metoda meri različne antioksidativne lastnosti spojine [32]. V tej študiji smo uporabili tri metode za določanje antioksidativne sposobnosti, vključno s testi DPPH, ABTS in FRAP. Sestavljeni indeks antioksidativne moči (APCI) je bil definiran za opis in oceno celotne in vitro antioksidativne zmogljivosti testiranih spojin in njihovih kombinacij. Enačbe linearne regresije treh testov so navedene v tabeli 1. In vsi povezani podatki so bili predstavljeni v tabeli 2. Medtem je bil APCI narisan na sliki 4B. Iz teh rezultatov smo lahko videli, da ima neohesperidin relativno šibko antioksidativno zmogljivost in vitro; to je pomenilo, da funkcija podaljšanja CLS neohesperidina ni bila odvisna od njegove in vitro antioksidativne aktivnosti. Vendar pa je s sorazmerno visoko antioksidativno aktivnostjo in vitro CD BCD razširil CLS kvasovke BY4742. Na splošno ne moremo napovedati sposobnosti razširitve CLS spojine samo na podlagi njene antioksidativne aktivnosti.

A: naringin, B: hesperidin, C: hesperetin, D: neohesperidin, the concentration of A, B, Cand Dis luM. APCI=>(vsaka vrednost vzorca/največja vrednost vzorca v tej metodi)/število metod. Podatki so bili izraženi kot povprečje ± SEM (n {{0}}) in primerjani z enosmerno ANOVA Sidakovim testom večkratnih primerjav pri p < 0,05="" z="" graphpad="" prism="" 7.00.="" različne="" črke="" (a,="" b,="" c,="" d,="" e,="" f,="" g,="" h,="" i,="" j,="" k)="" za="" podatki="" označujejo="" vrednosti="" v="" istem="" stolpcu="" s="" pomembnimi="">

Za več informacij kliknite tukaj

2.5. Neohesperidin ni mogel upočasniti variacije zunajceličnega zakisljevanja kvasovk BY4742

Pomembna parametra sta sestava gojišča in pH vrednost. Dokazano je, da imata sestava rastnega medija in pH vrednost velik vpliv na CLS S.cerevisiae[33]. Učinke pH na CLS brstečih kvasovk so raziskovali s prejšnjimi študijami in rezultati kažejo na mehanizem toksičnosti ocetne kisline, povezane z indukcijo signalnih poti rasti in oksidativnim stresom v kvasovkah [34]. Da bi spoznali učinek štirih flavonoidnih spojin na variacijo zunajceličnega zakisljevanja kultur kvasovk, smo s pH metrom vsakih pet minut zaznavali pH vrednosti.Izvleček Cistanche proti sevanjuNa sliki 5 je 10 uM naringina očitno upočasnilo variacijo zunajceličnega zakisljevanja brstečih kvasovk BY4742 pri različnih stanjih staranja, medtem ko druge tri flavonoidne spojine niso bistveno vplivale na to pri enaki koncentraciji v primerjavi s kontrolnimi skupinami.

Slika 5. Različice gojišč po brstečih kvasovkah BY4742, obdelanih s štirimi flavonoidnimi spojinami pri 10 μM. Poskus je bil izveden vsaj v treh izvodih. ∶ Naringin, B: hesperidin, C: hesperetin, D: neohesperidin.

3. Razprava

Prejšnje študije so poročale, da ima neohesperidin različne funkcije, povezane s staranjem, kot so nevroprotektivni učinek [15], aktivnosti odstranjevanja ROS in protivnetne aktivnosti [35], oslabitev zmanjšanja potenciala mitohondrijske membrane in povečanje kaspaze{ {5}} aktivnost, ki jo izzove H2O2 [16], in aktivnost, ki inducira celično apoptozo [21]. Vse te funkcije so postavile dobre temelje za rezultat, da je neohesperidin povečal CLS brstečih kvasovk BY4742 tukaj. Presenetljivo je, da je neohesperidin bistveno podaljšal CLS samo pri najnižji testirani koncentraciji. Poročilo Crakerja et al. pokazala tudi nižjo koncentracijo avksina (10-6 IAA), ki spodbuja ekstruzijo protonov. Ekstruzijo protonov pod visoko koncentracijo avksina (10-4 IAA) zavira etilen, ki ga povzroči avksin [36].cistanche herbaV naši raziskavi smo preverili aktivnost neohesperidina, ki lovi ROS. In vitro antioksidativna sposobnost neohesperidina je bila relativno šibka, kar je pojasnilo, zakaj CLSextension funkcija neohesperidina ni bila odvisna od njegove in vitro antioksidativne aktivnosti. Vendar sta imeli kombinaciji CD in BCD visoko antioksidativno aktivnost in vitro in sta povečali CLS kvasovk (slika 3B). Šibko korelacijo med ROS in antioksidativno aktivnostjo lahko povzroči metoda, ki smo jo uporabili za analizo antioksidativne aktivnosti. Metoda antioksidativne aktivnosti je poskušala reagirati z dvojno vezjo pri C2-C3 in/ali hidroksilno skupino pri C3 na C obroču flajonoida. V Areias et al. rezultati močno nakazujejo, da višja antioksidativna aktivnost flavonoidov ni povezana s prisotnostjo dvojne vezi pri C 2-C3 in/ali hidroksilne skupine pri C 3 na C obroču, temveč je lahko odvisna od sposobnost zaviranja proizvodnje reaktivnih kisikovih spojin za hidrofobno interakcijo z membranami [37]. Hkrati je veliko število raziskav pokazalo, da imajo nekateri antioksidanti sicer funkcijo podaljševanja življenjske dobe, vendar so njihovi specifični mehanizmi delovanja kompleksni. Dokazano je, da samo nekateri antioksidanti izkazujejo učinke proti staranju, povezane z neposrednim odstranjevanjem prostih radikalov in ROS. Toda učinki drugih antioksidantov na podaljšanje življenja na modelne organizme niso bili omejeni na neposredno antioksidativno delovanje, ampak vključujejo tudi regulacijo izražanja genov, povezanih s stresom, in indukcijo toksičnih stimulativnih učinkov [38]. Zato je nemogoče napovedati sposobnost snovi, da podaljša CLS kvasovk na podlagi njene antioksidativne aktivnosti. Čeprav nismo testirali rezultatov pri drugih sevih, je drugim raziskovalcem in znanstvenikom ponudil informacije za potrditev rezultata pri drugih sevih in modelnih organizmih.

Cistanche lahko upočasni staranje

Številni celični procesi in zunanji dejavniki negativno vplivajo na kronološko življenjsko dobo kvasovk, vključno s srednjo zakisanjem in oksidativnim stresom [39]. Ena od zgodnjih sprememb, ki se zgodijo v celicah kvasovk, gojenih v gojiščih, ki vsebujejo 2 odstotka glukoze (dekstroze), je proizvodnja ocetne kisline in zakisanje gojišča, za kar je bilo dokazano, da vpliva na kronološko staranje [38]. Pufriranje medija na pH 6-7 preprečuje zakisanje in podaljša kronološko življenjsko dobo [10,39-41]. Poleg tega lahko Saccharomyces cerevisiae uporablja ocetno kislino za rast in presnovo kljub njeni potencialni toksičnosti [42]. 10 uM neohesperidin, hesperidin in hesperetin so ohranili trend variacije vrednosti zunajceličnih pH v primerjavi s kontrolo (slika 5). Vendar je 10 uM naringina očitno upočasnilo variacijo zunajceličnega zakisljevanja (slika 5). Pri tej koncentraciji je bila CLS kvasovke BY4742 obdelana z neohesperidinom, hesperidin in hesperetin sta bila skoraj enaka kot pri kontrolni skupini.

Povečano odstranjevanje ROS ima izrazite učinke na CLS v kvasovkah, vendar razlog ostaja nerešeno vprašanje [33]. Staranje in z njim povezane bolezni so posledica poškodb celičnih makromolekul, ki jih povzročajo prosti radikali, in njihove nezmožnosti, da uravnotežijo endogene antioksidativne obrambne mehanizme [43]. Vendar pa podatki kažejo, da ima lahko ROS tudi pozitivno vlogo pri induciranju genov za odziv na stres (hormeza) [43-46].

Poleg tega nedavne ugotovitve kažejo, da sta tudi vrsta ROS in čas njihovega pojava pomembna za podaljšanje življenjske dobe pri S.cerevisiae [47-49], kar ponazarja kompleksno vlogo ROS pri staranju kvasovk. Graziano et al. [47] so poročali, da je neohesperidin zmanjšal nastajanje ROS v človeških keratinocitih.rast penisa cistancheNohara, et al. je nedavno razkrilo, da nobiletin (eden od flavonoidov v citrusih) krepi mitohondrijsko dihanje v skeletnih mišicah za spodbujanje zdravega staranja pred presnovnimi izzivi. Proizvodnja ROS je bila znatno zavrta z zdravljenjem z nobiletinom na način, odvisen od odmerka [50]. Sliki 3B in 4A sta pokazali, da sta D in CD povečala CLS kvasovke BY4742 in zmanjšala znotrajcelično vsebnost ROS. Toda za ABD in BCD so podaljšali CLS, medtem ko so povečali znotrajcelični ROS. Ta rezultat je bil skladen z Wujevim 51]. Torej ni bilo določene pozitivne ali negativne povezave med aktivnostmi ROS pri odstranjevanju spojin in njihovimi učinki na življenjsko dobo, kar je bilo tudi v skladu z zapleteno vlogo ROS pri staranju kvasovk.

Na sliki 3A se stopnje preživetja kvasovk BY4742 pri zdravljenju z različnimi spojinami in njihovimi kombinacijami od 2. do 20. dne niso postopoma zmanjševale. Predstavljajo dvojne vrhove. To je mogoče najti tudi v rezultatu Wu et al. (2014). Prvih nekaj dni so bile stopnje preživetja relativno visoke. To je mogoče razložiti z dovolj hranilnimi snovmi in nizkim pritiskom preživetja v tem času. Sčasoma so se za zelo kratek čas pojavile dolinske točke, saj je bilo prehrane manj. Nato so se spet pojavili vrhovi. Ta pojav bi lahko pripisal uspeh presnovi drugega hranila, ki je ublažilo pritisk na preživetje.

Tiho al. [36] so poročali, da je bila antioksidativna aktivnost kombinacije mešanice antioksidantov/spojine učinkovitejša od ene same spojine. V našem poskusu so imele kombinacije AB, AC, CD, ABC in BCD močnejšo antioksidativno sposobnost kot katera koli posamezna snov, ki jim ustreza.koristi cistanche salsaNa podlagi naših opazovanj je mogoče sklepati, da lahko flavonoidi, prisotni v mešanici, medsebojno delujejo, njihove interakcije pa lahko vplivajo na skupno antioksidativno zmogljivost raztopine (slika 4B). Čeprav smo dokazali, da štiri interakcije flavonoidov sprožijo sinergistične ali antagonistične učinke za antioksidativno moč, obstajajo druge kombinacije flavonoidov, ki zahtevajo podrobnejšo študijo, da bi bolje razumeli mehanizme, vključene v te interakcije. Lutchman et al. [52] so poročali o rastlinskih izvlečkih, ki so povečali CLS kvasovk. In avtofagija, ki jo spodbuja zmanjšano signaliziranje TORC1, je ključnega pomena za dolg CLS [10]. S sklicevanjem na te študije lahko raziščemo način, kako spojine izvajajo svoj učinek v prihodnjih študijah.

4. Materiali in metode

4.1.Materiali

Divji tip S. cerevisiae BY4742(ATCC⑧,201389TM)(Mata his3A1 leu2△0 lys2A0 ura3A0) je bil pridobljen iz ameriške zbirke tipskih kultur (Manassas, VA, ZDA). Kulturo referenčnega seva kvasovk smo alikvotirali v 10 uL in shranili pri -80 stopinjah. Vse L-aminokisline, dušikova baza kvasa brez aminokislin (YNB), amonijev sulfat, pepton, agar in ekstrakt kvasa, H2DCFDA, 2,4,6-tripiridil-s-triazin (TPTZ),2, 2'-in-bis(3-etilbenzotiazolin-6-sulfonska kislina)(ABTS),1,1-difenil-2-pikrilhidrazil(DPPH), dimetil sulfoksid (DMSO), neohesperidin , naringin, hesperidin in hesperetin so bili kupljeni pri Sigma-Aldrich (Šanghaj, Kitajska). YPDBroth, YPD in druge kemikalije so bile iz Solebo Biotech Co., Ltd. (Peking, Kitajska). 96-Polistirenske mikroplošče z vdolbinicami z ravnim dnom so bile kupljene pri Corning Incorporated (Kennebunk, ME, ZDA).

4.2. Življenjska doba in Grozoth test celic kvasovk

Določitev kronološke življenjske dobe (CLS) kvasovk je bila izvedena po metodi Wu et al. [25] z zmerno spremembo, kot sledi. Na kratko, celice kvasovk so bile pripravljene s prenosom progastega seva iz zamrznjenih surovin na plošče z agarjem YPD (0.5 odstotkov ekstrakta kvasa/1 odstotek peptona/2 odstotka dekstroze/1,4 odstotka agarja). Po 2-dnevni inkubaciji celic pri 30 stopinjah smo pobrali eno kolonijo in jo cepili v 1.{{10}}mL tekoče gojišče YPD (1 odstotek ekstrakta kvasa/2 odstotka peptona /2 odstotka dekstroze) v 10-mL sterilizirani centrifugalni epruveti (okroglo dno) in gojimo pri 30 stopinjah 2 dni v ravnem inkubatorju pri 200 pm. 2--dnevno kulturo YPD smo razredčili z avtoklavirano vodo stopnje Milli-Q 18 Qm (1:10) in shranili v hladilniku pri 4 stopinjah 2 dni. Po 2-dnevni inkubaciji pri 4 stopinjah ,5 μL (≈1 × 10* celic) razredčene kulture smo prenesli v 993 mikrolitrov sintetično definiranega (SD) medija (dodatna tabela S1, [51]) in vzdrževali pri 30 stopinjah, 200 obratih na minuto za celoten poskus. Spojine v DMSO z več koncentracijami （2,0 μL） so bile dodane ob začetni inokulaciji （0 h）. Vsak poskus je bil izveden vsaj v treh izvodih. Celične kulture so bile inkubirane pri 30 stopinjah brez zamenjave medija za staranje med poskusom. Po 2 dneh gojenja v mediju za staranje so celice dosegle stacionarno fazo in nato je bila vzeta prva starostna točka. Naslednje starostne točke so bile vzete vsakih 2-4 dni. Za vsako starostno točko je bilo v vsako vdolbino 96-mikroplošče z ravnim dnom pipetirano 5,0 μL mešane kulture. V vsako vdolbinico smo nato dodali 95 mikrolitrov medija YPD. Celično populacijo smo spremljali z bralnikom mikroplošč (Varioskan Flash; Thermo Scientific, Waltham MA, ZDA) s snemanjem OD660 vsakih 10 minut 24 ur.

Stopnja preživetja je bila izračunana na naslednji način[25]. Pri čemer je tOD=0.3,2day čas, ko vrednost OD starostne točke 2. dne doseže 0.3 v krivuljah rasti. Začetna starostna točka (2. dan) je opredeljena kot 100-odstotna sposobnost preživetja, relativni odstotek preživetja vsake naslednje starostne točke pa se lahko izračuna na naslednji način:

Integral preživetja (Sl) za vsako vdolbino je opredeljen kot površina pod krivuljo preživetja (AUC) in se lahko oceni s formulo:

kjer je dan starostna točka, na primer dnevi2,4,6,8,10,12,14,16,18in20.

4.3. Intracelularni testi sposobnosti odstranjevanja ROS

Za kvantifikacijo ravni znotrajceličnih reaktivnih kisikovih vrst (ROS) celic kvasovk, gojenih v standardnem mediju SD z/brez štirih spojin, je metoda, opisana v Wu et al. [51] je bilo navedeno. Namreč, 2 μL ROS sonde H2DCFDA iz sveže 5-mM osnovne raztopine v DMSO smo dodali v 1.0 mL kulturo staranja kvasovk (2. dan) pri 3{{10 }} stopinj za 1 uro. Kulturo smo nato dvakrat sprali v sterilni destilirani vodi in suspendirali v 1,0 ml 50 mM Tris/Cl pufra (pH 7,5). Dodali smo 20 mikrolitrov kloroforma in 10 μL 0,1-odstotnega （w/o）natrijevega dodecil sulfata （SDS） in celice inkubirali pri 200 obratih na minuto 30 minut, da je barvilo lahko difundiralo. Kulturo smo centrifugirali pri 5000 obratih na minuto 5 minut in izmerili fluorescenco supernatanta z uporabo bralnika mikroplošč z vzbujanjem pri 480 nm in emisijo pri 520 nm.

4.4. Test antioksidativne aktivnosti

V tej študiji so bili za oceno antioksidativne sposobnosti in vitro uporabljeni testi DPPH, FRAP in ABTS. Test DPPH je bil izveden v skladu z metodo, ki so jo opisali Barreca et al [53]. Alikvot vsakega vzorca (0,5 mL) smo zmešali s 75 uM (3,5 mL) DPPH v metanolu do končne prostornine 4.0 mL po reakciji 30 min brez svetlobe smo zaznali absorpcijo zmesi pri valovni dolžini 517 nm. Odstotek inhibicije aktivnosti lovljenja radikalov je bila vrednost DPPH. Test FRAP je bil izveden v skladu s Hungerjem et al. [54] z nekaj spremembami. Alikvot 0.2 ml vzorca smo zmešali s 3,8 ml reagenta FRAP (0.3 mol/L acetatni pufer (pH3.6), 10 mmol/L TPTZ raztopino in zmešali 20 mmol/L železovega klorida (FeCl3) (10:1:1, prostorninsko razmerje)). Po 30 minutah smo zaznali absorbanco pri valovni dolžini 593 nm. In test ABTS je sledil metodi Mnb et al. [55] z nekaj spremembami. Radikalni kation ABTS (ABTS· plus) je nastal z reakcijo 176 μl raztopine kalijevega persulfata (140 mM) in 10 ml vodne raztopine ABTS (7 mM) v pogojih brez svetlobe 12-16 h. Nato smo ga razredčili z metanolom do absorpcijske vrednosti 0,7±0,02 enot pri 734 nm. 0,1 ml vzorca smo dodali 4,9 ml reagenta ABTS.cistanche tubulosa doziranje redditAbsorbanco smo izmerili pri valovni dolžini 734 nm po 10 minutah reakcije. Vse vrednosti absorbance so bile določene z uporabo spektrofotometra UV-VIS (PerkinElmer Lambda 25 UV/VIS, Waltham, MA, ZDA). Vrednosti antioksidantov so bile izračunane z metodo standardne krivulje in izražene kot Trolox ekvivalenti (TE mg/g DW).

4.5. Odkrivanje zunajceličnega pH

Postopek gojenja kvasovk v zgodnji fazi je bil skoraj enak metodi, opisani v delu "Preskus življenjske dobe in rasti celic kvasovk". Konkretna operacija je bila naslednja. Celice kvasovk smo pripravili s prenosom seva kvasovk iz zamrznjenih surovin na plošče z agarjem YPD. Po inkubaciji celic pri 30 stopinjah 2 dni smo eno kolonijo pobrali in cepili v 1.0-mL tekoče gojišče YPD v 10-mL sterilizirani centrifugalni epruveti in gojili pri 30 stopinje 2 dni v ravnem inkubatorju pri 200 pm. 2--dnevno kulturo YPD smo razredčili z avtoklavirano vodo Milli-Qgrade 18 mΩ（1∶10） in shranili v hladilniku pri 4 stopinjah 2 dni. Po 2-dnevni inkubaciji pri 4 stopinjah je bilo 10 μL（~2 × 104 celic） razredčene kulture preneseno v 1986 μL medija SD in vzdrževano pri 30 stopinjah, 200 obratih na minuto 2/10/20 dni. Različne spojine v DMSO（4,0 μL） so bile dodane mediju do končne koncentracije 10 μM ob začetni inokulaciji (0 h）). Nato smo 1 mL 2/10/20-dnevne kulture SD dodali 19 mL svežega tekočega medija YPD. pH smo testirali vsakih pet minut s pH metrom, medtem ko smo kvas gojili pri 30 stopinjah C v stresalniku pri 200 obratih na minuto za celotno detekcijo. Vsak poskus je bil izveden vsaj v treh izvodih.

4.6. Analiza podatkov

Neobdelani podatki iz bralnika mikroplošč so bili izvoženi v Microsoft Excel 2007 (Redmond, WA, ZDA). Iz krivulj rasti je mogoče pridobiti sposobnost preživetja kvasovk v skladu s prejšnjim poročilom [25]. Integral preživetja [56] vsake starajoče se kulture je bil opredeljen kot površina pod krivuljami preživetja [25,57]. Podatki so bili analizirani z enosmerno analizo variance (enosmerna ANOVA) in so bili izraženi kot srednje vrednosti ± standardna napaka povprečja (SEM). Pomen razlike (* str<><0.01;***><0.001;*><0.0001) was="" determined="" using="" sidak's="" multiple="" comparisons="" test.="" graphpad="" prism="" 7(graphpad="" software,="" inc.,="" la="" jolla,="" ca,="" usa)was="" used="" for="" the="">

5. Sklepi

Za zaključek je neohesperidin z relativno visoko zmogljivostjo odstranjevanja znotrajceličnega ROS pokazal velik potencial pri razširitvi CLS brstečih kvasovk BY4742 posamično ali sinergistično s hesperetinom. To bi lahko vodilo do novih izbir za zdravljenje težav s staranjem, saj je obstajalo omejeno razmerje med CLS-podaljškom kvasovk in testiranimi indeksi (npr. sposobnost odstranjevanja ROS, in vitro antioksidativna aktivnost in zunajcelični pH). Nadaljnje študije za odkrivanje molekularnih mehanizmov tega pojava bodo izjemno koristne za preprečevanje staranja. Zaradi tega se moramo pri oblikovanju novih prehranskih dopolnil ali funkcionalnih živil zavedati pomena izbire najboljše kombinacije flavonoidov.

Ta članek je izvleček iz Molecules 2019, 24, 4093; doi:10.3390/molecules24224093 www.mdpi.com/journal/molecules