Indukcija periferne trenirane imunosti v trebušni slinavki spodbuja protitumorsko aktivnost za nadzor napredovanja raka trebušne slinavke 2. del

Diskusija

Medtem ko je bilo trgovanje z -glukanom že opisano, o specifičnem tropizmu -glukana na trebušno slinavko še niso poročali37. Pokažemo, da lahko glukan v obliki delcev prehaja neposredno v trebušno slinavko in ga lahko tudi fagocitirajo makrofagi, ki nato prehajajo v trebušno slinavko. Razmerje med peritonealno votlino in trebušno slinavko ni bilo dobro opredeljeno in študije v zvezi s patofiziologijo akutnega pankreatitisa (AP) so pokazale, da peritonealni makrofagi glavni dejavnik vnetnega odziva pri AP, kar podpira povezavo med peritoneumom in trebušna slinavka38.

Naši slikovni podatki dejansko kažejo, da peritonealni makrofagi, ki fagocitozirajo z izotopom označen WGP, primarno potujejo v trebušno slinavko. Študije o poškodbah jeter so dodatno podprle ta model dinamične izmenjave celic med peritonealno votlino in trdnimi organi, ki je neodvisen od krvnega obtoka 39. Skupaj to nakazuje, da tudi v homeostatskih pogojih obstaja bazalna raven izmenjave imunskih celic med trebušno slinavko in peritonealno votlino, ki jo je mogoče izkoristiti v okolju delcev -glukana.

Makrofagi so pomemben del prirojenega imunskega sistema človeškega telesa in imajo močne funkcije prepoznavanja, fagocitiranja in odstranjevanja bakterij in tujih snovi. Parodontitis, kronična nalezljiva bolezen, za katero je značilno vnetje dlesni in izguba alveolarne kosti, je glavni vzrok izgube zob pri odraslih. Zdaj je jasno, da tkivno destrukcijo parodontitisa povzroči gostiteljev imunski odziv na okužbo, makrofagi pa imajo kot pomemben del gostiteljevega imunskega odziva pomembno vlogo pri nastanku in razvoju vnetja.

Zato moramo v vsakdanjem življenju izboljšati imuniteto. V naši raziskavi smo ugotovili, da lahko Cistanche poveča imunost. Če Cistanche dodate v vrelo vodo za pripravo čaja Cistanche in ga pijete 1-2-krat na dan, lahko okrepite imunsko funkcijo telesa, ker vsebuje aktivne sestavine, kot so polisaharidi, flavonoidi, alkaloidi itd., ki lahko izboljšajo imunsko delovanje telesa. Hkrati lahko dodajanje Cistanche v juho ali kašo enkrat ali dvakrat na teden poveča imuniteto.

Kliknite, če želite izvedeti čisti cistanche izdelek

Medtem ko je ta študija preučevala glukan WGP v obliki delcev, bi bilo morda zanimivo tudi raziskati, ali topni glukan, pridobljen iz kvasa, kaže podoben tropizem in signalni mehanizem v trebušni slinavki. Znano je, da -glukani v obliki delcev signalizirajo neposredno prek dektina-1, medtem ko naj bi topni -glukani delovali po poti, odvisni od CR3-, da uveljavijo svoje protitumorske lastnosti40,41. Ena študija je pokazala, da IP dajanje topnega -glukana povzroči promet v periferno kri in APC v peritoneumu, vranici in kostnem mozgu, kar kaže, da je kljub različnim molekularnim signalnim mehanizmom možna podobna sposobnost aktiviranja usposobljene imunosti42. Vendar glede na to, da naši podatki kažejo, da je ta trgovina odvisna od dektina-1, lahko samo glukan v obliki delcev prikaže neposreden promet v trebušno slinavko prek delcev in topnih lahko sproži mehanizme trenirane imunosti.

Poleg tega prejšnje študije, ki označujejo promet intravensko vbrizganega topnega -glukana, kažejo promet v vranico, ledvice in jetra, čeprav ne omenjajo tropizma v trebušni slinavki43. Ker trebušna slinavka doslej ni bila tarča trgovine z glukanom, ni jasno, ali trebušna slinavka preprosto ni bila nikoli raziskana ali pa se trgovina s trebušno slinavko ne dogaja.

Prihodnje študije bi morale obravnavati biološko porazdelitev topnega glukana in glukana v delcih po različnih načinih dajanja.

- Prenos glukana v trebušno slinavko ima večfaktorski vpliv na imunsko populacijo, ki je prisotna v trebušni slinavki. Prvič, prihod glukana v trebušno slinavko neposredno vpliva na populacije imunosupresivnih M2 rezidenčnih makrofagov, prisotnih v trebušni slinavki, za katere je znano, da so pomembni pri spodbujanju tumorjev trebušne slinavke. Podatki CyTOF in scRNA-Seq so pokazali skoraj popolno izginotje rezidenčne populacije makrofagov 7 dni po dajanju WGP. Zanimivo je, da izginotje rezidenčne populacije makrofagov neposredno sovpada z recipročnim pojavom populacije makrofagov Ly6Clo. Ta populacija makrofagov Ly6Clo nosi podobne fenotipske označevalce kot rezidenčna populacija, čeprav se bolj nagiba k fenotipu M1.

Zato je verjetno, da rezidenčni makrofagi pridejo v stik z -glukanom, ki se je prenesel v trebušno slinavko, in te celice postanejo repolarizirane, zato prevzamejo drugačen celični fenotip, kar povzroči nastanek edinstvene skupine. Drugič, prihod -glukana v trebušno slinavko ima za posledico ojačano signalizacijo kemokinov/kemokinskih receptorjev, ki rekrutira provnetne Ly6CHi, ki infiltrirajo makrofage, pridobljene iz monocitov, od periferije do trebušne slinavke. Štiriindvajset ur po dajanju WGP so bile ravni CCL2 v celih lizatih trebušne slinavke povečane 30--krat. V skladu s tem smo pokazali, da je robusten celični dotok v trebušno slinavko, odvisen od glukana, odvisen od CCR2.

Medtem ko se osredotočamo na dinamiko mieloidnega predela zaradi opažene pomembnosti signalizacije CCR2/CCL2, je prišlo do zanimivega začetnega povečanja skupine 11 3. dan in nato izginotja do 7. dne po zdravljenju z WGP. Grozd 11 je bil označen kot ILC2 na podlagi izražanja več markerjev, kot so KLRG1, IL-5, IL-13 in ICOS. Znano je, da so ILC2 dolgotrajne celice, ki živijo v tkivih44. Nedavne študije so pokazale, da aktivacija lokalnih ILC2 s tkivno specifičnimi alarmini inducira njihovo proliferacijo, migracijo bezgavk in širjenje krvi. Pokazalo se je, da ILC2 iz več tkiv, kot sta črevesje in pljuča, vstopajo v kri z ekstruzijo iz teh motenj tkiv in migrirajo v druga tkiva, kot so jetra 44–46.

Takšen mehanizem bi lahko pojasnil prvotno povečanje in nato izginotje ILC2 v trebušni slinavki. Glede na to, da so bili ILC2 nedavno vpleteni v odziv tumorjev trebušne slinavke na imunoterapijo47, je potrebnih več raziskav, ki raziskujejo vpliv WGP in začetek trenirane imunosti na populacijo ILC2 trebušne slinavke.

Čeprav je začetek dotoka provnetnih imunskih celic v trebušno slinavko sam po sebi pomemben, ima CCR2 in Ly6CHi, ki se infiltrira v populacije makrofagov, ki izvirajo iz monocitov, z obrobja značilnosti trenirane imunosti, ki ima najpomembnejše posledice kot indukcija periferno usposobljena imunost v trebušni slinavki še ni bila opredeljena. Ta inducirana usposobljena imunost je povezana tudi s presnovnim in epigenetskim reprogramiranjem.

Čeprav je znano, da je CCR2 pomemben receptor pri rekrutiranju monocitov, je to tudi prvi znak, da je signalizacija CCR2 na monocitih potrebna za vzpostavitev periferno usposobljene imunosti. Ugotovljeno je bilo, da so CCR2 in monociti/makrofagi povezani z metastazami in napredovanjem tumorja 48, 49. Vendar pa naši podatki kažejo, da rekrutiranje reprogramiranega, usposobljenega CCR2 in monocitov/makrofagov izvaja močne protitumorske učinke.

To je neposredno dokazano z našim eksperimentom mešanice, kjer so miši, ki so prejele CCR2 in mieloidne celice od miši, treniranih z WGP, pokazale znatno zmanjšano obremenitev tumorja v primerjavi z mišmi, ki so prejele mieloidne celice CCR2- od iste trenirane miši.

Ker smo pokazali, da je bila v trebušni slinavki vzpostavljena periferna usposobljena imunost, se sprašujemo, ali bi lahko te celice ponovno aktivirale tumorske celice ali njihovi izločeni faktorji. Pokazalo se je, da ponovna izpostavljenost in vivo mieloidnih celic trebušne slinavke, treniranih z WGP, medijem, pogojenim s tumorjem, močno izzove treniran odziv. Kalafati idr. je pred kratkim pokazala vlogo granulocitov v izurjenih protitumorskih mehanizmih, ki jih poganja imunost21, vendar je glede na njihovo uporabo na podkožnih modelih raka trenutno poročana študija prvi primer, ki nakazuje, da je mogoče mieloidne celice v določenem organu usposobiti za neposredno reakcijo na tumorske celice istega organa.

Ugotovljeno je bilo, da so mieloidne celice sposobne neposredno ubijati tumorske celice z mehanizmi fagocitoze in proizvodnje ROS 50–54, in tukaj prikazujemo, da usposabljanje WGP bistveno poveča neposredne protitumorske funkcionalnosti povečane fagocitoze tumorskih celic in citotoksičnosti, posredovane z ROS. tumorske celice.

Nadalje, medtem ko poudarjamo, da lahko mediji, pogojeni s tumorjem, ponovno aktivirajo trenirane mieloidne celice, identificiramo tudi specifičen faktor, MIF, v medijih, pogojenih s tumorjem, ki je vključen v to aktivacijo. Ti podatki kažejo, da bi lahko indukcija usposobljene imunosti sodelovala pri mehanizmih imunskega nadzora tumorja. Na primer, v zgodnjih fazah razvoja tumorja tumorji izločajo topne faktorje, ki lahko ponovno stimulirajo izurjene prirojene celice, kar vodi do izkoreninjenja teh tumorskih celic.

To razumevanje protitumorskega potenciala treniranih prirojenih mieloidnih celic, ki vstopijo v trebušno slinavko, nato prevedemo v ortotopne modele PDAC, kjer opazimo dramatično zmanjšanje tumorske obremenitve in povečanje preživetja miši, ki so dobile le eno aplikacijo zdravila WGP. Nadalje dokazujemo, da so celice, odgovorne za nadzor tumorja, večinoma usposobljene CCR2 in celice, pridobljene iz mieloidov. V nasprotju z drugimi predlaganimi modeli nadzora tumorja, za katere se zdi, da jih v celoti poganja indukcija centralno usposobljene imunosti v BM21, namesto tega v tem modelu zgodnja trgovina z WGP v trebušno slinavko in posledična proizvodnja CCL2 v rekrutih trebušne slinavke CCR2 in mieloične celice s periferije, ki so v glavnem odgovorne za protitumorske učinke. WGP, ki neposredno prevaža v trebušno slinavko, tudi repolarizira M2-podobne tkivne rezidenčne makrofage proti M1-podobnim makrofagom, ki lahko tudi zavirajo napredovanje tumorja.

Medtem ko je bilo zmanjšanje tumorja, opaženo pri miših z implantiranimi tumorji KPC, ki so jim bili pomešani s CCR2 in treniranimi celicami, pomembno, ni bilo tako osupljivo kot pri miših, ki so jim dajali IP WGP. To potrjuje, da so protitumorski učinki IP WGP dvojni; rekrutiranje CCR2 plus usposobljenih protitumorskih mieloidnih celic v trebušno slinavko in repolarizacija pro-tumorogenih rezidenčnih makrofagov delujeta usklajeno, da izzoveta protitumorske prirojene odzive, ki vodijo do zmanjšane tumorske obremenitve v modelih PDAC.

Opažamo tudi visoko izraženost MHCII na teh usposobljenih monocitih/makrofagih, ki verjetno igrajo vlogo pri obdelavi tumorskega antigena in komunikaciji s T-celicami, da izzovejo adaptivne imunske odzive proti tumorju. Zanimivo je, da čeprav smo potrdili, da ti protitumorski mehanizmi niso odvisni od adaptivnih imunskih odzivov, smo opazili znatno povečanje CD8 in T-celic, prisotnih v CCR2 in mešanih tumorjih. Poleg tega, glede na to, da so opazili, da mieloidne celice v tumorjih kažejo visoke ravni PD-L1 in da se zdi, da prisotnost treniranih celic CCR2 plus v trebušni slinavki rekrutira celice CD8 plus T, smo sklepali, da lahko WGP okrepi učinke protiteles -PD-L1 terapija.

V literaturi samo zdravljenje z mAb proti PD-L1 ni imelo koristi za preživetje, medtem ko je kombinacija WGP in anti-PD-L1 sinergizirala, da je povzročila boljše rezultate preživetja kot samo WGP55. To nakazuje, da lahko usposobljene prirojene imunske celice aktivirajo adaptivne imunske celice v TME, vendar je treba imunosupresivno mikrookolje verjetno dodatno premagati s sočasnimi učinki anti-PD-L1. Pomembno je, da so kljub izboljšanemu preživetju vse miši sčasoma podlegle tumorju, zato so prihodnje preiskave optimizacije tega zdravljenja v smislu odmerjanja in števila zdravljenj upravičene.

Imunosupresivne mieloidne celice igrajo ključno vlogo pri ustvarjanju imunosupresivnega TME v PDAC. Tukaj prikazujemo sposobnost vključitve teh mieloidnih celic v nastavitev PDAC z indukcijo usposobljene prirojene imunosti v trebušni slinavki.

Pomembno je tudi, da pokažemo, da sposobnost sprožitve trenirane imunosti v trebušni slinavki potencira terapevtske učinke imunoterapije, kot je terapija blokade imunske kontrolne točke proti PD-L1. Z nadaljnjo klinično uporabnostjo teh ugotovitev tudi prikazujemo, da lahko indukcija usposobljene imunosti v adjuvantnem okolju zmanjša velikost tumorja in podaljša preživetje. Te ugotovitve poudarjajo potencial uporabe -glukana za terapevtsko ciljanje na mieloidne celice znotraj TME in poudarjajo, da bi lahko imela indukcija periferno usposobljene imunosti v trebušni slinavki posledično vlogo pri reprogramiranju supresivnega TME PDAC, kar bi lahko povzročilo podaljšanje življenja bolnikov diagnosticiran s to smrtonosno malignostjo.

Metode

Etična izjava.

Vsi poskusi, ki so vključevali živali, so bili izvedeni v skladu z etičnimi smernicami, ki jih je določil Odbor za institucionalno oskrbo in uporabo živali Univerze Louisville. Poskusi so bili izvedeni v skladu z odobrenima protokoloma 19471 in 19536.

Miši.

V vseh poskusih so uporabili mišje samce in samice, stare šest do osem tednov. Miši divjega tipa (WT) C57BL/6 J so bile kupljene v laboratoriju Jackson (Bar Harbor, ME, ZDA) ali vzrejene v objektu za živali brez specifičnih patogenov (SPF) Univerze v Louisvillu. C57BL/6 Dectin-1 knockout miši (Dectin-1−/−) so bile opisane prej56. Globalno izločene miši CCR2 so bile kupljene pri Jackson Laboratory. Miši Albino C57BL/6 je prijazno zagotovil dr. Jonathan Warawa z Univerze v Louisvillu. Miši NOD/SCID/IL2r Null (NSG) so bile kupljene v laboratoriju Jackson. Največja velikost tumorja, ki jo dovoljuje IUCAC, ni bila večja od 2000 mm3. Miši so dnevno spremljali glede rasti tumorja in jih evtanazirali, ko je obremenitev tumorja presegla omejeno velikost. Miši so vzdrževali 12--urni cikel temno/svetlo pri sobni temperaturi z nadzorovano vlažnostjo (okoli 55 odstotkov).

Vse živali so bile nameščene v pregradnem objektu in za poskuse so bile uporabljene samo zdrave miši. Vse miši so bile pred nami stare vsaj 6 tednov in vsi poskusi z živalmi so bili izvedeni v skladu z vsemi ustreznimi zakoni in institucionalnimi smernicami, ki jih zagotavlja Rodent Rearing Facility (RRF) in odobri Institucionalni odbor za nego in uporabo živali (IACUC). Univerze v Louisvillu.

Priprava -glukana.

Biothera je zagotovila visoko prečiščen delec -glukan v obliki delcev polnega -glukana (WGP), izoliran iz Saccharomyces cerevisiae. Pred uporabo je bil WGP nežno soniciran 15 s, dvakrat z uporabo sonikatorja Qsonica Q55-110 Q55 (Cole-Parmer), da se zagotovi, da so agregati razbiti.

Priprava in uporaba DTAF-WGP.

DTAF (Sigma-Aldrich) pri 2 mg/mL smo zmešali s suspenzijo 20 mg/mL WGP v boratnem pufru (pH 10,8). To smo inkubirali pri sobni temperaturi 8 ur z neprekinjenim mešanjem. Po inkubaciji smo WGP petkrat centrifugirali in sprali s hladnim sterilnim DPBS brez endotoksinov (Sigma-Aldrich) ali dokler supernatant ni več vseboval vidnega DTAF. Koncentracijo smo prilagodili na 10 mg/mL v DPBS brez endotoksina za shranjevanje. Približno 1 mg DTAF-WGP je vbrizgal IP v C57BL/6 in Dectin-1−/− miši in organe so pobrali 3 dni kasneje.

Priprava 89Zr-WGP.

WGP (100 mg) smo zmešali z deferoxamineSCN (2,7 mg, v 0,8 ml DMSO) in čez noč suspendirali v 10 ml natrijevega karbonatnega pufra (0,1 M, pH 9,4). pri sobni temperaturi v temi z rahlim stresanjem. Z deferoksaminom označen WGP smo nato sprali z DI vodo (10 × 40 mL) in 30 mg z deferoksaminom označenega WGP zmešali s 3 mCi oksalata 89Zr v 2 ml pufra Tris•HCl (0,5 M, pH 7,5) in nato inkubiramo pri 37 oC 60 minut s stresanjem. 89Zr-WGP smo nato centrifugirali in sprali s 3 ml sterilnega PBS. Radioaktivnost 89Zr-WGP je bila izmerjena s kalibratorjem odmerka in uporabljena za študije in vitro in in vivo.

Biodistribucija in PET/CT skeniranje z uporabo 89Zr-WGP.

Slikanje s pozitronsko emisijsko tomografijo (PET)/računalniško tomografijo (CT) je bilo izvedeno pri miših C57BL/6 in Dectin-1−/− 48 ur po IP injekciji 1 mg čistega 89Zr-WGP ali injekciji 1 × 106 peritonealno makrofagi, ki so bili so-kultivirani s 25 ug/ml 89Zr-WGP 2 uri in nato nežno oprani, da se odstrani presežek 89Zr-WGP. Miši smo skenirali 15 minut s Siemens R4 MicroPET, čemur je sledilo 10 minut CT skeniranja. Za zajem in rekonstrukcijo signala PET je bila uporabljena programska oprema Siemens IAW, za združevanje in analizo slikovnih podatkov pa programska oprema Siemens IRW.

Na koncu slikovne študije so miši evtanazirali in pobrali zanimive organe. Za biodistribucijo smo zbrali 50 uL periferne krvi s tehniko retro-bulbarne krvavitve. Možgane, srce, pljuča, jetra, vranico, ledvice, trebušno slinavko, debelo črevo, tanko črevo, želodec, stegnenico, kos kože z boka miši in mišico rektus femoris smo pobrali, stehtali in dali v 2470 Wizard avtomatski števec gama (PerkinElmer) za merjenje radioaktivnosti vsakega tkiva. Vrednosti CPM so bile izračunane s programsko opremo Prism (GraphPad Software, La Jolla, CA).

Obdelava trebušne slinavke.

Po evtanaziji so mišjo trebušno slinavko pobrali in s sterilnimi škarjami nežno razrezali na manjše kose. Suspendirali so jih v 15 ml epruveti v popolnem mediju (RPMI) z 1X razgradljivim pufrom, sestavljenim iz 300 U/ml kolagenaze I, 60 U/ml hialuronidaze in 80 U/ml DNaze (Sigma). Te so postavili v rotacijski inkubator pri 37 stopinjah s 5 odstotki CO2 za 15–20 minut. Digestivni pufer smo nato pogasili z ledeno mrzlim popolnim RPMI 1640 in sprali. Celice smo spustili skozi sterilni najlonski 40 µm košarasti filter in majhne neprebavljene koščke tkiva zdrobili s sterilnim zamaškom brizge, da smo ustvarili enocelično suspenzijo. Če so v vzorcu opazili precejšnje število rdečih krvnih celic (RBC), so izvedli lizo rdečih krvnih celic z dodatkom 2 ml sterilnega 10x ACK (Thermo Fisher Scientific).

In vivo administracija WGP.

Miši so dobile en sam intraperitonealni odmerek 1 mg nežno sonificiranega WGP, 3 μm polistirenske kroglice (Sigma-Aldrich) ali 3 μm fluorescentne mikrosfere (Polysciences) (vse 1 mg v 200 ul sterilni PBS) ali 200 ul sterilnega PBS na dan 0. Za tipično trenirane študije imunosti so 7 dni po začetnem IP odmerku miši evtanazirali z uporabo CO2 in trebušno slinavko skupaj z drugimi zanimivimi tkivi odstranili in obdelali. Za študije titracije odmerka so 0,5, 1 in 2 mg WGP dostavili IP v 200 uL sterilnega PBS. Za študije časovne titracije so miši injicirali 1 mg WGP in trebušno slinavko pobrali po 24 urah, 48 urah, 3, 7, 10, 16 in 30 dneh kasneje.

Restimulacija ex vivo.

Za oceno treniranega fenotipa mononuklearnih celic pri miših, zdravljenih z WGP ali PBS ex vivo, so po obdelavi trebušne slinavke suspenzije celic trebušne slinavke nanesli na plošče s 24 vdolbinicami in stimulirali z LPS (10 ng/ml), supernatantom iz gojenega KPC in Pan02 celic (40 odstotkov) in rekombinantnega MIF (rMIF) (10 ng/ml). MIF je bil velikodušno darilo dr. Roberta Mitchella z Univerze v Louisvillu in je bil prokariontski zaveznik izražen, prečiščen in ponovno zvit, kot je opisano prej57. Celice smo gojili v DMEM in inkubirali pri 37 stopinjah s 5 odstotki CO2 5–6 ur v prisotnosti 1X brefeldina A (BioLegend). Celice smo nato pobrali s celičnim strgalom, jih oprali, peletirali in nato obarvali za znotrajcelično izražanje citokinov.

In vitro trening in preskus ponovne stimulacije.

Peritonealne makrofage ali razvrščene celice CD11b plus iz mišje trebušne slinavke smo nasadili na 24-ploščo z vdolbinicami za 2 uri pri 37 stopinjah in 5 odstotkih CO2, da smo omogočili pritrditev celic na plošče, nato pa lebdeče celice previdno nasadili aspiriran. Pritrjene celice smo nežno sprali s sterilnim PBS in nato resuspendirali v 1 ml DMEM, sestavljenega iz 10 odstotkov FBS in 1 odstotka penicilina/streptomicina.

Za začetno usposabljanje celic smo v ustrezno vdolbinico dodali 25 ug/ml delcev WGP, 25 ug/ml polistirenskih mikrodelcev 3 μm (Sigma-Aldrich) ali 100 ul PBS in inkubirali 24 ur. Po 24 urah smo vdolbinice nežno sprali, da smo odstranili začetni dražljaj in dodali svež DMEM ter celice inkubirali s 5 odstotki CO2 pri 37 stopinjah 7 dni. Po 7 dneh smo medij aspirirali in ga nadomestili s svežim medijem ter celice ponovno stimulirali z LPS (100 ng/mL), supernatantom celic KPC ali Pan02 (40 odstotkov) ali PBS kot kontrolo. Štiriindvajset ur po stimulaciji smo supernatante pobrali in uporabili v testu ELISA za TNF- in IL-6.

Mediji, pogojeni s tumorjem.

Približno 1 × 106 celic KPC ali Pan02 smo gojili v plošči s šestimi jamicami v 4 ml popolnega DMEM pri 37 stopinjah in 5 odstotkih CO2. Po 3 dneh smo supernatante pobrali in shranili pri -80 stopinjah v alikvotih za uporabo kot medij, kondicioniran s tumorjem. Kot kontrolo smo trebušno slinavko miši C57BL/6 predelali v enocelično suspenzijo in 1 × 106 teh celic gojili v plošči s šestimi vdolbinicami v 4 ml popolnega DMEM in pri 37 stopinjah in 5 odstotkih CO2 ter supernatante smo zbrali tudi po 3 dneh. Kot kontrolo smo trebušno slinavko naivnih miši obdelali v enocelično suspenzijo in nasadili na ploščo s šestimi jamicami za 1 dan. Nesprijete celice smo sprali in te celice nato gojili 3 dni in supernatant pobrali.

Pridobivanje peritonealnih makrofagov.

Miši smo evtanazirali in 5 ml sterilnega RPMI vbrizgali v peritonej z uporabo 25-merne brizge. Trebuh smo masirali, da bi sprostili peritonealne makrofage. Narejen je bil majhen zarez in za odstranitev suspenzije je bila uporabljena pipeta za prenos. Peritonealno votlino smo nato večkrat sprali s hladnim RPMI in celice peletirali pri 458 × g.

Pretočna citometrija.

Enocelične suspenzije v PBS z 1 odstotkom FBS so bile blokirane z mišjim Fc blokom (anti-CD16/CD32) pri 4 stopinjah 15 minut. Protitelesa, označena s fluorokromom, za sposobnost preživetja (APC/Cy7) in proti površinskim označevalcem CD45, CD11b, F4/80, Ly6G, Ly6C, MHCII, CD3, CD4, CD8, NK1.1, Ki67 (Biolegend) in CCR2 (R&D Systems) so bila rabljeno. Informacije v zvezi z vsemi abs pretoka so povzete v dodatni tabeli 3. Po 30 minutah inkubacije v temi pri 4 stopinjah celice speremo s hladnim PBS in filtriramo skozi mrežasti filter 40 µm. Vzorci so bili pridobljeni s citometrom FACSCanto II (BD Biosciences) in analizirani s programsko opremo FlowJo (Tree Star, Ashland, OR). Za pridobitev vseh podatkov je bila v FACSCanto uporabljena različica programske opreme FACSDiva 6.

intracelularno barvanje za izražanje citokinov.

Po stimulaciji smo celice obarvali na želene površinske markerje, kot je opisano zgoraj. Celice nato speremo s hladnim PBS in v epruvete dodamo 500 ul fiksacijskega pufra (Biolegend), na kratko vrtinčimo in inkubiramo v temi pri sobni temperaturi 20 minut. Nato smo dodali približno 1 ml permeabilizacijskega pufra (Biolegend) in vzorce centrifugirali pri 458 × g 5 minut pri 4 stopinjah, čemur je sledilo še eno pranje z 1 ml permeabilizacijskega pufra. Celice smo resuspendirali v 200 ul permeabilizacijskega pufra in celice obarvali s protitelesi proti TNF-, Ki67, Granzyme-B, IL12, IL-6 in IFN ali ustrezni izotipski kontroli čez noč pri 4 stopinjah. Celice smo nato sprali, filtrirali in podatke pridobili s pretočnim citometrom.

FACS izolacija CD11b plus makrofagov za in vitro trening.

Trebušno slinavko smo predelali v enocelično suspenzijo, kot je opisano zgoraj. Celice smo sprali z 1 ml PBS in inkubirali s Fc blokom 10 minut pri 4 stopinjah, čemur je sledilo obarvanje z barvilom za preživetje (APC-Cy7), CD45 (PerCPcy5) in CD11b plus (APC) 30 minut pri 4 stopinjah. Celice smo sprali s PBS in resuspendirali v hladnem tekočem pufru MACS (Miltenyi Biotech). Celice ViabilityCD45 plus CD11b plus so bile razvrščene z uporabo FACS Aria III (BD Biosciences). Celice smo zbrali v 50 odstotkih FBS, 40 odstotkih PBS in 10 odstotkih HEPES (Corning). Po sortiranju smo celice sprali s PBS in nato nasadili na plošče za in vitro trening, kot je opisano zgoraj.

ELISA.

Supernatante iz in vitro naučenih celic skupaj s standardi smo analizirali z uporabo kompletov za mišji TNF- in IL-6 ELISA (BioLegend). Test je bil izveden po navodilih proizvajalca in vsi pogoji so bili izvedeni v treh izvodih. Uporabljen je bil tudi komplet ELISA za rMIF (sistema R in D) v skladu z navodili proizvajalca za kvantifikacijo rMIF v medijih, kondicioniranih s tumorjem Pan02 in KPC, ter supernatantu iz gojenih neobdelanih celic trebušne slinavke. Za kvantificiranje modifikacij histonov so bili pri EpiGenteku kupljeni kompleti ELISA (komplet za kvantificiranje tri-metil histona H3K4, komplet za kvantificiranje acetil-histona H3K27, komplet za kvantificiranje tri-metil histona H3K27 in komplet za kvantifikacijo celotnega histona H3) in testi so bili izvedeni na podlagi proizvajalčevih navodil. navodila. Laktat je bil izmerjen s kompletom za testiranje L-laktata I (Eton Bioscience).

Western blot analiza.

Celice CD11b plus iz miši, ki so bile vbrizgane s PBS ali WGP (24 h), so bile ločene z uporabo mikrokroglic CD11b (Miltenyi Biotech). Histon je bil ekstrahiran v skladu z navodili proizvajalca (Active Motif, Inc.) in koncentracija proteina je bila določena z uporabo Bradfordove kvantifikacije. Histonske proteine ​​smo ločili s SDS-PAGE 15-odstotnimi Tris-HCl geli in jih prenesli na PVDF membrane (Millipore). Membrana je bila blokirana s 5 odstotki BSA pri sobni temperaturi 1 uro in inkubirana čez noč pri 4 stopinjah s primarnimi protitelesi, vključno s tri-metil-histonskim H3 (lys4) zajčjim mAb, acetil-histonskim H3 (lys27) XP zajčjim mAb, tri-metil -histonsko H3 (Lys27) kunčje mAb in histonsko H3 XP kunčje mAb (tehnologija celične signalizacije), nato inkubirano s HRP-konjugiranimi sekundarnimi protitelesi (GE Healthcare) pri sobni temperaturi 1 uro. Membrana je bila razvita z reagentom Amersham ECL Prime Western Blotting Detection (GE Healthcare) in zaznana s procesorjem medicinskega filma (Konica Minolta Medical & Graphic). Precision Plus Protein Kaleidoscope Prestained Protein Standards so bili uporabljeni kot standardni proteinski marker (Bio-Rad).

qRT-PCR.

Potem ko so bile celice CD11b plus izolirane iz mišje trebušne slinavke pri miših, zdravljenih z WGP, in nezdravljenih miših, so bile celice shranjene v TRIzolu. RNA so bile izolirane in reverzno prepisane z uporabo TaqMan Reverse Transcription Reagents (qRTPCR) pomnoževanja z uporabo Bio-Rad MyiQ enobarvnega detekcijskega sistema RT-PCR. Na kratko, cDNA je bila pomnožena v 25 uL reakcijski zmesi, ki je sestavljena iz SYBR Green PCR super-mix (Bio-Rad), 100 ng komplementarne DNA šablone in izbranih primerjev (200 nM) z uporabo priporočenih pogojev cikla.

H plus E.

Sedem dni po injiciranju s PBS/kroglicami mikrodelcev ali WGP smo trebušno slinavko pobrali in fiksirali v 4-odstotnem formalinu za 1 teden, čemur je sledila vdelava v parafin v skladu s standardnimi postopki. Tkiva, vdelana v parafin, so bila razrezana na 5 mm debele dele in obarvana s hematoksilinom in eozinom (H & E) za morfološko analizo.

Merjenje amilaze v serumu.

Amilazo mišjega seruma smo izmerili z uporabo Amylase Activity Assay Kit (Millipore Sigma) in jo uporabili v skladu z navodili proizvajalca. Skratka, miši so injicirali WGP in 7 dni kasneje so miši zbrali kri s tehniko retro-bulbarne krvavitve. Ti vzorci so bili uporabljeni za analizo serumske amilaze.

In vivo izčrpavanje T-celic.

T-celice so bile izčrpane z uporabo samo anti-CD4 mAb, samega anti-CD8 mAb ali skupaj anti-CD4 in anti-CD8 mAb. Protitelesa so izdelali doma. V tem postopku izčrpavanja so miši 1. dan injicirali IP z WGP in so jim prav tako injicirali IP 200 µg mAbs na 1. dan in 4. dan med obdobjem zdravljenja. Miši so bile evtanazirane 7. dan (CD4 klon GK1.5, CD8 klon 53-6.72). Učinkovitost izčrpavanja je bila potrjena 7. dan.

Deplecija NK celic in vivo.

Celice NK so bile osiromašene z intraperitonealno injekcijo 100 µg PK136 mAb (Proizvedeno v laboratoriju dr. Jun Yana na Univerzi v Louisvillu) na dan -1 in 5 med obdobjem zdravljenja. WGP je bil injiciran na dan 0 in dan 7 so bile živali evtanazirane in učinkovitost izčrpavanja NK celic je bila ocenjena z obarvanjem tkiv trebušne slinavke za NK1.1.

izčrpanost Ly6G.

Nevtrofilce smo zmanjšali z injiciranjem 300 µg anti-Ly6G mAb (Bio X Cell) ali izotipskega kontrolnega podganjega IgG2a (Bio X Cell) na dan -1, 2 in 6 med zdravljenjem. Približno 1 mg WGP je bil injiciran IP na dan 1. Miši so bile evtanazirane na dan 7 in trebušna slinavka je bila ocenjena glede učinkovitosti izčrpavanja. V tumorju so modelne miši injicirali 300 µg anti-Ly6G mAb ali izotipskega kontrolnega podganjega IgG2a na 2., 4., 10. in 16. dan. Miši so prejele WGP na dan 0 in jim na dan vsadili ortotopne KPC tumorje trebušne slinavke. 7. Miši so bile evtanazirane 21. dan in tkiva trebušne slinavke so bila obarvana z Ly6G, da bi ocenili učinkovitost deplecije granulocitov v tem času.

Priprava vzorca za masno citometrijo CyTOF.

Protitelesa za masno citometrijo so bila kupljena pri Fluidigmu ali pa so bila ustvarjena v podjetju s konjugacijo komercialno dostopnih prečiščenih protiteles z ustreznim kovinskim izotopom z uporabo polimernih kompletov MaxPar X8 ali MCP9 Polymer (Fluidigm). Vzorce trebušne slinavke treh PBS in treh 7-dnevnih WGP miši smo predelali v enocelično raztopino in izvedli stimulacijo ex vivo, kot je opisano zgoraj. Celice smo nežno postrgali s plošč z uporabo sterilnega celičnega strgala, sprali s PBS in dali v sterilno epruveto za kulturo. Uporabili smo približno 2 × 106 celic na vzorec. Celice smo najprej obarvali na sposobnost preživetja s 5 uM cisplatinom (Fluidigm) v RPMI 1640 brez seruma 5 minut pri sobni temperaturi. Celice smo nato sprali z RPMI 1640, ki je vseboval 10 odstotkov FBS 5 minut pri 300 × g. Celice smo obarvali s površinskimi protitelesi 30 minut pri RT in jih dvakrat sprali s pufrom za obarvanje celic Maxpar (Fluidigm).

Za obarvanje na intracelularne citokine smo celice nato fiksirali z 1 ml pufra 1X Maxpar Fix I 30 minut pri sobni temperaturi in nato dvakrat sprali z 2 ml pufra 1X Maxpar Perm-S 5 minut pri 800 × g. Nato smo dodali koktajl citoplazemskih/izločenih protiteles in jih inkubirali s celicami 30 minut pri sobni temperaturi. Po inkubaciji so bile celice sprane z 1 ml 1X pufra Maxpar Perm-S 5 minut pri 800 × g in nežno popivnane, da se odstrani vsa tekočina iz epruvete.

Za barvanje na jedrske antigene smo celice nato suspendirali v 1 ml pufra za obarvanje jedrnega antigena 1X Maxpar 30 minut pri sobni temperaturi. Nato smo dodali koktajl protiteles jedrnega antigena in ga inkubirali 30 minut pri sobni temperaturi. Celice smo spirali dvakrat po 5 minut pri 800 × g z 2 ml pufra za prepustnost obarvanja z jedrskim antigenom. Končno smo celice fiksirali z 1,6-odstotnim formaldehidom 10 minut pri sobni temperaturi, nato pa jih čez noč inkubirali v 125 nM IntercalatorIridium (Fluidigm) pri 4 stopinjah.

Zajem podatkov CyTOF.

Ko so bile celice pripravljene za pridobivanje, so vzorce dvakrat sprali s pufrom za obarvanje celic (Fluidigm) in jih hranili na ledu, medtem ko so čakali na pridobivanje. Neposredno pred pridobitvijo so bile celice suspendirane v 1:9 raztopini Cell Acquisition Solution: EQ 4 element kalibracijske kroglice (Fluidigm). Uporabljen je bil sistem Helios CyTOF in po ustreznih postopkih zagona in nastavitve so bili vzorci izvedeni s hitrostjo manj kot ali enako 500 dogodki/sekundo do 300000 dogodkov. Z uporabo programske opreme CyTOF so bile datoteke FCS normalizirane. Datoteke FCS in te datoteke so bile nato pripravljene za analizo podatkov.

Analiza podatkov CyTOF.

Podatki CyTOF so bili analizirani s FlowJo, programskim paketom CytoBank58 in potekom dela CyTOF59, ki vključuje nabor paketov, ki so na voljo v R (r-project. org)60–63. Za analizo, izvedeno v okviru delovnega toka CyTOF, so bile uporabljene datoteke delovnega prostora FlowJo, izvožene iz Flow Workspace in CytoML61.

Sekvenciranje RNA: ekstrakcija in izolacija RNA.

Sedem dni po dajanju PBS ali WGP IP smo trebušno slinavko pobrali, predelali v suspenzijo ene same celice, obarvali za sposobnost preživetja, CD45 in CD11b ter sortirali z uporabo FACS Aria III. Vzorci so bili pripravljeni v treh izvodih za vsako poskusno skupino. Ko smo te mieloidne celice izolirali, smo celice 2x sprali z ledeno mrzlim PBS in nato lizirali s Trizolom (Invitrogen). RNA smo ekstrahirali z uporabo kompleta QIAGEN RNAeasy Kit (QIAGEN).

Celovitost izolirane RNA smo preverili s sistemom Agilent Bioanalyzer 2100 (Agilent Technologies, Santa Clara, CA) in kvantificirali s fluorometričnim testom Qubit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA). Poly-A obogatene knjižnice mRNA-Seq so bile pripravljene po standardnem protokolu kompleta Universal Plus mRNASeq (Tecan Genomics, Redwood City, CA) z uporabo 10 ng celotne RNA.

Vsi vzorci so bili povezani z adapterji Illumina in posamično označeni s črtno kodo. Odsotnost adapterskih dimerjev in konsistentne velikosti knjižnice ~300 bp je bila potrjena z uporabo Agilent Bioanalyzer 2100. Koncentracija knjižnice in obnašanje zaporedja sta bila ocenjena glede standardiziranega vnosa PhIX z uporabo pretočne celice za sekvenciranje Nano MiSeq podjetja Illumina. 1,8 pm združenih knjižnic z 1-odstotnim pojavom PhiX je bilo naloženih v eno pretočno celico za sekvenciranje NextSeq 500/550 75 ciklov High Output Kit v2 in sekvenciranih na sekvencerju Illumina NextSeq 500, ki cilja na 60 M 1x75 bp branj na vzorec.

Sekvenciranje RNA.

Knjižnice so bile pripravljene z uporabo kompleta Universal Plus mRNA-seq s kvantifikacijo knjižnice NuQuant® (NuGen). Šest vzorcev je bilo v enem zagonu porazdeljenih po štirih linijah zaporedja. 24 enosmernih neobdelanih datotek zaporedja (.fastq)64 je bilo prenesenih iz Illumininega BaseSpace65 na strežnik KBRIN za analizo. Nadzor kakovosti (QC) neobdelanih zaporednih podatkov je bil izveden z uporabo FastQC (različica 0.10.1)66. Zaporedja so bila poravnana z referenčnim genomom miši mm10 z uporabo STAR (različica 2.6)67, pri čemer so bile datoteke za poravnavo ustvarjene v formatu bam. Diferencialno izražanje transkriptov, ki kodirajo beljakovine ENSEMBL, je bilo izvedeno z uporabo DESeq268,69. Neobdelana števila so bila pridobljena iz datotek formata bam, poravnanih s STAR, z uporabo HTSeq (različica 0.10.0)70. Neobdelana štetja so bila normalizirana z uporabo metode relativnega log izražanja (RLE) in nato filtrirana, da so izključili gene z manj kot desetimi štetji v vzorcih71. Podatki RNA-seq so bili deponirani z GEO pristopom GSE187464.

Sekvenciranje RNA: analiza obogatitve genskega niza.

Analiza obogatitve genskega niza (GSEA) je bila uporabljena za nadaljnjo karakterizacijo biologije genov, ki sestavljajo pogoje WGP v primerjavi s PBS, in njihove razlike72. Nabori genov so bili pridobljeni iz baze podatkov molekularnih podpisov (MSigDB) za biološke procese genske ontologije (GO) in poti Reactome. Za vsak nabor genov so bile vse testirane lokacije genov v primerjavi kontrolnih miši, zdravljenih z WGP in PBS, razvrščene od najvišje do najnižje pomembnosti z uporabo vrednosti p. Ta pristop omogoča vključitev zelo pomembnih navzgor in navzdol reguliranih genov v vsak nabor genov, pristop, ki natančneje odraža pogoje v biološki poti. Za to analizo tabeli obogatenih nizov sledi graf obogatitve, ki prikazuje profil obogatitvenega rezultata (ES) in položaj članov genskega niza na razvrščenem seznamu.

Enocelično sekvenciranje: izolacija posameznih celic in sekvenciranje RNA.

Žive celice CD45 plus so bile razvrščene iz mišje trebušne slinavke, sprane in resuspendirane v 1x PBS (brez kalcija in magnezija), ki je vseboval 0.04 odstotka BSA. Posamezne celice so bile zajete in knjižnice cDNA s črtno kodo so bile izdelane z uporabo Chromium Next GEM Single-Cell 3′ Reagent Kit (v3.1, 10X Genomics) in krmilnika Chromium v ​​skladu z navodili proizvajalca. Knjižnice so bile združene in sekvencirane z uporabo konfiguracije 28 bp × 8 bp × 125 bp za read1 × i7 index x read2 na Illumina NextSeq 500 s ciklom NextSeq 500/550 150 High Output Kit v2.5 (20024907).

Od celičnega sekvenciranja: profiliranje izražanja genov.

Datoteke Bcl so bile demultipleksirane v datoteke fastq s programsko opremo CellRanger (10X Genomics, v3.1.{{10}}). Skupno število zaporednih branj je bilo 506.913.062. Odčitki so bili dobre kakovosti, kot je ugotovil FastQC66. Število genov je bilo izmerjeno z uporabo "štetja" CellRangerja z uporabo referenčnega genoma cell ranger-mm10-3.0.0 za miši. Za vsak vzorec je bila ustvarjena matrika štetja in en združeni vzorec s pričakovanim številom celic, nastavljenim na 5000.

Podatki neobdelanega števila, ki jih je določil CellRanger, so bili uporabljeni kot vhodni podatki za cevovod analize po meri v R, ki uporablja različna orodja za analizo ene celice, ki temeljijo na Seuratu. Graf kolena (dopolnilna slika 7b) prikazuje graf, ki prikazuje razvrščeno število UMI za vsako črtno kodo celice za podatke, združene v treh skupinah. Celice nad prevojno točko predstavljajo možne dvojnike, medtem ko tiste pod kolenom predstavljajo celice ozadja. Ukrepi nadzora kakovosti celic so bili analizirani z uporabo Seurata v373 in črtne kode celic z naslednjimi značilnostmi so bile odstranjene iz analize: nizko število (možne celice v ozadju) z mejo FDR 0.01 iz funkcije DropletUtils74 "emptyDrops", visoko število (možne dvojne celice) z večjim številom kot prevojna točka ploskve kolena, vsebnost mitohondrijev večja od 30 odstotkov in vsebnost ribosomov večja od 40 odstotkov. Gene (lastnosti) smo dodatno filtrirali, da smo odstranili identifikatorje upokojenih genov in gene, ki niso bili izraženi v vsaj dveh celicah. Glej dodatno sliko 7a, b za začetno in filtrirano število celičnih črtnih kod in genov.

Podatki o ekspresiji so bili normalizirani z uporabo SCTransform75, kjer so bili geni celičnega cikla, vsebnost ribosomov in vsebnost mitohondrijev nazadovali. Celice so bile nato združene v skupine in zmanjšanje dimenzij je bilo izvedeno z uporabo UMAP76. Začetna imena grozdov so bila dodeljena z uporabo modificirane tehnike obogatitvenega rezultata GSVA77,78. Za vsako od teh skupin so bili identificirani glavni markerski geni. Diferencialno izraženi geni, ki primerjajo vsako skupino z vsako drugo skupino (vse primerjave po parih), so bili določeni z uporabo Seurat73 in MAST79. Podatki scRNA-seq so bili deponirani z GEO pristopom GSE187464.

Identifikacija grozdov, ustvarjenih s scRNA-Seq.

Grozdi, ki niso izhajali iz mieloida, so bili na splošno razvrščeni kot B-celice (MS4A1), plazemske celice (SDC1), CD8 in T-celice (CD3e, C8a), CD4 in T-celice (CD3e, CD4), T-regulacijske celice (T -regs) (CD3e, CD4, FoxP3), δ T-celice (CD3e, TRGC1, TRGC2,IL7Ra) in prirojene imunske celice tipa 2 (ILC2s) (Alox5, KLRG1, Ly6a, Pparg,GATA3, IL-5 , IL-13, ICOS in Rxrg)80–82. Nevtrofilci so bili identificirani z izražanjem MMP9, Csf3r, S100A8, S100A8 in ADAM8, čeprav so lahko v teh analizah premalo zastopani zaradi nizke vsebnosti RNA in visokih ravni intrinzičnih RNaz83. Konvencionalne dendritične celice (cDC) so bile identificirane z ekspresijo ITGAX in ITGAE, plazmacitoidne DC (pDC) pa sta identificirala ITGAX in Siglech.

Klasifikacija mieloidnih grozdov iz scRNA-Seq.

Grozd 5 je izražal ITGAMINtADGRE1HiLyz2HiH2-Ab1HiLy6C2- in ni izražal TNFAIP2, kar kaže, da so te celice rezidenčni makrofagi. Grozd10 izraža ITGAM- HiADGRE1HiLyz2Hi H2-Ab1Int Ly6C2-. Skupki 3 in 4 izražata ITGAMINt ADGRE1Int Lyz2Hi H2-Ab1Int Ly6C2Hi, kar nakazuje, da sta obe podskupini infiltriranih monocitov/makrofagov, čeprav so bili okrepljeni geni za vnetje, izraženi v skupini 3, uporabljeni za identifikacijo skupine 3 kot vnetno infiltrirajočih monocitov/makrofagov .

Testi fagocitoze.

Trebušno slinavko miši, vbrizganih s PBS/mikrodelci, in in vivo miši, treniranih z WGP, smo pobrali 7 dni po injiciranju in obdelali, kot je opisano prej, v enocelično suspenzijo. Približno 2 × 106 smo sprali s HEPES, razredčenim 50x v RPMI 1640 in nato inkubirali v 100 μL te raztopine 1 uro pri 37 stopinjah, da aktiviramo celice. Invitrogen promovira Green S.

Komplet za fagocitozo Aureus BioParticlesTM za pretočno citometrijo (Thermo Fisher Scientific) je bil uporabljen v skladu z navodili proizvajalca. Približno 100 μL rekonstituiranih delcev ali 1 × 106 GFP plus KPC tumorskih celic smo dodali aktiviranim celicam trebušne slinavke in inkubirali 1 uro pri 37 stopinjah. Vzorci so bili nežno vrtinčeni vsakih 15 minut. Reakcijo smo ustavili z dodatkom 1 mL hladnega PBS. Vzorci so bili inkubirani s Fc Blockom 10 minut pri 4 stopinjah, obarvani na sposobnost preživetja, CD45, CD11b in F4/80 30 minut pri 4 stopinjah, nato pa analizirani z uporabo BD FACSCanto. Za analizo je bilo po prehodu na žive celice in CD45 ugotovljeno, da so celice, ki so fluorescirale v kanalu FITC, fagocitne.

Test citotoksičnosti.

Trebušno slinavko miši, zdravljenih z WGP in PBS, smo pobrali in populacije CD11b plus izolirali z uporabo magnetnih CD11b plus MicroBeads (Miltenyi Biotec) in autoMACS Pro Separator (Miltenyi Biotec). Očiščene celice CD11b plus smo nato sprali in prešteli ter jih nasadili v razmerje 1:20 tumor: efektorske celice v 96-ploščo z jamicami. Vsi poskusni vzorci so bili testirani v treh izvodih. Po nasaditvi celic CD11b plus smo enemu dodali inhibitorje ROS N-acetil-Lcistein (NAC) (1 mM, Sigma-Aldrich), Trolox (5 µM, Sigma-Aldrich) ali DFO (50 µM, Evropska farmakopeja). niz celic, pridobljenih iz PBS in WGP, 1 uro pred dodatkom 5000 KPC, ki izražajo luciferazo, in tumorskih celic trebušne slinavke v vse vdolbinice. Po 24 urah sokulture smo plošče centrifugirali in 20 µL supernatanta zmešali s 100 µL reagenta za analizo luciferaze (Promega). Aktivnost luciferaze, izmerjena v supernatantu, je bila v korelaciji s tumorskimi celicami, ki so jih uničile efektorske celice in so bile izmerjene z uporabo luminometra (Femtomaster FB 12, Zylux Corporation). Spontani signal luciferaze iz tumorskih celic na ploščici smo odšteli od meritve supernatanta. Vrednosti luciferaze so predstavljene kot relativne svetlobne enote (RLU).

In vivo tumorski modeli raka trebušne slinavke.

Celična linija KPC na ozadju C57BL/6, pridobljena iz LSL-KrasG12D/plus ; LSL-Trp53R172H/ plus ; Model miške Pdx1-Cre (KPC) je bil kupljen pri Ximbio. Te celice in celice Pan02, ki so bile velikodušno darilo dr. Yong Luja z univerze Wake Forest, so bile uporabljene v ortotopnem modelu raka trebušne slinavke. Linija KPC, transficirana z GFP in luciferazo (KPCGFP plus Luc plus), je bila tudi velikodušen prispevek dr. Michaela Dwinella z Medicinskega kolidža v Wisconsinu. Te celice so bile uporabljene izključno pri albino miših C57BL/6.

Za implantacijo tumorja so miši anestezirali z izofluranom, trebuh miši pa smo pripravili z betadinom in sterilno pokrili. 2 cm sredinska laparotomija je bila izvedena z uporabo aseptične tehnike s sterilnimi instrumenti. Po laparotomiji sta bili trebušna slinavka in vranica eksternalizirani. Tumorske celice smo suspendirali v ledeno mrzlem PBS in zmešali v razmerju 1:1 z matriksom bazalne membrane Matrigel (Corning). 0.1 × 106 tumorskih celic v 50 uL raztopine PBS-matrigela je bilo injiciranih v rep trebušne slinavke z uporabo 30-inzulinske brizge. Nastanek majhnega mehurčka je kazal na uspešno implantacijo. Peritonej je bil zaprt s prevlečenim vpojnim šivom 5/0, pletenim s poliglikolno kislino, koža pa je bila zaprta s svilenim pletenim nevpojnim šivom 5/0. (CP Medical). Buprenorfin so dajali za obvladovanje bolečine do 72 ur po operaciji in spremljali miši.

In vivo slikanje.

Miši, ki so bile ortotopsko implantirane z GFP plus luciferazo in tumorskimi celicami KPC, so injicirali IP s 150 mg/kg telesne teže pri 100 µL XenoLight D-Luciferin-K plus Salt Bioluminescent Substrate (PerkinElmer). Po 10 minutah smo miši anestezirali z izofluranom in jih dali v Biospace Lab Photon Imager, ki je namenska in vivo optična modalnost pri šibki svetlobi za bioluminiscenčno in fluorescentno slikanje. Posneli so slike miši in jih uporabili za merjenje velikosti in rasti tumorja.

Model tumorja z mešanico.

Miši so bile trenirane z 1 mg WGP in 7 dni kasneje so bile populacije CD11b plus CCR2 plus in CD11b plus CCR2− razvrščene in zmešane 1:1 s tumorskimi celicami KPC 1 × 105 tumorskih celic. Celice so bile ortotopično implantirane v miši WT in 3 tedne kasneje so miši evtanazirali in ocenili velikost tumorja.

Kombinirano zdravljenje z anti-PD-L1 mAb.

Miši C57BL/6 smo na dan -7 zdravili z WGP in jim implantirali ortotopne tumorje trebušne slinavke KPC na dan 0. Miši smo 3., 7. in 11. dan zdravili z 200 µg protimišjega anti-PD-L1 mAb (Bio X Cell) ali kontrolo izotipa IgG2b podgane (Bio X Cell). Miši smo nato spremljali glede preživetja.

WGP kot zdravljenje.

Miši C57BL/6 so implantirali ortotopne tumorje trebušne slinavke KPC na dan 0, 4. in 11. dan pa so miši prejele 1 mg IP WGP ali PBS. Miši so nato spremljali glede preživetja.

Statistična analiza.

Vsi rezultati so bili za preverjanje ponovljeni vsaj trikrat, razen če je določeno drugače. Prikazani so reprezentativni rezultati. Rezultati so predstavljeni kot povprečje ± SEM. Podatke smo analizirali z dvostranskim Studentovim t-testom ali Mann–Whitneyjevim U-testom. Primerjave več skupin so bile izvedene z uporabo enosmerne ali dvosmerne ANOVA, ki ji je sledil Tukeyjev test večkratne primerjave. Korelacijske analize so bile izvedene z uporabo Pearsonovega korelacijskega koeficienta (normalna porazdelitev). Statistična značilnost je bila nastavljena na p < 0,05. Vse statistične analize so bile izvedene z uporabo programske opreme GraphPad Prism različice 9 (GraphPad Inc., La Jolla, CA).

Povzetek poročanja.

Dodatne informacije o zasnovi raziskave so na voljo v Povzetku poročil o raziskavah narave, ki je povezan s tem člankom.

Razpoložljivost podatkov

Izvorni podatki so navedeni v tem prispevku. Podatki RNASeq so na voljo pod GEO pristopom GSE187464, podatki scRNA-Seq pa so na voljo pod GEO pristopom GSE187464. Izvorni podatki so navedeni v tem dokumentu.

Prejeto: 2. april 2021; Sprejeto: 17. januar 2022.

Reference

1. ACS. Dejstva in številke o raku 2020.

2. Rahib, L. et al. Projekcija incidence raka in smrti do leta 2030: nepričakovano breme raka ščitnice, jeter in trebušne slinavke v Združenih državah. Cancer Res. 74, 2913–2921 (2014).

3. Kommalapati, A., Tella, SH, Goyal, G., Ma, WW & Mahipal, A. Sodobno zdravljenje lokaliziranega resektabilnega raka trebušne slinavke. Raki 10, 24 (2018).

4. Bliss, LA, Witkowski, ER, Yang, CJ & Tseng, JF Rezultati pri operativnem zdravljenju raka trebušne slinavke. J. Surg. Oncol. 110, 592–598 (2014).

5. Schizas, D. et al. Imunoterapija raka trebušne slinavke: posodobitev 2020. Zdravljenje raka. Rev. 86, 102016 (2020).

6. Henriksen, A., Dyhl-Polk, A., Chen, I. & Nielsen, D. Zaviralci kontrolnih točk pri raku trebušne slinavke. Zdravljenje raka. Rev. 78, 17–30 (2019).

7. Madden, K. & Kasler, MK Zaviralci imunskih kontrolnih točk pri pljučnem raku in melanomu. Semin. Oncol. Nurs. 35, 150932 (2019).

8. Kao, HF & Lou, PJ Zaviralci imunskih kontrolnih točk za ploščatocelični karcinom glave in vratu: Trenutna pokrajina in prihodnje usmeritve. Glava. Vrat 41, 4–18 (2019). 9. Leinwand, J. & Miller, G. Regulacija in modulacija protitumorske imunosti pri raku trebušne slinavke. Nat. Immunol. 21, 1152–1159 (2020).

10. Royal, RE et al. Preskušanje 2. faze ipilimumaba z enim zdravilom (proti-CTLA-4) za lokalno napredovali ali metastatski adenokarcinom trebušne slinavke. J. Immunother. 33, 828–833 (2010).

11. O'Reilly, EM et al. Durvalumab s tremelimumabom ali brez njega za bolnike z metastatskim duktalnim adenokarcinomom trebušne slinavke: randomizirano klinično preskušanje 2. faze. JAMA Oncol. 5, 1431–1438 (2019).

12. Weiss, GJ et al. Študija faze Ib/II gemcitabina, nab-paklitaksela in pembrolizumaba pri metastatskem adenokarcinomu trebušne slinavke. Investirajte. Nova zdravila 36, ​​96–102 (2018). 13. Whatcott, CJ, Posner, RG, Von Hoff, DD & Han, H. v Rak trebušne slinavke in tumorsko mikrookolje (ur. Grippo, PJ & Munshi, HG) Ch. 8 (Transworld Research Network, 2012).

14. Karamitopoulou, E. Tumorsko mikrookolje raka trebušne slinavke: imunsko pokrajino narekujejo molekularne in histopatološke značilnosti. Br. J. Rak 121, 5–14 (2019).

15. Daniel, SK, Sullivan, KM, Labadie, KP & Pillarisetty, VG Hipoksija kot ovira za imunoterapijo pri adenokarcinomu trebušne slinavke. Clin. prevod med. 8, 10–10 (2019).

16. Wang, W. et al. RIP1 kinaza poganja makrofagno posredovano adaptivno imunsko toleranco pri raku trebušne slinavke. Cancer Cell 38, 585–590 (2020).

17. Netea, MG et al. Izurjena imunost: program prirojenega imunskega spomina v zdravju in bolezni. Znanost 352, aaf1098 (2016).

18. Bekkering, S. et al. Presnovna indukcija usposobljene imunosti po mevalonatni poti. Celica 172, 135–146 e139 (2018).

19. van der Heijden, C. et al. Epigenetika in izurjena imunost. Antioksid. Redox signal. 29, 1023–1040 (2018).

20. Priem, B. et al. Izurjena nanobiološka terapija za spodbujanje imunosti zavira rast tumorja in potencira inhibicijo kontrolnih točk. Celica 183, 786–801 e719 (2020).

21. Kalafati, L. et al. Prirojeni imunski trening granulopoeze spodbuja protitumorsko delovanje. Celica 183, 771–785 e712 (2020).

22. Mitroulis, I. et al. Modulacija progenitorjev mielopoeze je sestavni del usposobljene imunosti. Celica 172, 147–161.e112 (2018).

23. Bekkering, S., Dominguez-Andres, J., Joosten, LAB, Riksen, NP & Netea, MG Izurjena imunost: reprogramiranje prirojene imunosti v zdravju in bolezni. Annu Rev. Immunol. 39, 667–693 (2021).

24. Kierdorf, K., Prinz, M., Geissmann, F. & Gomez Perdiguero, E. Razvoj in delovanje tkivno rezidentnih makrofagov pri miših. Semin. Immunol. 27, 369–378 (2015). 25. Calderon, B. et al. Anatomija trebušne slinavke pogojuje izvor in lastnosti rezidenčnih makrofagov. J. Exp. med. 212, 1497–1512 (2015).

26. Kim, H. Transkripcijski faktor MafB spodbuja protivnetno M2 polarizacijo in izliv holesterola v makrofagih. Sci. Rep. 7, 7591 (2017).

27. Kim, SY et al. Protivnetni učinki apocinina, zaviralca NADPH oksidaze, pri vnetju dihalnih poti. Immunol. Cell Biol. 90, 441–448 (2012).

28. Liu, M. et al. Transkripcijski faktor c-Maf je kontrolna točka, ki programira makrofage pri pljučnem raku. J. Clin. Investirajte. 130, 2081–2096 (2020).

29. Zimmerman, KA et al. Enocelično sekvenciranje RNA identificira podpise ekspresije genov za ledvične makrofage med vrstami. J. Am. Soc. Nefrol. 30, 767–781 (2019).

30. Bakos, E. et al. CCR2 uravnava imunski odziv z modulacijo medsebojne pretvorbe in delovanja efektorskih in regulatornih celic T. J. Immunol. 198, 4659–4671 (2017).

31. Kurihara, T., Warr, G., Loy, J. & Bravo, R. Napake pri zaposlovanju makrofagov in obrambi gostitelja pri miših brez kemokinskega receptorja CCR2. J. Exp. med. 186, 1757–1762 (1997).

32. Kuziel, WA et al. Močno zmanjšanje adhezije levkocitov in ekstravazacije monocitov pri miših s pomanjkanjem CC kemokinskega receptorja 2. Proc. Natl Acad. Sci. ZDA 94, 12053–12058 (1997).

33. Kratofil, RM, Kubes, P. & Deniset, JF Pretvorba monocitov med vnetjem in poškodbo. Arterioskler. Thromb. Vasc. Biol. 37, 35–42 (2017).

34. Funamizu, N. et al. Inhibitorni faktor migracije makrofagov inducira prehod epitelija v mezenhim, poveča agresivnost tumorja in napoveduje klinične rezultate pri reseciranem duktalnem adenokarcinomu trebušne slinavke. Int. J. Rak 132, 785–794 (2013).

35. Denz, A. et al. Inhibicija MIF povzroči zaustavitev celičnega cikla in apoptozo v celicah raka trebušne slinavke. J. Surg. Res. 160, 29–34 (2010).

36. Su, LJ et al. Peroksidacija lipidov, povzročena z reaktivnimi kisikovimi vrstami pri apoptozi, avtofagiji in feroptozi. Oksid. med. Celica Longev. 2019, 5080843 (2019).

37. Geller, A., Shrestha, R. & Yan, J. -glukan, pridobljen iz kvasa, pri raku: nove uporabe tradicionalne terapije. Int. J. Mol. Sci. 20, 3618 (2019).

38. Shrivastava, P. & Bhatia, M. Bistvena vloga monocitov in makrofagov pri napredovanju akutnega pankreatitisa. Svet J. Gastroenterol. 16, 3995–4002 (2010).

39. Wang, J. & Kubes, P. Rezervoar zrelih votlinskih makrofagov, ki lahko hitro napadejo visceralne organe in tako vplivajo na obnovo tkiva. Celica 165, 668–678 (2016).

40. Qi, C. et al. Diferencialne poti, ki uravnavajo prirojene in prilagodljive protitumorske imunske odzive z delci in topnimi glukani, pridobljenimi iz kvasovk. Blood 117, 6825–6836 (2011).

41. Goodridge, HS et al. Aktivacija prirojenega imunskega receptorja dektina-1 ob nastanku 'fagocitne sinapse'. Narava 472, 471–475 (2011).

42. Masuda, Y. et al. Peroralno dajanje topnih -glukanov, ekstrahiranih iz Grifola frondosa, inducira sistemski protitumorski imunski odziv in zmanjša imunosupresijo pri miših, ki nosijo tumor. Int. J. Rak 133, 108–119 (2013).

43. Rice, PJ et al. Farmakokinetika glivičnih (1-3)-beta-D-glukanov po intravenskem dajanju pri podganah. Int. Imunofarmakol. 4, 1209–1215 (2004).

44. Huang, Y. et al. Od S1P odvisno medorgansko trgovanje prirojenih limfoidnih celic skupine 2 podpira obrambo gostitelja. Znanost 359, 114–119 (2018).

45. Mathä, L. et al. Migracija prirojenih limfoidnih celic skupine 2 prebivalcev pljuč povezuje alergijsko vnetje pljuč in imunost jeter. Spredaj. Immunol. 12, 67950 (2021).

46. ​​Ricardo-Gonzalez, RR et al. Tkivno specifične poti iztisnejo aktivirane ILC2 za širjenje imunosti tipa 2. J. Exp. med. 217, e2019117 (2020).

47. Mattiola, I. & Diefenbach, A. Omogočanje protitumorske imunosti s sprostitvijo ILC2. Cell Res. 30, 461–462 (2020).

48. Qian, BZ & Pollard, JW Raznolikost makrofagov pospešuje napredovanje tumorja in metastaze. Celica 141, 39–51 (2010).

49. Qian, BZ et al. CCL2 rekrutira vnetne monocite za olajšanje metastaz tumorja dojke. Narava 475, 222–225 (2011).

50. Munn, DH & Cheung, NK Fagocitoza tumorskih celic s človeškimi monociti, gojenimi v rekombinantnem faktorju, ki spodbuja kolonije makrofagov. J. Exp. med. 172, 231–237 (1990).

51. Jadus, MR et al. Makrofagi uničijo tumorske celice glioma T9, ki nosijo membransko izoformo faktorja, ki spodbuja kolonije makrofagov, po poti, ki je odvisna od fagocitoze. J. Immunol. 160, 361–368 (1998).

52. Zhou, X., Liu, X. in Huang, L. Fagocitoza tumorskih celic, posredovana z makrofagi: priložnost za intervencijo nanomedicine. Adv. Funk. Mater. 31, 2006220 (2021).

53. Lecoultre, M., Dutoit, V. & Walker, PR Fagocitna funkcija s tumorjem povezanih makrofagov kot ključna determinanta nadzora napredovanja tumorja: pregled. J. Immunother. Rak 8, e001408 (2020).

54. Cui, S., Reichner, JS, Mateo, RB & Albina, JE Aktivirani mišji makrofagi inducirajo apoptozo v tumorskih celicah prek od dušikovega oksida odvisnih ali neodvisnih mehanizmov. Cancer Res. 54, 2462–2467 (1994).

55. Brahmer, JR et al. Varnost in aktivnost protiteles proti PD-L1 pri bolnikih z napredovalim rakom. N. angl. J. Med. 366, 2455–2465 (2012).

56. Saijo, S. et al. Dektin-1 je potreben za obrambo gostitelja pred Pneumocystis carinii, ne pa tudi pred Candido albicans. Nat. Immunol. 8, 39–46 (2007).

57. Bernhagen, J. et al. Čiščenje, bioaktivnost in analiza sekundarne strukture zaviralnega faktorja migracije makrofagov (MIF) pri miših in človeških makrofagih. Biokemija 33, 14144–14155 (1994).

58. Chen, TJ & Kotecha, N. Cytobank: zagotavljanje analitične platforme za analizo citometričnih podatkov skupnosti in sodelovanje. Curr. Vrh. Microbiol. Immunol. 377, 127–157 (2014).

59. Nowicka, M. et al. Potek dela CyTOF: diferencialno odkrivanje v podatkovnih nizih visokodimenzionalne citometrije z visoko zmogljivostjo. F1000Res. 6, 748 (2017).

60. Wilkerson, MD & Hayes, DN ConsensusClusterPlus: orodje za odkrivanje razreda z ocenami zaupanja in sledenjem elementom. Bioinformatika 26, 1572–1573 (2010). 61. Finak G., JM FlowWorkspace: Infrastruktura za predstavitev in interakcijo z nizi podatkov o zaprti in zaprti citometriji. Različica Bioconductor (2019).

62. Finak, G., Jiang, W. & Gottardo, R. CytoML za izmenjavo citometričnih podatkov med platformami. Cytom. Del A: J. Int. Soc. Analno Cytol. 93, 1189–1196 (2018).

63. Crowell, HL, Zanotelli, VRT, Chevrier, S. & Robinson, MD CATALYST: orodja za analizo podatkov citometrije. R paket različica 1.10.3. HelenaLC/KATALIZATOR (2020).

64. Cock, PJ, Fields, CJ, Goto, N., Heuer, ML & Rice, PM Format datoteke Sanger FASTQ za sekvence z ocenami kakovosti in različice FASTQ Solexa/Illumina. Nucleic Acids Res. 38, 1767–1771 (2010).

65. Ilumina. Uporabniški priročnik za BaseSpace. 2014.

66. Andrews, S. FastQC: orodje za nadzor kakovosti za visoko prepustne zaporedne podatke.

67. Dobin, A. et al. STAR: ultra hiter univerzalni RNA-seq aligner. Bioinformatika 29, 15–21 (2013).

68. Love, MI, Huber, W. & Anders, S. Moderirana ocena spremembe gube in disperzije za podatke RNA-seq z DESeq2. Genome Biol. 15, 550 (2014).

69. Trapnell, C. et al. Analiza diferencialne ekspresije genov in transkriptov eksperimentov RNAseq s TopHat in manšetnimi gumbi. Nat. Protoc. 7, 562–578 (2012).

70. Anders, S., Pyl, PT & Huber, W. HTSeq–ogrodje Python za delo s podatki zaporedja z visoko zmogljivostjo. Bioinformatika 31, 166–169 (2015).

71. Boyle, EI et al. GO::TermFinder – odprtokodna programska oprema za dostop do informacij genske ontologije in iskanje znatno obogatenih izrazov genske ontologije, povezanih s seznamom genov. Bioinformatika 20, 3710–3715 (2004).

72. Kanehisa, M. & Goto, S. KEGG: kjotska enciklopedija genov in genomov. Nucleic Acids Res. 28, 27–30 (2000).

73. Stuart, T. et al. Celovita integracija podatkov v eni celici. Celica 177, 1888–1902. e1821 (2019).

74. Lun, AT, Riesenfeld, S., Andrews, T., Gomes, T. & Marioni, JC EmptyDrops: razlikovanje celic od praznih kapljic v podatkih sekvenciranja enocelične RNA na podlagi kapljic. Genome Biol. 20, 1–9 (2019).

75. Hafemeister, C. & Satija, R. Normalizacija in stabilizacija variance enoceličnih podatkov RNA-seq z uporabo urejene negativne binomske regresije. Genome Biol. 20, 1–15 (2019).

76. Becht, E. et al. Zmanjšanje dimenzij za vizualizacijo enoceličnih podatkov z uporabo UMAP. Nat. Biotehnologija. 37, 38–44 (2019).

77. Diaz-Mejia, JJ et al. Vrednotenje metod za dodeljevanje oznak tipa celice celičnim grozdom iz podatkov sekvenciranja RNK v eni celici. F1000Res. 8 ISCB Comm J-296 (2019). 78. Hänzelmann, S., Castelo, R. & Guinney, J. GSVA: analiza variacije nabora genov za podatke mikromrež in RNA-seq. BMC Bioinforma. 14, 7 (2013).

79. Finak, G. et al. MAST: prilagodljiv statistični okvir za ocenjevanje transkripcijskih sprememb in karakterizacijo heterogenosti v podatkih sekvenciranja enocelične RNA. Genome Biol. 16, 1–13 (2015).

80. Suffiotti, M., Carmona, SJ, Jandus, C. & Gfeller, D. Identifikacija prirojenih limfoidnih celic v enoceličnih podatkih RNA-Seq. Imunogenetika 69, 439–450 (2017).

81. Entwistle, LJ et al. Fenotip prirojenih limfoidnih celic pljučne skupine 2 je odvisen od konteksta: določanje učinka seva, lokacije in dražljajev. Spredaj. Immunol. 10, 3114 (2020).

82. Ricardo-Gonzalez, RR et al. Tkivni signali vtisnejo identiteto ILC2 s funkcijo predvidevanja. Nat. Immunol. 19, 1093–1099 (2018).

83. Zilionis, R. et al. Enocelična transkriptomika človeških in mišjih pljučnih rakov razkriva ohranjene mieloidne populacije pri posameznikih in vrstah. Imuniteta 50, 1317–1334.e1310 (2019).

Zahvala

Avtorji se želijo zahvaliti dr. Wolfgangu Zachariasu, dr. Mei Zhang in Sabine Waigel iz Brown Cancer Center Genomics Facility za njihovo pomoč pri RNA-Seq in scRNASeq. Zahvaljujemo se tudi dr. Clintu Gellerju za lektoriranje rokopisa. To delo sta podprla NIH R01CA213990 in R01AI128818 (JY). CD in CTW sta bila delno podprta s strani NIH P20GM135004. Del tega dela je bil opravljen s pomočjo UofL Genomics Facility, ki ga podpirajo NIH P20GM103436 (KY IDeA Networks of Biomedical Research Excellence), Brown Cancer Center in uporabnine. CyTOF je bil izveden v Functional Immunomics Core, ki ga podpira NIH P20GM135004 (Jun Yan/Jason Chesney, MPI). Podporo za sekvenciranje in bioinformatiko za to delo sta zagotovila NIH P20GM103436 (Nigel Cooper, PI) in NIH P20GM106396 (Donald Miller, PI). Vsebina tega dela je izključno odgovornost avtorjev in ne predstavlja uradnih stališč NIH ali Nacionalnega inštituta za splošne medicinske vede (NIGMS).

Avtorski prispevki

AEG je zasnoval in izvedel poskuse, analiziral podatke, interpretiral rezultate in napisal rokopis. RS, CD in HG so prispevali k načrtovanju eksperimentov, pridobivanju podatkov in analizi podatkov. MRW, XH in MZ so pomagali pri pridobivanju podatkov in pripravi materialov. KA in ECR sta prispevala k računalniški analizi in interpretaciji analiz RNA-Seq, JHC in ECR pa sta prispevala k računalniški analizi in interpretaciji analiz ScRNA-Seq. DT in CTW sta prispevala k analizi podatkov CyTOF. RAM, H.-gZ in YL so prispevali materiale in vodili projekt. RAM je opravil kritičen pregled. JY je vodil eksperimentalno načrtovanje in celotno študijo, interpretiral podatke, nadziral raziskave ter pomagal pri pisanju in pregledu rokopisa.

Konkurenčni interesi

Avtorji izjavljajo, da ni konkurenčnih interesov.

Dodatne informacije

Dodatne informacije Spletna različica vsebuje dodatno gradivo, ki je na voljo na https://doi.org/10.1038/s41467-022-28407-4.

Korespondenco in zahteve za gradivo naslovite na Jun Yan.

Informacije o strokovnem pregledu

Nature Communications se zahvaljuje Georgeu Millerju in drugim, anonimnim recenzentom(-om) za njihov prispevek k strokovnemu pregledu tega dela. Na voljo so poročila strokovnih ocenjevalcev.

Ponatisi in informacije o dovoljenjih so na voljo na http://www.nature.com/reprints

Opomba založnika Springer Nature ostaja nevtralen glede trditev o pristojnosti v objavljenih zemljevidih ​​in institucionalnih povezavah.

Odprt dostop Ta članek je licenciran pod licenco Creative Commons Attribution 4.0 International License, ki dovoljuje uporabo, skupno rabo, prilagajanje, distribucijo in reprodukcijo v katerem koli mediju ali formatu, če navedete ustrezno priznanje izvirnemu avtorju (s) in vir, navedite povezavo do licence Creative Commons in navedite, ali so bile narejene spremembe.

Slike ali drugo gradivo tretjih oseb v tem članku so vključeni v licenco Creative Commons za članek, razen če je v kreditni liniji za gradivo navedeno drugače. Če gradivo ni vključeno v licenco Creative Commons za članek in vaša predvidena uporaba ni dovoljena z zakonskimi predpisi ali presega dovoljeno uporabo, boste morali pridobiti dovoljenje neposredno od imetnika avtorskih pravic. Za ogled kopije te licence.

For more information:1950477648nn@gmail.com