Visoka vsebnost ent-11 -hidroksi-15-okso-kaur-16-en-19-ojske kisline v izvlečku listov Adenostemma Lavenia (L.) O. Kuntze: s predhodnim testom in vivo

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Akie Hamamoto, Ryosuke Isogai, Miwa Maeda, Masumi Hayazaki, Eito Horiyama, Shigeo Takashima, Mamoru Koketsu in Hiroshi Takemori *

Povzetek:Ozadje: Ent-11 -hidroksi-15-okso-Kaur-16-en-19-ojska kislina(11 OH-KA) je večnamenska biokemikalija, ki jo najdemo v nekaterih praproti, Pteris semipinnata, in njenih sorodnih vrstah. Čeprav so bile predlagane številne terapevtske uporabe 11 OH-KA (npr. proti raku, proti vnetju inbeljenje kože), vsebnost 11 OH-KA v teh praproti ni visoka. Adenostemma lavenia (L.)O. Poročali so tudi, da Kuntze, Asteraceae, vsebuje 11 OH-KA. Odvarek (izvleček vroče vode) celih rastlin A. Lavenia se uporablja kot ljudsko zdravilo za vnetne bolezni, kot sta hepatitis in pljučnica, kar nakazuje, da je lahko 11 OH-KA sestavina, odgovorna za zdravilne lastnosti te rastline. Metode: Antimelanogene aktivnosti vodnih izvlečkov A. Liste Lavenia in Pteris dispar Kunze (sorodnik P. semipinnata) so primerjali v mišjih celicah melanoma B16F10. Znesek11 OH-KAsmo izmerili s spektrometrijo s tekočinsko kromatografijo. Miši C57BL/6J smo zdravili z vodnim izvlečkom listov A. Lavenia in izmerili koncentracijo 11 OH-KA v krvi. Učinkovitost vodnega izvlečka A. Lavenialeaf in vivo je bila ovrednotena glede na njegovo antimelanogeno delovanje s spremljanjem barve las. Rezultati: Čeprav sta oba izvlečka (A. Lavenia in P. dispar Kunze) pokazala visoko antimelanogeno delovanje, je le A. Lavenia vsebovala visoko količino 11 OH-KA, približno 2,5 odstotka teže suhih listov.11 OH-KA se lahko očisti iz listov A. Lavenia v dveh korakih: ekstrakcija vode, ki ji sledi porazdelitev kloroforma. Zdravljenje miši z vodnim izvlečkom listov A. Lavenia zavira pigmentacijo v njihovih dlačicah. Sklepi: Kljub majhnemu številu pregledanih miši trenutni preliminarni rezultati potlačene pigmentacije dlak kažejo, da sta vodni izvleček listov A. Lavenia in sestavina, ki je morda odgovorna za to – 11 OH-KA – nova materiala za oralno kozmetiko. Rezultati so lahko koristni tudi pri prihodnjem razvoju funkcionalnih živil in metod za zdravljenje bolnikov s hiperpigmentacijskimi motnjami, kot je melazma.

Ključne besede: 11 -hidroksi-15-okso-kaur-16-en-19-ojska kislina; proti melanogenezi; beljenje kože;funkcionalna hrana; zdravilna rastlina; Adenostemma Lavenia; Pteris dispar Kunze;tirozinaza; B16F10 melanom

Cistanche zavira aktivnost tirozinaze

1. Uvod

Študije o antimelanogenih reagentih zabeljenje kožein preprečevanje staranja so postali vse pogostejši, zlasti za sestavine v živilih (sadje, zelenjava in zdravilna zelišča) [1]. Številni polifenoli in terpeni ter njihovi viri so bili razviti in komercializirani kot funkcionalna živila in dodatki.

Diterpen/kaurene ent-11 -hidroksi-15-okso-kaur-16-en-19-ojska kislina (11 OH-KA), najdena v listih praproti (Pteris semipinnata [2– 5], Pteris livida [6]) in Compositae (Gochnatia decora [7]), je tudi privlačen kandidat za antimelanogene reagente [5]. Kljub širokemu fiziološkemu delovanju (npr. proti raku in vnetju) [8–11] obstaja le nekaj zapisov o in vivo učinkovitosti 11 OH-KA, vključno z njegovim antimelanogenim potencialom, verjetno zaradi njegove redkosti. in omejeno število virov.

Študije razmerja med strukturo in aktivnostjo, tako in vitro kot v gojenih celicah, so identificirale dele v 11 OH-KA, pomembne za izvajanje njegovih funkcionalnih aktivnosti (slika 1). Zamenjava karboksi skupine na 19. mestu v11 OH-KAz metilnimi ali hidroksi skupinami pretvori to spojino v spojino z visoko aktivnostjo proti raku, kar kaže, da 19-karboksilna skupina oslabi celično toksičnost te spojine [5,10,12]. Nasprotno pa alkenska skupina na 16. položaju, ketonska skupina na 15. položaju in hidroksi skupina na 11. položaju povečajo apoptotične aktivnosti z aktiviranjem signalne poti kaspaze [10,12]. Vendar pa ti deli niso nepogrešljivi za signale celične smrti kaurenov. Strukturne zahteve za protivnetno delovanje so podobne tistim za delovanje proti raku, kar kaže na preslušavanje prek običajnih celičnih tarč, kot je jedrski faktor kapa B (NF-κB) [12].

Tirozinazaje encim, ki omejuje hitrost pri sintezi melanina [13,14]. Encim katalizira zaporedne reakcije: pretvorbo tirozina v l-3,4-dihidroksifenilalanin, l-Dopa in nato v dopakinon. Poročali smo, da 11 OH-KA zavira izražanje gena tirozinaze, ki povzroči zatiranjemelanogenezav celicah mišjega melanoma B16F10 [5]. Deli 11 -hidroksi, 15-okso in 16-en v 11 OH-KA so nepogrešljivi za njegovoproti melanogeneziaktivnost, ki je drugačna značilnost strukturnih zahtev 11 OH-KA v primerjavi z drugimi aktivnostmi, kot so protirakaste ali protivnetne aktivnosti.

Tako je 11 OH-KA v smislu svojega antimelanogenega delovanja edinstvena spojina med kaureni. Na žalost je Pteris dispar Kunze, naš prejšnji vir11 OH-KA, je vseboval le majhno količino te spojine [5] in ta praprot, kot tudi P. semipinnata (sorodnik) [4,15], nista zabeležena o uporabi pri ljudeh. Poleg tega so bila v vseh preteklih poskusih za ekstrakcijo 11 OH-KA uporabljena organska topila (metil ali etilni alkohol, kloroform ali heksan), brez zapisov o uporabi vodne ekstrakcije.

Pred skoraj 40 leti je ameriška skupina odkrila 11 OH-KA in njegove derivate v AdenostemmaLavenia (L.) O. Kuntze (Asteraceae) [16]. Čeprav A. Lavenia ni bila dovolj raziskana glede tveganja možnih kontaminantov (npr. anorganskih onesnaževal [17] in sekundarnih metabolitov, ki jih proizvajajo glive [18,19]) v listih in drugih delih, se prašek cele rastline (imenovan Ma Zhi Hu) prodaja v Združenih državah z dovoljenjem zdravnikov (izdelke je mogoče dobiti pri QualiHerb, Cerritos, CA, ZDA: Dodatni materiali, slika S1). Zato v tej študiji z merjenjem11 OH-KAVsebnost in ocenjevanje učinkovitosti njegovih antimelanogenih aktivnosti smo preučili potencial vodnega izvlečka listov A. Lavenia za uporabo v interni kozmetiki, kot tudi novo kategorijo funkcionalnih živil [20–22], ki se lahko uporabljajo za zdravljenje bolniki s hiperpigmentacijskimi motnjami, kot je melazma. Do danes je bila na voljo le traneksamična kislina (hemostatsko zdravilo) kot interno zdravilo za hiperpigmentacijske motnje [23, 24].

Tukaj poročamo, da listi A. Lavenia vsebujejo 11 OH-KA v visokih ravneh (približno 2,5 odstotka suhe teže listov). Vodni izvleček listov A. Lavenia učinkovito zatiramelanogenezav celicah B16F10 in11 OH-KAje lahko odgovoren za 50 odstotkov antimelanogenih aktivnosti vodnega izvlečka. Peroralno zdravljenje miši z vodnim izvlečkom listov A. Lavenia povzroči zatiranje njihove pigmentacije dlak.

2. Materiali in metode

2.1. Razmnoževanje A. lavenia

Ker je A. lavenia na večini območij Japonske navedena kot ogrožena vrsta, smo to rastlino gojili na polju v bližini našega laboratorija. A. lavenia je bila razmnožena z delitvijo iz 10 sadik, v tej raziskavi pa je bilo uporabljenih skoraj 100 gof posušenih listov, nabranih od junija do julija 2019.

2.2. Čiščenje 11 OH-KA iz vodnih izvlečkov in njegova analiza

Čisti 11 -OH KA (avtentični) je bil kupljen pri BioBioPha (Šanghaj, Kitajska). Posušen listni prah (100 mg), pridobljen iz listov A. lavenia ali P. dispar Kunze, smo za 12 ur namakali v 1 ml destilirane vode (za 10-volumensko ekstrakcijo) in ostanke odstranili s centrifugiranjem pri 12, 000 vrt/min za 10 min. Dobljene ekstrakte smo analizirali s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HP) z uporabo kolone C18 ODS (4,6 mm × 50 mm: RP-18 GP, Kanto Kagaku, Tokio, Japonska) z gradientom v razponu od 40 odstotkov metanol/voda do 100 % metanola v 10 minutah. Detekcija 11 -OHKA je bila izvedena z določanjem ultravijolične (UV) absorpcije pri 245 nm (A245). Za 20-,30- in 50-volumenske ekstrakcije smo 50 mg, 33 mg in 20 mg prahu posušenih listov ekstrahirali z 1 ml destilirane vode.

Za potrditev strukture {{0}}OH KA v A. lavenia smo kaurenojsko kislino očistili v pol velikem obsegu. Skupaj 100 g posušenih listov A. lavenia je bilo dvakrat ekstrahiranih iz 20 volumnov vode, vodnemu ekstraktu listov je bil dodan enak volumen CHCl3 in 11 -OH KA je bil pridobljen iz faze CHCl3. Med izhlapevanjem pridobljene faze CHCl3 se je 11 -OH KA oboril kot bele kristale. Ti kristali so bili pridobljeni s papirnatim filtrom. Pridobljene kristale smo analizirali z jedrsko magnetno resonanco (NMR) (1H-NMR (CDCI3) δ 0,95 (3H, s), 1,28 (3H, s), 1,05–2,22 (15H, m), 2,37 (1H, d, J { {27}}.9 Hz), 3,06 (1H, širok s), 4,06 (1H, d, J=4.6 Hz), 5,27 (1H, s) in 5,87 (1H, s)). 1H-NMR spekter kristala je sovpadal z avtentičnim spektrom 11 -OH KA (glejte sliko S2 dodatnega materiala).

2.3. Analiza 11 OH-KA v mišjem serumu

Metode za ultrazmogljive analize LC (UPLC)-masne spektrometrije (MS) so bile povzete iz več metod, uporabljenih v [25,26]. Na kratko, za zdravljenje miši (C57BL/6J) smo liste A. lavenia ekstrahirali s 30 volumni vode. Po 20-minutni sterilizaciji pri 120 ◦C smo izvleček še razredčili z 2 volumnima vode in postregli kot pitno vodo. Da bi preučili farmakokinetiko 11 -OHKA, smo peroralno dajali 100 mg/kg spojine, suspendirane v 1 odstotku Tween 80 (Kanto Kagaku, Tokio, Japonska). Kri so pridobili preko repne vene 15–240 minut po dajanju.

Za merjenje {{0}}OH KA v mišji krvi smo serum (20 µL) ekstrahirali z 200 µL offacetonitrila. Za normalizacijo učinkovitosti ekstrakcije je bilo serumu pred ekstrakcijo dodanih 10 nmol 18 -gliciretinske kisline (Kanto Kagaku). Po odstranitvi acetonitrila z uparjenjem smo spojine raztopili v 5 µL metanola, čemur je sledil dodatek 5 µL H2O. Nato smo uporabili 1 µL raztopine za LC-MS spektrometrijo (MS: Waters Xevo G2-XS QTof, Waters, Milford, MA). Za ločevanje 11 -OH KA, C18 ODS kolona (3,0 mm × 150 mm (5 µm): RP-18 GP, Kanto Kagaku) ​​in gradient v razponu od 35 odstotkov acetonitrila/vode do 100 odstotkov acetonitrila v 10 minutah. Pogoji MS so bili naslednji: kapilara (kV), 2,20; jedro za vzorčenje, 45; ekstrakcijski konus, 4.0. Ker nam z analizami MS/MS ni uspelo zaznati fragmentov 11 -OH KA (slika S3A dodatnega materiala),11 -OH KA kvantificiramo samo s signali MS s spremljanjem razmerja med maso in nabojem (m/ z) od 331.1879 s potjo 0,01 Da (slika S3B dodatnega materiala). Standardno krivuljo smo pripravili z dodatkom 11 -OH KA (pri končni koncentraciji 0,1–3 µM) 50-odstotnemu metanolu/vodi, ki smo ga pripravili iz običajnega mišjega seruma z uporabo istega postopka za 11 -OH Ekstrakcija KA. 18 -Gliciretinsko kislino smo izmerili z uporabo LC-UV pod enakimi pogoji kot za meritev 11 -OH KA. Te poskuse na živalih je odobril Odbor za poskuse na živalih Univerze Gifu (H30-041). Uporabili smo minimalno število miši, da smo izpolnili zahteve glede dobrega počutja živali.

2.4. Test melanogeneze

Mišje celice melanoma B16F10 iz ameriške zbirke tipskih kultur (RIKEN, Tsukuba, Japonska) so bile gojene v Dulbeccovem modificiranem Eagleovem mediju (DMEM-High glucose (4,5 g/L d-glucose), WAKO, Kyoto, Japonska) in dopolnjene z 10 odstotki fetalni goveji serum in antibiotiki. Celice smo inkubirali v vlažni atmosferi s 5 odstotki CO2 pri 37 ◦C in jih vsaka dva dni prenesli s tripsinizacijo na nove plošče s kulturo.

Celice (2 × 105) smo nanesli na 6-ploščo z vdolbinicami in inkubirali 12–16 ur pred indukcijomelanogeneza. Melanogenezo smo inducirali z 20 µM forskolinom (Fsk) skupaj z vodnim izvlečkom A. lavenia ali 11 -OH KA 48 ur. Meritve melanina so bile izvedene v skladu z literaturo [5]. Na kratko, celice smo dvakrat sprali s fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom in obnovili v 2 ml zbiralne epruvete, čemur je sledilo centrifugiranje pri 8000 obratih na minuto 1,5 minute. Vsako celično peleto smo suspendirali v 200 µL destilirane vode in 50 µL smo uporabili za merjenje vsebnosti beljakovin. Preostalih 150 µL smo zmešali s 150 µL 2 M NaOH in nato lizirali z inkubacijo pri 45 ◦C 2 uri. Melanin smo ekstrahirali z mešanico kloroforma in metanola 2:1 in izmerili z aspektofotometrom (Glomax Multi, Promega, Madison, WI, ZDA) pri 405 nm. Koncentracijo beljakovin v celičnih peletih smo določili z Bradfordovim reagentom (Bio-Rad, Hercules, CA, ZDA) in uporabili za normalizacijo vsebnosti melanina.

učinki ekstrakta cistanche: zavirajo melanin in beljenje kože

2.5. Statistična analiza

Statistična analiza je bila izvedena z uporabo Studentovega t-testa, ko so bili podatki pridobljeni med istim poskusom. Statističnih analiz nismo uporabili, če so bili poskusi izvedeni na različne dneve ali če je bilo število vzorcev le dva.

3. Rezultati

3.1. A. Lavenia vsebuje visoko količino 11 OH-KA

Prej smo poročali, da je etanolni ekstrakt listov P. disper Kunze, pripravljen z 10 volumni suhe teže (v/m) etanola, učinkovito zaviralmelanogenezav celicah B16F10, tudi po razredčitvi 1/1000 [5]. Za primerjavo učinkovitosti vodnih izvlečkov posušenih listov A. lavenia in vodnih izvlečkov listov P. disper Kunze smo pripravili izvlečke (20 volumnov vode (v/m posušenih listov)) in jih skupaj dodali v gojišče. s forskolinom (induktor melanogeneze – agonist acAMP). Oba izvlečka sta učinkovito zavirala sintezo melanina tudi pri razredčitvi 1/1000, ko je bila vsebnost temelanina vizualno ocenjena (slika 2A). Vsebnost melanina je bila izmerjena po ekstrakciji NaOH (slika 2B). Pri razredčitvi 1/3000 je ekstrakt A. lavenia zmanjšal vsebnost melanina za 69 odstotkov v primerjavi s kontrolo (samo Fsk), ekstrakt P. disper Kunze pa je znižal vsebnost melanina za 41 odstotkov. Pri razredčitvi 1/1000 je ekstrakt A. lavenia popolnoma zmanjšal vsebnost melanina, medtem ko so izvlečki P. disperKunze znižali vsebnost melanina za 60 odstotkov. Te razlike niso opazili, ko so bili ekstrakti razredčeni na 1/300.

LC-UV analize so pokazale, da11 OH-KAje bila glavna sestavina vodnega izvlečka A. lavenia (slika 2C, levo). Nasprotno pa ni bil zaznan jasen vrh za 11 OH-KA, ko je P. Analiziran je bil disperzni ekstrakt Kunze (slika 2C, desno). Analize LC-MS so pokazale, da je vrh, označen s puščico, ustrezal 11 OH-KA (podatki niso prikazani). Ti rezultati kažejo, da je 11 OH-KA morda glavna komponenta, odgovorna zamelanogenezainhibicijo v ekstraktu A. lavenia, medtem ko lahko derivati, kot so glikozilirane oblike [5], prednostno prispevajo k inhibiciji melanina v P. razpršeni izvleček Kunze.

Nato smo poskušali očistiti11 OH-KAz distribucijo. CHCl3 je uspel ekstrahirati 11 OH-KA iz zgornjega vodnega ekstrakta A. lavenia z visoko čistostjo (več kot 87 odstotkov) (slika 2D, levo). Spektri NMR analiz kristalizirane snovi v CHCl3 so bili identični spektrom avtentičnega11 OH-KA (glejte Materiali in metode). V nasprotju s tem je bilo iz vodnega ekstrakta P. disper Kunze ekstrahiranih veliko neznanih spojin (slika 2D, desno). Povzetek analiz LC je prikazan na sliki 2E, kar nakazuje, da je A. lavenia privlačen vir 11 OH-KA.

3.2. Primerna ekstrakcija 11 OH-KA iz A. lavenia

Glede na informacije, ki jih najdemo na internetu, se vsi deli (listi, steblo in korenina) A. lavenia uporabljajo kot zeliščna zdravila na Kitajskem in Tajvanu. Da bi ugotovili najboljše pogoje za ekstrakcijo 11 OH-KA iz A. lavenia, smo najprej preučili, kateri deli rastline so bogati s to spojino. Vodne izvlečke smo pripravili samo iz listov ali iz nadzemnih delov. Themelanogenezatest na celicah B16F10 je pokazal, da ima izvleček, pripravljen iz nadzemnih delov (stebel in listov), ​​manjšo antimelanogeno aktivnost kot tisti, pripravljen iz samih listov (slika 3A, levo). To nakazuje, da stebla (ki predstavljajo več kot 90 odstotkov suhe teže) vsebujejo manj11 OH-KA, kar je bilo potrjeno z analizami LC-UV (slika 3A, desno).

Nato smo preverili, koliko volumnov vode je treba uporabiti za ekstrakcijo. Očitno bi lahko majhna količina vode (10-krat) obogatila11 OH-KA(Slika 3B). Špekulirali smo, da bi lahko nizka topnost 11 OH-KA v vodi pomagala zadržati to spojino v ostankih. Največji izkoristek 11 OH-KA v vodi je bil opažen, ko je bilo uporabljenih več kot 30 volumnov vode (slika 3C). Zato smo ob upoštevanju največjega izkoristka in obogatitve 11 OH-KA v vodi v kasnejših poskusih uporabili 30 volumnov vode.

Na Kitajskem in v Tajvanu A. lavenia ekstrahirajo v vroči vodi, s katero so preverili toplotno stabilnost11 OH-KA. Vodne ekstrakte smo inkubirali pri 90 ◦C ali 120 ◦C 10 ali 20 minut in vsebnost 11 OH-KA analizirali z LC-UV. Te toplotne obdelave so povzročile veliko količino usedlin, verjetno sestavljenih iz denaturiranih beljakovin. The11 OH-KAvsebnosti v topni frakciji so bile očitno povečane (slika 3D), kar je lahko posledica odstranitve teh usedlin.

3.2.1. OH-KA je spojina v vodnem izvlečku A. Lavenia odgovorna za antimelanogeno delovanje v celicah B16F10

Ko smo 1 g lista ekstrahirali v 30 volumnih vode, je bila vsebnost 11 OH-KA približno 0,6 mg/mL (1,8 mM). Za določitev stopnje prispevka11 OH-KAv vodnem izvlečku A. lavenia na antimelanogeno delovanje so testirali različne koncentracije avtentičnega 11 OH-KA v celicah B16F10. Vizualni pregled (Slika 4A) in merjenje vsebnosti melanina (Slika 4B) sta razkrila, da so vodni izvlečki (Slika 4A, zgornji niz), ki so pokazali enako učinkovitost v smislu antimelanogene aktivnosti kot avtentični 11 OH-KA sam (Slika 4A, spodnji niz) je vseboval le polovično količino11 OH-KA. Ti rezultati kažejo, da je 11 OH-KA v izvlečku prispeval k skoraj 50 odstotkom antimelanogene aktivnosti izvlečka. Ostalih 50 odstotkov bi lahko izhajali iz derivatov 11 OH-KA, kot so glikozidne oblike, kar bi lahko tudi pojasnilo nizko vsebnost 11 OH-KA v P. disper Kunzejev izvleček kljub visoki učinkovitosti v smislu antimelanogenega delovanja (slika 2).

učinki izvlečka cistanke: proti staranju in beljenju kože

3.2.2. OH-KA je spojina v izvlečku A. lavenia odgovorna za antimelanogeno delovanje pri miših

Da bi pridobili predhodne rezultate za prihodnji razvoj A. lavenia kot materiala za kozmetiko, smo izvedli analize in vivo z uporabo majhnega števila miši. Najprej smo preučili farmakokinetiko 11 OH-KA pri miših. Pri miših s približno 25 g telesne teže je bil vnos vode približno 4 ml na dan. Največja topnost 11 OH-KA v vodnem ekstraktu A. lavenia (glej sliko 3C, 20–30 prostornine vode: 0,6 mg/mL) bi lahko teoretično zagotovila 100 mg/kg dnevni odmerek thiskaurenojske kisline (4 mL 0,6 mg/mL 11 OH-KA je pomenilo 2,4 mg/dan; normalizacija 2,4 mg glede na telesno težo miši (25 g) je povzročila 96 mg/kg). Zato smo se odločili, da miši zdravimo s 100 mg/kg11 OH-KA (suspendiranega v 200 µL 1-odstotnega Tween 80).

Peroralno zdravljenje z11 OH-KApovzročilo njegov hiter pojav (v 15 minutah) v krvi (slika 5A). Koncentracija je dosegla in obdržala učinkovit odmerek v celicah B16F10. Ta rezultat kaže, da se lahko 11 OH-KA absorbira skozi prebavni trakt. Vendar pa dejstvo, da se je koncentracija zmanjšala v 60 minutah, kaže na hitro izločanje te spojine.

Nato smo preučili kronične učinke 11 OH-KA pri miših. Ker se celo 0.6 mg/mL 11 OH-KA hitro obori v pitni vodi, če11 OH-KAje bil čist, smo se odločili preizkusiti vodni izvleček A. lavenia. Vendar lahko vodni izvleček A. lavenia vsebuje neznane sestavine z grenkim okusom. Zato je bilo treba izvleček dodatno razredčiti z dvema volumnima vode (s končno vrednostjo 0.3 mg/mL za 11 OH -KA, približno 50 mg/kg/dan). Miši smo 1 teden zdravili z vodnimi izvlečki in jim nato odvzeli vzorce krvi (slika 5B). Analize LC-MS so odkrile11 OH-KA v krvi pri polučinkoviti koncentraciji. Preučili smo tudi vodni izvleček P. dispar Kunze, ki je bil pripravljen po enakem postopku kot vodni izvleček A. lavenia. Vsebnost 11 OH-KA v krvi miši, zdravljenih z ekstraktom P. dispar Kunze, je bila 10-krat nižja kot pri miših, zdravljenih z ekstraktom A. lavenia.

Pri odraslih miših se rast dlak med telogensko fazo ustavi za nekaj mesecev, nova rast (anagen) pa se naključno pojavi v samo nekaj dneh na različnih področjih [27]. Zato je treba preučiti učinekmelanogenezazaviralci, mora pripadati trajanje zdravljenja s spojinami (zaviralci) (npr. nekaj mesecev). Nasprotno pa se puhaste dlake v 3–4-tedenski (W) fazi sočasno zamenjajo z dlakami odraslih. Ko torej miši 3W 2 tedna zdravimo z zaviralci, so učinki namelanogenezase lahko oceni iz pigmentacije (barve) na novo zraslih las (tj. prvih odraslih las) pri 5W–6W [28].

Ko so miši dva tedna zdravili z izvlečkom A. lavenia s pitno vodo (3W–4W), je bila njihova pigmentacija v novo zraslih dlačicah zatrta (slika 5C). Nasprotno pa njihova pigmentacija oči ni bila prizadeta. Pri miših, zdravljenih z ekstraktom P. dispar Kunze, niso opazili zatiranja pigmentacije dlak. Ti rezultati kažejo, da lahko izvleček listov A. lavenia vsebuje antimelanogene snovi, po možnosti 11 OH-KA, ki so učinkovite in vivo, medtem ko P. izvleček listov dispar Kunze, verjetno bogat z11 OH-KAderivati ​​morda ne bodo učinkoviti in vivo.

koristi cistanche: antioksidacija

4. Razprava

Ugotovili smo, da listi A. lavenia vsebujejo visoko količino 11 OH-KA (približno 2,5 odstotka teže suhih listov). Voda je učinkovito ekstrahirala 11 OH-KA kljub hidrofobni naravi te spojine. Ker je bil 11 OH-KA v vodi stabilen pri 120 ◦C 20 minut, smo sterilizirali vodni ekstrakt A. list lavenije in ga dajali mišim. Rezultati so potrdili prisotnost11 OH-KAv krvi mišic in moč vodnega izvlečka kot antimelanogenega reagenta in vivo.

O prisotnosti 11 OH-KA in njegovih derivatov v A. lavenia so poročali leta 1979 [16] in 1990 [29]. Od takrat je samo ena študija iz Indonezije poročala o celoviti analizi sestavin v A. lavenia [30]. Vendar v teh materialih ni bil identificiran noben 11 OH-KA. Poleg tega niso bile najdene nobene študije o fizikalnih lastnostih 11 OH-KA, ki jih je mogoče ekstrahirati s čisto vodo iz A. lavenia.

Pregledni članek o ljudskih zdravilih v Indiji se nanaša na vodni izvleček A. lavenia kot zdravilo za motnje prebavnega sistema [31]. Internetno iskanje za "A. lavenia" ali njeno kitajsko ime je nakazovalo nekaj koristnih uporab te rastline kot protivnetnega zeliščnega zdravila prek izvlečka vroče vode (tj. kot pripravka) (npr. za hepatitis, vnetje pljuč (alergija in kronična obstruktivna pljučna bolezen) in vnetje kože). Vendar pa v PubMed ni bilo najdenih uradnih poročil o bioloških aktivnostih izvlečkov A. lavenia ali ekološkem stanju te rastline. V našem mestu (Gifu, Japonska) je A. lavenia uvrščena med ogrožene vrste. Redkost A. lavenia lahko oteži analizo in razvoj njenega potenciala kot zdravila rastlinskega izvora in funkcionalne hrane.

Po drugi strani pa blagodejni potencial11 OH-KA, očiščen iz P. semipinnata, je bil določen in vitro in in vivo [8–11]. Čeprav nismo preučili vsebnosti 11 OH-KA v P.semipinnata, domnevamo, da ta vsebnost morda ni zelo visoka v primerjavi s tisto v A. lavenia, ker P. semipinnata je tesno povezana s P. disper Kunze. Poleg tega ni nobenih zapisov o uporabi teh praproti pri ljudeh, niti na internetu. To ozadje nakazuje, da ima lahko A. lavenia večji potencial kot zdravilo rastlinskega izvora kot te praproti, če se dokaže, da ima 11 OH-KA klinični potencial.

Študije o potencialu11 OH-KAso bili osredotočeni na njegove dejavnosti kot sredstva proti raku [2,10,11,32] in protivnetnemu [11,33]. Res pa je tudi, da so odmerki 11 OH-KA, potrebni za te aktivnosti, večji od 20 µM, kar je relativno veliko. Nasprotno pa pri koncentraciji, manjši od 1 µM, kaurene ent-11 -hidroksi-16-Karen-15-on, ki ima metilno skupino v19-položaju namesto karboksilne skupina v 11 OH-KA kaže visoko apoptotično aktivnost proti človeškim monocitom HL-60 [12]. Te razlike kažejo, da je 19-položaj lahko determinant celične toksičnosti [5].

Čeprav najdemo protitumorsko in protivnetno delovanje v različnih kaurenih [7,34–36], je specifična značilnost 11 OH-KA vrsta antimelanogenega delovanja [5]. Ugotovljeno je bilo, da številne naravne spojine, kot so flavonoidi in terpenoidi, modulirajomelanogenezas spreminjanjem izražanja transkripcijskega faktorja mikroftalmije (MITF), ki je bistvenega pomena za melanogene programe [13,14]. V nasprotju s temi spojinami v kaurenskih ali kaurenojskih kislinah niso našli modulatorjev MITF.

11 OH-KAzavira izražanjetirozinazaČeprav 11 OH-KA ne spremeni izražanja ali ravni aktivnosti MITF, 11 OH-KA zavira aktivnost promotorja gena stirozinaze na način, ki je odvisen od elementa, ki veže MITF [5]. Zanimivo je, da čezmerna ekspresija MITF v celicah B16F10 povzroči odpoved 11 OH-KA-posredovane supresije aktivnosti promotorja tirozinaze, kar kaže na to, da lahko 11 OH-KA rekrutira neznani represor na element, ki veže MITF. Še več, mehanizem, s katerim 11 OH-KA zaviratirozinazaaktivnost promotorja je lahko drugačna od tiste, ki vodi do citotoksičnosti, ker je antimelanogena aktivnost opažena tudi, ko celice B16F10 obdelamo z 1,2 µM 11 OH-KA (slika 4).

Raziskave, ki vključujejo tridimenzionalni model človeške kože, sestavljen iz primarnih keratinocitov in melanocitov, kažejo, da lokalna uporaba 1 mM11 OH-KApopolnoma zatre pigmentacijo kože [5]. Kar zadeva antimelanogeno aktivnost, je 1 mM 11 OH-KA enakovreden približno 6,6 mg/mL (0,66 odstotka) posušenih listov A. Lavenia (slika 3). V tem kontekstu je A. Lavenia privlačen vir kozmetičnih izdelkov zabeljenje kože. Poleg tega se A. Lavenia uporablja kot ljudsko zdravilo, 11 OH-KA pa ima širok razpon med učinkovitimi odmerki (koncentracijami) za antimelanogeno delovanje in citotoksičnost.

Pomembno je, da je bilo ugotovljeno, da traneksamična kislina (hemostatično zdravilo) zavira odlaganje melanina v človeški koži in se uporablja kot peroralno zdravilo za zdravljenje melazme [23, 24]. Zanimivo je, da je krzno miši, zdravljenih s traneksamično kislino, spremenilo barvo iz črne v rjavo [37]. V tej študiji smo tudi pokazali, da lahko vodni izvleček listov A. Lavenia učinkovito zavira pigmentacijo las (črno do rjavo) pri miših, če ga dajemo peroralno, kar nakazuje, da bi lahko liste A. Lavenia razvili tako v notranjo kozmetiko kot v funkcionalna živila [20– 22] za bolnike z melazmo. Potrebne so nadaljnje študije glede celičnih tarč izvlečkov A. Lavenia in11 OH-KA, kot tudi njihovo varnost.

cistanche tabletezabeljenje kože