Ključne vloge TRPM6 pri cirkadianem uravnavanju krvnega tlaka

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Pomen ledvičnega ionskega kanala TRPM6 v cirkadianem izločanju renina za zvišanje krvnega tlaka

Yosuke Funato, Daisuke Yamazaki, Daisuke Okuzaki, Nobuhiko Yamamoto & Hiroaki Miki

Krvni pritiskima dnevni vzorec, z višjimi vrednostmi v aktivnem obdobju. Njegovo zvišanje na začetku aktivnega obdobja bistveno poveča tveganje za srčno-žilne dogodke s smrtnim izidom. Izločanje renina, ki ga spodbujajo ledvični simpatični nevroni, velja za bistveno za ta proces; vendar njegov regulativni mehanizem ostaja večinoma neznan. Tukaj prikazujemo pomenprehodni receptorski potencial, povezan z melastatinom 6 (TRPM6), Mg2 plus-prepustni kationski kanal, pri povečanju izločanja renina v aktivnem obdobju.TRPM6izražanje je znatno zmanjšano v distalnem zavitem tubulu hipotenzivnih miši s pomanjkanjem Cnnm2-. Ustvarjamo specifično za ledviceTRPM6-pomanjkljive miši in opazili zmanjšanjekrvni pritiskin izginotje njegove cirkadiane variacije. Dosledno se izločanje renina v aktivnem obdobju ne poveča. Poleg tega se izločanje renina po farmakološki aktivaciji -adrenoreceptorja, tarče nevronske stimulacije, razveljavi, izražanje receptorja pa se zmanjša v celicah, ki izločajo renin. Ti rezultati kažejo na ključno vlogoTRPM6 v cirkadiani regulacijikrvni pritisk.

Ocenjuje se, da ima približno milijarda ljudi po vsem svetu hipertenzijo, kar znatno poveča tveganje za različne bolezni, vključno s potencialno smrtnimi boleznimi, kot sta ishemična bolezen srca in možganska kap. Znano je, da se ti s hipertenzijo povezani smrtni dogodki pogosto zgodijo zgodaj zjutraj, na začetku aktivnega obdobja, kokrvipritiskmočno naraste. Za izločanje renina, ki ga sprožijo ledvični simpatični nevroni, velja, da ima pri tem ključno vlogo.krvni pritiskvišine, vendar njegov regulativni mehanizem ni dobro razumljen².

cistanche bodybuilding

Splošno sprejeto je, da imajo nekateri prehranski minerali, zlasti natrij in kalij, pomembno vlogo pri nadzorukrvipritisk. Magnezij je pomemben bistveni element, ki sodeluje pri različnih bioloških dejavnostih. Epidemiološke študije so pokazale pomembno obratno razmerje med ravnmi magnezija v prehrani in tveganjem za hipertenzijo3-6. Poleg tega je izločanje magnezija z urinom, za katerega se domneva, da je v približno ravnovesju z absorpcijo magnezija v črevesju, v obratni korelaciji s tveganjem za hipertenzijo. Te ugotovitve kažejo na tesno povezavo med homeostazo magnezija v telesu inkrvni pritiskregulacijo, ki poudarja pomen kanalov in/ali prenašalcev Mg2 plus pri regulacijikrvni pritisk.

Velika količina magnezija se nenehno reabsorbira v ledvicah. Večina magnezija v glomerularnem filtratu se reabsorbira v debelem naraščajočem delu Henlejeve zanke, vendar se zadnja stopnja reabsorpcije zgodi v distalnem zavitem tubulu (DCT)8. Slednji proces je strogo reguliran, da prilagodi količino reabsorpcije na raven, primerno za vzdrževanje homeostaze magnezija. Genomske analize prirojenih bolezni s simptomi hipomagneziemije so razkrile več ključnih molekul, vključenih v ta procesTRPM6, kodiranjeprehodni receptorski potencial, povezan z melastatinom 6(TRPM6), ki je mutiran pri bolnikih z recesivno hipomagneziemijo s sekundarno hipokalcemijo 2,10.TRPM6tvori ionski kanal, prepusten za Mg2 plus, lokaliziran na apikalni membrani celic DCT, in posreduje vnos Mg2 plus iz tubularnega lumna1. Druga ključna molekula je ciklin M2 (CNNM2) in Mg2 plus transporter, lokaliziran na bazolateralni membrani celic DCT12,13. Mutacije Cnnm2 povzročajo družinsko prevladujočo hipomagneziemijo, za katero so značilne napake v reabsorpciji magnezija v ledvicah2. Miši s pomanjkanjem Cnmm2- kažejo podobne simptome hipomagneziemije z izgubljanjem magnezija v ledvicah4. Natančna molekularna vloga CNNM2 je še vedno sporna, vendar več vrst dokazov kaže, da posreduje Mg2 in iztok iz DCT celic skozi bazolateralno membrano5, s čimer prispeva k reabsorpciji magnezija. Nadaljnje analize miši s pomanjkanjem Cnnm2-so pokazale, da imajo te miši tudi znatno nižjekrvipritiskkot kontrolne miši4. Vendar mehanične podrobnosti in vpletenost drugih kanalov/transporterjev Mg2 plus pri temkrvipritiskuredba ostaja neznana.

Znano je tudi, da ima ledvični DCT ključno vlogo prikrvipritiskuravnavanje, ker močno reabsorbira natrij in uravnava volumen telesnih tekočin6. Številni kationski kanali/transporterji, kot so Na-Cl kotransporter (NCC), epitelijski natrijev kanal (ENaC) in Na plus /H plus izmenjevalec 2 (NHE2), se izražajo na DCT apikalni membrani in nekaterih ti proteini posredujejo pri vnosu Na plus v celice DCT iz tubularnega lumna. Znotrajcelični Na plus se nato iztisne iz celic skozi bazolateralno membrano z Na plus /K plus -ATPazo, da se doseže njegova reabsorpcija. Poleg neposredne vpletenosti v uravnavanje volumna telesnih tekočin se DCT nahaja ob makuli densi, ki nadzoruje izločanje renina, hormona z glavno vlogo pri orkestriranjukrvni pritiskuredba17,18. Z zaznavanjem ravni Cl- v urinu celice makule densa stimulirajo bližnje jukstaglomerularne (JG) celice, da izločajo renin.

V tem delu izvajamo analize transkriptoma z ledvicami hipotenzivnih miši s pomanjkanjem Cnnm2-. Ugotavljamo znatno zmanjšanjeTrpm6, kar nas spodbudi k ustvarjanju specifičnih za ledviceTrpm6-pomanjkljive miši. Nepričakovano analize tega seva miši razkrijejo fenotip, ki se kvalitativno razlikuje od fenotipa s pomanjkanjem Cnnm2-: izguba cirkadianih variacijkrvipritisk. Ugotavljamo tudi, da je ta fenotip posledica oslabljenega izločanja renina, akrvni pritisk- zvišanje hormona, katerega raven v krvi je običajno povišana med aktivno fazo.

cistanche bodybuilding

Rezultati

Zmanjšanje regulacijeTRPM6 (prehodni receptorski potencial, povezan z melastatinom 6)izražanja pri miših s pomanjkanjem Cnnm2-. Za raziskovanje molekularnega mehanizmakrvni pritiskzmanjšanje Cnnm{0}}miši s pomanjkanjem, smo izvedli analize mikromrež DNA, da bi raziskali spremembe izražanja genov v ledvicah Cnnm2f/il; Šest2-Cre miši, ki nimajo obeh alelov Cnnm2 v ledvici4. Med različno izraženimi geni (tabela 1) smo se odločili za analizo Pvalb inTrpm6, ki sta oba izražena v DCT919. Kvantitativne PCR(qPCR) analize so pokazale, daTrpm6izražanje je bilo podobno zmanjšano v ledvicah obeh Cnnm2fi; Šest2-Cre in Cnnm2 plus / miši. Ker sta oba Cnnm2 plus /A in Cnnm2fi/; Analizirali smo, da je bilo šest2-Cre miši hipotenzivnih4TRPM6 izražanje podrobneje. Imunobloting analize ledvičnih lizatov so potrdile znatno zmanjšanjeTRPM6na ravni beljakovin zaradi pomanjkanja Cnnm2-, medtem ko ravni NCC in fosforiliranega NCC (aktivna oblika) niso bile opazno prizadete, izražanje CNNM2 pa je bilo potrjeno z zaporednimi analizami imunoprecipitacije in imunoblotinga). ZmanjšanjeTRPM6v ledvicah Cnnm2f/i; Šest 2-Cre miši je bilo potrjenih tudi z imunofluorescenčnimi analizami.

Pregledali smo tudiTRPM6izražanje pri miših brez CNNM4, ki prav tako kažejo simptome hipomagneziemije20, vendar imajo povišanokrvni pritisk4. Imunobloting in imunofluorescenčne analize so pokazale, daTRPM6izražanje povečano v celicah DCT miši s pomanjkanjem Cnnm4-, kar kaže, daTRPM6izraz je tesno povezan zkrvni pritiskvrednosti, vendar ni neposredno povezan z ravnijo magnezija v krvi.

Uredba oTRPM6izražanje z intracelularnim Mg2 plus v celicah DCT. Za karakterizacijo molekularnega mehanizmaTRPM6 znižanje regulacije pri miših s pomanjkanjem Cnnm2-, smo uporabili celično linijo MDCT21, pridobljeno iz DCT, ki med geni družine Cnnm izraža pretežno Cnnm2 in zmerno Cnnm3 in Cnnm4. Ker imata CNNM2 in CNNM4 močno aktivnost Mg2 plus iztoka, medtem ko CNNM3 nima aktivnosti Mg2 plus iztoka15, smo izvedli knockdown, posredovan z majhno motečo RNA (siRNA), Cnnm2, Cnnm4 ali obeh. Podrtje Cnnm2 je povečalo znotrajcelične ravni Mg plus ([Mg plus ]), sočasno znižanje Cnnm4 pa je privedlo do rahlega zvišanja povprečja [Mg2]; vrednosti, ki ni bila statistično pomembna. Naprej smo pregledaliTrpm6ekspresijo s qPCR in ugotovil znatno zmanjšanje po knockdownu Cnnm2 in veliko večje zmanjšanje po dvojnem knockdownu Cnnm2 in Cnnm4. zatoTrpm6Zdi se, da je izražanje negativno regulirano z znotrajceličnimi ravnmi Mg2 plus, kar je skladno s prejšnjimi poročili23. Da bi neposredno preučili pomen Mg2 plus, smo gojili celice MDCT v gojiščih z različnimi koncentracijami Mg2 plus. 1 h je zmanjšanje zunajcelične koncentracije Mg2 plus povzročilo zmanjšanje znotrajcelične ravni Mg2 plus in povečanjeTrpm6ekspresijo, kar kaže na zaviralno vlogo Mg2 plus. V primeru dvojnih knockdown (Cnnm2/Cnnm4) MDCT celic,Trpm6izražanje je bilo zatrto z zmanjševanjem Mg2 plus

povečane koncentracije do 0,2 mm, vendar so nadaljnja znižanja izničila supresivni učinek; tako znotrajcelični Mg2 plus kotTrpm6ravni se niso bistveno razlikovale od kontrolnih celic, transficiranih s siRNA, v pogojih 0.1 in 0.02 mM. Ti rezultati kažejo na od Mg2 plus odvisen regulativni mehanizemTrpm6izraz, ki pojasnjujeTrpm6znižana regulacija v ledvicah miši s pomanjkanjem Cnnm2-.

Pogojna motnjaTrpm6 (prehodni receptorski potencial, povezan z melastatinom 6)v ledvicah. Nato smo želeli ustvaritiTrpm6-pomanjkljive miši za nadaljnje raziskovanje pomenaTRPM6v uredbi okrvni pritisk. Uporabili smo klon embrionalnih matičnih (ES) celic, ki nosijo rekombinantTrpm6alel (Trpm6-), ki vsebuje spojno akceptorsko sekvenco, ki povzroči prezgodnje spajanje mRNA in ima za posledico mRNA, okrnjeno po eksonu 6. Himerne heterozigotne miši so bile pridobljene z blastocistno injekcijo celic ES in rekombinacija je bila potrjena s PCR. Te smo križaliTrpm6plus /- miši, a neTrpm6-/--off_vzmeti. Ta rezultat je skladen s prejšnjimi poročili, ki kažejo embrionalno smrtnost priTrpm6-pomanjkljive miši24,25

Zato smo izvedli za ledvice specifično pogojno motnjoTrpm6z uporabo Six2-Cre, ki omogoča učinkovito in specifično izražanje GFP-fuzionirane rekombinaze Cre v embrionalni ledvici.Trpm6fl/, Six2-Cre miši (specifične za ledviceTrpm6-miši s pomanjkljivostjo) so bile rojene pri pričakovanem mendelskem razmerju. Za določitev izražanjaTRPM6smo izvedli imunobloting analize z anti-TRPM6protitelesa.TRPM6raven beljakovin se je v ledvicah močno zmanjšalaTrpm6fl/fl, Six2-Cre miši, vendar v drugih organih niso opazili pomembnih sprememb. Imunofluorescenčne analize obarvanja prav tako niso pokazale izražanjaTRPM6v NCC-pozitivnih DCT celicah. Opazili nismo pomembnegaTRPM6-pozitiven signal v več kot 100 takšnih skupinah NCC-pozitivnih celic, kar kaže, daTRPM6ekspresija je skoraj popolnoma potlačena v DCT celicah Trpmfi/; Šest2-Cre miši. Ti rezultati potrjujejo uspešno ustvarjanje ledvično specifičnihTrpm6-pomanjkljive miši.

Najprej smo preučili učinek, specifičen za ledviceTrpm6- pomanjkanje homeostaze magnezija. Miši smo vzdrževali v presnovnih kletkah in zbrali vzorce urina in seruma, ki smo jih nato podvrgli kolorimetrični kvantitaciji ravni magnezija z uporabo Xylidyl Blue-I. Serumske ravni magnezija so bile znatno nižje priTrpm6l/l; Šest2-Cre miši v primerjavi s tistimi iz kontroleTrpm6plus / plus; Šest2-Cre miši, medtem ko so bile ravni magnezija v urinu višje. Izvedli smo tudi analize emisijske spektroskopije z induktivno sklopljeno plazmo (ICP-ES), da bi izmerili več glavnih kovinskih elementov v serumu in ugotovili, da so bile pri Trpmd/ pomembno prizadete le ravni magnezija; Šest2-Cre miši. Ti rezultati jasno kažejo, da imajo ledvično specifične miši s pomanjkanjem Trpm6-hipomagneziemijo z izgubljanjem magnezija v ledvicah, kot so opazili pri za ledvice specifičnih micelih s pomanjkanjem Cnnm2-4.

Pomanjkanje cirkadianih variacijkrvipritiskin aktivnost renina. Naprej smo podvrgliTrpm6i/l; Šest2-Cre miši zakrvipritiskmeritve z uporabo radiotelemetrije. Sistolični in diastoličnikrvni pritiskvrednosti sta bili obe znatno nižji vTrpm6l/; Šest2-Cre miši kot pri kontrolnih miših. Omeniti velja, da običajna cirkadiana variacijakrvni pritisk, z visokimi vrednostmi v temnem obdobju in nizkimi vrednostmi v svetlem obdobju pri miših, niso opazili priTrpm6f/l; Šest2-Cre miši. Da bi preverili, ali cirkadiani ritem poteka normalno, smo uporabili radiotelemetrijo za merjenje lokomotorne aktivnosti miši in potrdili zelo jasno cirkadiano variacijo vTrpm6l/; Šest{{0}}Cre miši. Pregledali smo tudi krvne ravni vazopresina (AVP) in ravni mRNA dveh urnih genov Bmall in Per2 v možganih in ledvicah; za vse je znano, da kažejo tipične cirkadiane variacije27,28. Analizirali smo v šestih različnih časovnih točkah (pri 0,4,8 zeitgeberovih časih (ZT) za svetlo obdobje in pri 12,16,20 ZT za temno obdobje). Kontrolne miši kažejo jasne cirkadiane vzorce njihovega izražanja, kot smo že poročali28, in spet nismo našli nobenih pomembnih nepravilnosti vTrpm6/il; Šest2-Cre miši. Preverili smo tudi raven izražanja Trpm7, ki kodira kanal, prepusten za Mg2 plus, ki je tesno povezan zTRPM6, v ledvicah. Vzorci izražanja so bili pri obeh zelo podobniTrpm6plus / plus; Šest2-Cre in Trpm6f/; Šest2-Cre miši in niso pokazale jasnih cirkadianih vzorcev. Skupaj sklepamo, da cirkadiani ritem poteka normalnoTrpm6jaz; Šest2-Cre miši. Veljalo je, dakrvipritiskzvišanje med aktivnim obdobjem (temno obdobje za miši in svetlo obdobje za ljudi) pri ljudeh in miših se pojavi kot odgovor na povečanje izločanja renina v kri2. Izmerili smo aktivnost renina v vzorcih krvi, zbranih v šestih različnih časovnih točkah, opisanih zgoraj. Jasno povečanje aktivnosti renina v krvi so opazili v temnih obdobjih v vzorcih kontrolnih miši, vendar niso opazili pomembnega povečanja v vzorcih mišiTrpm6/lŠest2-Cre miši. Izmerili smo tudi raven noradrenalina v krvi, katerega sproščanje, kot je znano, spodbuja aktivacija sistema renin-angiotenzin29,30. Po pričakovanjih je izginila tudi njihova cirkadiana variacijaTrpm6, Šest2-Cre miši. Medtem na raven beljakovin angiotenzinogena v krvi (AGT), druge molekule, ki omejuje hitrost za aktiviranje sistema renin-angiotenzin pri miših31, ni vplivaloTrpm6 pomanjkanje. Rezultati kažejo, da je oslabljena cirkadiana variacija renina pomembna za izgubo cirkadiane variacijekrvipritiskavtorTrpm6-pomanjkanje.

BližinaTRPM6-izražajoče celice v celice, ki izločajo renin. Renin se izraža in izloča iz JG celic v ledvicah17,18. Celice JG so v neposrednem stiku z maculo densa, ki se nahaja v bližini DCT in stimulira izločanje renina iz celic JG kot odgovor na znižanje ravni Cl v urinu18. Imunofluorescenčno barvanje za renin in nevronsko sintazo dušikovega oksida (nNOS), marker macula densa, ni pokazalo nepravilnosti v vzorcu ali intenzivnosti pozitivnih signalov, opaženih v bližini glomerulov vTrpm6f/; Šest2-Cre miši. Zato se zdi, da na celice, ki so neposredno vključene v izločanje renina in njegovo regulacijo, ne vpliva bistvenoTrpm6pomanjkanje. KotTRPM6je soizražen z NCC v DCT, smo nato pregledali prostorsko razmerje medTRPM6/NCC-izražajoče celice (DCT) in celice macula densa ali JG. Konfokalne slike sagitalnih odsekov DCT so pokazale skoraj popolno prekrivanjeTRPM6in NCC signale v celotnem DCT. Nato smo obarvali za nNOS in NCC in ugotovili, da so območja, pozitivna za nNOS in NCC, povezana brez kakršnega koli prekrivanja signalov. Poleg tega dvojno barvanje za renin inTRPM6/NCC je razkril, da nekateriTRPM6Celice, ki izražajo /NCC, so v bližini celic JG, ki izražajo renin, kar kaže, daTRPM6Celice, ki izražajo /NCC, kot tudi makula densa lahko pomembno vplivajo na izločanje renina.

Moteno izločanje renina zaradiTrpm6 (prehodni receptorski potencial, povezan z melastatinom 6)pomanjkanje. Na splošno ima avtonomni živčni sistem ključno vlogo pri orkestriranju napredovanja cirkadianega ritma. Izločanje renina iz celic JG med aktivnim obdobjem naj bi stimuliral noradrenalin, izločen iz ledvičnih simpatičnih nevronov32. Da bi neposredno raziskali učinek takšne stimulacije na izločanje renina, smo pripravili rezine ledvic in jih stimulirali z izoproterenolom, agonistom -adrenoreceptorja (AR). Rezultati so pokazali zelo jasno zmanjšanje renin-pozitivnega signala, ki je ostal v rezini po 30-minutni stimulaciji z izoproterenolom. Kvantitativne analize so pokazale, da se je odstotek glomerulov, obdanih z renin-pozitivnim signalom, zmanjšal s približno 80 odstotkov na 30 odstotkov po stimulaciji z izoproterenolom, kar kaže na pojav masivnega izločanja renina. Vendar pa nismo opazili pomembnega učinka stimulacije z izoproterenolom na reninski signal v rezinah ledvic izTrpm6/1; Šest2-Cre miši. Za potrditev rezultata smo izmerili tudi aktivnost renina v krvi po dajanju izoproterenola. Rezultati kažejo, da je bilo pomembno zvišanje aktivnosti renina v krvi opaženo samo pri kontrolnih miših, medtem ko je bilo povečanje srčnega utripa pogosto opaženo pri obeh sevih. Ti rezultati kažejo, da se celice JG, ki izločajo renin, ne morejo odzvati na stimulacijo ledvičnih simpatičnih nevronov, kar je skladno z izginotjem cirkadianega povečanjakrvipritiskin aktivnost renina vTrpm6l/fl; Šest2-Cre miši.

Celice JG je mogoče tudi stimulirati, da izločajo renin kot odziv na prostaglandine, med katerimi velja, da je prostaglandin E2 (PGE2) najpomembnejši, saj ga fiziološko izločajo celice makule densa, ko se ravni Cl- v urinu zmanjšajo 17,18. Poleg tega je znano tudi, da lahko PGE, zdravljenje ledvičnih rezin, učinkovito stimulira izločanje renina33. Stimulacija celic JG s PGE2 in izoproterenolom običajno aktivira produkcijo cAMP, kar na koncu povzroči izločanje renina. Zato smo testirali tudi učinek PGE in analog cAMP, prepusten za membrano, dibutilil-cAMP(db-cAMP).PGE2 in db-cAMP sta uspešno spodbudila izločanje renina v rezinah ledvic iz Trpmdi/A, Six2- Cre miši in kontrolne miši. To kaže na toTrpm6 pomanjkanje ne razveljavi splošnega mehanizma, ki sodeluje pri zaznavanju zunanjih signalov, posredovanju znotrajceličnih signalov in izvajanju izločanja renina, vendar posebej vpliva na odziv na -AR.

Zmanjšana ekspresija -AR v celicah JG zaTrpm6 (prehodni receptorski potencial, povezan z melastatinom 6)pomanjkanje. Oslabljen odziv receptorja -ARTrpm6l/l; Šest2-Cre miši nas je vodilo k raziskovanju statusa ekspresije receptorja -AR, zato smo izvedli imunofluorescenco 1-AR, glavnega podtipa -AR, izraženega v celicah JG34. Kot smo že poročali34, smo našli traku podoben vzorec obarvanja v ledvičnih odsekih kontrolnih in Trpmdi/l, Six2-Cre miši. Znano je, da je 1-AR močno izražen tako v krvnih žilah kot v celicah JG34 in dosledno so bile pozitivne tudi 1-AR-pozitivne celice na koncu traku podobnega obarvanja v ledvicah kontrolne miši za obarvanje z reninom (prikazano s konico puščice). Nasprotno pa je obarvanje Trpm6l/fl; Ledvica šest2-miši Cre je pokazala manjše število 1-AR/renin dvojno pozitivnih celic, kar nakazuje, da je bila ekspresija 1-AR zmanjšana v celicah JG. Da bi potrdili to ugotovitev, smo izolirali celice JG z uporabo metode centrifugiranja z gradientom gostote Percoll v skladu s prejšnjim poročilom35. Imunobloting analize so pokazale, da so renin-pozitivne celice JG obogatene s frakcijo pasu 3, kar je skladno z njihovim poročilom35, in 1-izražanje AR v tej frakciji pasu 3 je bilo specifično precej nižje pri Trpmdi/1; Šest2-Cre miši. Skupaj smo ugotovili, daTrpm6pomanjkanje zmanjša raven izražanja 1-AR v celicah JG, kar je skladno z oslabljenim izločanjem renina.

Učinek umetnega posega na cirkadianekrvipritiskvariacija. V končnem nizu poskusov smo testirali učinek različnih posegov na cirkadianekrvipritiskvariacija. Da bi potrdili pomembnost renina, smo mišim divjega tipa dajali klinično dostopen zaviralec renina aliskiren36. Všeč mi jeTrpm6ablacija je dajanje aliskirena s kirurško vsaditvijo osmotske mini črpalke znatno zavrlo cirkadianikrvipritiskvariacija. Nato smo izvedli operacije ledvične denervacije, saj je aktivacija -AR na celicah JG skozi simpatični živčni sistem glavna pot za stimulacijo izločanja renina na cirkadiani način2. Spet smo ugotovili, da je intervencija zatrlakrvipritiskvariacija. Ti rezultati se ujemajo z našim modelom, da so napake v odzivu -AR in izločanje renina odgovorne za izgubokrvni pritiskvariacija Trpmdl/l; Šest2-Cre miši.

Preizkusili smo tudi učinek povečanja vsebnosti magnezija v prehrani. V ta namen so miši divjega tipa 1 mesec hranili z visoko vsebnostjo magnezija, ki je vsebovala 0,6 odstotka (normalna prehrana:0,3 odstotka magnezija). Kot je bilo pričakovano, so te miši pokazale povišane ravni Mg v krvi. Nato smo preverili stopnjo izražanjaTRPM6pri DCT; se je drastično zmanjšal s hrano z visoko vsebnostjo Mg in obseg zmanjšalTRPM6izražanje je bilo večje od ledvične ablacije Cnnm2. Ko smo izmerilikrvni pritiskpri teh miših smo ugotovili, da so miši, hranjene z dieto z visoko vsebnostjo Mg, pokazale bistveno manjšekrvipritiskvariacija kotTrpm6-pomanjkljive miši, kar je v skladu z našo predstavo o ledvičniTRPM6je pomembna za cirkadianekrvni pritiskvariacija.

Tabela 1 Geni, ki so bili regulirani navzgor ali navzdol v ledvicah Cnnm2flfl/flfl; Šest2-Cre miši.

Diskusija

V tej študiji smo dokazali pomenTRPM6 (prehodni receptorski potencial, povezan z melastatinom 6)v uredbi okrvni pritisk. Zlasti kažemo skoraj popolno izginotje cirkadiane variacijekrvni pritiskpri specifičnih za ledviceTrpm6-pomanjkljive miši. Ugotovili smo tudi, da je bilo izločanje renina, ključnega hormona, ki uravnava krvni tlak, močno moteno vTrpm6-pomanjkljive miši, kar je skladno z opaženimkrvni pritiskfenotip. Več poročil je pokazalo, da je TRPM7, še en kanal, prepusten za Mg2 plus, zelo podobenTRPM6, vpliva tudi na krvni tlak37,38. TRPM7 preprečuje povečanjekrvni pritiskpo dajanju angiotenzina II z zaviranjem odziva vaskularnih endotelijskih celic na angiotenzin II37. Ravno nasprotno, nedavno so poročali, da TRPM7 olajša tudi dvigkrvni pritiskob dajanju leptina s posredovanjem Mg2 plus pritoka v celice karotidnega telesa38. Tako je vloga TRPM7 vkrvni pritiskuredba je dvoumna. Ker pa na raven izražanja TRPM7 v ledvicah niso vplivale ledviceTrpm6ablacije (dopolnilna slika 5), ​​se zdi, da TRPM7 ni neposredno vključen v fenotipe, opažene v tej študiji.

Kot so opazili pri miših s pomanjkanjem Cnnm2-,krvni pritiskvrednosti so se znižale vTrpm6-pomanjkljive miši (slika 2)14. Vendar je treba opozoriti, da je med temi mišmi obstajala jasna razlika. Motnje Cnnm2 so na splošno zmanjšanekrvni pritisk, vendar je bila cirkadiana variacija še vedno jasno opazna. Nasprotno pa je ta variacija izginila vTrpm6-pomanjkljive miši. Takšna kvalitativna razlika je tudi skladna z našim opažanjem, da se je cirkadiana variacija renina ohranila pri miših s pomanjkanjem Cnnm2- (dopolnilna slika 9). Opozoriti je treba, da tako CNNM2 kotTRPM6so pomembni za ledvično reabsorpcijo Mg2 plus s posredovanjem vektorskega transporta Mg2 plus skozi DCT, in dejansko so miši s pomanjkanjem obeh genov pokazale identičen ledvični fenotip izgube Mg2 plus (slika 1 in ref. 39). Kvalitativna razlika medkrvni pritiskfenotip med Cnnm2-inTrpm6-miši s pomanjkanjem kaže, da Mg2 plus transport v DCT, ki je skupna funkcija obeh molekul, ni neposredno vključen v cirkadiano variacijokrvni pritiskin izločanje renina, kar kaže, da je CNNM2-neodvisna vlogaTRPM6je osnova teh zanimivih fenotipov.

Več mehanizmov deluje za spodbujanje izločanja renina iz celic JG za vzdrževanjekrvni pritisk. Med njimi velja, da ima vnos iz ledvičnih simpatičnih nevronov glavno vlogo pri povečanjukrvni pritiskmed aktivnim obdobjem cirkadiane variacije32. Ti nevroni izločajo noradrenalin, ki se veže na in aktivira -AR na celicah JG, da stimulira proizvodnjo cAMP, kar končno vodi do izločanja renina1732. V naših poskusih smo uporabili rezine ledvic, pridobljene izTrpm6-miši s pomanjkanjem, stimulacija z izoproterenolom, agonistom -AR, ni pokazala učinka na izločanje renina, medtem ko je stimulacija s PGE2 ali db-cAMP učinkovito povečala izločanje renina (slika 4). PGE2 izloča makula densa kot odziv na nizke ravni Cl- v urinu in aktivira receptorja EP2 in EP4 na celicah JG, kar, tako kot aktivacija -AR, na koncu stimulira produkcijo cAMP40. Zato ti rezultati pomenijo, da je signalizacija -AR selektivno razveljavljena v celicah JGTrpm6-miši s pomanjkanjem, ne da bi vplivali na signalno pot, ki jo posreduje cAMP. Dosledno sta imunofluorescenca delov mišjih ledvic in imunobloting izoliranih celic JG pokazala, da je bila ekspresija -AR znatno zmanjšana v celicah JGTrpm6-pomanjkljive miši (slika 5). Takšna zmanjšana ekspresija -AR naj bi povzročila, da celice JG ne morejo izločati renina kot odgovor na stimulacijo simpatičnega živca med aktivnim obdobjem, s čimer bi odpravili cirkadiane spremembe ravni renina v krvi inkrvni pritisk. Opozoriti je treba, da obstaja študija z uporabo 1/ 2-AR izločenih miši, ki je pokazala zmanjšano cirkadianokrvni pritiskvariacija kotTrpm6-pomanjkljive miši41. Pripisali so ga zmanjšani lokomotorni aktivnosti, vendar ostaja možno, da zmanjšana cirkadiana variacija aktivnosti renina prispeva k zmanjšani cirkadiani variacijikrvni tlake. Druga možnost je, da nenavadno ozadje njihovih miši (mešano ozadje C57BL6/J, 129 in VFB; uporabili smo čisto ozadje C57BL6/) lahko prikrije učinek -AR nakrvni pritiskvariacija; genetsko ozadje je kritično za cirkadianekrvni pritiskvariacija42.

cistanche bodybuilding

Kako izgubaTRPM6 (prehodni receptorski potencial, povezan z melastatinom 6)v celicah DCT vodi do zmanjšane ekspresije -AR v celicah JG je ostala nedosegljiva. Poskusi z drugimi vrstami celic so pokazali, da ekspresijo -AR uravnavajo različne molekule, za katere je znano, da posredujejo medcelično signalizacijo: dodatek glukokortikoidov v gojišče celične linije DDT1 MF-2, pridobljene iz vas deferensa, poveča ekspresijo -AR43. Poročali so tudi, da je dušikov oksid (NO) zaviral razgradnjo -AR v srčnih celicah prek S-nitrozilacije GRK24. Med temi molekulami je vredno omeniti, da se NO izloča iz celic ledvične makule densa, kar stimulira celice JG na parakrin način, da povečajo izločanje renina45. Medtem ko je izražanje nNOS, encima, ki proizvaja NO v ledvicah, omejeno na celice macula densa, so te v neposrednem stiku s celicami DCT, naslednjim segmentom ledvičnega tubulela6. Tako je možno, daTrpm6-pomanjkanje v celicah DCT vodi do zmanjšane ekspresije -AR v celicah JG, tako da vpliva na proizvodnjo ali sproščanje NO iz sosednjih celic makule densa.

Znano je, da JG celice komunicirajo tudi z drugimi celicami z tvorbo vrzelnih stikov z okoliškimi celicami, kot so mezangialne celice, in prejemajo Ca2 plus za zatiranje izločanja renina7. Čeprav celice JG in celice DCT niso v neposrednem stiku druga z drugo, so še vedno tesno nameščene (ref.46 in slika 3) in možno je, da te celice uporabljajo komunikacijo v vrzeli prek posredniških celic, kot so mezangialne celice; vsi trije tipi celic naj bi izražali Cx3747,48, izoformo koneksina, ki oligomerizira in tvori vrzelne spoje. Nadaljnja analiza lahko identificira molekulo in pot, odgovorno za medcelično signalizacijo med celicami DCT in JG, kar je pomembno za razkritje celotnega mehanizma motenega cirkadianegakrvni pritiskvariacija poTrpm6-pomanjkanje.

noterTrpm6-miši s pomanjkanjem je izginila cirkadiana sprememba krvnih ravni ne le renina, ampak tudi noradrenalina. Aktivacija renin-angiotenzinskega sistema stimulira sproščanje noradrenalina v krvni obtok 29, 30, zato se zdi smiselno, da učinekTrpm6 (prehodni receptorski potencial, povezan z melastatinom 6)ablacija ravni renina in noradrenalina v krvi je bila podobna. Ker noradrenalin deluje tudi na -AR celic JG za spodbujanje izločanja renina, se domneva, da obe molekuli tvorita pozitivno povratno zanko, ki spodbuja izločanje druga druge. Vendar je treba opozoriti, da rezultati eksperimentov z dajanjem izoproterenola eksplicitno kažejo napako v izločanju renina (slika 4), zato se zdi, da je glavni vzrok za izgubo cirkadiane variacije tako renina kot noradrenalina.

Doslej so razvili vrsto učinkovitih zdravil, ki se uporabljajo za zdravljenje hipertenzivnih bolnikov. Vendar pa precejšnje število bolnikov kaže odpornost na konvencionalna zdravljenja, ki uporabljajo kombinacijo glavnih antihipertenzivnih zdravil z različnimi funkcionalnimi mehanizmi4. Kirurška denervacija ledvičnih simpatičnih nevronov z uporabo endovaskularnih katetrov je bila izvedena na poskusni osnovi za zdravljenje takšne odporne hipertenzije50. Njegova praktična učinkovitost pri izboljšanjukrvni pritisknadzor je bil sporen51,52, vendar so nedavno objavljene študije pokazale znatno zmanjšanjekrvni pritiskv primerjavi z lažnimi kontrolami53,54. Obstajajo tudi mešani rezultati o vplivu ledvične denervacije na cirkadiane variacijekrvni pritisk. Nekatera poročila so pokazala, da je obsegkrvni pritiskzmanjšanje zaradi ledvične denervacije je bilo večje med aktivnimi obdobji53, drugi pa niso poročali o spremembi cirkadianih variacijkrvni pritisk55,56. V analizi z uporabo laboratorijskih živali so naše operacije ledvične denervacije pri miših zavrle cirkadiano variacijokrvni pritisk(slika 6). Podobne operacije so bile izvedene tudi proti podganam, vendar tudi kontrolne podgane divjega tipa ne kažejo skoraj nobenega cirkadianegakrvni pritiskvariacije na prvem mestu57,58, zaradi česar je težko oceniti učinek operacije. Potrebnih je več študij, da bi pojasnili vpliv ledvične denervacije na cirkadiankrvni pritiskvariacije, kar bi nam tudi pomagalo razumeti podrobnejši mehanizemkrvni pritiskdisregulacijo s straniTrpm6-pomanjkanje.

Telemetrične meritvekrvni pritisk, srčni utrip in lokomotorna aktivnost. Telemetrične meritvekrvni pritiskso bile izvedene na naslednji način4.Krvni pritiskpretvornike (TAl1PA-C10, Data Sciences International) smo kirurško vstavili v levo skupno karotidno arterijo 2- do 3-mesečnih miši pod anestezijo (z intraperitonealnim dajanjem 0,3 mg/ kg medetomidina, 4 mg/kg midazolama in 5 mg/kg butorfanola). Po 3 tednih okrevanja sistolični in diastoličnikrvni pritiskvrednosti so bile zabeležene z 2--minutnim načrtovanim vzorčenjem vsakih 60 minut z uporabo programske opreme Dataquest ART (Data Sciences International). Zapisi so bili pridobljeni vsaj pet zaporednih dni in povprečja meritev, opravljenih vsak dan ob istem času, so bila določena za vsako miško in uporabljena za nadaljnje statistične analize, razen za dopolnilno sliko 4. Na podlagi Nakamori et al.68, ledvična 2 tedna pred vstavitvijo je bila opravljena denervacijakrvni pritiskpretvornike, kot sledi. Ledvice so bile izpostavljene z abdominalnim rezom in vezivno tkivo okoli ledvičnih žil je bilo razrezano. Nato so bile ledvične žile za 2 minuti potopljene v 95-odstotni etanol in nato za 2 minuti v PBS. Lažna operacija je bila izvedena z enakovrednim postopkom brez potopitve v etanol. Aliskiren so dajali 25 mg/kg/dan s subkutano vgradnjo osmotske črpalke (1004, ALZET), beleženje pa se je začelo dan po uvedbi črpalke. Za dodatek magnezija so miši 1 mesec pred tem hranili hrano, obogateno z magnezijem, ki je vsebovala 0,6 odstotka magnezija (CLEA Japonska).krvni pritiskmerjenje.

Srčni utrip je bil izmerjen z istim radiotelemetričnim sistemom, le da je bilo snemanje izvedeno z 30--imi načrtovanimi vzorci vsako minuto, ena sama meritev pa je bila uporabljena za nadaljnjo analizo.

Lokomotorne aktivnosti so bile ocenjene z uporabo istega radiotelemetričnega sistema s spremljanjem sprememb v jakosti signala iz pretvornika zaradi gibanja živali. V tem primeru so bili pretvorniki kirurško vstavljeni v podkožje na desnem boku. Posnetki so bili izvedeni v enakih časovnih intervalih, kot je opisano zgoraj.

cistanche bodybuilding

Reference

1. Giles, TDC Cirkadijski ritemkrvni pritiskin odnos do srčno-žilnih dogodkov.J. hipertenzije. 24, S11-S16 (2006).

2. Smolensky, MH, Portaluppi, F. & Hermida, RC inKrvni pritiskSpremljanje v kardiovaskularni medicini in terapevtiki, 3rd EDT. (eds White, WB) Part II, Ch.6, 105-128(Springer,2016).

3. Witteman, JCet al. Prospektivna študija prehranskih dejavnikov in hipertenzije med ženskami v ZDA. Naklada 80, 1320-1327(1989).

4. Ascherio, A. et al. Prospektivna študija prehranskih dejavnikov in hipertenzije med ameriškimi moškimi. Naklada 86,1475-1484(1992).

5. Ascherio, A. et al. Prospektivna študija prehranskih dejavnikov,krvni pritiskin hipertenzijo med ženskami v ZDA. Hipertenzija 27,1065-1072(1996).

Opomba:zgoraj ni popoln seznam referenc