Ohranjeni s cisteinom bogati sekretorni protein MaCFEM85 sodeluje z MsWAK16 za aktiviranje obrambe rastlin
Oct 26, 2023
Povzetek: Metarhizium anisopliaeje entomopatogena gliva, ki lahko poveča rast in odpornost rastlin, ko deluje kot endofit v gostiteljskih rastlinah. Vendar pa je malo znanega o interakcijah beljakovin ali njihovih aktivacijskih mehanizmih. Proteini zunajcelične membrane gliv (CFEM), ki so pogosti, so bili identificirani kot rastlinski imunski regulatorji, ki zavirajo ali aktivirajo odzive rastlinske odpornosti. Tu smo identificirali protein, ki vsebuje domeno CFEM, MaCFEM85, ki je bil večinoma lokaliziran v plazemski membrani. Dvohibridni testi kvasovk (Y2H), glutation-S-transferaze (GST) pull-down in bimolekularni fluorescenčni komplementacijski testi so pokazali, da je MaCFEM85 sodeloval z zunajcelično domenoMedicago sativa(alfalfa) membranski protein, MsWAK16. Analize izražanja genov so pokazale, da sta bila MaCFEM85 in MsWAK16 znatno povečana vM. anisopliaeinM. sativa12 do 60 ur po soinokulaciji. Dodatni dvohibridni testi kvasovk in mutacija, specifična za mesto aminokislin, so pokazali, da sta za interakcijo MaCFEM85 z MsWAK16 potrebna posebej domena CFEM in 52. cistein. Testi obrambne funkcije so pokazali, da je bil JA reguliran navzgor, vendar sta bila velikost lezije Botrytis cinerea in razmnoževanje Myzus persicae zatrta s prehodno ekspresijo MaCFEM85 in MsWAK16 v modelni gostiteljski rastlini Nicotiana benthamiana. Skupaj ti rezultati zagotavljajo nove vpoglede v molekularne mehanizme, na katerih temelji interakcija M. anisopliae z gostiteljskimi rastlinami.
koristi dodatka cistanche-povečanje imunosti
Ključne besede: z zidom povezana kinaza; CFEM-ji; Metahizium anisopliae; imunost rastlin; Medicago sativa
1. Uvod
Interakcije med rastlinami in mikrobi so zelo razširjene in so rezultat pretekle in tekoče koevolucije. Te interakcije imajo lahko koristne, nevtralne ali škodljive rezultate za vsakega udeleženca [1–3]. Koristna rizosferna mikrobiota lahko poveča rast rastlin in izboljša splošno zdravje z zaščito pred boleznimi, ki se prenašajo s prstjo, ali povečanim vnosom hranil [4, 5]. Široka paleta koristnih mikrobov lahko poveča zmogljivosti rastlin, kot so vnos hranil, rast ter obramba pred patogeni in insekti [6,7]. Metarhizium Sorok¯ın je pomemben rod entomopatogenih gliv s sposobnostjo koloniziranja rastlin [8], vendar obstajajo tudi dokazi, ki kažejo, da lahko člani rodu povečajo odpornost rastlinskih patogenov. Na primer, laboratorijska študija je pokazala 60-odstotno inhibicijo Fusarium solani (Mart.) Sacc. v prisotnosti Metarhizium robertsii (prej znan kot M. anisopliae) v primerjavi s kontrolami brez M. robertsii [9]. Nekateri sevi Metarhizium lahko izboljšajo odpornost rastlin na škodljivce in bolezni žuželk s spreminjanjem izražanja obrambnih genov rastlin. Endofitna kolonizacija z M. Roberts aktivira izražanje obrambnih poti jasmonske kisline (JA) in salicilne kisline (SA) v listih koruze; poleg tega je takšna kolonizacija povezana s spodbujanjem rasti rastlin in zatiranjem razvoja ličink Agrotis epsilon (Hufnagel) [10]. Metarhizium guizhouense je aktiviral -1,3-glukanazo in hitinazo v sadni lupini Lansium parasiticum, kar je povzročilo zaviranje rasti Botrytis sp. in Fusarium sp. na plodu Aglaia dookkoo Griff [11]. Poleg tega, ko je bila M. anisopliae nanesena na sadike arašidov, so se aktivirali številni transkripcijski faktorji, vključno z WRKY, MYC, TGA in transkripcijskimi faktorji, odzivnimi na etilen, medtem ko so bili transporterji nitratov in proteini, ki vežejo elemente, odzivne na dehidracijo, tudi različno izraženi [12] . To nakazuje, da M. anisopliae uravnava rastlinske obrambne gene, ko kolonizira rastlino. Vendar je razmeroma malo znanega o mehanizmih, na katerih temelji obrambni odziv rastlin po okužbi z Metarhiziumom. Efektorji so običajno sredstvo, s katerim mikroorganizmi uravnavajo odpornost rastlin [13]. Za aktivacijo odpornosti rastlin je običajno značilen oksidativni izbruh in indukcija hormonov, metabolitov in drugih signalov [13]. Rastlinska hormona SA in JA imata pomembno vlogo pri spodbujanju odpornosti rastlin, saj posredujeta dve ločeni obrambni signalni poti [14]. Signalna pot SA deluje predvsem pri alergijskem odzivu rastlin in pri sistemski pridobljeni odpornosti na patogene, vendar je lahko vključena tudi v posredne obrambne odzive rastlin, ki jih povzroči hranjenje z žuželkami [15]. Kopičenje SA je povezano s povečano ekspresijo genov, ki kodirajo proteine za prenos lipidov (LTP) in fenilalanin amoniak-liazo (PAL) [16], ki posredujejo pri sintezi in kopičenju specializiranih metabolitov, kot so flavonoidi in lignin [17]. Signalna pot JA deluje pri neposrednih in posrednih odzivih na mehanske poškodbe, glivične patogene in škodljivce insektov. Študije so pokazale, da ima signalizacija JA regulatorni učinek na sintezo specializiranih metabolitov, kot so terpenoidi, fenilpropanoidi in alkaloidi, ki imajo širok spekter bioloških funkcij [18]. Dokazano je, da se nekateri specializirani presnovki kopičijo v rastlinskih celicah po zdravljenju z methylJA (MeJA), vključno s paklitakselom pri vrstah Taxus [19,20], terpenoidi pri Centella Asiatica (L.) Urban [21] in saponini v ginsengu [22] . Uporaba SA in hitozana (CHT) kot elicitorjev je povzročila kopičenje lignina in obrambne encimske reakcije v paradižnikih, kar je zmanjšalo incidenco okužbe z Ralstonia solanacearum (Smith) Yabuuchi [23]. Poleg tega so se ravni JA in SA v pšenici znatno nakopičile z uporabo elicitorja PeaT, kar je povečalo obrambni odziv na ovseno listno uš Sitobion avenae (Fabricius) [24]. To kaže, da bi lahko rastlinsko imunost regulirali ti efektorji prek rastlinskih hormonov in metabolitov.
cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema
Proteini, ki so pogosti v zunajcelični membrani gliv (CFEM), so prisotni v številnih glivah. Kodirajo domene, ki so običajno dolge 60 aminokislin (aa) in vsebujejo osem značilno razporejenih cisteinov [25]. Domene CFEM so podobne domenam, podobnim epidermalnemu rastnemu faktorju (EGF), ki delujejo kot zunajcelični receptorji, signalni pretvorniki ali adhezijske molekule v interakcijah med gostiteljem in patogenom [26]. Proteini, ki vsebujejo domene CFEM, lahko manipulirajo z odzivom odpornosti rastlin tako, da delujejo kot efektorji. Pri glivi pšenične listne rje Puccinia triticina Erikas je kandidat za efektor CFEM PTTG_08198 pospešil napredovanje celične smrti in spodbudil kopičenje reaktivnih kisikovih vrst (ROS) [27]. Antraknozna gliva Colletotrichum graminicola (Ces.) GW Wils vsebuje pet efektorjev (CgCFEM6, 7, 8, 9 in 15), za katere je bilo dokazano, da zavirajo programirano celično smrt, ki jo povzroča BAX, v Nicotiana benthamiana Domin [28]. Poročali so, da fitosimbiozna mikorizna gliva Laccaria bicolor (Maire) PDOrton izloča več proteinov CFEM, kot so Lac310796, Lac296573 in Lac296572, v simbiotskih tkivih [29]. Čeprav kompleksne funkcije teh proteinov niso bile dodatno raziskane v mikorizni simbiozi, predhodni rezultati kažejo, da lahko proteini CFEM delujejo pri signalizaciji med glivami in rastlinami. M. anisopliae lahko deluje kot entomopatogena ali endofitna gliva v gostiteljski rastlini [30]. Vendar o vlogah proteinov CFEM še niso poročali. Prej smo identificirali protein, ki vsebuje domeno CFEM, v M. anisopliae, MaCFEM85 (GenBank ID: MZ682609) [31]. Tukaj poročamo o razmerju med MaCFEM85 in kinazo MsWAK16, povezano s steno Medicago sativa. Analizirali smo zaporedje MaCFEM85 in izvedli poskuse, da bi ugotovili, kateri ostanki so kritični za interakcijo z MsWAK16. Na koncu smo z uporabo N. benthamiana kot naše modelne rastline ovrednotili obrambne odzive rastlin na Botrytis cinerea in listno uš Myzus persicae s prehodno ekspresijo MaCFEM85 in MsWAK16 in brez nje.
Prednosti cistanche tubulosa- okrepiti imunski sistem
Kliknite tukaj za ogled izdelkov Cistanche Enhance Imunity
【Vprašajte za več】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692
2. Rezultati
2.1. MaCFEM85 je bil najtesneje povezan z nepatogenimi glivičnimi CFEM in lokaliziran na plazemski membrani
Zgrajeno je bilo filogenetsko drevo za analizo odnosov med MaCFEM85 in drugimi proteini CFEM iz patogenih in nepatogenih modelnih gliv. Med njimi so bili Magnaporthe oryzae, Fusarium oxysporum (Schl.), Neurospora crassa Shear & BODodge in Beauveria bassiana (Bals.) (glejte razdelek 4). MaCFEM85 je bil najbolj povezan s proteini CFEM v B. bassiana in zato evolucijsko bližje nepatogenim kot patogenim glivam (slika 1a).
Slika 1a
2.2. MaCFEM85 je bil povečan med interakcijami z M. sativa
Z steno povezane receptorje podobne kinaze (WAK) predstavljajo podskupino znotraj superdružine receptorjem podobnih protein kinaz (RLK) in vključujejo zunajcelično domeno, transmembransko vijačnico in intracelularno kinazno domeno. Imajo pomembno vlogo pri uravnavanju rasti rastlin, razvoja, odziva na stres in signalnih poti odpornosti na patogene [32]. RNA je bila ekstrahirana iz hif M. anisopliae in korenin M. sativa po soinkubaciji, da bi raziskali vzorce izražanja MaCFEM85 in MsWAK16. Tako MaCFEM85 kot MsWAK16 sta bila med soinkubacijo od 12 do 6{13}} h izražena na bistveno višjih ravneh (slika 1c,d). Od 0 do 36 ur se je ekspresija MaCFEM85 postopoma povečevala in dosegla vrh pri 36 urah. V kombinaciji M. anisopliae in M. sativa je bil × 593-krat bolj izražen v primerjavi z M. anisopliae, gojenim samostojno. Čeprav se je izražanje MaCFEM85 v obdobju 48–60 ur rahlo zmanjšalo, je bilo še vedno izraženo na znatno višjih ravneh kot pri M. anisopliae, ki je gojen sam. MsWAK16 je bil tudi znatno povečan, z izražanjem, ki je doseglo vrh pri 36 urah. Pri M. sativa, okuženih z M. anisopliae, je bil MsWAK16 × 89,06-krat bolj izražen kot pri M. sativa brez M. anisopliae. Od 36 do 60 ur so se ravni MsWAK16 nekoliko znižale, vendar je bila njegova izraženost še vedno bistveno večja kot v neinokuliranih rastlinah.
2.3. MaCFEM85 sodeluje z MsWAK16 In Vitro in In Vivo
Da bi raziskali potencialni funkcionalni mehanizem MaCFEM85 kot odziv na zdravljenje z M. anisopliae, je bil izveden dvohibridni (Y2H) pregled kvasovk za predhodno identifikacijo gostiteljskih proteinov, ki medsebojno delujejo z MaCFEM85. Interakcija med zunajcelično domeno MsWAK16 (MsWAK16-ED) in MaCFEM85 je bila raziskana z dvohibridnim testom kvasovk ena proti ena z uporabo MaCFEM85 v pGBKT7 kot vektorju BD in MsWAK16 v pGADT7 kot vektorju AD. Vse transformirane kvasovke so dobro rasle na gojišču s pomanjkanjem SD-T/L, pozitivna kontrolna skupina in poskusna skupina pa sta uspešno rasli na gojišču s pomanjkanjem SD-T/L/H/A + X- -gal. To je pokazalo, da bi MaCFEM85 lahko deloval z MsWAK16-ED (slika 2a).
Slika 2. Validacija interakcije med MaCFEM85 in MsWAK16.
Za validacijo in vitro smo v pGEX6-P2 vstavili z glutation-S-transferazo (GST) označen MsWAK16-ED (ki kodira produkt 60 kDa) in MaCFEM85, označen s polihistidinom (His) ( ki kodira produkt 17 kDa) je bil vstavljen v pET-21b. Imunobloting s protitelesi His in GST je pokazal, da je rekombinantni protein MaCFEM85-His medsebojno deloval s plenom GST-MsWAK16-ED, ne pa samo z GST in da je GST-MsWAK16- ED medsebojno deloval s His -MaCFEM85 (slika 2b). Za nadaljnjo potrditev interakcije med MaCFEM85 in MsWAK16 smo izvedli test bimolekularne fluorescenčne komplementacije (BiFC) s konstruktoma MaCFEM85-YFPN in MsWAK16-YFPC. Sočasno izražanje MaCFEM85-YFPN in MsWAK16-YFPC v listih tobaka je ustvarilo rumen fluorescenčni signal, kar kaže, da je MaCFEM85 medsebojno deloval z MsWAK16 (slika 2c).
2.4. Ključna mesta za interakcije MaCFEM85 in MsWAK16
Za določitev regije MaCFEM85, ki je potrebna za interakcijo z MsWAK16-ED, so bile proteinske domene predvidene s spletno programsko opremo SMART (slika 3a). MaCFEM85 je vseboval domeno CFEM v regiji 19-86 aa. Predvidena je bila tudi terciarna struktura (Slika 3b). Osem cisteinov v tej domeni je povzročilo štiri disulfidne vezi (CYS26 in CYS69, CYS30 in CYS64, CYS43 in CYS50 ter CYS52 in CYS85), ki ohranjajo stabilnost proteina (slika 3b). Za potrditev domnevnih interakcijskih mest v MaCFEM85 je bilo ustvarjenih sedem mutiranih različic proteina in vstavljenih v pGBKT7 kot beljakovine vabe. Vsak rekombinantni vektor je bil sotransfektiran z AD-MsWAK16-ED v sevu Y2H Gold. Sev z mutiranim CYS52 ni rasel na selektivnih medijih (slika 3c, obrobljena z rdečo), kar kaže, da je CYS52 potreben za interakcijo MaCFEM85 z MsWAK16-ED.
2.5. Interakcija MaCFEM85 z MsWAK16 aktivira rastlinski imunski odziv
2.5.1. Vrednotenje vloge MaCFEM85 in MsWAK16 pri odpornosti na bolezni proti B. cinerea
Da bi raziskali možno vpletenost MaCFEM85 in MsWAK16 v obrambne odzive patogenov, smo preučili, ali bi prekomerna ekspresija MaCFEM85, MsWAK16 ali MaCFEM85 in MsWAK16 lahko povečala odpornost proti B. cinerea. Te vektorje smo začasno ekspresirali v listih N. benthamiana. Western blot test je pokazal, da sta bila MaCFEM85 in MsWAK16 izražena na primerljivih ravneh, ko sta bila izražena sama ali skupaj, kar kaže, da sta bila MaCFEM85 in MsWAK16 uspešno izražena v tobaku (slika 4a). Testi bolezni so bili izvedeni tudi z uporabo bakterije N. benthamiana, infiltrirane z MaCFEM85, MsWAK16, MaCFEM85+MsWAK16 ali kontrolo GFP. Poškodbe so bile znatno manjše (za ~30 % 2 dni po inokulaciji) na listih, infiltriranih z MaCFEM85, MsWAK16 ali MaCFEM85+MsWAK16, v primerjavi s kontrolnimi rastlinami (slika 4b). Ti podatki kažejo, da je prehodna ekspresija MaCFEM85 v N. benthamiana povečala odpornost proti B. cinerea in da sta MaCFEM85 in MsWAK16 pozitivno regulirala obrambni odziv proti B. cinerea.
Slika 3. Identifikacija mesta interakcije med MaCFEM5 in MsWAK16.
Slika 4. Indukcija odpornosti rastlin s prehodno ekspresijo MaCFEM85 in MsWAK16.
2.5.2. Vrednotenje vloge MaCFEM85 in MsWAK16 pri obrambi listnih uši pri N. benthamiana
Za nadaljnjo raziskavo vloge MaCFEM85 in MsWAK16 so bile rastline N. benthamiana, ki so začasno izražale MaCFEM85 in MsWAK16, okužene z M. persicae, populacije pa so bile ocenjene. Za ta poskus je bilo veliko območje vsakega lista N. benthamiana agroinfiltrirano z rekombinantnim binarnim vektorjem pYBA1132, ki je vseboval MaCFEM85 in MsWAK16. GFP je bil uporabljen kot kontrola. Po 12 urah po infiltraciji so 20 odrasli osebki M. persicae postavili v kletko na vsak list, pri čemer so infiltrirano območje izpostavili listnim ušem. V naslednjih treh dneh smo zabeležili pogin odraslih listnih uši in število lužnic; nimfe so nato odstranili. Med populacijami M. persicae, ki so se hranile z rastlinami, ki izražajo MaCFEM85, MsWAK16 ali MaCFEM85+MsWAK16 (χ2=3.65827, DF=3, p < 0,30081, ni bilo pomembne razlike v tveganju smrtnosti ) (slika 4c). Vendar pa je bilo po 24, 48 in 72 urah povprečno število potomcev, ki jih je proizvedla vsaka odrasla listna uš, znatno večje pri N. benthamiana, ki izraža kontrolo GFP, v primerjavi s tistimi, ki izražajo MaCFEM85, MsWAK16 ali MaCFEM85+MsWAK16 (slika 4d).
2.5.3. Vrednotenje vloge MaCFEM85 in MsWAK16 pri kopičenju hormonov in izražanju genov, povezanih s hormoni
Za analizo razlik med obrambnimi odzivi rastlin N. benthamiana, ki izražajo eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 in MaCFEM85+MsWAK16, smo izmerili ravni JA, SA in skupnih flavonoidov ter izražanje sorodnih genov. Rezultati so pokazali, da se ravni JA in SA razlikujejo med rastlinami, ki izražajo eGFP, MaCFEM85, MsWAK16 in MaCFEM85+MsWAK16 (slika 5a). V primerjavi s tistimi, ki izražajo eGFP, so bile ravni JA bistveno nižje v rastlinah, ki izražajo MaCFEM85; Ravni SA so bile rahlo povišane, vendar razlike niso bile pomembne. Nasprotno pa rastline, ki izražajo MsWAK16, niso pokazale pomembnih razlik v ravneh JA v primerjavi s kontrolo eGFP, medtem ko so bile ravni SA bistveno nižje kot pri kontroli (slika 5a). Ravni JA in SA so bile v rastlinah, ki izražajo MaCFEM85+MsWAK16, v primerjavi z eGFP znatno povečane oziroma znižane.
Slika 5. Ravni hormonov in ekspresija genov za hormonski odziv
Skupna vsebnost flavonoidov je bila znatno višja v rastlinah, ki izražajo MaCFEM85+MsWAK16, v primerjavi z vsemi drugimi tretiranimi skupinami (slika 5a). Stopnje ekspresije biosintetičnih genov so bile podobne pri rastlinah, ki izražajo MsWAK16 in MaCFEM85+MsWAK16. Na primer, geni, povezani z odzivom JA, in sicer COI1, MYC2 in PDF1.2, so bili znatno povečani v primerjavi z rastlinami, ki izražajo GFP (slika 5b). Podobno so bili geni NPR1, WRKY70 in PR1, povezani s SA, značilno različno izraženi v rastlinah, ki izražajo MsWAK16 in MaCFEM85+MsWAK16; NPR1 je bil reguliran navzgor, medtem ko sta bila WRKY70 in PR1 regulirana navzdol v primerjavi s kontrolo (slika 5b). Preučili smo tudi izražanje ključnih genov v poteh sinteze šikimske kisline in fenilpropanoida, ki sta oba povezana s sintezo flavonoidov. Na splošno ekspresija MaCFEM85 sama po sebi ni povzročila bistveno večje ekspresije teh genov v tobaku. Vendar so bili ti geni regulirani navzgor v tobaku, ki izraža MsWAK16 ali MsWAK16+MaCFEM85 v primerjavi s kontrolo GFP (slika 5c).
cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema
3. Razprava
3.1. Ohranjeni proteinski motiv CFEM služi več funkcijam pri vrstah gliv
Domena CFEM je edinstvena za glive in se pogosto pojavlja v zunajceličnih membranskih proteinih gliv. Domena izvira iz najnovejšega skupnega prednika Ascomycota in Basidiomycota [33]. Nedavne raziskave so pokazale, da lahko proteini CFEM v glivičnih patogenih delujejo kot rastlinski imunski regulatorji, kar povzroči zatiranje ali aktivacijo imunskega sistema gostiteljske rastline, odvisno od vrste okužbe [28,34,35]. V M. anisopliae je bilo malo poročil o proteinih, ki vsebujejo domeno CFEM, samo v kontekstu evolucijske primerjave z drugimi glivami [36]. V tej študiji smo primerjali proteine M. anisopliae CFEM z drugimi znanimi proteini CFEM v patogenih in nepatogenih glivah. Potrdili smo, da je najbližji homolog MaCFEM85 Cfem5, ki ga najdemo v Beauveria bassiana, enem od 12 proteinov CFEM v tej vrsti (dodatna slika S1). BbCfem5 je bistvenega pomena za pridobivanje železa [37]. Poleg tega je glede na predvideno terciarno strukturo domena CFEM v MaCFEM85 zelo podobna proteinu površinskega antigena 2 (CSA2), ki ga najdemo v Candida albicans (CPRobin) Berkhout, v katerem je bilo 65 ostankov (96 % zaporedja) modeliranih z 99,8 % zaupanja [31]. Candida albicans je živalski patogen; CSA2 ima pomembno vlogo pri rasti in patogenosti z ekstrakcijo hema iz hemoglobina in transportom hema iz celične stene v plazmo [38–40]. Domnevamo, da je MaCFEM85 lahko vpleten v virulenco M. anisopliae gostiteljev žuželk. Zaradi teh kombiniranih funkcij MaCFEM85 pri živalskih patogenih okužbah in aktivaciji rastlinske imunosti je beljakovina vznemirljiv fokus prihodnjih raziskav.
3.2. Disulfidne vezi so pomembne strukture za delovanje beljakovin
Konformacijska celovitost proteinske strukture je neposredno povezana z njeno sposobnostjo delovanja. Disulfidne vezi, ki jih tvorijo cisteinski pari, spodbujajo zvijanje beljakovin in konformacijsko stabilnost ter veljajo za ključna mesta za prepoznavanje in vezavo specifičnih receptorjev ali ligandov [41]. Na primer, prekinitev katere koli od treh ohranjenih disulfidnih vezi v efektorskem proteinu AVR4 rastlinskega patogena Cladosporium fulvum povzroči občutljivost na proteazo in zmanjšano sposobnost vezave hitina [42]. V treh drugih proteinih C. fulvum (ECP1, ECP2 in ECP5) posamezne zamenjave alaninov za cisteine dušijo preobčutljivostni odziv paradižnika, kar kaže, da so cisteini ključni za ohranjanje stabilnosti in aktivnost, ki povzroča preobčutljivostni odziv [43]. Poleg tega lahko v zrelem proteinu MC69 Magnaporthe oryzae mutageneza dveh ohranjenih cisteinskih ostankov (Cys36 in Cys46) poslabša delovanje MC69 brez vpliva na izločanje, kar kaže na pomen disulfidne vezi posebej pri patogenosti MC69 [44]. Zdi se, da je domena CFEM po velikosti in vzorcu cisteinskih ostankov podobna domenam, podobnim EGF, ki vsebujejo tri ali štiri pare disulfidnih vezi. Proteini EGF lahko delujejo kot receptorji na celični površini, signalni pretvorniki ali adhezijske molekule v interakcijah med gostiteljem in patogenom [45]. V tej študiji nismo le ugotovili, da domena CFEM MaCFEM85 vsebuje osem ohranjenih cisteinov, ki so tvorili štiri pare disulfidnih vezi (slika 3b), ampak smo tudi potrdili, da je CFEM kritična domena za interakcijo med MaCFEM85 in MsWAK16. Poleg tega smo s pomočjo na mesto usmerjene mutacije cisteinskih ostankov v alanin ugotovili, da je cisteinski ostanek na položaju 52 osrednje mesto, potrebno za interakcijo (slika 3c). Ti rezultati so podlaga za nadaljnje študije fizioloških funkcij interakcije CFEM85–WAK16.
3.3. Interakcija MaCFEM85 z MsWAK16 aktivirano obrambo rastlin
Pri interakcijah med mikrobi in rastlinami obrambne odzive rastlin na splošno aktivirajo mikrobni efektorski proteini. Inducirana obramba postaja pomembno orodje pri biološkem nadzoru škodljivcev za spodbujanje odpornosti. Proteini CFEM so bili identificirani kot efektorji, ki sodelujejo pri uravnavanju aktivacije ali inhibicije imunskega sistema rastlin [28, 46]. Vendar pa je malo objavljenih raziskav, ki povezujejo regulacijo teh imunskih dejavnikov z njihovo specifično vlogo pri rastlinskih boleznih in odpornosti proti insektom. V tej študiji smo uporabili entomopatogeno in endofitno glivo, M. anisopliae, za identifikacijo interakcije med MaCFEM85 in kinazo, povezano s celično steno, MsWAK16, v M. sativa. Rezultati so pokazali, da je ta interakcija zmanjšala delež lezij po inokulaciji z B. cinerea (slika 4b) in zmanjšala stopnjo rasti populacije M. persicae (slika 4d), kar kaže, da je interakcija med MaCFEM85 in MsWAK16 povečala odpornost M. sativa na listne uši. Spremembe ravni JA, SA in etilena (ET) se lahko uporabijo kot označevalci za oceno indukcije odpornosti rastlin [47, 48]. Tu smo dokazali, da je MaCFEM85 medsebojno deloval z MsWAK16, da bi vplival na odpornost rastlin prek hormonske regulacije in zaviral stopnjo razmnoževanja M. persicae (slika 4d). O podobnih študijah so že poročali. Na primer, pokazalo se je, da efektorski protein Brevibacillus laterosporus PeBL1 inducira kopičenje JA in SA v paradižnikih in zmanjša stopnjo rasti druge in tretje generacije populacij M. persicae, ki so se hranile s temi rastlinami. Poleg tega imajo rastline paradižnika, poškropljene z efektorji, repelentni učinek na M. persicae [49]. Uporaba elicitorskega proteina PeBC1 na navadnem fižolu (Phaseolus vulgaris L.) vodi do izrazitih in pomembnih subletalnih učinkov na zelene breskove uši. Rastline, obdelane s PeBC1, kažejo znatno povečano regulacijo genov, povezanih z JA in SA [50]. Elicitor Beauveria bassiana PeBb1 zmanjša plodnost M. persicae na tobaku in inducira izražanje genov, povezanih z JA in ET [51]. V tej študiji je prehodna ekspresija MaCFEM85 in MsWAK16 v tobaku znatno povečala z odzivom JA povezane gene COI1, MYC2 in PDF1.2 (slika 5b) ter povečala JA in skupno vsebnost flavonoidov (slika 5a), kar je bilo primerljivo z rezultati v literaturi, kot je opisano zgoraj. Vendar nismo odkrili visokih ravni SA v tobaku 12 ur po infiltraciji in rastline, ki prehodno izražajo MsWAK16 ali MaCFEM85+MsWAK16, so pokazale znatno znižane ravni SA in znižano regulacijo genov, vključenih v odziv SA (slika 5a,b) . To je pokazalo, da lahko stimulacija različnih rastlinskih hormonov vodi ne le do sinergijskih aktivnosti, ampak tudi do preslušavanja in povratnih informacij, kar rastlinam omogoča, da se ustrezno odzovejo na različne dražljaje. V rastlinah so prej poročali o povečanih ravneh JA, vendar o nizkih ravneh SA. Na primer, pri A. thaliana z okvarjenim kopičenjem SA so bile ravni JA 25-krat višje kot pri divjem tipu A. thaliana in aktivirani so bili geni, odzivni na JA [52]. Poročali so tudi, da lahko nekatere bakterije povečajo raven JA v rastlinah, da zavirajo kopičenje SA in se tako izognejo škodi, ki jo povzroča SA. Na primer, Pseudomonas syringae cilja na receptor COI1 prek toksina, koronatina, ki negativno uravnava pot JA [53]. To spodbuja povečano regulacijo transkripcijskih faktorjev ANAC019, ANAC055 in ANAC072 [54], ki jo povzroči MYC2-, inhibira transkripcijo ICS1 (ključnega gena za sintezo SA) in tako zmanjša regulacijo proizvodnje SA in prenosa signala. V tej študiji je interakcija med MaCFEM85 in MsWAK16 povzročila povečano kopičenje JA in uravnavanje genov, ki se odzivajo na JA, vendar zaviranje kopičenja SA in transkripcije genov, povezanih s SA. To je pokazalo, da je interakcija med MaCFEM85 in MsWAK16 povzročila JA in s tem izboljšala odpornost rastlin na listne uši.
Pri N. benthamiana, ki prehodno izraža MaCFEM85 in MsWAK16, so bile ravni JA povečane, velikost lezij B. cinerea pa zmanjšana (slika 4b), kar je skladno s prejšnjimi študijami. JA sodeluje pri odpornosti rastlin na žuželke in nekrotrofne patogene [52, 55]. Kot nekrotrofni patogen je B. cinerea zavirala kopičenje JA in ET [56]. V mutantu ein2-1 s pomanjkanjem ET A. thaliana in mutantu coi1-1 z odzivom JA so bile ravni spodnjega obrambnega gena PDF1.2 znatno zmanjšane in občutljivost na B. cinerea je bila povečana [ 57]. Tu smo ugotovili, da sta se kopičenje JA in transkripcija genov, povezanih z JA, znatno povečala pri N. benthamiana, ki prehodno izraža MaCFEM85 in MsWAK16, medtem ko sta bila kopičenje SA in transkripcija genov, povezanih s SA, inhibirana. Ekspresija MaCFEM85 in MsWAK16 je prav tako pokazala zaviralni učinek na B. cinerea. To je pokazalo, da sta JA aktivirala MaCFEM85 in MsWAK16 in je igrala vodilno vlogo pri odpornosti rastlin na B. cinerea.
4. Materiali in metode
4.1. Sevi gliv, rastlinski materiali in metode gojenja
Izolatne seve Metarhizium anisopliae Ma 9 smo gojili na gojišču krompirjev sladkor-agar (PSA) (200 g ekstrakta olupljenega krompirja, kuhanega v vodi, 20 g saharoze in 15 g agarja/L). Svež trosni prah smo zbrali po 10 d. Rastline Nicotiana benthamiana smo gojili v umetni klimatski komori s 14/10 h ciklom svetloba/tema (27/25 ◦C). Za prehodno izražanje genov s transformacijo, ki jo posreduje Agrobacterium, smo sev GV3101 Agrobacterium tumefaciens gojili v mediju Luria Broth (LB) (10 g triptona, 5 g ekstrakta kvasa in 10 g NaCl/L). Sev kvasa Gold (OE Biotech Co., Ltd., Šanghaj, Kitajska) smo gojili na mediju peptonske dekstroze (YPDA) ekstrakta kvasovk (10 g ekstrakta kvasa, 20 g peptona, 20 g glukoze in 0,03 g adenin hemisulfata/L). Za vsak vektor in sev smo uporabili ustrezne antibiotike, in sicer rifampicin, kanamicin ali ampicilin (25, 50 oziroma 50 µg/mL). Sevi in plazmidi, uporabljeni v tej študiji, so navedeni v dodatni tabeli S1. Semena Medicago sativa smo površinsko sterilizirali s 75% etanolom 1 minuto, čemur je sledilo 50% NaClO (5,5%) 15 minut. Semena smo temeljito premešali in nato trikrat po 5 minut sprali v sterilni vodi. Semena smo inkubirali pri 4 ◦C v temi več kot 24 ur, nato pa kalili na ploščah z 1% vodnim agarjem pri sobni temperaturi čez noč. Tri dni po kalitvi smo razvijajoče se sadike prenesli na filtrirni papir na 9- cm sterilne petrijevke, po 20 sadik na posodo. Tretmaji in kontrola so bili dodeljeni vsakemu po 15 jedi. Sadike smo nato namakali z 10 mL suspenzije spor M. anisopliae, ki je vsebovala 107/mL, kontrolo pa smo namakali z 10 mL sterilne vode. Ob 0, 12, 24, 48 in 60 urah je bil vzet naključni izbor sadik iz treh petrijevk za vsak časovni interval. Vzorce smo zamrznili v tekočem dušiku in shranili pri –80 ◦C.
4.2. qRT-PCR in konstrukcija plazmida
Celotno RNK smo ekstrahirali iz M. anisopliae (hife) in M. sativa (korenine) z reagentom TRIzol (Invitrogen, CA, ZDA) po navodilih proizvajalca. Kakovost in številčnost nastale RNA smo izmerili z NanoPhotometrom® (Implen, München, Nemčija). Sinteza prve verige cDNA (do 2 ug RNA) je bila izvedena z uporabo 5 × All-In-One RT Master Mix (Applied Biological Materials Inc., Vancouver, BC, Kanada) po navodilih proizvajalca. qRT-PCR je bil izveden z uporabo 2×SYBR Green qPCR Master Mix podjetja US EVER BRIGHT ® INC. in sistema ABI QuantStudio 5 po navodilih proizvajalca. Primerji, uporabljeni za vsak gen, so navedeni v dodatni tabeli S2. Maury [58], Msactin [59] in Nbactin [60] so bili uporabljeni kot notranji referenčni geni za normalizacijo podatkov o izražanju. Reakcija je potekala pod naslednjimi pogoji: 5 minut pri 95 ◦C, čemur je sledilo 40 ciklov pri 95 ◦C 15 s in pri 60 ◦C 40 s. Za vsak vzorec so bile tri tehnične ponovitve. Relativni izraz je bil izračunan z metodo 2−∆∆Ct [61]. Statistična značilnost je bila določena z uporabo enosmerne analize variance (ANOVA) in Duncanovega testa več razponov v SPSS v20.0 (SPSS).
4.3. Prehodna ekspresija beljakovin v N. benthamiana
MaCFEM85 kodirno zaporedje (CDS) je bilo pomnoženo z ultra-fidelity DNA polimerazo z uporabo cDNA kot matrice. Za teste subcelularne lokalizacije so bili produkti PCR, ki vsebujejo CDS za MaCFEM85, klonirani v pYBA1132-eGFP (prebavljeno z EcoRI in SalI) oziroma pcambia1300-češnja (EcoRI in SacI). Vsi konstrukti so bili validirani s sekvenciranjem (Tsingke Biotechnology Co., Ltd. Peking, Kitajska). Primerji, uporabljeni v tej študiji, so navedeni v dodatni tabeli S2. Za prehodno izražanje MaCFEM85-eGFP in MaCFEM85-mCherry v N. benthamiana je bil sev A. tumefaciens GV3101 transformiran z vsakim plazmidom in preverjen s PCR. Agrobacterium smo gojili čez noč pri 28 ◦C s stresanjem. Celice smo zbrali s 5-minutnim centrifugiranjem pri 5000 obratih na minuto pri sobni temperaturi, trikrat sprali s sterilno dvojno destilirano vodo in resuspendirali v 10 mM MgCl2 pufru (ki vsebuje 10 mM MES in 10 mM acetosiringona, pH 5,7). Suspenzijo celic naravnamo na OD600 0,5, nato pa jo z 1- ml brizgo infiltriramo v spodnjo stran 4- do 5-tednov starih listov N. benthamiana. Vsak list je bil infiltriran s 50 µL A. tumefaciens; trije listi so bili tretirani na rastlino in tri rastline so bile v vsaki tretirani skupini. Obdelane liste smo zbrali po 30 urah in vizualizirali s konfokalnim mikroskopom Zeiss LSM980 (Carl Zeiss, Nemčija), da smo določili podcelično lokalizacijo.
koristi cistanche za moške - krepitev imunskega sistema
4.4. Filogenetska analiza
Filogenetsko drevo je bilo zgrajeno z uporabo metode združevanja sosedov v MEGA X. 1000 zagonskih ponovitev je uporabljalo model P-razdalje. Aminokislinska zaporedja, uporabljena za ustvarjanje drevesa, so bila pridobljena z iskanjem BLASTP v zbirki podatkov NCBI o sorodnih glivah (npr. Magnaporthe oryzae, Botrytis cinerea, Fusarium graminearum, Colletotrichum graminicola, Fusarium oxysporum, Neurospora crassa, Aspergillus fumigatus, Lasiodiplodia theobromae, Gliocladium roseum , Trichoderma harzianum, Beauveria bassiana in Paecilomyces lilacinus) z uporabo MaCFEM85 kot poizvedbo.
4.5. Dvohibridni testi kvasovk
Za preverjanje interakcije med MaCFEM85 in MsWAK16 je bil uporabljen dvohibridni sistem Matchmaker Gold Yeast (Clontech Laboratories, Inc.; zdaj Takara Bio USA, Inc.). MaCFEM85 brez signalnega peptida je bil vstavljen v pGBKT7 kot vaba in zunajcelična domena MsWAK16 (MsWAK16-ED) je bila vstavljena v pGADT7 kot plen. Priprava in transformacije celic, kompetentnih za kvasovke, so bile izvedene z uporabo Frozen-EZ Yeast Transformation II Kit™ (ZYMO Research, CA, ZDA) po navodilih proizvajalca. Plazmidi vabe in plena so bili so-transformirani v sev kvasovk Gold. Interakcije protein-protein so bile analizirane na podlagi rasti na ploščah SD z dvojnim izpadnim medijem (DDO, SD/-Trp-Leu) in SD s štirimi izpadnimi mediji (QDO, SD/-Trp-Leu-His-Ade).
4.6. BiFC test
Za ustvarjanje konstruktov BiFC smo vektorje pUC-SPYNE in pUC-SPYCE linearizirali z razgradnjo z BamHI. CDS polne dolžine MaCFEM85 in MsWAK16 sta bila vsakega klonirana in vstavljena v linearizirane plazmide z uporabo rekombinantnega encima, da smo dobili konstrukta MaCFEM85-YFPN in MsWAK16-YFPC. Plazmidi, ki vsebujejo MaCFEM85 in MsWAK16, so bili sotransformirani s praznimi vektorji kot negativnimi kontrolami (MaCFEM85-YFPN + pUC-SPYCE, MsWAK16-YFPC + pUC-SPYNE in pUC-SPYNE + pUC-SPYCE) . Vsi vektorji so bili vneseni v N. benthamiana s transformacijo, posredovano z Agrobacterium, kot je opisano zgoraj. Fluorescenčne signale smo opazili v epidermalnih celicah listov z uporabo konfokalnega mikroskopa Zeiss LSM980 (Carl Zeiss, Nemčija). Primerji, uporabljeni za vektorsko konstrukcijo, so navedeni v dodatni tabeli S2.
4.7. GST Pull-Down test
Za padajoče teste GST je bil MsWAK16-ED vstavljen v vektor pGEX-6P-2 in MaCFEM85 vstavljen v pET-21b. Prečiščeni fuzijski proteini (GST- MsWAK16- ED) in pGEX-6P-2 protein brez obremenitve (GST) so bili uporabljeni kot protein vabe in prečiščen pET-21 Kot plen je bil uporabljen fuzijski protein b-MaCFEM85 (His-MaCFEM85). GST pulldown testi so bili izvedeni s sistemom za čiščenje beljakovin Mag-Beads GST Fusion (Sangon Biotech, Šanghaj, Kitajska) po navodilih proizvajalca. Na kratko, Mag-Beads smo petkrat sprali z 1 × fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom (PBS, pH 7,4), da smo sprostili alkoholni zaščitnik, nato pa smo dodali 10 ml GST ali GST-MsWAK16-ED. Kroglice smo mešali z inverzijo pri sobni temperaturi 30 minut. Po odstranitvi supernatanta smo Mag-Beads petkrat sprali z 1 × PBS. His-MaCFEM85 smo dodali Mag-Beads, ki so že vezane na GST, in zmes inkubirali čez noč pri 4 ◦C z vrtenjem. Kroglice smo nato petkrat sprali z 1 × PBS, da smo odstranili nevezane proteine. Nato smo proteine, imobilizirane na kroglicah, ločili s SDS-PAGE, prenesli na nitrocelulozno membrano (100 V, 1 h) in analizirali z Western blotom. Membrane smo sprali trikrat po 10 minut s PBS + Tween (PBST). Membrane so bile 2 uri blokirane pri sobni temperaturi s 5 % posnetim mlekom, nato pa inkubirane z mišjim monoklonskim protitelesom ProteinFind anti-His (TransGen Biotech, Peking, Kitajska) (razredčeno 1:3000) ali z mišjim monoklonskim protitelesom ProteinFind anti-GST 2 uri. h pri 4 ◦C. Membrane so bile nato potopljene v protitelesa ProteinFind proti kunčjim IgG(H+L) (HRP) (TransGen Biotech, Peking, Kitajska) (razredčeno 1:5000) za 1 uro pri sobni temperaturi. Membrane smo vizualizirali z EasySee® Western Blot Kit (TransGen Biotech, Peking, Kitajska) po navodilih proizvajalca.
4.8. Identifikacija ključnega mesta v MaCFEM85
Za določitev velikosti, ki je potrebna za interakcijo MaCFEM85 z MsWAK16, je bilo izvedeno pomnoževanje PCR, da se je ustvarilo več okrnjenih oblik MaCFEM85. Domena CFEM (MaCFEM85-CFEM; aa ostanki 19–86) in C terminal brez domene CFEM (MaCFEM85-C, aa ostanki 87–170) sta bili vstavljeni v vektor pGBKT7 kot protein vabe (dodatna tabela S1). Drugih pet različic je bilo konstruiranih z uporabo sinteze polipeptidov za mutacijo cisteina v alanin na položajih 26, 30, 43, 52 in 26/30/43/50/52/64/69/85 (∆CFEM8526, ∆CFEM8530, ∆CFEM8543, ∆ CFEM8552 oziroma vsi ∆CFEM858). Te različice so bile uporabljene za izvajanje poskusov Y2H z MsWAK16-ED. Transformirane celice kvasovk so bile testirane na rast na ploščah s sintetičnim izpadom SD/-Trp-Leu in ploščah SD/-Trp-Leu-His-Ade, ki vsebujejo X- -galaktozidazo (X- -Gal).
4.9. Testi odpornosti rastlin
Myzus persicae so pridobili pri Henan Quanying Biological Co., Ltd. En teden pred začetkom bioloških testov so 150 odraslih listnih uši namestili na tri rastline N. benthamiana (50 listnih uši na rastlino). Po 72 urah so bile vse odrasle osebke odstranjene z mehkim umetniškim čopičem in nimfam je bilo omogočeno, da so se hranile dodatne štiri dni, preden so jih prenesli na N. benthamiana za teste učinkovitosti listnih uši.
4.10. Testi delovanja listnih uši
Nicotiana benthamiana Domin. (Solanales: Solanaceae) je bil uporabljen za oceno delovanja M. persicae, odpornosti rastlin na bolezni proti B. cinerea in izražanja genov, povezanih s hormoni. Agrobakterije, ki so nosile bodisi pYBA-eGFP, pYBA-MaCFEM85, pYBA-MsWAK16 ali pYBA-MaCFEM85+pYBA-MsWAK16, so gojili v LB, dopolnjenem z ustreznimi antibiotiki, 36 ur pri 28 ◦C. Celice smo trikrat sprali, nato resuspendirali v infiltracijskem pufru (10 mM MgCl2, 10 mM MES in 100 µM acetosiringona, pH 5,6) do OD600 0,6. Za sočasno okužbo so bile bakterije, ki prenašajo MaCFEM85 in MsWAK16, naravnane na OD600 1,2 in nato zmešane v enakih volumnih. Popolnoma razširjene liste smo infiltrirali z bakterijami z 1-mL brizgami brez igle. Na vsako rastlino so bili infiltrirani trije listi in vsako zdravljenje je bilo uporabljeno na treh rastlinah za skupno 12 rastlin na poskus.
Za teste delovanja listnih uši je bilo 20 odraslih listnih uši nanešenih na infiltrirano območje vsakega lista 12 ur po nanosu Agrobacterium. Listne uši so bile omejene s kletkami s sponkami s premerom 5 mm. Vsako zdravljenje smo ponovili petkrat. Umrljivost odraslih listnih uši in število na novo položenih livk so beležili dnevno tri dni. B. cinerea je bila gojena pet dni na PDAY. Po 12 urah po infiltraciji z Agrobacterium smo na novo gojeno B. cinerea preluknjali v 5- mm pogačo gliv in rastno površino micelija pritrdili na območje infiltracije na površini lista. Da bi olajšali razvoj bolezni, so rastline vzdrževali vlažne tako, da so jih prekrili s plastično folijo v pladnjih pri 22 ◦C, da bi olajšali napredovanje bolezni. Po 48 urah je bilo napredovanje bolezni ocenjeno v inokuliranih listih z merjenjem velikosti lezij. Za kvantificiranje relativne ekspresije ustreznih genov so bili trije infiltrirani listi zbrani iz vsake rastline 12 ur po infiltraciji, nato zamrznjeni v tekočem dušiku in shranjeni pri -80 stopinjah. Ekstrakcija celotne RNA, sinteza cDNA in qRT-PCR so bile izvedene, kot je opisano v razdelku 3.2. Ravni salicilne kisline (SA), jasmonske kisline (JA) in flavonoidov so bile izmerjene v 15 infiltriranih listih N. benthamiana na zdravljenje. Listi so bili zbrani, zamrznjeni v tekočem dušiku in nato shranjeni pri –80 stopinjah. Rastlinski hormoni so bili kvantificirani z uporabo kompletov ELISA rastlinske saliciklične kisline in rastlinske jasmonske kisline (Beijing WeLab Scientific Co., Ltd.), flavonoidi pa so bili kvantificirani z uporabo kompleta Micro Plant Flavonoids Assay Kit (Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd.). navodila proizvajalca.
4.11. Statistična analiza
Podatki so bili analizirani v SPSS v20.0. Pomembne razlike v stopnjah izražanja MaCFEM85 in MsWAK16 so bile določene s Studentovim t-testom. Pomembne razlike v ravneh SA, JA in flavonoidov so bile določene z uporabo enosmerne ANOVA in Duncanovega testa z več razponi s pragom p < 0,05.
5. Sklepi
V tej študiji smo identificirali in označili novo izločeno beljakovino, MaCFEM85, v M. anisopliae. Ugotovljeno je bilo, da je ohranjen efektor, ki lahko sodeluje z MsWAK16 in aktivira obrambni odziv N. benthamiana. Pokazali smo, da sta bila domena CFEM in cisteinski ostanek na položaju 52 v MaCFEM85 kritična za interakcijo. Ta interakcija lahko aktivira z JA povezane imunske odzive in mehanizme v rastlini, odporne proti boleznim in žuželkam.
Reference
1. Paulucci, NS; Anta, GG; Gallarato, LA; Vicario, JC; Cesari, AB; Reguera, YB; Kilmurray, C.; Bueno, MA; García, MB; Dardanelli, MS Partnerstva med rastlinami in mikrobi: Posledice za rast in zdravje rastlin. V simbioza rastlinskih mikrobov: osnove in napredek; Springer: Berlin/Heidelberg, Nemčija, 2013; strani 105–117. [CrossRef]
2. Schenk, PM; Carvalhais, LC; Kazan, K. Razkrivanje interakcij med rastlinami in mikrobi: ali lahko transkriptomika več vrst pomaga? Biotehnološki trendi. 2012, 30, 177–184. [CrossRef]
3. Sasse, J.; Martinoia, E.; Northen, T. Nahranite svoje prijatelje: Ali rastlinski izločki oblikujejo koreninski mikrobiom? Trends Plant Sci. 2018, 23, 25–41. [CrossRef]
4. Lugtenberg, B.; Kamilova, F. Rizobakterije, ki spodbujajo rast rastlin. Annu. Rev. Microbiol. 2009, 63, 541–556. [CrossRef]
5. Shoresh, M.; Harman, GE; Mastouri, F. Inducirana sistemska odpornost in odzivi rastlin na sredstva za biokontrolo gliv. Annu. Rev. Phytopathol. 2010, 48, 21–43. [CrossRef]
6. van de Mortel, JE; de Vos, RC; Dekkers, E.; Pineda, A.; Guillod, L.; Bouwmeester, KJ; van Loon, J.; Dicke, M.; Raaijmakers, JM Presnovne in transkriptomske spremembe, ki jih pri Arabidopsis povzroča rhizobacterium Pseudomonas fluorescens SS101. Plant Physiol. 2012, 160, 2173–2188. [CrossRef]
7. Lareen, A.; Burton, F.; Schafer, P. Komunikacija rastlinskih korenin in mikrobov pri oblikovanju koreninskih mikrobiomov. Rastlina Mol. Biol. 2016, 90, 575–587. [CrossRef]
8. Sasan, RK; Bidochka, MJ Insekt-patogena gliva Metarhizium Roberts (Clavicipitaceae) je tudi endofit, ki spodbuja razvoj rastlinskih korenin. Am. J. Bot. 2012, 99, 101–107. [CrossRef]
9. Sasan, RK; Bidochka, MJ Antagonizem endofitne insektno patogene glive Metarhizium robertsii proti patogenu rastlin fižola Fusarium solanif. sp. phaseoli. Lahko. J. Plant Pathol. 2013, 35, 288–293. [CrossRef]
10. Ahmad, I.; Jiménez-Gasco, MdM; Luthe, DS; Shakeel, SN; Barbercheck, ME Endofitni Metarhizium robertsii spodbuja rast koruze, zavira rast žuželk in spreminja izražanje obrambnih genov rastlin. Biol. Control 2020, 144, 104167. [CrossRef]
11. Čairin, T.; Petcharat, V. Indukcija obrambnih odzivov v hongkonškem sadju (Aglaia dookkoo Griff.) proti glivam sadne gnilobe z Metarhizium guizhouense. Biol. Nadzor 2017, 111, 40–44. [CrossRef]
12. Hao, K.; Wang, F.; Nong, X.; McNeill, MR; Liu, S.; Wang, G.; Cao, G.; Zhang, Z. Odziv korenin arašidov Arachis hypogaea na prisotnost koristnih in patogenih gliv z analizo transkriptoma. Sci. Rep. 2017, 7, 964. [CrossRef] [PubMed]
13. Patel, ZM; Mahapatra, R.; Jampala, SSM, poglavje 11 - Vloga glivičnih elicitatorjev v obrambnem mehanizmu rastlin. V Molekularni vidiki rastlinsko koristnih mikrobov v kmetijstvu; Sharma, V., Salwan, R., Al-Ani, L., ur.; Academic Press: Cambridge, MA, ZDA, 2020; strani 143–158. [CrossRef]
14. Dong, X.; Sa, JA Etilen in odpornost rastlin na bolezni. Curr. Opin. Plant Biol. 1998, 1, 316–323. [CrossRef] [PubMed]
15. Thomma, BP; Eggermont, K.; Penninckx, IA; Mauch-Mani, B.; Vogelsang, R.; Cammue, BP; Broekaert, WF. Ločene obrambne odzivne poti, odvisne od jasmonata in od salicilata, so pri Arabidopsisu bistvene za odpornost na različne mikrobne patogene. Proc. Natl. Akad. Sci. ZDA 1998, 95, 15107–15111. [CrossRef] [PubMed]
16. Pant, SR; Irigoyen, S.; Liu, J.; Bedre, R.; Christensen, SA; Schmelz, EA; Sedbrook, JC; Scholthof, K.-BG; Mandadi, KK Brachypodium Phenylalanine ammoniak lyase (PAL) Spodbuja protivirusno obrambo proti virusu mozaika Panicum in njegovim satelitom. mBio 2021, 12, e03518-20. [CrossRef]
17. Liu, R.; Xu, S.; Li, J.; Hu, Y.; Lin, Z. Ekspresijski profil gena PAL iz Astragalus membranaceus var. Mongholicus in njegova ključna vloga pri pretoku v biosintezo flavonoidov. Plant Cell Rep. 2006, 25, 705–710. [CrossRef]
18. De Geyter, N.; Gholami, A.; Goormachtig, S.; Goossens, A. Transkripcijski stroji v sekundarnem metabolizmu rastlin, ki ga povzroča jasmonat. Trends Plant Sci. 2012, 17, 349–359. [CrossRef]
19. Mirjalili, N.; Linden, JC Učinki sestave plinske faze na suspenzijske kulture Taxus cuspidata. Biotehnologija. Bioeng. 1995, 48, 123–132. [CrossRef]
20. Li, ST; Zhang, P.; Zhang, M.; Fu, CH; Zhao, CF; Dong, YS; Guo, AY; Yu, LJ Transkripcijski profil celic taxus chinensis kot odziv na metil jasmonat. BMC Genom. 2012, 13, 295. [CrossRef]
21. Tugizimana, F.; Ncube, EN; Steenkamp, PA; Dubery, IA Metabolomics izpeljani vpogled v manipulacijo sinteze terpenoidov v celicah Centella asiatica z metil jasmonatom. Rastlinska biotehnologija. Rep. 2015, 9, 125–136. [CrossRef]
22. Lu, M.; Wong, H.; Teng, W. Učinki elicitacije na proizvodnjo saponina v celični kulturi Panax ginsenga. Plant Cell Rep. 2001, 20, 674–677. [CrossRef]
23. Mandal, S.; Kar, I.; Mukherjee, AK; Acharya, P. Elicitor-inducirani obrambni odzivi v Solanum lycopersicum proti Ralstonia solanacearum. Sci. World J. 2013, 25, 561056. [CrossRef]
24. Li, L.; Wang, S.; Yang, X.; Frančišek, F.; Qiu, D. Protein elicitor PeaT1 poveča odpornost proti listnim ušem (Sitobion avenae) v pšenici. Pest Manag. Sci. 2020, 76, 236–243. [CrossRef] [PubMed]
25. Bujalowski, W. Razširitev fiziološke vloge heksamerne helikaze DnaB. Trends Biochem. Sci. 2003, 28, 116–118. [CrossRef]
26. Vaknin, Y.; Shadkchan, Y.; Levdanski, E.; Morozov, M.; Romano, J.; Osherov, N. Trije GPI-zasidrani proteini domene Aspergillus fumigatus CFEM (CfmA-C) vplivajo na stabilnost celične stene, vendar ne igrajo vloge pri virulenci gliv. glivične. Genet. Biol. 2014, 63, 55–64. [CrossRef]
27. Zhao, S.; Shang, X.; Bi, W.; Ju, X.; Liu, D.; Kang, Z.; Wang, X.; Wang, X. Genomska identifikacija kandidatov za efektorje z ohranjenimi motivi iz glive pšenične listne rje Puccinia triticina. Spredaj. Microbiol. 2020, 11, 1188. [CrossRef]
28. Gong, A.; Jing, Z.; Zhang, K.; Tan, Q.; Wang, G.; Liu, W. Bioinformatska analiza in funkcionalna karakterizacija proteinov CFEM v koruzni antraknozni glivi Colletotrichum graminicola. J. Integr. Agric. 2020, 19, 541–550. [CrossRef]
29. Martin, F.; Aerts, A.; Ahren, D.; Brun, A.; Danchin, EG; Duchaussoy, F.; Gibon, J.; Kohler, A.; Lindquist, E.; Pereda, V.; et al. Genom Laccaria bicolor omogoča vpogled v mikorizno simbiozo. Narava 2008, 452, 88–92. [CrossRef]
31. Štefan, V.; Lara, RJ Entomopatogene glive kot endofiti: interakcije med rastlinami in endofiti ter rastlinojedci in možnosti za uporabo pri biološkem nadzoru. Curr. Sci. 2015, 109, 46–54.
31. Cai, N.; Liu, R.; Yan, D.; Zhang, N.; Zhu, K.; Zhang, D.; Nong, X.; Tu, X.; Zhang, Z.; Wang, G. Bioinformatska analiza in funkcionalna karakterizacija proteinov CFEM Metarhizium anisopliae. J. Glive. 2022, 8, 661. [CrossRef]
32. Stephens, C.; Hammond-Kosack, KE; in Kanyuka, K. WAKsing rastlinska imunost, zmanjševanje bolezni. J. Exp. Bot 2022, 73, 22–37. [CrossRef]
33. Zhang, ZN; Wu, QY; Zhang, GZ; Zhu, YY; Murphy, RW; Liu, Z.; Zou, CG Sistematične analize razkrivajo edinstvenost in izvor domene CFEM v glivah. Sci. Rep. 2015, 5, 13032. [CrossRef] [PubMed]
34. Fang, A.; Gao, H.; Zhang, N.; Zheng, X.; Qiu, S.; Li, Y.; Zhou, S.; Cui, F.; Sun, W. Nov efektorski gen SCRE2 prispeva k polni virulenci Ustilaginoidea virens na riž. Spredaj. Microbiol. 2019, 10, 845. [CrossRef] [PubMed]
35. Zhu, W.; Wei, W.; Wu, Y.; Zhou, Y.; Peng, F.; Zhang, S.; Chen, P.; Xu, X. BcCFEM1, protein, ki vsebuje domeno CFEM z domnevno zasidranim mestom GPI, je vključen v patogenost, proizvodnjo konidijev in toleranco na stres pri Botrytis cinerea. Spredaj. Microbiol. 2017, 8, 1807. [CrossRef]
36. Xu, X.; Li, G.; Li, L.; Su, Z.; Chen, C. Primerjalna analiza celotnega genoma domnevnih receptorjev G, povezanih s proteinom Pth11-, v glivah, ki pripadajo Pezizomycotina. BMC Microbiol. 2017, 17, 166. [CrossRef] [PubMed]
37. Peng, YJ; Hou, J.; Zhang, H.; Lei, JH; Lin, HY; Ding, JL; Feng, MG; Ying, SH Sistematični prispevki proteinov, ki vsebujejo domeno CFEM, k pridobivanju železa so bistveni za interakcijo med vrstami nitaste patogene glive Beauveria bassiana. Okolje. Microbiol. 2022, 24, 3693–3704. [CrossRef] [PubMed]
38. Roy, U.; Kornitzer, D. Pridobivanje heme-železa v glivah. Curr. Opin. Microbiol. 2019, 52, 77–83. [CrossRef] [PubMed]
39. Okamoto-Shibayama, K.; Kikuchi, Y.; Kokubu, E.; Sato, Y.; Ishihara, K. Csa2, član družine beljakovin Rbt5, sodeluje pri uporabi železa iz človeškega hemoglobina med rastjo hif Candide albicans. FEMS Kvas Res. 2014, 14, 674–677. [CrossRef]
40. Perez, A.; Pedros, B.; Murgui, A.; Casanova, M.; Lopez-Ribot, JL; Martinez, JP Tvorba biofilma z mutanti Candide albicans za gene, ki kodirajo glivične proteine, ki kažejo domeno CFEM, ki vsebuje osem cisteina. FEMS Kvas Res. 2006, 6, 1074–1084. [CrossRef]
41. Hogg, PJ Disulfidne vezi kot stikala za delovanje beljakovin. Trends Biochem. Sci. 2003, 28, 210–214. [CrossRef]
42. van den Burg, HA; Westerink, N.; Francoijs, KJ; Roth, R.; Woestenenk, E.; Boeren, S.; de Wit, PJ; Joosten, MH; Vervoort, J. Naravni mutanti z moteno disulfidno vezjo AVR4 paradižnikovega patogena Cladosporium fulvum so občutljivi na proteolizo, se izognejo odpornosti, posredovani s Cf-4-, vendar ohranijo svojo sposobnost vezave hitina. J. Biol. Chem. 2003, 278, 27340–27346. [CrossRef] 43. Hu, K.; Cao, J.; Zhang, J.; Xia, F.; Ke, Y.; Zhang, H.; Xie, W.; Liu, H.; Cui, Y.; Cao, Y.; et al. Izboljšanje številnih agronomskih lastnosti z genom za odpornost na bolezni z ojačitvijo celične stene. Nat. Rastline 2017, 3, 17009. [CrossRef] [PubMed]
44. Saitoh, H.; Fujisawa, S.; Mitsuoka, C.; Ito, A.; Hirabuchi, A.; Ikeda, K.; Irieda, H.; Yoshino, K.; Yoshida, K.; Matsumura, H.; et al. Obsežna genska motnja pri Magnaporthe oryzae identificira MC69, izločeno beljakovino, ki je potrebna za okužbo z glivičnimi patogeni enokaličnic in dvokaličnic. Patog PLoS. 2012, 8, e1002711. [CrossRef] [PubMed]
45. Kulkarni, RD; Kelkar, HS; Dean, R. Domena CFEM, ki vsebuje osem cisteina in je edinstvena za skupino glivičnih membranskih proteinov. Trends Biochem. Sci. 2013, 28, 118–121. [CrossRef] [PubMed]
46. Peng, J.; Wu, L.; Zhang, W.; Zhang, Q.; Xing, Q.; Wang, X.; Li, X.; Yan, J. Sistemska identifikacija in funkcionalna karakterizacija skupnih proteinov zunajceličnih membran gliv v Lasiodiplodia theobromae. Spredaj. Plant Sci. 2021, 12, 804696. [CrossRef]
47. Bari, R.; Jones, JD Vloga rastlinskih hormonov pri obrambnih odzivih rastlin. Rastlina Mol. Biol. 2009, 69, 473–488. [CrossRef]
49. Verma, V.; Ravindran, P.; Kumar, PP Regulacija stresnih odzivov, ki jo posredujejo rastlinski hormoni. BMC Plant Biol. 2016, 16, 86. [CrossRef]
49. Javed, K.; Qiu, D. Protein elicitor PeBL1 Brevibacillus laterosporus poveča odpornost proti Myzus persicae v paradižniku. Patogeni 2020, 9, 57. [CrossRef]
50. Basit, A.; Hanan, A.; Nazir, T.; Majeed, MZ; Qiu, D. Molekularna in funkcionalna karakterizacija elicitorja PeBC1, ekstrahiranega iz Botrytis cinerea, vključenega v indukcijo odpornosti proti zeleni breskovi uši (Myzus persicae) v navadnem fižolu (Phaseolus vulgaris L.). Žuželke 2019, 10, 35. [CrossRef]
52. Nazir, T.; Hanan, A.; Basit, A.; Majeed, MZ; Anwar, T.; Nawaz, I.; Qiu, D. Domnevna vloga še neopredeljenega proteinskega elicitorja PeBb1, pridobljenega iz seva Beauveria bassiana ARSEF 2860 proti Myzus persicae (Homoptera: Aphididae) v Brassica rapa ssp. pekinensis. Patogeni 2020, 9, 111. [CrossRef]
52. Spoel, SH; Koornneef, A.; Claessens, SM; Korzelius, JP; Van Pelt, JA; Mueller, MJ; Buchala, AJ; Metraux, JP; Brown, R.; Kazan, K.; et al. NPR1 modulira navzkrižni pogovor med od salicilata in jasmonata odvisnimi obrambnimi potmi prek nove funkcije v citosolu. Rastlinska celica 2003, 15, 760–770. [CrossRef]
53. Xin, XF; He, SY Pseudomonas syringae pv. paradižnik DC3000: model patogena za sondiranje občutljivosti na bolezni in signaliziranje hormonov v rastlinah. Annu. Rev. Phytopathol. 2013, 51, 473–498. [CrossRef] [PubMed]
54. Zhang, X.; Wang, C.; Zhang, Y.; Sonce, Y.; Mou, Z. Podenota mediatorskega kompleksa Arabidopsis16 pozitivno uravnava sistemsko pridobljeno odpornost, posredovano s salicilatom, in obrambne poti, ki jih povzroča jasmonat/etilen. Rastlinska celica 2012, 24, 4294–4309. [CrossRef] [PubMed]
55. Doares, SH; Narvaez-Vasquez, J.; Conconi, A.; Ryan, CA Salicilna kislina zavira sintezo inhibitorjev proteinaze v listih paradižnika, ki jih povzroča sistemin in jasmonska kislina. Plant Physiol. 1995, 108, 1741–1746. [CrossRef] [PubMed]
56. Pieterse, CM; Leon-Reyes, A.; Van der Ent, S.; Van Wees, SC Mreženje s hormoni majhnih molekul v imunosti rastlin. Nat. Chem. Biol. 2009, 5, 308–316. [CrossRef]
57. Penninckx, IA; Thomma, BP; Buchala, A.; Métraux, JP; Broekaert, WF Za indukcijo gena rastlinskega defenzina pri Arabidopsis je potrebna sočasna aktivacija poti odziva na jasmonat in etilen. Rastlinska celica 1998, 10, 2103–2113. [CrossRef]
58. Fang, W.; Bidochka, MJ Izražanje genov, ki sodelujejo pri kalitvi, konidiogenezi in patogenezi pri Metarhizium anisopliae z uporabo kvantitativne RT-PCR v realnem času. Mycol. Res. 2006, 110, 1165–1171. [CrossRef]
59. Guerriero, G.; Legay, S.; Hausman, JF Ekspresija gena za sintazo celuloze lucerne pod abiotskim stresom: Štoparski vodnik za normalizacijo RT-qPCR. PLoS ONE 2014, 9, e103808. [CrossRef]
60. Yang, Y.; Zhang, Y.; Li, B.; Yang, X.; Dong, Y.; Qiu, D. Verticillium dahliae pectate lyase inducira rastlinski imunski odziv in prispeva k virulenci. Spredaj. Plant Sci. 2018, 9, 1271. [CrossRef]
62. Livak, KJ; Schmittgen, TD. Analiza podatkov o relativnem izražanju genov z uporabo kvantitativne PCR v realnem času in metode 2(-Delta Delta C(T)). Metode 2001, 25, 402–408. [CrossRef]
