Globalna razširjenost kronične ledvične bolezni (CKD) narašča s staranjem prebivalstva

Za več informacij se obrnite na oscar.xiao@wecistanche.com

Ozadje:Fibroza je ena najpogostejših patoloških značilnosti procesa staranja ledvic, fibroza v starajočih se ledvicah pa tudi poslabša proces kronične ledvične bolezni (CKD). Corallodiscus flabellata BLBurtt (C.flabellata, CF) je pogosto uporabljena botanična droga v kitajski folklori. Vendar pa le malo študij poroča o njegovih farmakoloških učinkih. Namen te študije je bil raziskati učinek etanolnega ekstrakta CF na ledvično fibrozo pri miših SAMP8 in identificirati potencialno aktivne spojine.

Metode:Kot živalski modeli so bili uporabljeni k staranju pospešeno mišje nagnjeni 8 (SAMP8), različni odmerki CF pa so bili dajani z gavažo en mesec. Za opazovanje stopnje staranja ledvic pri miših z barvanjem z -galaktozidazo. Barvanje po Massonu in ravni izražanja Col-lI, a-SMA in FN so bili uporabljeni za oceno ledvične fibroze pri miših. Izmerjeni so bili nivoji izražanja beljakovin na poti Nrf2 in poti Wnt/-catenin/RAS v ledvicah. In celice NRK-52E, inducirane z -galaktozidazo (-gal), kot in vitro model za pregledovanje aktivnih sestavin CF.

Za več informacij kliknite tukaj

Rezultati:Ekstrakt etanola CF je znatno zaviral aktivnost ledvične -galaktozidaze in ravni izražanja miši Coll, a-SMA in FNin SAMP8 ter izboljšal obarvanje po Massonu pri miših SAMP8. CF je pri miših SAMP8 izjemno zmanjšal beljakovine v urinu, kreatinin, dušik iz sečnine in serumske ravni TNF-a in IL-1 ter znatno povečal ravni SOD in GSH-Px. Poleg tega je CF aktiviral pot Nrf2 in blokiral pot Wnt/-catenin/RAS v ledvicah miši. Poleg tega še 3,4-dihidroksi fenil etanol (SDC-0-14,16) in (3,4-dihidroksi fenil etanol-8-O-[4-O-trans -kafeoil- -D-apiofuranozi-(1→3)- -D-glukopiranozil (1→6)]- -D-glukopiranozid (SDC-1-8) so izolirali iz CF , ki je zmanjšal staranje celic NRK-52E, in morda aktivne sestavine CF igrajo vlogo proti staranju.

Sklepi:Naši poskusi so pokazali, da lahko etanolni ekstrakt CF izboljša ledvično fibrozo pri miših SAMP8 preko poti Wnt/-catenin/RAS. In SDC-0-14,16 in SDC-1-8 sta lahko materialna podlaga za CF, da izvaja učinke, povezane s staranjem ledvic.

Ključne besede:Staranje, Corallodiscus flabellata, ledvica, ledvična fibroza, SAMP8, staranje, Wnt/-catenin/RAS

Uvod

Globalna razširjenost kronične ledvične bolezni (CKD) narašča s staranjem prebivalstva in predstavlja veliko breme za družbo [1-3]. Najpogostejša patološka manifestacija kronične ledvične bolezni je neka oblika ledvične fibroze[4]. Prav tako je ledvična fibroza tudi eden od znakov staranja ledvic [2]. Študije so pokazale, da so oksidativni stres, vnetje, Wnt/-katenin, sistem renin-angiotenzin-aldosteron (RAS) in signalizacija rapamicina (mTOR) povezani s kronično ledvično boleznijo, ki jo povzroči staranje [5]. Ledvična fibroza pri starajočih se ledvicah je tesno povezana z aktivacijo Wnt/-katenina in RAS signalne poti [6]. Po aktivaciji Wnts se -katenin v citoplazmi prenese v jedro, kjer se veže na faktor vezave limfoidnega ojačevalca (LEF)/družino transkripcijskih faktorjev T-celičnega faktorja (TCF) in sproži prepisovanje spodnjih ciljnih genov. Zanimivo je, da promocijska regija gena RAS vsebuje tudi vezavna mesta LEF/TCF, kar omogoča -kateninu, da spodbuja vezavo LEF-1 na ta mesta[7].čisti holesterol,Zato je ciljanje na signalno pot Wnt/-catenin/RAS lahko potencialna terapevtska strategija za ledvično fibrozo [8,9]. V zadnjih letih je nadomestno zdravljenje ledvične fibroze z naravnimi izdelki pritegnilo pozornost številnih znanstvenikov [10]. . Xiaoyan Shen et al. so ugotovili, da je ginsenosid Rgl izboljšal glomerularno fibrozo med staranjem ledvic z zaviranjem aktivacije vnetja NLRP3 pri miših SAMP8 [11]. Ta študija je raziskovala učinek ekstrakta C. flabellate(CF) na ledvično fibrozo pri miših SAMP8 s poti Wnt/-catenin/RAS.

Cistanche lahko upočasni staranje

CF kot zdravilna rastlina na Kitajskem je bila prvič zapisana v "Dian Nan Ben Cao". Celotna rastlina se običajno uporablja za zdravljenje griže, prezgodnje ejakulacije, bolezni semenskih veziklov in bolezni ledvic na območjih etničnih manjšin na Kitajskem [12]. Trenutno , je v sodobnih raziskavah le malo poročil o CF. Farmakološke študije v našem laboratoriju so pokazale, da ima izvleček CF diuretične učinke in izboljša z lipopolisaharidom/D-galaktozaminom povzročeno odpoved jeter in poškodbe možganov pri podganah [13, 14] In fitokemične študije na razkrila je, da so bili feniletanoidni glikozidi in flavonoidi glavne kemične sestavine CF [15, 16].Cilj te študije je bil raziskati učinek izvlečka CF na ledvično fibrozo pri miših SAMP8 in razjasniti njen možni mehanizem, da bi zagotovili eksperimentalni dokazi za zdravljenje bolezni ledvic s CF, opisani v starodavnih knjigah.

Materiali in metode

Zbiranje in pridobivanje rastlinskega materiala

"Kitajska zeliščna medicina Yunnan" navaja, da se CF lahko nabira skozi vse leto. Rastline CF, uporabljene v tem poskusu, so bile pobrane v okrožju Xixia v provinci Henan na Kitajskem septembra. Identificiral ga je profesor Suiqing Chen z univerze kitajske medicine Henan, vzorci pa so bili shranjeni v laboratorijski knjižnici vzorcev.cistanche deserticola neželeni učinkiRastline (1 kg) smo refluktirali s 50-odstotnim etanolom (3 × 12 L, vsako 1 uro) in zmes filtrirali s 16 plastmi gaze. Združene filtrate smo posušili z rotacijskim izparevanjem z uporabo zamrzovalnega sušilnika. Končno je bil odstotni izkoristek 50-odstotnega etanolnega surovega ekstrakta CF 15,5 odstotka. Posušen izvleček smo do nadaljnje uporabe hranili v hladilniku. Dodatno gradivo navaja ustrezne podatke o označbi sestavine izvlečka CF.

Drug postopek ločevanja, o katerem so predhodno poročali, je bil uporabljen v tej študiji za pridobitev frakcije eluiranja z vodo, 20-odstotne elucijske frakcije etanola, 30-odstotne elucijske frakcije etanola in 40-odstotne eluirane frakcije etanola iz CF [13]. 40-odstotno etanolno frakcijo smo ločili z uporabo Sephadex LH-20 in kolone s silikagelom ter očistili s polpreparativno tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC), da smo končno dobili spojine, kot so SDC-0-14,16, SDC{ {10}}, SDC-0-60(p-hidroksi benzil alkohol).

Živali in administracija

V tej študiji so bili uporabljeni šestmesečni samci miši SAMP8 in miši 1 (SAMR1), odporne na pospešeno staranje, iz Prve pridružene bolnišnice Tianjinske univerze tradicionalne kitajske medicine (Tianjin, Kitajska). Živali so bile nameščene v pogojih nadzorovane svetlobe (12-h cikel svetlobe/teme), temperature (23-25 stopinj C) in vlažnosti (45-55 odstotkov) ter prejele standardno prehrano in vodo libitum. Skupaj 48 miši SAMP8 je bilo razdeljenih v štiri poskusne skupine (n=12/skupina): miši modela SAMP8 (M), miši SAMP8, zdravljene z nizkim odmerkom CF etanola (CF-L, 387,5 mg/kg, intragastrično), miši SAMP8, zdravljene s srednjim odmerkom CF etanolnega ekstrakta (CF-M, 775 mg/kg, intragastrično), in miši SAMP8, zdravljene z visokim odmerkom CF etanolnega ekstrakta (CF-H, 1550 mg/ kg, intragastrično). Miši v kontrolni skupini SAMRI (Con, n=10) in modelni skupini SAMP8 (M) smo zdravili s fiziološko raztopino (0,9 odstotka). Vse miši so bile zdravljene peroralno 1 mesec. Vse poskuse na živalih je odobril etični odbor Univerze za kitajsko medicino Henan in so bili izvedeni v skladu z institucionalnimi smernicami (Henan, Kitajska številka odobritve: HACTCM-2018009060-19). Med poskusom je prišlo do ene smrti miši v vsaki od skupin Con in M, dve miši pa sta umrli v skupini CF-H.

Zbirka vzorcev

Na koncu poskusa so bile miši posamezno nameščene v presnovne kletke za 12--urne zbiranje urina. Miši smo nato anestezirali z izofluranom in vzorce krvi zbrali z retro-orbitalno krvavitvijo. Ledvice vsake miši so nato kirurško odstranili in do analize hranili pri 80 stopinjah.

Celična kultura in študija in vitro

Celice NRK-52E, kupljene pri Cell Bank Kitajske akademije znanosti (Šanghaj, Kitajska), so gojili, da bi raziskali učinek izvlečka CF na staranje celic, ki ga povzroča D-galaktoza (D-gal, S11050, Yuanye, Šanghaj, Kitajska). Celice NRK-52E so bile gojene v Dulbeccovi modifikaciji Eagleovega medija Dulbecco (DMEM, 12,100,046, Thermo Fisher, Massachusetts, ZDA), ki je bil opremljen z 10 odstotki fetalnega govejega seruma v inkubatorju pri 37 stopinjah C in v prisotnosti 5 % , CO. Celice so bile gojene v 96-ploščah z vdolbinicami ali 6-ploščah z vdolbinicami do 80-85-odstotne konfluence in nato obdelane z rastnimi gojišči, ki vsebujejo različne kombinacije zdravil: mediji in D-gal ( 20 mg/mL）, Media plus D-gal plus CF（10, 25,50, 100 ug/mL） ali Media plus D-gal plus monomerna spojina（10 μM） 48 ur. Nato se metil tiazolil tetrazolij( MTT) je bil uporabljen za odkrivanje viabilnosti celic, barvanje z -galaktozidazo pa je bilo uporabljeno za opazovanje staranja celic.

Barvanje z galaktozidazo, povezano s staranjem

Zamrznjene ledvice miši, narezane na 10-μm debele dele, in celice NRK-52E so bile obarvane s staranjem povezano -galaktozidazo (SA- -gal, C0602, Beyotime Biotechnology, Šanghaj, Kitajska) po protokolih proizvajalca.

Histološka analiza

Ledvične odseke smo fiksirali s 4-odstotnim pufranim paraformaldehidom, 10-µm debele odseke, vdelane v parafin, pa smo obarvali z Massonovim trikromom (G1006, Service, Wuhan, Kitajska) in opazovali mikroskopsko. Modro obarvana območja v Massonovih trikromno obarvanih odsekih so bila kvantitativno izmerjena iz šestih naključno izbranih polj in analizirana s programsko opremo Image-Pro Plus 6.0.

Biokemijske meritve

Vzorci seruma in ledvičnega homogenata so bili odmrznjeni na sobno temperaturo in vrednosti superoksid dismutaze (SOD, CSB-E08556m, Wuhan Huamei, Wuhan, Kitajska), glutation peroksidaze (GSH-Px, A005-1-2, Nanjing Jiancheng, Nanjing, Kitajska), interlevkin-1 (IL-1, RK00006, ABclonal, Wuhan, Kitajska), faktor tumorske nekroze- (TNF-, RK00027, ABclonal, Wuhan, Kitajska), sečninski dušik (C{ {10}}, Nanjing Jiancheng, Nanjing, Kitajska), kreatinin (Cr, C011-2-1, Nanjing Jiancheng, Nanjing, Kitajska) v mišjem serumu, skupne beljakovine v urinu (C035-2-1, Nanjing Jiancheng, Nanjing , Kitajska) v mišjem urinu in ravni izražanja kolagena tipa I (Col-I, MU30364, Bio-Swamp, Wuhan, Kitajska), -aktina gladkih mišic (-SMA, MU30359, Bio-Swamp, Wuhan, Kitajska), fibronektina (FN, MU30179, Bio-Swamp, Wuhan, Kitajska) v tkivih mišjih ledvic so merili zaporedno v skladu s protokolom proizvajalca testnega kompleta.

Imunohistokemijska analiza

Imunohistokemijsko analizo smo izvedli z rutinsko metodo [17]. Uporabljena protitelesa so vključevala naslednja: Wnt4 (14371-1-AP, Proteintech, Chicago, ZDA), -katenin (17565-1-AP, Proteintech, Chicago, ZDA), receptorje tipa 1 za angiotenzin II (AGTR1,{{ 7}}AP, Proteintech, Chicago, ZDA), p-nuklearni faktor eritroid 2-povezan faktor 2 (p-Nrf2, ab76026, Abcam, Cambridge, UK), pc-Fos(ab27793, Abcam, Cambridge, UK) ), faktor rasti vezivnega tkiva (CTGF, GB11078, Service, Wuhan, Kitajska). Odseke smo opazovali pod mikroskopom (Olympus, Tokio, Japonska).cistanche odmerek redditIzmerite površino in integrirano optično gostoto (IOD) območja s tan izrazom s programsko opremo Image-Pro Plus 6.0 in izračunajte srednjo optično gostoto (MOD, MOD=IOD/površino) za pol - kvantitativna analiza.

Western blot analiza

Western blot test je bil izveden, kot je opisano v prejšnji študiji [18]. Na kratko, ledvična tkiva so bila homogenizirana v pufru za lizo in kvantificirana z uporabo kompleta Bradford Protein Assay Kit (AR0197, Boster Biological Technology, Wuhan, Kitajska). Homogenate smo nato izpostavili elektroforezi z natrijevim dodecil sulfatom in poliakrilamidnim gelom, prenesli na membrano iz poliviniliden fluorida in blokirali v pufru za blokiranje (4-odstotno nemastno suho mleko) za 90 minut. Nato so jih inkubirali s primarnimi protitelesi (Wnt4; renin; AGTR1; p-Nrf2; pc-Fos; Kelchu podoben ECH povezan protein 1 (Keapl, GB11847, Service-bio, Wuhan, Kitajska); -aktin (AC026, Abclonal, Wuhan, Kitajska); in gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenazo (GAPDH, AC033, Abclonal, Wuhan, Kitajska)) čez noč pri 4 stopinjah, čemur sledi inkubacija z ustreznim sekundarnim protitelesom, konjugiranim s prisotnostjo fluora, 1 uro pri sobni temperaturi . Beljakovine, ki nas zanimajo, so skenirali z Odyssey IR skenerjem (LI-COR Biosciences, Nebraska, ZDA), intenzitete signala pa so kvantificirali s programsko opremo Image Studio. Ravni beljakovin so bile normalizirane glede na -aktin ali GAPDH.

Analiza UPLC-Q-TOF-MS za vzorce ledvic

Ledvična tkiva smo stehtali in homogenizirali v ledeno mrzli fiziološki raztopini (w/v=1:1). Nato smo dodali 1 ml acetonitrila k 200 μL vzorcev tkivnega homogenata, čemur je sledila ultrazvočna ekstrakcija 30 minut. Ekstrakt smo centrifugirali pri 12,000 g in 4 stopinjah 10 minut. Supernatant smo vzeli v vialo za analizo. Kromatografsko ločevanje je bilo izvedeno na ultrazmogljivi tekočinski kromatografiji (UPLC) (Dionex UltiMate 3000 System, Thermo Scientific, Massachusetts, ZDA), pri čemer je LC sistem obsegal kolono Acclaim RSLC 120 C18 （2,2 μm, 2,1 × 100 mm; Thermo Scientific).koristi izvlečka cistancheMobilna faza je bila sestavljena iz topila A (acetonitril) in vode z {{0}}.1 % mravljinčne kisline (B). Ločevanje je bilo izvedeno z gradientno elucijo, kot sledi:10-70 % A od 0 do 3 min,70-78 % A od 4 do 13 min,78-90 % A od 14 do 15 min, 90 odstotkov -10 odstotkov A od 15 do 16 minut in 10 odstotkov A od 16 do 20 minut. Injekcijska prostornina testnega vzorca je bila 2 μL. Analiza z masno spektrometrijo（MS） je bila izvedena z uporabo vira ESI pod naslednjimi pogoji: kapilarna napetost v pozitivnem načinu je bila 3,5 kV, kapilarna napetost v negativnem načinu pa 3,2 kV. Tlak razpršilnika je bil 2,0 bara, temperatura suhega plina je bila 230 stopinj, pretok pa 8 L/min.

Statistična analiza

The acquired raw data from ultra-performance liquid chromatography coupled to quadrupole time-of-flight mass spectrometry (UPLC-Q/TOF-MS) analysis were first preprocessed using profile analysis(version 2.1, Bruker, Germany). The"bucket table" was obtained and imported into the SIMCA-P software(version13.0 Umetrics AB, Sweden)for principal component analysis (PCA). Other results were presented as mean±stand-ard deviation(SD). The data were processed using IBM SPSS Statistics 26.0. The normal distribution of the data used the Levene test, which required the average value, P>{{0}}.05; za primerjavo med skupinami smo uporabili enosmerno analizo variance. Vrednost AP manj kot 0,05 je veljala za statistično pomembno.

Rezultati

CF je izboljšal staranje in fibrozo ledvic pri miših SAMP8

Da bi raziskali učinek CF na ledvice miši SAMP8, so v ledvicah izmerili aktivnost SA- -gal. Na sliki la se je aktivnost SA- -gal v ledvičnih tkivih znatno povečala v skupini M (modra izboljšava). Dajanje CF-L in CF-M je pomembno zaviralo aktivnost -galaktozidaze v ledvicah miši SAMP8, medtem ko izboljšanje s CF-H ni bilo pomembno. Tudi ledvični indeks modelne skupine je bil bistveno nižji kot pri kontrolni skupini (slika 1b, P<0.05). after="" treatment="" with="" cf-m,="" the="" kidney="" index="" of="" samp8="" mice="" was=""><0.01). next,="" the="" results="" of="" masson's="" trichrome="" staining="" (fig.="" lc,=""><0.01)and the="" expression="" of="" fibrosis="" indicators="" col-i,="" α-sma,="" and="" fn="" revealed="" that="" m-group="" mice="" had="" more="" severe="" renal="" fibrosis="" than="" con-group="" mice,="" and="" cf-l="" and="" cf-m="" significantly="" attenuated="" renal="" fibrosis="" in="" samp8="" mice(fig.leg,=""><>

CF je izboljšal delovanje ledvic, oksidativni stres in ravni vnetja pri miših SAMP8

Poleg tega so testirali indikatorje ledvične funkcije vsake skupine miši, ki so vključevali količino urina pri miših za 12 ur, ravni dušika Cr in sečnine v serumu ter ravni beljakovin v urinu. Kot je prikazano na slikah 2a-d, so bile ravni beljakovin v urinu, Cr v serumu in dušika sečnine v serumu v modelni skupini znatno višje kot v kontrolni skupini (slika 2a, P<0.01), while="" the="" urine="" volume="" of="" the="" model="" group="" was="" significantly="" lower="" than="" that="" of="" the="" control="" group(fig.2b-d,=""><0.01). cf="" supplementation="" down-regulated="" the="" levels="" of="" urine="" protein,="" serum="" cr="" and="" urea="" nitrogen="" in="" the="" model="" group(fig.2b-d,=""><0.05 or=""><0.01) while="" increasing="" the="" urine="" output="" of="" model="" mice.="" collectively,="" the="" results="" indicated="" that="" samp8="" mice="" had="" kidney="" damage="" associated="" with="" aging,="" and="" treatment="" with="" cf="" effectively="" ameliorated="" this="" injury.="">cistanche Genghis KhanNato je bilo raziskano, ali je CF koristno moduliral oksidativni stres in vnetje v ledvicah hitro starajočih se miši. Kot je prikazano na sliki 2e-h, sta bili ravni SOD in GSH-Pxin v ledvicah skupine M znatno nižji od tistih v skupini Con, ravni IL-1 pa so bile bistveno višje od tistih v skupini skupina Con. Po zdravljenju s CF so se zgornji kazalniki izboljšali, še posebej je boljši učinek izboljšanja CF-L in CF-M.

CF je aktiviral pot Nrf2 v ledvicah miši SAMP8

Raven ekspresije p-Nrf2 je bila izmerjena v ledvičnih tkivih, da bi raziskali, ali je bila pot Nrf2 vključena v zaščitni učinek CF (sl. 3a-c) v tej študiji. Raven izražanja p-Nrf2 se je znatno zmanjšala samo v skupini SAMP8 (P<0.01, fig.="" 3c),="" and="" the="" downregulation="" was="" reversed="" to="" some="" extent="" by="" the="" treatment="" of="" cf="" crude="" extract.="" there="" was="" no="" significant="" change="" in="" the="" expression="" level="" of="" keapl="" among="" the="" groups(fig.="" 3b="" and="" d).="" further,="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" was="" detected="" and="" analyzed="" by="" immunohistochemical="" and="" western="" blot="" analyses.="" it="" was="" found="" that="" the="" expression="" level="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" mice="" in="" the="" m="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" in="" the="" con="" group;="" while="" cf="" treatment="" significantly="" reduced="" the="" expression="" levels="" of="" p-c-fos="" in="" the="" kidneys="" of="" the="" mice="" (fig.3a-b="" and="">

CF oslabljena Wnt/-katenin/RAS signalna aktivacija v ledvicah miši SAMP8

Da bi nadalje raziskali potencialni mehanizem delovanja CF proti fibrozi. Lokalizacija proteina je bila izvedena z uporabo imunohistokemije. Kot je prikazano na sliki 4a, je raven izražanja Wnt4 in

-katenin je bil induciran pretežno v ledvičnih tubularnih celicah. Podobne rezultate so opazili, ko so ocenili AGTR1, cilje spodnje poti signalizacije Wnt (slika 4a). Po tem je bila raven izražanja beljakovin kvantificirana in rezultati so pokazali, da so se beljakovine Wnt4, -katenin, renin in AGTR1 kopičile v tkivu ledvic miši v modelni skupini, medtem ko je CF znatno zaviral te spremembe (sl. 4b-f). ). Poleg tega je bila locirana in kvantitativno analizirana tudi raven izražanja CTGF. V skladu z zgoraj omenjenimi rezultati je bil CTGF izražen predvsem v ledvičnih tubulih, CF pa je izrazito zaviral aktivnost CTGF (slika 4d g).

CF in njegove spojine zavirajo staranje celic NRK-52E, ki ga povzroča D-gal

Celice NRK-52E, inducirane z D-gal, so bile uporabljene za presejanje nekaterih učinkovin pri CF, da bi določili materialno osnovo za zdravljenje senilnih ledvic z izvlečkom CF. Rezultati so pokazali, da je CF povečal viabilnost celic na način, ki je odvisen od odmerka, in spojin

SDC-0-14,16 in SDC-1-8, izolirana iz CF, sta imela boljše učinke na celično proliferacijo. Poleg tega so 25 ug/mL CF in spojine SDC-0-14,16 in SDC-1-8 pokazale učinek zaviranja aktivnosti -galaktozidaze (slika 5).

CF izboljšana PCA analiza ledvičnega tkiva pri miših SAMP8 Analiza glavnih komponent (PCA) je bila izvedena za raziskovanje učinkov CF na miših SAMP8. Kot je prikazano na sliki 6a, je obstajala očitna skupina med kontrolno in modelno skupino (R2X=0.542; Q2=0.38), kar nakazuje, da so bili endogeni metaboliti miši SAMP8 drugačni od SAMR1 miši, zaradi česar odstopajo od skupine SAMR1. Kot je prikazano na sliki 6b, so se tudi različne skupine CF združile v različne razrede od kontrolnih in modelnih skupin, skupine CF pa so se približale kontrolni skupini, kar kaže, da

endogeni presnovki miši SAMP8, ki so jih intervenirali s CF, so bili podobni presnovkom miši SAMR1.

Diskusija

Staranje ima pomembno vlogo pri napredovanju kronične ledvične bolezni [19]. Ko fibroza CKD napreduje, starajoče se celice izražajo in izločajo profibrotične faktorje (TGF-, CTGF itd.) in pro-vnetne faktorje (IL-1, IL-6, TNF- itd. ), ki so dejavniki sekretornega fenotipa, povezani s staranjem, s čimer pospešujejo ledvično fibrozo [20, 21]. Trenutno je tradicionalna kitajska medicina dosegla dobre rezultate pri zdravljenju ledvične fibroze z manj stranskimi učinki [22]. Ta študija je raziskovala intervencijske učinke izvlečka CF na ledvično fibrozo pri miših SAMP8. Sev miši, izbran za to študijo, je bil SAMP8, ki je bil razvit na podlagi življenjske dobe, staranja in rezultatov patološkega fenotipskega ocenjevanja AKR/miši in je bil model pospešenega staranja izključno genetskega izvora [23, 24]. Študije so pokazale, da spremembe v ledvični patologiji miši SAMP8 (9 mesecev) vključujejo tubulointersticijsko fibrozo in žariščno segmentno glomerulosklerozo [25]. Ugotovljeno je bilo, da je ledvična fibroza pri miših SAMP8 povezana s starostjo [6]. Zato smo testirali aktivnost -galaktozidaze in

stopnjo ledvične fibroze pri miših SAMP8 in ugotovili, da CF-L in CF-M izboljšata fibrozo ledvic in aktivnost -galaktozidaze pri miših SAMP8 (slika 1). Testirali smo tudi izločanje urina miši. V skladu s predhodno objavljenimi študijami, ki kažejo, da ima CF, pridobljen z dvema različnima postopkoma, diuretične učinke [13], je izvleček znatno povečal količino urina miši SAMP8. Prav tako je ta študija pokazala, da je dopolnjevanje s CF izboljšalo delovanje ledvic, aktivnost antioksidativnih encimov in ravni vnetnih dejavnikov pri miših SAMP8 (slika 2).

Sistem Keap1-Nrf2 je v zadnjih letih pritegnil pozornost številnih učenjakov zaradi svojih antioksidativnih in protivnetnih lastnosti. Njegov farmakološki potencial pri zdravljenju bolezni ledvic je bil obsežno raziskan v nekliničnih in kliničnih študijah [26]. Nrf2 je glavni transkripcijski regulator za gene, povezane z redoks statusom in antioksidativnimi učinki [27]. Študije so pokazale, da je fosforilacija potrebna za aktivacijo Nrf2 in indukcijo ciljnega gena [28]. Aktivacija Nrf2 je izboljšala napredovanje CKD s preprečevanjem oksidativnega stresa in vzdrževanjem celične redoks homeostaze [29]. Kot ključni transkripcijski faktor igra Nrf2 ključno vlogo pri obrambi pred oksidativnim stresom z uravnavanjem svojih antioksidantov in encimov za razstrupljanje [30]. Kim et al. poročali, da je resveratrol kot močan aktivator Nrf2 izboljšal s staranjem povezano progresivno poškodbo ledvic [31]. V tej študiji je CF izboljšal oslabitev Nrf2 v ledvicah miši SAMP8, ne da bi vplival na raven ekspresije Keapl, kar kaže, da lahko surovi ekstrakt CF izboljša oksidativno škodo v ledvicah z aktiviranjem poti Nrf2 (slika 3).

Za ledvično fibrozo je značilno prekomerno odlaganje zunajceličnega matriksa (ECM), kar povzroči nastanek brazgotin v ledvičnem parenhimu [32]. Transformacijski rastni faktor (TGF-) naj bi bil ključni citokin pri prekomerni aktivaciji fibroblastov [33, 34]. Seveda ciljanje samo na signalno pot TGF ne zadostuje za zmanjšanje ledvične fibroze. Nekatere študije so pokazale, da so CTGF, Wnt/-katenin, sistem renin-angiotenzin, oksidativni stres in tako naprej vpleteni v ledvično fibrozo [35-37]. Wnt/-katenin je evolucijsko ohranjena signalna pot, vključena v regulacijo tkivne homeostaze, razvoj organov in popravilo poškodb[38]. Cisternas et al. razpravljali o profibrotičnem učinku signalizacije Wnt v skeletnih mišicah in ledvicah [39]. Vse več dokazov je pokazalo, da ima signalna pot Wnt/-katenin ključno vlogo pri uravnavanju razvoja in napredovanja ledvičnih fibrotičnih lezij po poškodbi [40-42]. Signal Wnt/-katenin je v ledvicah zdravih odraslih relativno tih in se aktivira, ko so ledvice izpostavljene različnim vrstam poškodb [43].

Pri sesalcih ima družina Wnt vsaj 19 družinskih članov, ki so kritični za razvoj ledvic. In vsaj 15 od teh družinskih članov je različno reguliranih v starajočih se ledvicah, vključno z Wnt4 [6]. Rezultati te študije so pokazali, da je bila stopnja ekspresije proteina Wnt4 v ledvicah miši SAMP8 bistveno višja od tiste pri miših SAMR1, kar je bilo preverjeno tako z Western blotom kot z imunohistokemičnimi analizami (sl. 4a, d in f). Po naključju se je povečala tudi raven izražanja proteina -katenina. Prav tako sta bila tako Wnt4 kot -katenin izražena v epitelijskih celicah ledvičnih tubulov, kot je razkrila imunohistokemična analiza (sliki 4a in f). Wnt/-katenin je izzval ledvično fibrozo z indukcijo številnih fibrogenih genov, kot so komponente RAS, matrična metaloproteinaza-7 (MMP-7), inhibitor aktivatorja plazminogena 1 (PAI-1) in Snail [37]. ]. Zhou et al. opisal Wnt/-katenin kot glavni regulator navzgor, ki nadzoruje izražanje vseh testiranih komponent RAS v ledvicah [44]. Zhou in drugi so uporabili podganji model 5/6 nefrektomije (5/6 NX), da bi prikazali stopnje izražanja glavnih komponent RAS v možganih in ledvicah, kot so angiotenzinogen, angiotenzin-konvertaza in angiotenzin II AT{{25 }}receptor je bil znatno povečan. Povečano raven izražanja je zaviral osrednji zaviralec Wnt, ki je bil adeno-povezan virusni vektor, ki prekomerno izraža gen DKK1 [45]. Podobno je ta študija ugotovila, da je bil AGTR1 še vedno izražen v ledvičnem tubulnem epiteliju in da so bile ravni ekspresije renina in AGTRl v ledvičnih tkivih miši SAMP8 bistveno večje od tistih pri miših SAMR1 (sl. 4a in dg). Ti rezultati so pokazali, da je bila signalna pot Wnt/-catenin/RAS aktivirana v ledvicah miši SAMP8 in CF je učinkovito zaviral aktivacijo te poti.

CTGF izvaja več bioloških funkcij, vključno s spodbujanjem mitoze kemotaktičnih celic, spodbujanjem adhezije in spodbujanjem celične proliferacije in sinteze ECM [35,46]. CCN2(CTGF) modulira Wnt signalizacijo z vezavo na protein 5/6, povezan z receptorjem lipoproteinov nizke gostote (LRP5/6), za nadaljnje posredovanje fibroze [39, 47]. Druge študije so uporabile utišanje genov, da bi odkrile in potrdile, da Nrf2 uravnava pot Wnt z uravnavanjem ravni izražanja CTGF, kar vpliva na ledvično intersticijsko bolezen. Prav tako je Nrf2 reguliral raven transkripcije CTGF predvsem preko regulatorja transkripcije CTGF c-Fos [48]. Imunohistokemijska analiza je pokazala, da sta bila CTGF in pc-Fos izražena predvsem v epitelijskih celicah ledvičnih tubulov, pc-Fos pa je bil porazdeljen tudi v glomerulih. Kvantitativna analiza je pokazala, da je CF zaviral nivoje izražanja obeh proteinov (sliki 3b in e ter 4a in c). Končno je bila analiza PCA uporabljena za nadaljnje preverjanje, da je CF izboljšal poškodbo ledvic pri miših SAMP8 (slika 6). Ta študija je zagotovila dokaze, da CF ni le aktiviral signalizacije Nrf2, ampak se je zanašal tudi na Nrf2 za uravnoteženje oksidativnega stresa in vnetja, zaviral signalizacijo Wnt/-katenin/RAS ter izboljšal staranje ledvic in ledvično fibrogenezo. Vendar pa smo v tem poskusu ugotovili tudi nedosledno izboljšanje učinka CF na obarvanje po Massonu in SA- -gal. Špekulira se, da je to lahko posledica nedoslednega napredovanja ledvičnega staranja in ledvične fibroze pri miših SAMP8. Stopnja staranja ledvic pri miših v tem poskusu je lahko resnejša od fibroze. Zato učinek CF-H na staranje ledvic pri miših SAMP8 ni bil tako očiten kot učinek ledvične fibroze.

Kot redukcijski monosaharid se D-galaktoza široko uporablja pri različnih starostnih boleznih in vivo in in vitro. Ugotovljeno je bilo, da D-gal povzroča staranje in poškodbe v celicah NRK-52E [49], inducira staranje proksimalnih tubularnih epitelijskih celic človeške ledvice (celice HKC-8) in povečuje ravni ekspresije dveh ledvičnih proteina markerja fibroze FN in a-SMA [6]. V tej študiji je bil D-gal uporabljen za indukcijo celic NRK-52E in vitro. Z uporabo testa MTT in barvanja z -galaktozidazo za odkrivanje spojin, izoliranih iz CF, je bilo ugotovljeno, da sta SDC-0-14,16 in SDC-1-8 povečala viabilnost celic, ki jo povzroča D-gal, in zavirata, ki jo povzroča D-gal celično staranje (slika 5). Ti kažejo, da sta lahko SDC-0-14,16 in SDC-1-8 materialna podlaga za CF za upočasnitev staranja ledvic. SDC-1-8 je eden od feniletanoidnih glikozidov. Ugotovljeno je bilo, da feniletanoidni glikozidi podaljšujejo življenjsko dobo Caenorhabditis Elegans [50] z učinki proti staranju [51] in nevroprotektivnimi učinki [52-54]. Ti zagotavljajo smer za našo nadaljnjo študijo o farmakoloških učinkih CF.

Sklepi

Na koncu so študije in vivo pokazale, da CF zmanjša ledvično fibrozo pri starejših miših. Nekatere možne aktivne sestavine so odkrili v poskusih in vitro. Te ugotovitve so zagotovile farmakološko podporo zdravljenju bolezni ledvic s CF in usmeritev za nadaljnje raziskave učinkovin CF.

Ta članek je izvleček iz Cao et al. Komplementarna medicina in terapije BMC (2022) 22:52