Cirkadijska ura uravnava ritmično izražanje eritropoetina v mišji ledvici

Za več informacij:ali.ma@wecistanche.com

Lina K. Sciesielsk idr

Cistanche tubulosa preprečuje ledvično bolezen, kliknite tukaj za pridobitevizdelki in Cistanče

Generiranje cirkadianih ritmov je celično avtonomno in temelji na povratni zanki transkripcije/prevajanja, ki jo nadzira družina aktivatorjev faktorja transkripcije cirkadiane ure, vključno s CLOCK, BMAL1 in represorji, kot sta CRY1 in CRY2. Namen te študije je bil preučiti molekularni mehanizem in hemopoetske posledice cirkadianega izražanja eritropoetina. Za pojasnitev cirkadiane regulacije eritropoetina so bile uporabljene mutantne miši s homozigotno delecijo glavnih genov cirkadiane ure kriptokroma 1 in 2 (Cry-null). Kontrolne miši divjega tipa so pokazale pomembno razliko vledvicaizražanje mRNA eritropoetina med cirkadianimi časi 06 in 18. Vzporedno je bilo znatno večje število celic, ki proizvajajo eritropoetin, vledvica(z RNAscope) in znatno višje ravni krožečega proteina eritropoetina (z ELISA) so bile odkrite cirkadiani čas 18. Takšne spremembe so bile odpravljene pri Cry-null miših in so bile neodvisne od napetosti kisika, nasičenosti s kisikom ali izražanja faktorja 2alfa, ki ga povzroči hipoksija, kar kaže na da cirkadiano izražanje eritropoetina transkripcijsko regulirata CRY1 in CRY2. Testi reporterskih genov so pokazali, da heterodimer CLOCK/BMAL1 aktivira element E-box v 5' promotorju eritropoetina. RNAscope in situ hibridizacija je potrdila prisotnost Bmal1 v celicah, ki proizvajajo eritropoetin.ledvica. Pri Cry-null miših so ugotovili bistveno zmanjšano število retikulocitov, medtem ko sta bila števila eritrocitov in hematokrit nespremenjena. Tako cirkadiana regulacija eritropoetina pri normoksičnih odraslih mišihledvicaje transkripcijsko nadzorovan z glavnimi cirkadianimi aktivatorji CLOCK/BMAL1 in represorji CRY1/CRY2. Ta ugotovitev lahko vpliva nafiziologija ledvicin bolezni, laboratorijska diagnostika in zdravljenje anemije.

KLJUČNE BESEDE:kronobiologija; cirkadiani ritem; ura; kriptokrom; eritropoetin; hematopoeza; dejavnik, ki povzroča hipoksijo

Translacijska izjava Molekularne ure v skoraj vseh vrstah celic poganjajo transkripcijo genov v sodelovanju s tkivno specifičnimi dejavniki. Do sedaj so bili cirkadiani oscilacijski mehanizmi vledvicaniso bili povezani z biologijo eritropoetina (Epo). Tu je bilo razjasnjeno, da cirkadiano izražanje Epo uravnavajo proteini glavne ure (kriptokroma 1 in 2, Clock in Bmal1). Ker EPO izrazito deluje znotraj kompleksne regulativne mreže eritropoeze, je optimalna uporaba rekombinantnega humanega EPO pri bolnikih zledvicanezadostnost lahko vključuje njegovo uporabo tik pred fiziološkim cirkadianim maksimumom okoli polnoči.

Cirkadiani ritmi v nefrologiji so večinoma neraziskani, a zelo pomembni, ker je njihova motnja zaradi izmenskega dela, izbire življenjskega sloga in staranja povezana s povečanim tveganjem za različne bolezni, vključno s kardiovaskularnimi motnjami.^1–4Živalski modeli motene cirkadiane ure zagotavljajo prve dokaze o negativnem vplivu cirkadiane disregulacije na hematopoetski sistem (npr. s povečanim številom starih eritrocitov).^5,6

Kar zadeva eritropoezo, so še posebej zanimivi ne le celični učinki, ampak tudi ritmičnost njenega primarnega regulatorja, eritropoetina (Epo), ker so bili športniki večkrat obtoženi krvnega dopinga z rekombinantnim človeškim Epo (who) zaradi razlik v količini, odvisnih od časa dneva. koncentracije Epo v obtoku in hematološki parametri. 7,8 Dnevne spremembe ravni Epo (S-Epo) v človeškem serumu so bile prvič opisane leta 1981 pri bolnikih s kronično boleznijo dihal pljuč in premogovnikov,⁹in nato pri zdravih osebah.^10,11Do danes več poročil kaže na visoke ravni S-Epo ponoči (od 20.00 do 4.00) in nizke ravni S-Epo zgodaj zjutraj (od 4.00 do 8.00). Faza in amplituda nihanj S-Epo, če so sploh prisotne, sta različni med posamezniki.^9,10,12,13V povprečju so se ravni S-Epo spremenile približno 1.5-krat glede na njihov minimum.^14–22Pokazalo se je, da na ta dnevni ritem ne vplivajo staranje,20 trening,16 ali izpostavljenost nadmorski višini.17 Nasprotno pa je dnevno nihanje S-Epo odpravljeno pri bolnikih s kronično obstruktivno pljučno boleznijo, zapleteno zaradi dnevne hipoksemije, pri mielomu z odpovedjo ledvic in pri mielodisplaziji.^15,21,23

Leta 2009 smo opisali cirkadiano izražanje mRNA Epo v mišji ledvici v obsežni analizi promotorjev genov, nadzorovanih z uro, vendar nismo mogli identificirati niti posebnega genetskega elementa v genu EPO niti transaktivacijskega faktorja, odgovornega za cirkadiano nihanje. 24 Nedavno je podganji model hemoragičnega šoka glede na vzporedne vzorce ekspresije nakazal, da sta geni ure (Bmal1 in Per2) vključena v regulacijo izločanja EPO med hipoksijo/ishemijo.²⁵

Generiranje cirkadianih ritmov je celično avtonomno in temelji na povratni zanki transkripcija-prevajanje, ki jo nadzira družina transkripcijskih faktorjev cirkadiane ure, vključno s CLOCK, BMAL1, PER1, PER2, CRY1 in CRY2.26 Heterodimer CLOCK/BMAL1 aktivira transkripcijo genov cirkadiane ure PER1/2 in CRY1/2 preko vezave na elemente E box v njihovih promotorjih. Proteina PER in CRY pa zagotavljata negativno povratno informacijo z zaviranjem aktivnosti CLOCK/BMAL1 in s tem zmanjšata lastno izražanje. Neto rezultati vodijo do vzorcev nihanja cirkadianega izražanja genov in ritmičnih sprememb v celični in organski fiziologiji.²⁷

Da bi razumeli posledice biološke ure, so do sedaj preučevali različne vrste mutantnih miši z motenimi ali abliranimi transkripcijskimi faktorji enojedrne ure. 28, 29 Tu smo izkoristili dvojni mutant Cry1–/–/Cry2–/– miši (Cry-null), ki nimajo sposobnosti izražanja endogenih cirkadianih ritmov.^26,30Kombinirani podatki in vivo in in vitro kažejo, da Cry1/2 uravnava cirkadiano izražanje Epo prek CLOCK/BMAL1-inducirane transkripcije v normoksični ledvici.

METODE

Poskusi na živalih

Homozigotne živali Cry1–/– /Cry2–/– (Cry-null; samci in samice; temelji na C57BL/6J)31 in kontrole divjega tipa (WT) so bile vzrejene (For-schungseinrichtungen für Experimentelle Medizin Charité) in vzrejene 5 let. do 7 mesecev. Miši WT so prišle iz vzreje kolonije Cry-null.

Genotip Cry-null je bil potrjen z verižno reakcijo s polimerazo (dodatna tabela S1). Za umik so bile miši nameščene v skupinah in so imele hrano in vodo ad libitum v 12-ur:12-urnem ciklu svetloba/tema 14 dni. Drugi dan po izpustitvi v stalno temo so bile živali žrtvovane v cirkadianem času (CT) 06 ali 18 (n=13–15 za vsako skupino in časovno točko). Tkiva (jetrna in ledvična) so bila hitro pridobljena in na hitro zamrznjena v tekočem dušiku. Podskupino samcev in samic WT in Cry-null živali smo podrobno analizirali glede telesne teže in diferencialnega hemograma.

Za plinsko analizo krvi so bile živali anestezirane (fentanil, {{0}}.075 mg/kg, midazolam, 1,5 mg/kg in medetomidin, 0,75 mg/kg), traheotomirane, intubirane in ventilirane (plimovanje prostornina 9 ml/kg; hitrost dihanja 160 min- 1; pozitiven tlak ob koncu izdiha, 2 cm H2O), kot je opisano.32 Polietilenski kateter je bil kirurško uveden v levo karotidno arterijo. Po 5 minutah stabilizacije smo poskus zaključili s hitro eksangvinacijo preko karotidnega katetra, analizirali krvne pline (ABL-800; radiometer; nadzorovana temperatura) in izrezali ledvice za post hoc analize.

Vse postopke je odobril lokalni odbor za varstvo živali (T0307/08; G0100/17 z dodatkom od januarja 2021) in izvedeni v skladu s smernicami in predpisi nemškega zakona o zaščiti živali.

Priprava RNA in kvantitativna analiza verižne reakcije s polimerazo

Celotno RNA smo ekstrahirali, kot je opisano.33 Skupno 1000 ng celotne RNA smo reverzno prepisali z reverzno transkriptazo SuperScript III (Thermo Fisher; št. 18080085) in naključnimi heksameri (Thermo Fisher; št. SO142) v skladu z navodili proizvajalca. Kvantitativne verižne reakcije polimeraze so bile izvedene na ciklerju StepOnePlus (Life Technologies) s primerji, ki zajemajo intron, ali testi TaqMan (dodatna tabela S2). Absolutno kvantifikacijo mRNA smo dosegli s primerjavo s standardno krivuljo iz serijskih razredčitev šablone verižne reakcije s polimerazo.

Odkrivanje ekspresije mRNA Epo v ledvicah s tehniko RNAscope

Test RNAscope je bil izveden v skladu s protokoli proizvajalca (ACD; tehnična opomba 320536). 10- mm srednje prečne kriosekcije ledvice so bile obarvane s sondo C1 proti DapB (negativna kontrola; ACD; št. 310043) ali Epo (ACD; št. 315501). Hibridizacijski koraki z uporabo Amp 4-6 in zaznavanje rdečih signalov so bili izpuščeni. Dva neodvisna, zaslepljena raziskovalca sta štela Epo pozitivne celice pri prvotni povečavi 200 na 3 do 8 kriosekcijah na žival v slikovnem sistemu Axioplan 2 (Zeiss).

Reprezentativne slike kvantifikacije Epo in dvojno fluorescentno barvanje so izvedli z uporabo kompleta RNAscope Multiplex FluorescentDetection Reagent V2 (ACD; št. 323110) v skladu s protokoli proizvajalca. 15-mm srednji prečni pararezi ledvic so bili obarvani s sondo C1 proti Bmal1 (ACD; št. 438741) in sondo C2 proti Epo (ACD; št. 315501-C2). Opaleye 520 (Akoya BioSciences; št. FP1487001KT) je bilo uporabljeno s sondo C1, opalno barvilo 650 (Akoya BioSciences; št. FP1496001KT) pa je bilo uporabljeno s sondo C2. Pri prvotni povečavi - 400 so bile Epo pozitivne celice slikane za kolokalizacijo Bmal1 na sistemu Eclipse Ti2imaging (Nikon). 40,6-diamidino-2-fenilindol je bil uporabljen kot protibarvanje.

Serumske koncentracije EPO

Vzorce krvi smo pustili strjevati 1 uro pri sobni temperaturi, preden smo jih centrifugirali 20 minut pri 2000 - g. Serum smo odstranili in takoj zamrznili pri –80 C do izvedbe encimsko vezanega imunskega testa za Epo (Quantikine; R&D Systems; št. MEP006) z nerazredčenimi vzorci. Absorbanco smo odčitali z čitalnikom absorpcije mikroplošč iMARK (Bio-Rad) pri 450 nm, s korekcijo valovne dolžine pri 570 nm in 4-standardno krivuljo, ki ustreza parametrom, kot je opisano prej.³³

Število krvnih celic

skupno število in število diferenciranih celic iz antikoagulirane krvi z EDTA je izmeril Synlab. vet Berlin z avtomatskim števcem celic ADVIA2120i (Siemens) za mišjo kri.

Testi reporterskih genov

Ledvične celice človeškega zarodka 293 (DSMZ; št. ACC305; številke prehodov 3–10; mikoplazma negativne) so bile gojene v Dulbeccovem modificiranem Eagleovem mediju/Ham F12 (Biochrom; št. FG4815), dopolnjenem z 10 odstotki fetalnega govejega seruma (Merck; št. F7524). Transfekcijo celic so izvedli v 12-ploščah z vdolbinicami, ki so vsebovale 1.67 - 105 celic/vdolbinico. Vsaka vdolbinica je bila transfektirana s 333 ng plazmidne DNA (od tega je bil 1 od 10 vaniljev konstrukt) in 1 ml transfekcijskega reagenta Fugene 6 (Promega; št. E2691), kot je opisano.34 Vsi uporabljeni konstrukti so navedeni v dodatni tabeli S3. Celice smo lizirali 48 ur po transfekciji s pufrom za pasivno lizo (Promega; št. E1941). Luciferazno aktivnost smo določili s kompletoma Beetle-Juice in Renilla-Juice (oba pjk GmbH; št. 102511/102531) na luminometru Lumat LB9501. Vsak poskus je bil izveden v tehničnih dvojnikih, za izračune pa so bile uporabljene srednje vrednosti.

Statistična analiza

In all animals, the circadian gene expression was analyzed; 2 animals were excluded as they showed outlier values (>1.5-fold the interquartile range) v 4 od 6 cirkadiano izraženih genov. Podatki so bili analizirani z uporabo IBM SPSS Statistics 27 in so predstavljeni kot posamezne pike z mediano ali kot stolpci s povprečjem in SD. Izveden je bil Mann-Whitneyjev U test ali Kruskal-Wallisov z Bonferronijevim post hoc testom.

REZULTATI

Ablacija cirkadianega izražanja Epo pri Cry-null miših

Da bi razjasnili molekularni mehanizem cirkadiane regulacije Epo, smo analizirali ekspresijo mRNA in beljakovin Epo pri WT in Cry-null mutantnih miših. V ledvicah WT so kanonični urni geni pokazali izražanje, odvisno od časa dneva, medtem ko je bilo to odpravljeno pri Cry-null miših, kot je bilo pričakovano (dodatna slika S1). Prej smo poročali o cirkadianem nihanju ekspresije mRNA Epo v 24 urah za ledvice odraslih mišjih WT. 24 Če se zdaj osredotočimo na minimalne in maksimalne vrednosti, smo opazili pomembno, w9--kratno razliko med CT06 (obdobje spanja pri miših; pričakovani minimum ) in CT18 (faza aktivnosti; pričakovani maksimum; slika 1a). V ledvicah Cry-null miši pa niso odkrili pomembne razlike v ekspresiji mRNA Epo v ledvicah. Predvsem pri Cry-null miših so bile absolutne količine ledvičnih ravni transkriptov Epo v obeh časih med srednjimi ravnmi mRNA WT Epo pri CT06 in CT18 (slika 1a). EPO mRNA v ustreznih jetrih je bila pod mejo detekcije (podatki niso prikazani).

Dnevne spremembe serumskih koncentracij Epo

Da bi ocenili prevod cirkadiane ekspresije mRNA Epo v krožeči protein Epo, smo analizirali vzorce seruma z encimsko imunskim testom. Pred vzorci organov so bili odvzeti vzorci krvi. Serumski Epo se je povečal w2.3--krat med CT06 in CT18 pri miših WT, vendar je bila ta razlika odpravljena pri miših Cry-null (slika 1b). Predvsem so bile mediane koncentracije S-Epo, povprečene skozi čas (CT06 in CT18), podobne pri miših WT in Cry-null (22 mU/ml [razpon, 3–59 mU/ml] v primerjavi z 21 mU/ml [razpon, 7 –50 mU/ml]).

Izražanje cirkadianega Epo v povezavi s parametri arterijske krvi in ​​pulzno oksimetrijo

Da bi raziskali, ali bi morebitne dnevne spremembe ravni kisika v krvi in ​​tkivu lahko povzročile cirkadiano nihanje izražanja Epo, so bili pridobljeni vzorci arterijske krvi in ​​izvedene analize krvnih plinov pri anesteziranih, traheotomiziranih in mehansko ventiliranih miših Cry-null in WT pri CT06 ali CT18, ki ustrezata najnižji oziroma najvišji cirkadiani ravni mRNA Epo (slika 1a). Nismo zaznali niti pomembnih razlik v arterijskem pH, delnem tlaku CO2 ali delnem tlaku O2 niti v standardnem presežku baze ali koncentracijah laktata (slika 2a–e) med mišmi CT06 in CT18 ali WT in Cry-null. Tudi ravni nasičenosti s kisikom, izmerjene s pulzno oksimetrijo, niso pokazale razlik (slika 2f). Genska ekspresija glavnega regulatorja hipoksije inducibilnega faktorja EPO (HIF) 2a se ni razlikovala med CT06 in CT18, niti pri WT ali Cry-null miših (slika 3). Tako v normoksičnih pogojih cirkadiane regulacije Epo ne povzročajo spremembe v napetosti kisika.

Cirkadian vklop-izklop izražanja Epo v ledvičnih celicah, ki proizvajajo Epo

Da bi preučili, ali je cirkadiana ekspresija Epo mRNA posredovana z vklopom dodatnih ledvičnih celic, ki proizvajajo Epo (REPC), ali samo s povečanjem ekspresije Epo na celico, je bila hibridizacija RNAscope in situ uporabljena na srednjih prečnih odsekih ledvic (primer v dodatni sliki S2). Pri miših WT se je število REPC znatno povečalo med CT06 (mediana, 5; razpon, 0–25) in CT18 (mediana, 22; razpon, 5–82; 4.{{ 11}}krat; P=0,010). V nasprotju s tem so Cry-null ledvice pokazale podobno število REPC pri CT06 (mediana, 18; razpon, 2–33) in CT18 (mediana, 15; razpon, 4–87; ni pomembno; slika 1c). Menili smo, da Cry-null miši kažejo omejitev rasti zaradi oslabljenega signaliziranja insulinu podobnega rastnega faktorja 1 (IGF1), kar ima za posledico stalno naraščajočo razliko v telesni teži in velikosti organov med Cry-null in WT mišmi.30 Kot smo uporabili pri relativno mladih živalih je bila absolutna teža ledvic Cry-null miši le malo nižja kot pri WT miših (–12 odstotkov pri Cry-null miših), vendar se relativno razmerje med ledvicami in telesno težo ni razlikovalo (dodatna slika S3) . Tako se zdi, da je cirkadiano povečanje ekspresije mRNA Epo regulirano z vklopom dodatnih REPC.

Aktivacija minimalnega promotorja EPO s CLOCK/BMAL1

Za identifikacijo regulatornih sekvenc, ki so odgovorne za cirkadiano izražanje Epo (slika 4a), so bile izvedene analize reporterskega gena luciferaze v celicah 293 ledvic človeških zarodkov. Celična linija ledvice 293 človeškega zarodka ni bila izbrana zaradi ledvičnega izvora, ampak zaradi pomanjkanja endogene cirkadiane ure. Tako bi lahko stimulativni učinek CLOCK/BMAL1 preizkusili v nizkem, nenihajočem ozadju CLOCK/BMAL1. Prekomerna ekspresija CLOCK/BMAL1 je znatno stimulirala aktivnost minimalnega človeškega promotorja EPO (slika 4b, I proti II). Če je motiv E-boxa (–36 do –31 bp glede na začetno mesto transkripcije) mutiran,35 je ta učinek oslabljen (slika 4b, III).

Da bi preučili, ali je opazovana cirkadiana regulacija odvisna od tipa celice, smo pregledali več celičnih linij, ki izražajo EPO, za aktivnost endogene ure s spremljanjem oscilacij, posredovanih s promotorjem Bmal1, reporterja luciferaze. Tiste z endogenim ritmom so vključevale celice HEP3B, pridobljene iz človeškega hepatoma, celice KELLY, pridobljene iz človeškega nevroblastoma, in celice mišjih ledvic PDGFRbþ (prej EPO, ki izraža mišjo celično linijo FAIK1-10).36,37 Med 3 celičnimi linijami je samo Celice KELLY so pokazale oscilacije luciferaze, ki jih poganja promotor EPO (dodatna slika S4A). Čeprav so celice PDGFRbþ pokazale močan cirkadiani ritem aktivnosti promotorja Bmal1, nismo odkrili oscilacij, posredovanih s promotorjem EPO, kar kaže na nižjo amplitudo reporterskega konstrukta, ki ga poganja promotor EPO (dodatna slika S4B).

Kolokalizacija Bmal1 in Epo v ledvicah miši Cry-null v primerjavi z WT

Za nadaljnjo razjasnitev (i) cirkadiane regulacije ledvične proizvodnje Epo z rekrutiranjem ledvičnih celic, ki proizvajajo Epo, in (ii) kolokalizacijo ekspresije Bmal1 in Epo, smo izvedli hibridizacijo RNAscope in situ. Epo in Bmal1 sta kolokalizirana, mikroskopija pri majhni povečavi pa predstavlja razlike v pridobivanju REPC (slika 5), ​​kot je kvantificirano na sliki 1c.

Hematološke ugotovitve pri pomanjkanju Cry1/Cry2 Za oceno (i) hematopoetskih učinkov pomanjkanja cirkadianega izražanja Epo in (ii) možnih drugih hematoloških nepravilnosti pri miših brez funkcionalne ure so analizirali število krvnih celic. Razlike v času dneva v ekspresiji mRNA Epo in koncentraciji S-Epo se niso odražale v pomembnih razlikah v številu perifernih retikulocitov pri CT06 v primerjavi s CT18 pri miših WT. Število retikulocitov pa je bilo bistveno nižje pri CT06 in CT18 pri živalih Cry-null v primerjavi z mišmi WT (slika 6a). Ni bilo pomembne razlike v številu eritrocitov ali vrednostih hematokrita pri miših WT v primerjavi z mišmi Cry-null. Oba parametra pa se nista razlikovala med CT06 in CT18 v obeh sevih (slika 6b in c) in nista ustrezala nižjemu številu perifernih retikulocitov pri miših Cry-null (slika 6a). Da bi preverili, ali so prehranske pomanjkljivosti (npr. železa in folata) zaradi oslabljenega signaliziranja IGF1 vključene v neskladje med zmanjšanim številom retikulocitov in normalnim številom eritrocitov pri Cry-null miših, so analizirali velikost in obliko rdečih krvnih celic, vendar niso pokazale nobenih pomembnih razlik med mišmi Cry-null in WT (dodatna slika S5).

Predvsem je bilo mediano število trombocitov pri miših Cry-null običajno višje kot pri miših WT, vendar se število trombocitov med CT06 in CT18 v obeh sevih ni bistveno razlikovalo (slika 6d). V nasprotju s tem se je število belih krvnih celic (WBC) bistveno razlikovalo med CT06 in CT18 pri WT, ne pa tudi pri Cry-null miših. Mediano število WBC pri miših Cry-null je bilo podobno visoko kot pri miših WT pri CT06 (slika 6e).

DISKUSIJA

Tukaj dokazujemo, da je cirkadiana ekspresija Epo regulirana na transkripcijski ravni. Analiza koncentracij Epo mRNA in S-Epo pri aritmičnih miših s pomanjkanjem Cry1 in Cry2 je preusmerila naše iskanje "Epove ure" na njihova nižja ciljna transkripcijska faktorja CLOCK in BMAL1, ki ju potlačita CRY1 in CRY2.26 Ablacija odvodov Cry1/Cry2 do izgube ritmične represije CLOCK/BMAL1, kar je povzročilo konstantne ravni transkriptov Epo, ki so bile med srednjimi ravnmi pri CT06 in CT18 pri miših WT (slika 1a). Hibridizacija in situ z RNAscope kaže, da je cirkadiana oscilacija dosežena s preklopom ekspresije mRNA Epo v intersticijskih celicah (slika 1c), in situ hibridizacija z RNAscope pa je razkrila tudi ekspresijo Bmal1 v REPC (slika 5).

Še pomembneje, znatno višje ravni S-Epo pri CT18 potrjujejo, da se cirkadiana, transkripcijska regulacija Epo prevede v cirkadiana nihanja krožečega proteina Epo v normoksičnih pogojih (slika 1b). Dejanski maksimum ravni S-Epo se pričakuje nekoliko kasneje kot CT18, ker de novo sinteza proteina EPO zahteva w80 do 120 minut,38 cirkadiani časi pa so bili izbrani na podlagi maksimalnih ravni mRNA Epo. 24 Ugotovili smo, da je cirkadiana regulacija Epo verjetno posredovana s transkripcijsko aktivacijo motiva E-box v 5' EPO promotorju s CLOCK/BMAL1 (slika 4 in dodatna slika S4), kar je skladno z opisano pozitivno korelacijo med proteinom BMAL1 in Ravni S-Epo pri podganjem modelu akutne krvavitve.²⁵

Obstajajo dokazi za dvosmerno regulacijo med potmi CLOCK/BMAL1 in HIF prek neposredne interakcije protein-protein.^39,40Povečana regulacija HIF2a, glavnega aktivatorja promotorja EPO, 41, 42 je povzročila spremenjene ravni ekspresije genov ure v celicah človeškega hepatoma. 43 Poleg tega BMAL1 dimerizira s proteini HIF1a in HIF2a,^44,45,in kontrola cirkadiane ure aktivnosti HIF sta regulirana na tkivno specifičen način.39 Pri miših, izpostavljenih akutni hipoksiji (4 ure pri 6 odstotkih v primerjavi z 21 odstotki O2), je bila mRNA EPO čezmerno povečana, vendar ni več kazala cirkadianih razlik .46 Tako so normoksični pogoji verjetno najprimernejši za razčlenitev molekularnega mehanizma cirkadiane regulacije Epo. Pri glodavcih pa so poročali o dnevnih spremembah ravni kisika v krvi in ​​tkivih.39,47 Pri podganah obstaja nizek razpon ritmičnih dnevnih sprememb oksigenacije ledvic zD3 odstotkov, z vrhom v temi (¼ aktivnosti glodavcev). .47 Takšnih razlik ni bilo mogoče odkriti v naših poskusih, v katerih je bilo mogoče proučevati samo anestezirane, traheotomizirane in mehansko ventilirane miši zaradi regulativnih razlogov za živali. Vendar pa analiza arterijskega pH, parcialnega tlaka CO2 in parcialnega tlaka O2, presežka standardne baze ali laktata kot tudi nasičenosti s kisikom ni pokazala večjih razlik med mišmi WT in Cry-null pri obeh CT (slika 2). Poleg tega so bile ravni transkriptov Hif2a v ledvicah podobne v vseh pogojih (slika 3). Tako se zdi, da je v normoksičnih pogojih cirkadiana regulacija Epo neodvisna od dnevnih sprememb v napetosti kisika. Vendar pa si zasluži nadaljnjo pozornost vprašanje, v kolikšni meri velika nadmorska višina ali hipoksija (nizek pO2) vpliva na cirkadiano nihanje proizvodnje Epo. Človeške ravni S-Epo so na splošno višje na visoki nadmorski višini, medtem ko sta faza in amplituda nespremenjeni, 17, 22 in pri zdravih prostovoljcih, izpostavljenih normobarični hipoksiji, kažejo koncentracije S-Epo izrazito nihanje.⁴⁸

Regulacija cirkadianega Epo je verjetno najbolj pomembna za klinično nefrologijo in hematologijo, pa tudi v zvezi z laboratorijsko diagnostiko, kot je testiranje krvi za doping s sredstvi, ki spodbujajo eritropoezo. Za oceno koncentracij Epo v obtoku pri analizah dopinga je treba upoštevati čas dneva (zunanji čas) ob odvzemu krvi in ​​kronotip osebe (notranji čas).49,50

V eritropoezi so enote, ki tvorijo razpoke – eritroid prve celice, specifične za linijo, sledijo pa enote, ki tvorijo kolonije – eritroid, ki kažejo obilno izražanje receptorja Epo. Po 2 dneh v kulturi z Epo enote, ki tvorijo mišje kolonije – eritroid, proizvajajo kolonije eritroblastov. Ko je po 7 dneh dosežena stopnja ortokromatičnih eritroblastov, celice ekstrudirajo svoja jedra, da postanejo retikulociti brez izražanja receptorja Epo.51 Glede na čas, ki je potreben, da enote, ki tvorijo kolonije – eritroid, dozorijo v retikulocite ali celo popolnoma zrele eritrocite, verjetno ni presenetljivo, da med CT06 in CT18 pri miših WT niso opazili razlik (slika 6a–c). Zlasti skupno število retikulocitov je bilo bistveno višje pri WT kot pri Cry-null miših (slika 6a), kar kaže, da je diferenciacija v retikulocite pri Cry-null miših oslabljena. Prejšnji podatki kažejo, da zgodnje eritroidne matične celice kažejo tudi cirkadiani vzorec sinteze DNK. Dajanje rhEpo in vivo poveča cirkadiane ritme števila eritroidnih kolonij.52 Nižje število retikulocitov, kljub relativno visokim celotnim koncentracijam S-Epo pri Cry-null miših, je lahko posledica odprave cirkadiane sinteze DNA na ravni eritroidnih prednikov. Takšno konstelacijo visokega S-Epo in zmanjšane eritropoeze so opazili pri miših z genetsko ablacijo proizvodnje melatonina v epifizi (miši C3H/HeN, ki nimajo N-acetil transferaze, ki bi omejevala hitrost),53 kar zagovarja intrinzične cirkadiane aktivnosti na eritroidnih matičnih celicah ravni.

Predvsem Cry-null miši kažejo približno 80-odstotno zmanjšanje ravni IGF1, kar vodi do zmanjšanega signaliziranja IGF1 in 30-odstotnega zmanjšanja telesne teže in velikosti organov v primerjavi z WT, učinek, ki se v življenju poslabša.30 Čeprav so živali, uporabljene v našem poskusi so bili relativno mladi (srednja starost,^21–29 tednov), so pokazali zmeren učinek na celotno telesno težo in absolutno težo ledvic pri Cry-null miših, vendar je bilo razmerje med ledvico in telesno težo normalno (dodatna slika S3). Slednje dejstvo je lahko pomembno za sposobnost sinteze proteina Epo (slika 1b).

Vendar pa analiza velikosti ali oblike rdečih krvnih celic (MCV, MCH in MCHC; dodatna slika S5) ni nakazala prehranskih pomanjkljivosti (npr. železa in folata) kot razlage za neskladje med zmanjšanim številom retikulocitov in normalnim številom eritrocitov pri Cry- ničelne miši (slika 6a in b). Predvsem signalizacija Epo in IGF1 sinhronizirata celično proliferacijo in diferenciacijo med eritropoezo prek interakcije z GATA-1/prijateljem transkripcijskega kompleksa GATA-1.54 V tem procesu Epo aktivira celično pot AKT in s tem poveča afiniteto GATA-1, glavnega transkripcijskega regulatorja eritropoeze, do njegovega kofaktorskega prijatelja GATA-1. Vendar pa je ta mehanizem zavrt, če je signalizacija IGF1 odpravljena.54 Tako lahko pozitiven učinek relativno višjega Epo pri Cry-null miših na diferenciacijo rdečih krvnih celic odtehta zmanjšano aktivnost IGF1 pri relativno mladih Cry-null miših, ki so jih tu preučevali.

Splošna implikacija popolne cirkadiane aritmičnosti na hematopoezo je nadalje pojasnjena z našo analizo števila trombocitov in WBC. Prejšnji rezultati pri miših, ki izražajo dominantno negativno obliko Clock (ClockD19/D19), so pokazali, da motnja izražanja trombopoetina (primarnega regulatorja megakariopoeze) in njegovega receptorja Mpl povzroči povečano število zrelih megakariocitov kostnega mozga in število krožečih trombocitov. 55 Opisano pomembno cirkadiano nihanje števila trombocitov z najvišjo vrednostjo pri zeitgeberjevem času (ZT) 20 pri miših WT kot tudi višje število trombocitov pri ZT08 pri miših ClockD19/D19, 55 kar ima za posledico pomanjkanje cirkadianega nihanja števila trombocitov, ni moglo potrditi v našem modelu miške (slika 6d). Druga pomembna ugotovitev je izguba razlik v času dneva krožečih belih krvnih celic pri miših Cry-null v nasprotju z mišmi WT (slika 6e), kar je skladno s poročano aktivnostjo CLOCK/BMAL1 na zrelo proizvodnjo belih krvnih celic.^56,57

Za razlago naših podatkov je treba upoštevati razlike med dnevno-nočnimi aktivnostmi pri miših in ljudeh: čas CT06 pri ljudeh približno ustreza polnoči (faza spanja), medtem ko CT18 približno ustreza poldnevu (faza aktivnosti). Nasprotno velja za nočne miši, vendar oba organizma kažeta enak cirkadiani vzorec izražanja Epo (nizko pri CT/ZT06, visoko pri CT/ZT18). To kaže, da bi lahko dodatni mehanizmi (npr. presnovni dejavniki) spremenili ritem izražanja Epo v obeh organizmih. Sinhronizacija med najvišjimi nivoji Epo in izražanjem receptorja Epo v zgodnjih eritroidnih matičnih celicah (enote, ki tvorijo razpoke – eritroidne in celo enote, ki tvorijo kolonije – eritroidne celice)⁵² kaže, da bi bolnikom, ki prejemajo zdravljenje z rhEpo (npr. pri končni fazi ledvične anemije ali hematoloških motnjah), koristilo posnemanje normalne cirkadiane fiziologije z uporabo hipo ponoči. O hematopoetskih motnjah pri ljudeh z mutacijami CRY1 (spletno mendelsko dedovanje pri človeku *601933) ali CRY2 (spletno mendelsko dedovanje pri človeku *603732) še niso poročali o izgubi funkcij. Klinična poročila povezujejo različice CRY1 predvsem z motnjami pomanjkanja pozornosti/hiperaktivnosti, ki jih pogosto spremljajo nespečnost, anksioznost, depresija ali motnje zapoznele faze spanja.^58,59To si zasluži nadaljnje preiskave, ker lahko takšne bolezni poslabšajo anemija ali hematopoetske motnje.

Skratka, ta študija zagotavlja prvi dokaz, da je cirkadiana ekspresija Epo v normoksični odrasli mišji ledvici regulirana na transkripcijski ravni z CLOCK/BMAL1-posredovano aktivacijo elementa E-box v promotorju 5'EPO. Ker EPO izrazito deluje znotraj kompleksne regulativne mreže eritropoeze, lahko optimalna uporaba repo pri bolnikih z ledvično insuficienco vključuje njegovo uporabo tik pred njegovim fiziološkim cirkadianim maksimumom ponoči.