Epigenetski regulator BRD4 je vključen v vnetni odziv podganjih ledvic, ki ga sproži kadmij

za več informacij:ali.ma@wecistanche.com

Zhongguo Gong et al

Cistanche tubulosa preprečuje ledvično bolezen, kliknite tukaj za pridobitevizdelkov in Cistanche DHT

POVZETEK

Kadmij (Cd) je bil opisan kot potencialni induktor vnetja, medtem ko vse več dokazov kaže, da je neustrezno vnetje dejavnik, ki prispeva kpoškodba ledvic. Zato so raziskave o vnetnem odzivu, ki ga sproži Cd, velikega pomena za pojasnitev mehanizma nefrotoksičnosti, ki jo povzroča Cd. Vsebuje bromodomeno 4(BRD4) je pomemben epigenetski regulator, ki sodeluje pri razvoju številnih vnetnih bolezni, vendar je njegova regulativna vloga pri sproženih s Cdvnetnaodziv je treba še pojasniti. Tu smo ugotovili, da zdravljenje s Cd pri podganah Sprague-Dawley (2 mg/kg telesne mase, ip, 5 zaporednih dni) in pri podganahledvična celicalinija (NRK{{0}}E, 0–10 μM, 12 h) je povzročila transkripcijo vnetnih citokinov, ki bi jo lahko zmanjšal JQ1 (zaviralec BRD4, 25 mg/kg telesne mase, ip. , 3 zaporedne dni in vivo; 0,5 μM, 12 h in vitro) ali majhna moteča RNA BRD4 (siRNA, in vitro), kar kaže, da BRD4 sodeluje pri vnetnem odzivu, ki ga sproži Cd. Nato je naša študija razjasnila vlogo BRD4 pri vnetnem odzivu, ki ga sproži Cd. Inhibicija BRD4 je zmanjšala jedrsko translokacijo in aktivacijo NF-κB, ki jo spodbuja Cd, in vivo in in vitro. Cd je zvišal raven acetilacije RelA K310 in okrepil vezavo BRD4 na acetiliran NF-κB RelA in vivo in in vitro, kar je bilo razveljavljeno z inhibicijo BRD4. Če povzamemo, naša študija kaže, da je BRD4 vključen v transkripcijo vnetnih citokinov, ki jo sproži Cd, tako da posreduje aktivacijo signalne poti NF-κB in poveča svojo vezavo na acetiliran NF-κB RelA pri podganahledvica,zato je BRD4 lahko potencialna terapevtska tarča za ledvične bolezni, ki jih povzroča Cd.

Ključne besede: BRD4kadmijVnetje ledviccitokini NF-κB JQ1

1. Uvod

Kadmij (Cd) je težko kovinsko onesnaževalo z visoko toksičnostjo in dolgo razpolovno dobo. Z razvojem industrijske proizvodnje je povečana grožnja onesnaženja s kadmijem za okoljsko varnost in zdravje ljudi povzročila zaskrbljenost (Wang et al., 2020; Horiguchi in Oguma, 2016). Ko ga telo absorbira, Cd povzroči poškodbe več organov inledvicaje glavni tarčni organ (Fernando et al., 2020; Zhao et al., 2021). Prej smo sistematično preverjali, da inhibicija avtofagije, oksidativni stres in apoptoza sinergistično prispevajo k nefrotoksičnosti, ki jo povzroča Cd pri podganah (Liu et al., 2017; Wang et al., 2017). Vnetje je fiziološki odziv, ki deluje kot obrambna reakcija pred okužbo ali poškodbo, vendar lahko nenadzorovani in neustrezni vnetni odzivi, ki jih povzroča Cd, povzročijo škodo, kot je poškodba normalnega tkiva mimoidočih in spodbujanje avtoimunskih bolezni (Hossein-Khannazer et al., 2020; Zhang et al. sod., 2020). Vnetni odziv, ki ga sproži Cd, je poslabšal srčno-žilne bolezni in poškodbe jeter, kar kaže, da lahko vnetje igra pomembno vlogo pri Cdledvicapatoloških procesov (Fagerberg et al., 2017; Almeer et al., 2019).

Epigenetika se nanaša na dedne spremembe v izražanju genov, ki temeljijo na spremembah zaporedja, ki niso DNK, reverzibilnost teh modifikacij pa omogoča odkrivanje novih terapevtskih ciljev (Vendetti in Rudin, 2013). Družina bromodomene in zunajterminalne domene (BET) vključuje bromodomeno, ki vsebuje 2 (BRD2), BRD3, BRD4 in bromodomeno, specifično za testis (BRDT), za katero sta značilni dve bromodomeni in vezava na acetilirane lizine histonov in nehistonov ( Lochrin et al., 2014; Chatterjee in Bohmann, 2018). Proteini BET delujejo kot transkripcijski koaktivator številnih genov in tako uravnavajo celični cikel, vnetni odziv, oksidativni stres in druge fiziološke procese v različnih patoloških modelih (Jiao et al., 2020; Wang et al., 2019b). BRD4 je še posebej dobro raziskan član družine proteinov BET in kopičenje raziskav je pokazalo, da je nova epigenetska tarča pri uravnavanju različnihbolezni ledvic, vključno s kroničnim nefritisom, diabetično nefropatijo in eksperimentalno okvaro ledvic (Zeng in Zhou, 2002; Morgado-Pascual et al., 2019). Potrjeno je bilo, da BRD4 sodeluje pri transkripcijskem procesu, odvisnem od jedrskega faktorja κB (NF-κB) za uravnavanje vnetnih odzivov pri številnih boleznih (Xu in Vakoc, 2014; Suarez-Alvarez et al., 2017). BRD4 lahko rekrutira acetilirana RelA (podenota NF-κB, gen, ki kodira beljakovine) pri lizinu 310 (RelA-K310ac) prek njegovih bromodomen, s čimer se aktivira od ciklina odvisna kinaza 9 (CDK9) in fosforilirana RNA polimeraza II za spodbujanje transkripcijo tarčnih genov NF-κB (Hajmirza et al., 2018). Nedavne študije kažejo, da bi lahko bili zaviralci BRD4 potencialna terapevtska možnost za vnetne bolezni. Pri modelih poškodbe hrbtenjače pri podganah je inhibicija BRD4 oslabila vnetni odziv in spodbudila funkcionalno okrevanje mikroglije (Dey et al., 2019). Poleg tega je inhibicija BRD4 razveljavila eksperimentalno ledvično vnetje pri mišjih modelih enostranske ureteralne obstrukcije, antimembranskega bazalnega GN in infuzije angiotenzina II (Suarez-Alvarez et al., 2017).

Glede na možne provnetne učinke Cd in regulativne učinke BRD4 na vnetje smo domnevali, da je BRD4 vključen v vnetni odziv, ki ga sproži Cd. Kot je bilo pričakovano, BRD4 posreduje proces transkripcije vnetnih citokinov v modelih podganjih ledvic, izpostavljenih Cd. Naša študija razkriva potencialni mehanizem v vnetnem odzivu, ki ga sproži Cd, in zagotavlja nove vpoglede v terapijo nefrotoksičnosti, ki jo povzroča Cd.

2. Materiali in metode

2.1. Kemikalije in protitelesa

Kadmijev klorid (CdCl2, brezvodni, 439800) je bil kupljen pri Sigma-Aldrich (Carlsbad, CA, ZDA). (plus)-JQ1 (HY-13030) je bil pridobljen pri MedChemExpress (Monmouth Junction, NJ, ZDA). Komplet za ekstrakcijo jedrskih beljakovin je bil kupljen pri Beyotime Institute of Biotechnology (Šanghaj, Kitajska, P0027). Učinkovit komplet za kemiluminiscenco (ECL, 32209) in reagent za analizo beljakovin bicinhoninske kisline (BCA, 23225) sta bila pridobljena pri Thermo Fisher Scientific (Madison, WI, ZDA). Uporabljena so bila primarna protitelesa proti naslednjim proteinom: NF-κB p65 (10745-1- AP), IL-1 (26048-1-AP), TNF- (17590-1-AP) so bila kupljena pri Proteintech Group (Wuhan, Kitajska); -aktin (3700 s), Histon H3 (His3, 4499), Sirtuin 1 (Sirt1, 8469), normalni zajčji IgG (IgG, 4394) so ​​bili kupljeni pri Cell Signaling Technology (Danvers, MA, ZDA); BRD4 (ab128874), K (lizin) acetiltransferaza 3 (KAT3B/Ep300, ab14984), NF-κB RelA (acetil K310) (RelA-K310ac, ab19870), Alexa Fluor® 488 – konjugiran oslovski anti-zajec (ab150073) so bili kupljeni iz Abcama (Cambridge, Združeno kraljestvo). Druga protitelesa: kozji protimišji IgG (H plus L) (115-035-003) in kozji protizajčji IgG (H plus L) (111-035-003) so bila kupljena pri Jackson ImmunoResearch (West Grove, PA, ZDA). ).

2.2. Živali in poskusi

Štiriindvajset podgan Sprague-Dawley (samci, stari 6 tednov, 110–120 g) so bili kupljeni pri Pengyue Experimental Animal Breeding Co., Ltd (Jinan, Shandong, Kitajska). Podgane so imele prost dostop do hrane in vode v okolju nadzorovanem prostoru (24 ± 5 ​​stopinj, 12-urni cikel svetlobe/teme). Eksperimentalni postopki so veljali za Direktivo Sveta Evropskih skupnosti 2010/63/EU za poskuse na živalih, vse postopke pa je odobril Odbor za nego in uporabo živali Univerze Yangzhou. Po enem tednu aklimatizacije so podgane naključno razdelili v štiri skupine: (1) Kontrolna skupina: z intraperitonealnim injiciranjem ustreznega topila (fiziološke raztopine ali raztopine 2-hidroksipropil- -ciklodekstrina). (2) Skupina Cd: CdCl2 (2 mg/kg telesne teže, raztopljen v fiziološki raztopini), injiciran intraperitonealno 5 zaporednih dni, da se vzpostavi model zastrupitve s Cd. (3) Cd plus skupina JQ1: CdCl2 (2 mg/kg telesne teže), injiciran intraperitonealno 5 zaporednih dni, da se vzpostavi model zastrupitve s Cd, in JQ1 (25 mg/kg telesne teže, raztopljen v 2-hidroksipropilu{{ 25}}raztopina ciklodekstrina), injicirana intraperitonealno 6.–8. (4) Skupina JQ1: JQ1 (25 mg/kg telesne teže), injiciran intraperitonealno 6.–8. Statistični podatki o vsebnosti kadmija v serumih in tkivih ledvic podgan so bili navedeni v tabeli S1, kar odraža uspešno vzpostavitev modelov podgan, izpostavljenih kadiju.

Po 8 dneh zdravljenja so podgane ubili z dislokacijo materničnega vratu pod globoko anestezijo po 12 urah posta. Ledvična tkiva so razrezali in 1 g tkiva vsake ledvice hitro shranili pri –80 ◦C za sledečo analizo Western blot in kvantitativno PCR (qPCR). Preostalo količino tkiva smo hitro fiksirali v 4-odstotnem paraformaldehidu (PFA) za imunohistokemično (IHC) barvanje.

2.3. Kultura in zdravljenje celic

Celična linija podganjih ledvic (NRK{{0}}E) je bila pridobljena iz Shanghai Cell Bank of China Academy of Sciences. Celice NRK-52E smo gojili z Dulbeccovim modificiranim Eagleovim medijem (DMEM, Gibco, 12800-017), ki je vseboval 5 odstotkov fetalnega govejega seruma (FBS, Gibco, 10437-028), penicilin in streptomicin (1 00 U/mL) v vlažnem okolju s 5 odstotki CO2 in 95 odstotki zraka pri 37 stopinjah. CdCl2 (raztopljen v ultra čisti vodi) in JQ1 (raztopljen v dimetil sulfoksidu) sta bila ločeno shranjena pri 4 stopinjah in – 20 stopinjah ter pred uporabo razredčena v delovne raztopine. Eksperimentalna zasnova je bila naslednja: (1) Celice smo obdelali z 0, 2,5, 5, 10 μM Cd 12 ur ali 5 μM Cd 0, 6, 12, 24 ur za izvedbo naslednjih testov. (2) Celice smo 12 ur obdelali s 5 μM Cd in/ali 0,5 μM JQ1 za izvedbo naslednjih testov. (3) Celice so bile transfektirane s siBRD4 in/ali obdelane s 5 μM Cd še nadaljnjih 12 ur za izvedbo naslednjih testov.

2.4. Majhna interferenčna transfekcija RNA

Transfektirali smo 20 nM majhne moteče RNK BRD4 (siBRD4, Invitrogen, CA, ZDA) v celice NRK-52E s transfekcijskim reagentom Lipofectamine RNAiMAX (Thermo Fisher Scientific, kat. št. 13778150) 24 ur v skladu s priročniki za izdelek. Uporabljene so bile naslednje smiselne siRNA:

siBRD4, s ciljnim zaporedjem 5'-CCGTCAAGCTGAACCTCCCTGATTA-3';

siCt (negativna kontrola siRNA), s ciljnim zaporedjem 5'- UUCUCGAACGUGUCACGUTT-3'.

2.5. Western blotting

Vzorce ledvičnega tkiva in celice NRK-52E smo lizirali v pufru RIPA, ki je vseboval zaviralce proteaze, da smo ekstrahirali celotne beljakovine. Jedrski protein je bil vnaprej pripravljen iz svežih tkiv in celic in shranjen pri -80 stopinjah. Vzorci beljakovin (20–30 ug na vzorec) so bili ločeni z elektroforezo SDS-PAGE, nato pa preneseni na poliviniliden fluoridne membrane (Millipore, ISEQ00010). Membrane so bile blokirane s 5-odstotnim posnetim mlekom za 90 minut in inkubirane 12 ur pri 4 stopinjah z naslednjimi primarnimi protitelesi: -aktin (1:5000), NF-κB p65 (1:1000), IL-1 ( 1:600), TNF- (1:600), BRD4 (1:1000), Ep300 (1:1000), Sirt1 (1:1000), His3 (1:1000), RelA-K310ac (1:1000). Nato so bile membrane sprane s TBST in inkubirane z ustreznimi sekundarnimi protitelesi (1: 10000) 90 minut pri sobni temperaturi (RT). Membrane so bile inkubirane z elektrokemiluminiscenco (ECL, ThermoFisher Scientific) in določene na Chemidoc XRS (Bio-Rad, Marnes-La Coquette, Francija), optična gostota pa je bila analizirana z uporabo ImageJ (NIH, Bethesda, MD, ZDA).

2.6. Imunofluorescenčno (IF) barvanje

Celice NRK{{0}}E, posejane v 24-ploščo z vdolbinicami, so bile gojene do približno 60-odstotne konfluence. Celice smo 12 ur obdelali s 5 μM Cd in/ali 0,5 μM JQ1, nato jih fiksirali s PFA (4 odstotki, 10 minut), permeabilizirali s Triton X- 100 (0,1 odstotka, 15 minut), blokirali z BSA (2 odstotka, 90 min) pri sobni temperaturi in inkubirano s primarnim protitelesom (NF-κB p65, razredčitev 1:50) čez noč pri 4 stopinjah. Po trikratnem izpiranju s PBS smo celice inkubirali s sekundarnim protitelesom (razredčitev 1: 500) 90 minut in z DAPI 5 minut pri RT, nato pa celice opazovali pod konfokalnim mikroskopom. Jedrska translokacija NF-κB je bila analizirana v treh neodvisnih študijah.

2.7. qPCR

Celotno RNA ledvičnih tkiv in celic NRK-52E smo ekstrahirali s kompletom RNAiso Plus (Takara Bio, Shiga, Japonska). 1 ug celotne RNA smo uporabili za sintezo 1. verige cDNA v skladu s priročnikom proizvajalca (Roche, Basel, Švica). Odvzeli smo 2 μL komplementarne DNA (cDNA) na vdolbinico, da smo zaznali relativne ravni mRNA z uporabo sistema LightCycler® 96 Real-Time PCR (Roche). Izračunajte relativne ravni mRNA v skladu z enačbo 2-△△CT. Primerji so bili navedeni v tabeli S2. -aktin je bil podganji referenčni gen.

2.8. Koimunoprecipitacija (Co-IP)

Ledvična tkiva in celice NRK-52E so bile lizirane v sveže pripravljenem pufru za lizo celic (20 mM HEPES–KOH pH 7,5, 150 mmol/L NaCl, 2 mmol/L EDTA, 1 odstotek Tritona X{{8} }), ki vsebuje PMSF. Protein G kroglice (100 μL na vzorec, Bio-Rad, Hercules, CA, ZDA) smo zmešali z 2 ug protitelesa BRD4, RelA-K310ac ali IgG na vzorec in vrteli 10 minut pri sobni temperaturi. Nato smo skupne proteinske lizate inkubirali s kompleksom kroglice-protitelo čez noč pri 4 stopinjah. Po trikratnem izpiranju s pufrom za celično lizo smo imunoprecipitate resuspendirali z 1 × SDS PAGE pufrom za vzorce, da smo konfigurirali vzorce. Ciljne proteine ​​smo odkrili z uporabo Western blottinga s primarnimi protitelesi anti-BRD4 in anti-RelA K310ac.

2.9. Statistična analiza

Vsi podatki so bili pridobljeni iz vsaj treh neodvisnih poskusov in izraženi kot povprečje ± SEM, razen če je navedeno drugače. Eksperimentalne skupine so primerjali z neparnim dvostranskim Studentovim t-testom ali enosmerno analizo variance (ANOVA) z uporabo SPSS 22.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, ZDA). Pomembnost je bila nastavljena na p <>

3. Rezultati

3.1. Cd inducira izražanje vnetnih citokinov in vivo in in vitro

Dokazano je, da Cd kot onesnaževalec okolja povzroča poškodbe ledvic z uravnavanjem vrste bioloških procesov (Wang et al., 2019c). V tej študiji so bile preučene spremembe ravni transkripcije vnetnih citokinov po izpostavljenosti Cd, da bi raziskali, ali je vnetje vključeno v nefrotoksičnost, ki jo povzroča Cd. Podatki so pokazali, da je izpostavljenost Cd znatno povečala ravni beljakovin interlevkina (IL)-1 in faktorja tumorske nekroze (TNF) v celicah NRK-52E (sl. 1A-B) in tkivih ledvic podgan (sl. 1C). -D). Medtem, kot je prikazano na sliki 1E-F, je izpostavljenost Cd povečala transkripcijske ravni vnetnih citokinov (IL-1, IL-6, TNF- in (monocitni kemoatraktantni protein-1) MCP -1) in vivo in in vitro. Te ugotovitve kažejo, da Cd inducira izražanje vnetnih citokinov v podganjih ledvicah.

3.2. BRD4 sodeluje v procesu transkripcije vnetnih citokinov, ki ga povzroči Cd

BRD4 je na novo opisan epigenetski regulator, ki se veže na acetilirane histone ali nehistone za uravnavanje vnetnih procesov pri številnih boleznih. Tukaj sta bila uporabljena zaviralec BRD4 JQ1 in BRD4-siRNA za preučevanje vloge BRD4 pri vnetnem odzivu, ki ga sproži Cd. Podatki so pokazali, da so bile ravni IL-1 in TNF-proteina, povišane s kadmijem, znižane z zdravljenjem z JQ1 in vivo in in vitro (sl. 2A–D) ter s knockdownom BRD4 in vitro (sl. S1A-B). Medtem je zdravljenje z JQ1 znatno zaviralo ravni transkripcije IL-1, IL-6, TNF- in MCP-1, povečane s Cd, v celicah NRK-52E (slika 2E) in tkiva ledvic podgan (slika 2F). Prav tako je knockdown BRD4 bistveno zmanjšal ravni transkripcije vnetnih citokinov, povečane s Cd, v celicah NRK-52E (slika S1C). Skupaj te ugotovitve kažejo, da je BRD4 kritičen regulator vnetnega odziva, ki ga sproži Cd, v ledvicah podgan.

3.3. Ravni ekspresije BRD4 ostanejo nespremenjene po izpostavljenosti Cd

Nato so bile po izpostavljenosti Cd odkrite spremembe v nivojih izražanja BRD4. Celice NRK-52E smo obdelali s kadmijem pod koncentracijskim gradientom, podganam pa intraperitonealno injicirali kadmij 5 dni, da bi pojasnili učinek kadmija na izražanje BRD4 v ledvicah in vivo in in vitro. Rezultati so pokazali, da so bile ravni proteina BRD4 nespremenjene tako v celicah NRK-52E, ki so bile izpostavljene Cd (sl. 3A-B), kot tudi v tkivih podganjih ledvic (sl. 3C-D). Prav tako so bile ravni mRNA BRD4 nespremenjene po izpostavljenosti Cd (sl. 3E-F). Ti rezultati kažejo, da BRD4 posreduje vnetni odziv, ki ga sproži Cd, ni odvisen od sprememb v ravni izražanja.

3.4. BRD4 uravnava jedrsko translokacijo NF-κB, ki jo spodbuja Cd

V naši študiji smo raziskali vlogo BRD4 pri vnetnem odzivu, ki ga sproži Cd. Sprememba signalne poti NF-κB je tesno povezana s transkripcijo vnetnih citokinov (Chi et al., 2021). Naša študija je pokazala, da je BRD4 vključen v Cd-regulirano jedrsko translokacijo in aktivacijo NF-κB. Najprej je bila subcelična lokalizacija NF-κB določena z IF obarvanjem in IHC obarvanjem. Podatki na slikah 4A in D so pokazali, da JQ1 zavira jedrsko translokacijo NF-κB, ki jo spodbuja Cd, v celicah NRK-52E in tkivih podganjih ledvic. Medtem so rezultati western blota pokazali, da je JQ1 bistveno zmanjšal ravni jedrskega proteina NF-κB, povišane s Cd, in vivo (sl. 4B-C) in in vitro (sl. 4E-F). Podobno je knockdown BRD4 tudi znatno zavrl Cd-spodbujeno jedrsko translokacijo NF-κB (slika S2A) in zmanjšal Cd-povečane ravni jedrskega proteina NF-κB (slika S2B-C) v celicah NRK-52E. Skupaj lahko inhibicija BRD4 zmanjša jedrsko translokacijo NF-κB, ki jo spodbuja Cd, kar kaže, da BRD4 posreduje aktivacijo signalne poti NF-κB v ledvicah po izpostavljenosti Cd.

3.5. Cd poveča ravni acetilacije RelA K310

Študije so potrdile, da se BRD4 veže na acetiliran RelA K310 prek njegovih domen broma, da uravnava transkripcijo, odvisno od NF-κB (Morgado-Pascual et al., 2019; Zhong et al., 2018). Tako smo zaznali stopnjo acetilacije RelA K310 in ekspresijo dveh encimov. Podatki so pokazali, da so se ravni beljakovin RelA-K310ac in acetilaze Ep300 nenehno zniževale s povečano koncentracijo Cd, medtem ko se je raven beljakovin deacetilaze Sirt1 postopoma povečevala v celicah NRK-52E (sl. 5A-B) in tkivih podganjih ledvic (sl. 5C-D). Tudi ravni mRNA Ep300 in Sirt1 so pokazale enake trende (sl. 5E-F). Ti rezultati kažejo, da Cd spodbuja raven acetilacije RelA K310, zato je lahko BRD4 vključen v transkripcijo vnetnih citokinov, ki jih sproži Cd, v ledvicah.

3.6. Cd poveča vezavo BRD4 na RelA-K310ac za izboljšanje njegove transkripcijske funkcije

Vezava na mesta acetilacije je osnova za regulacijo transkripcije BRD4 (Huang et al., 2009). Da bi preverili, ali Cd regulira funkcijo BRD4 s povečanjem vezave BRD4 na RelA-K310ac, je bila interakcija med RelA-K310ac in BRD4 zaznana prek Co-IP. Podatki na sliki 6A so pokazali, da je Cd znatno okrepil interakcijo med RelA-K310ac in BRD4 v celicah NRK-52E, ki je bila omilila zdravljenje z JQ1 ali knockdown BRD4. Enak trend so opazili tudi v tkivih ledvic podgan (slika 6B). Ti rezultati kažejo, da Cd poveča vezavo BRD4 na RelA-K310ac, kar spodbuja od NF-κB odvisno transkripcijo in posledično prispeva k vnetnemu odzivu, ki ga sproži Cd.

4. Razprava

Poročali so, da je Cd potencialni sprožilec vnetja zaradi njegove visoke toksičnosti, medtem ko natančen mehanizem še vedno ni popolnoma razumljen (Arab-Nozari et al., 2020; Ghosh, 2018). Naša študija je potrdila, da Cd inducira izražanje vnetnih citokinov v ledvičnih celicah podgan, in ugotovila, da BRD4, epigenetska tarča, ki ima kritične funkcije v nizu celičnih procesov, vključno z vnetjem, prispeva k vnetnemu odzivu, ki ga sproži Cd. Nadaljnji poskusi so pokazali, da je BRD4 vključen v aktivacijo signalne poti NF-κB, ki jo spodbuja Cd. Prav tako je Cd povečal raven acetilacije RelA K310, s čimer se je povečala vezava BRD4 na acetiliran NF-κB RelA za spodbujanje transkripcije vnetnih citokinov, odvisnih od NF-κB.

Vnetje je eden od naravnih obrambnih mehanizmov pred eksogenimi kemikalijami, medtem ko lahko nenadzorovan in neustrezen vnetni odziv poškoduje normalna tkiva in povzroči avtoimunske bolezni (Jian et al., 2018). Biološki označevalci vnetja, povečani s Cd, so bili pogosto povezani z različnimi boleznimi. Študije so pokazale, da je s Cd povzročeno vnetje vključeno v aterogenezo (Tinkov et al., 2018). Poleg tega je Cd spodbujal izražanje vnetnih citokinov, ki so prispevali k poškodbam pljuč in testisnega tkiva ter povzročajo hepatotoksičnost (Koopsamy Naidoo et al., 2019; Arafa et al., 2014). Ti škodljivi učinki so skladni z našimi rezultati, da je vnetni odziv vključen v poškodbo ledvic, ki jo povzroči Cd. Vse več raziskav se osredotoča na mehanizme nastanka vnetja, ki ga povzroči Cd. Kot dobro raziskan član družine proteinov BET ima BRD4 ključno vlogo pri številnih bioloških procesih, vključno z vnetjem. Tukaj sta bila JQ1 (inhibitor BRD4) in siRNA uporabljena za deregulacijo funkcionalne aktivnosti BRD4 in ugotovila, da je inhibicija BRD4 zmanjšala s Cd inducirano transkripcijo vnetnih citokinov v podganjih ledvicah, kar kaže, da BRD4 sodeluje pri vnetnem odzivu, ki ga sproži Cd . Na splošno velja, da je disregulacija izražanja BRD4 ključni dogodek pri pojavu vnetnega odziva. Pri poškodbi hrbtenjače, patološki hipertrofiji srca in drugih boleznih, povezanih z vnetjem, je neurejeno izražanje BRD4 prispevalo k izražanju vnetnih citokinov (Zhu et al., 2020; Marazzi et al., 2018; Ren et al., 2019). Vendar Cd ni vplival na ravni ekspresije BRD4 v sedanjih eksperimentalnih pogojih, zaradi česar smo razmislili, ali BRD4 posreduje vnetni odziv, ki ga sproži Cd, po drugih poteh.

NF-κB je pomemben regulatorni dejavnik pri vnetnih procesih in je odgovoren za nadzor izražanja številnih vnetnih mediatorjev (Lawrence, 2009). Poročali so o študijah, da je BRD4 vključen v regulacijo signalne poti NF-κB. Huang et al. (2017) je predlagal, da BRD4 regulira IKK-posredovano aktivacijo NF-κB prek poti p38 in JNK-MAPK. Wang et al. (2019a) so ugotovili, da je BRD4 knockdown ali zdravljenje z JQ1 blokiralo z lipopolisaharidom (LPS) aktivirano signalno pot NF-κB v mikrogliji. Meng et al. (2014) je dokazal, da je zdravljenje z JQ1 blokiralo izražanje vnetnih citokinov z zaviranjem aktivacije NF-κB v celicah RAW 264.7, obdelanih z LPS. Ta poročila so pokazala, da BRD4 posreduje pri aktivaciji NF-κB v številnih modelih vnetja, medtem ko je zaviranje BRD4 učinkovit terapevtski pristop proti vnetju. V trenutni študiji je inhibicija BRD4 blokirala jedrsko translokacijo NF-κB v tkivih ledvic podgan, izpostavljenih Cd, in celicah NRK-52E, kar kaže, da BRD4 posreduje s Cd aktivirano signalno pot NF-κB.

Običajno se BRD4 po aktivaciji NF-κB z različnimi dražljaji in premestitvi v jedro veže na acetiliran NF-κB RelA na mestu K310, kar poveča njegovo stabilnost in transkripcijsko aktivnost v jedru (Hajmirza et al., 2018). Tako stopnja acetilacije RelA K310 vpliva na regulacijsko funkcijo BRD4 na vnetni odziv. V hipokampalnih nevronih je deacetilaza Sirt1 posredovala deacetilacijo RelA K310 za uravnavanje ekspresije BACE1, kar je prispevalo k tvorbi nevronskega amiloida (Flores-Leon et al., 2019). V celicah glioblastoma je fotodinamični terapevtski stres znižal deacetilazo Sirt1 in aktiviral acetilazo Ep300, kar je zvišalo ravni RelA-K310ac in povzročilo povečano proizvodnjo dušikovega oksida, ki spodbuja preživetje (Fahey et al., 2019). Naša študija je pokazala, da Cd spodbuja raven acetilacije RelA K310 s povečanjem izražanja Ep300 in zmanjšanjem izražanja Sirt1, kar kaže, da Cd vpliva na regulacijsko funkcijo BRD4 s povečanjem ravni acetilacije RelA K310.

Predvsem so naši rezultati pokazali, da je bilo zdravljenje z JQ1 bolj učinkovito kot knockdown BRD4 pri blaženju vnetnega odziva, ki ga sproži Cd. JQ1 ima visoko vezavno afiniteto z BRD4 in lahko skoraj popolnoma blokira vezavo BRD4 na kromosom, medtem ko lahko siBRD4 samo moti ekspresijo proteina BRD4, da zmanjša vezavo BRD4 na ciljno mesto, kar kaže, da BRD4 posreduje vnetni odziv, ki ga sproži Cd, lahko odvisen od vezava z acetiliranim NF-κB RelA. Nedavne študije so pokazale podoben regulativni mehanizem: po jedrski translokaciji in aktivaciji NF-κB je BRD4 nato sodeloval z acetiliranim RelA, da je koaktiviral transkripcijsko aktivacijo NF-κB (Huang et al., 2009). RelA–BRD4 je bil rekrutiran na ciljne promotorje NF-κB v različnih vnetnih stimulacijskih pogojih, medtem ko je zdravljenje z JQ1 delovalo tako, da je preprečilo vezavo BRD4 na acetiliran NF-κB RelA in tako zmanjšalo transkripcijsko aktivnost NF-κB (Zou et al., 2014). Naši rezultati so pokazali, da inhibicija BRD4 blokira s Cd okrepljeno interakcijo med BRD4 in RelA-K310ac v podganjih ledvicah, kar potrjuje naše zgornje rezultate, da inhibicija BRD4 zavira s Cd inducirano transkripcijsko aktivnost NF-κB, kar kaže, da Cd poveča vezavo BRD4 na acetilirane NF-κB RelA za povečanje transkripcije vnetnih citokinov.

Če povzamemo, je naša študija razkrila regulativne mehanizme BRD4 pri vnetnem odzivu, ki ga sproži Cd, v ledvicah podgan: (1) BRD4 posreduje jedrsko translokacijo in aktivacijo NF-κB, ki jo povzroči Cd. (2) Cd zviša ravni acetilacije RelA K310 in poveča vezavo BRD4 na acetiliran NF-κB RelA, ki spodbuja transkripcijo vnetnih citokinov, odvisnih od NF-κB. Poleg tega je inhibicija BRD4 znatno ublažila s Cd povišane ravni vnetnih citokinov, kar nakazuje, da ima ciljni BRD4 potencial za razvoj kot učinkovito sredstvo za zdravljenje vnetnih bolezni, vključno s Cd-induciranim nefritisom.

Izjava o avtorskem prispevku CrediT

Zhongguo Gong: konceptualizacija, metodologija, vizualizacija, formalna analiza, validacija, preiskava, formalna analiza, skrbništvo podatkov, pisanje – izvirni osnutek. Gang Liu: konceptualizacija, metodologija, vizualizacija, urejanje podatkov, pisanje – izvirni osnutek, administracija projekta, pridobivanje sredstev. Wenjing Liu: Programska oprema, viri, metodologija, formalna analiza. Hui Zou: Administracija projekta, nadzor. Ruilong Song: programska oprema, formalna analiza, nadzor. Hongyan Zhao: programska oprema, formalna analiza, nadzor. Yan Yuan: Nadzor. Jianhong Gu: Nadzor. Jianchun Bian: Pridobivanje sredstev, nadzor. Jiaqiao Zhu: Pisanje – pregled in urejanje, nadzor. Zongping Liu: pisanje – pregled in urejanje, nadzor,

Projektna administracija, Pridobivanje sredstev, Konceptualizacija.

Izjava o konkurenčnem interesu

Avtorji izjavljajo, da nimajo znanih konkurenčnih finančnih interesov ali osebnih odnosov, ki bi lahko vplivali na delo, opisano v tem dokumentu.

Priznanje

To delo so podprli Kitajska nacionalna naravoslovna fundacija (št. 31872533, 31902329, 32072933), Kitajski nacionalni ključni raziskovalni in razvojni program (št. 2016YFD0501208) in projekt prednostnega razvoja akademskega programa za visokošolsko izobraževanje Jiangsu Ustanova (PADP). Rokopis je za ustrezen angleški jezik, slovnico, ločila, črkovanje in splošni slog uredil eden ali več visokokvalificiranih angleško govorečih urednikov pri ELIXIGEN.

Reference

Almeer, RS, AlBasher, GI, Alarifi, S., Alkahtani, S., Ali, D., Abdel Moneim, AE, 2019. Matični mleček zmanjša s kadmijem povzročeno nefrotoksičnost pri mišjih samcih. Sci. Rep. 9 (1), 5825.

Arab-Nozari, M., Mohammadi, E., Shokrzadeh, M., Ahangar, N., Amiri, FT, Shaki, F., 2020. Sočasna izpostavljenost netoksičnim ravnem kadmija in fluorida povzroči hepatotoksičnost pri podganah prek sproži mitohondrijsko oksidativno poškodbo, apoptozo in poti NF-kB. Okolje. Sci. Onesnaževanje. Res. Int. 27 (19), 24048–24058.

Arafa, MH, Mohammad, NS, Atteia, HH, 2014. Prah semen piskavice blaži s kadmijem povzročeno poškodbo testisov in hepatotoksičnost pri podganjih samcih. Exp. Toxicol. Pathol. 66 (7), 293–300.

Chatterjee, N., Bohmann, D., 2018. BET-ting na Nrf2: kako lahko signalizacija Nrf2 vpliva na terapevtske aktivnosti zaviralcev beljakovin BET. Bioeseji 40 (5), 1800007.

Chi, Q., Zhang, Q., Lu, Y., Zhang, Y., Xu, S., Li, S., 2021. Vloge selenoproteina S pri tvorbi zunajcelične pasti nevtrofilcev, ki je odvisna od reaktivnih kisikovih vrst, inducirana s selenom pomanjkljiv arteritis. Redox Biol. 44, 102003 Dey, A., Yang, W., Gegonne, A., Nishiyama, A., Pan, R., Yagi, R., Grinberg, A., Finkelman, FD, Pfeifer, K., Zhu, J ., Singer, D., Zhu, J., Ozato, K., 2019. BRD4 usmerja razvoj hematopoetskih matičnih celic in modulira vnetne odzive makrofagov. EMBO J. 38 (7)

Fagerberg, B., Roj, Y., Barregard, L., Sallsten, G., Forsgard, N., Hedblad, B., Persson, M., Engstrm, G., 2017. Izpostavljenost kadmiju je povezana s topnim receptorjem aktivatorja plazminogena urokinaze, krožečim označevalcem vnetja in bodočih kardiovaskularnih bolezni. Okolje. Res. 152, 185–191.

Fahey, JM, Korytowski, W., Girotti, AW, 2019. Signalni dogodki navzgor vodijo do povečane proizvodnje dušikovega oksida, ki spodbuja preživetje, v fotodinamično okuženih celicah glioblastoma. Prosti Radič. Biol. Med. 137, 37–45.

Fernando, TD, Jayawardena, BM, Mathota Arachchige, YLN, 2020. Spremembe različnih metabolitov in težkih kovin v Oryza sativa L., povezane s kronično boleznijo ledvic neznane etiologije na Šrilanki. Kemosfera 247, 125836.

Flores-Leon, M., Perez-Dominguez, M., Gonzalez-Barrios, R., Arias, C., 2019. Zmanjšanje NAD( plus ) zaradi palmitinske kisline je povezano z zmanjšanim delovanjem SIRT1 in povečanim izražanjem BACE1 v hipokampalnih nevronih. Neurochem. Res. 44 (7), 1745–1754.

Ghosh, KNI, 2018. Zdravljenje s kadmijem povzroči ehinokokozo, poškodbo DNA, vnetje in apoptozo v srčnem tkivu albino podgan Wistar. Okolje. Toxicol. Pharmacol. 59, 43–52. vnetja in raka. Biomedicine 6 (1), 16.

Horiguchi, H., Oguma, E., 2016. Akutna izpostavljenost kadmiju povzroči dolgotrajno nevtrofilijo skupaj z zakasnjeno indukcijo faktorja, ki spodbuja granulocitne kolonije, v jetrih miši. Arh. Toxicol. 90 (12), 3005–3015.

Hossein-Khannazer, N., Azizi, G., Eslami, S., Alhassan Mohammed, H., Fayyaz, F., Hosseinzadeh, R., Usman, AB, Kamali, AN, Mohammadi, H., Jadidi-Niaragh, F., Dehghanifard, E., Noorisepehr, M., 2020. Učinki izpostavljenosti kadmiju pri indukciji vnetja. Imunofarmakol. Imunotoksikol. 42 (1), 1–8.