Zaviralni učinek derivata kurkumina J147 na melanogenezo in transport melanosomov z olajšanjem razgradnje MITF, ki jo posreduje ERK 1. del

Priznana je bila terapevtska uporaba kurkumina in kemično modificiranega kurkumina (CMC) za zatiranje melanogeneze in aktivnosti tirozinaze. J147 je modificirana različica kurkumina z vrhunsko biološko uporabnostjo in stabilnostjo. Vendar ni poročil o učinkih J147 na pigmentacijo in vitro in in vivo. V naših študijah smo raziskali hipopigmentne učinke zdravljenja z J147 na melanocite in raziskali osnovni mehanizem. Sedanje študije so pokazale, da je J147 zaviral tako bazalno kot -MSH-inducirano melanogenezo, kot tudi zmanjšano razširitev dendrita melanocitov in transport melanosomov. J147 je igral te vloge predvsem z aktiviranjem zunajcelične signalno regulirane poti protein kinaze (ERK). Ko se je aktiviral, je povzročil razgradnjo MITF in dodatno znižal izražanje tirozinaze, TRP-1, TRP-2, miozina Va, Rab27a in Cdc42, kar je na koncu zaviralo sintezo melanina in melanosomski transport. Poleg tega so bili hipopigmentni učinki J147 dokazani in vivo na modelu cebrice in modelu hiperpigmentacije, ki jo povzroči UVB, pri rjavih morskih prašičkih. Naše ugotovitve so tudi pokazale, da J147 ni pokazal citotoksičnosti in vitro in in vivo. Skupaj so ti podatki potrdili, da se lahko J147 izkaže za precej uporabnega kot varnejše naravno sredstvo za beljenje kože.

Cistancheima tudi funkcijospodbujanje proizvodnje kolagena, ki lahko poveča elastičnost in sijaj kože ter pomaga obnoviti poškodovane kožne celice. CistancheFeniletanolni glikozidiimajo pomemben zaviralni učinek natirozinazaučinek na tirozinazo pa je kompetitivno in reverzibilno zaviranje, kar lahko zagotovi znanstveno podlago za razvoj in uporabobelilne sestavinev mestu Cistanche. Zato ima cistanča ključno vlogo pri beljenju kože. Lahkozavirajo proizvodnjo melaninaza zmanjšanje razbarvanja in motnosti; in spodbuja proizvodnjo kolagenaizboljšati elastičnost kožein sijaj. Zaradi splošnega priznanja teh učinkov cistanche, mnogibeljenje kožeizdelki so začeli vsebovati zeliščne sestavine, kot je Cistanche, da bi zadovoljili povpraševanje potrošnikov, s čimer se je povečala komercialna vrednost Cistanche v izdelkih za beljenje kože. Če povzamemo, je vloga cistanche pri beljenju kože ključna. Njegov antioksidativni učinek in učinek na proizvodnjo kolagena lahko zmanjšata razbarvanje in otopelost, izboljšata elastičnost in sijaj kože ter tako dosežeta učinek beljenja. Poleg tega široka uporaba Cistanche v izdelkih za beljenje kože dokazuje, da njene vloge pri komercialni vrednosti ni mogoče podcenjevati.

Ključne besede: J147, hipopigmentni učinki, transport melanosoma, pot ERK, razgradnja MITF

Kliknite na Cistanche Tubulosa za beljenje

Za več informacij: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501

UVOD

Pigmentacija kože je odvisna od sinteze melanina in porazdelitve v plasti povrhnjice. Melanin nastaja predvsem okoli jedra melanocitov in je shranjen v melanosomih (Tian et al., 2021). Po zorenju so melanosomi migrirali vzdolž mikrotubulov in aktinskih filamentov do konic dendritov celic in končno do sosednjih keratinocitov, da bi dokončali proces distribucije (Beaumont et al., 2011; Ohbayashi in Fukuda, 2012). V normalnem fiziološkem stanju melanin ščiti človeško kožo pred ultravijoličnimi (UV) poškodbami, strupenimi kemikalijami in drugimi okoljskimi dejavniki (Slominski et al., 2004; Yousaf et al., 2020). Vendar pa prekomerna proizvodnja in kopičenje povzročata hiperpigmentacijo in sta povezana s kožnimi motnjami, kot so povnetna melanoderma, melazma in solarni lentigini, kar vodi do izjemne psihosocialne obremenitve (Pillaiyar et al., 2017). Zato je treba razviti učinkovita in varna sredstva za beljenje kože.

V zadnjih letih je biologija melaninske celice postala širše raziskovalno področje in razjasnjenih je bilo več pomembnih proteinov, ki prispevajo k melanogenezi in transportu melanosomov, kar je omogočilo identifikacijo zaviralcev sinteze melanina. Tirozinaza je izključno potrebna za melanogenezo in zaviranje katalitičnega delovanja tirozinaze je najpogostejša metoda za zmanjšanje proizvodnje melanina (D'Mello et al., 2016). Več znanih zaviralcev tirozinaze, vključno z arbutinom in kojično kislino, je bilo že razvitih kot kozmetičnih dodatkov (Ding et al., 2020). KIF5b in kompleks Rab27A-melanofilin-miozin Va prispevata k transportu melanosoma navzven (Ohbayashi in Fukuda, 2012; Noguchi et al., 2014). Cdc42 uravnava raztezek dendrita, ki je bistvenega pomena za prenos melanosoma (Luo, 2000). Inhibicija teh zgornjih proteinov bi lahko znatno zavirala transport melanosomov, ki je pomemben mehanizem za razvoj sredstev za beljenje kože. Z mikroftalmijo povezan transkripcijski faktor (MITF) je glavni transkripcijski faktor v melanogenezi. Poleg tega MITF uravnava tudi transport melanosomov z indukcijo ekspresije Rab27a in Cdc42 (Noguchi et al., 2016). Več signalnih poti sodeluje pri pigmentaciji z uravnavanjem ravni izražanja MITF. Aktivacija cAMP protein kinaze A (PKA) stimulira pigmentacijo prek cAMP odgovornega elementa vezave proteina (CREB), ki je odvisen od regulacije izražanja MITF (Rodríguez in Setaluri, 2014). Nasprotno pa aktivacija zunajcelične signalno regulirane proteinske kinaze (ERK) zavira melanogenezo s pospeševanjem razgradnje MITF (Lv et al., 2020a). Razvita so bila številna antimelanogena sredstva, ki ciljajo na aktivnost tirozinaze, prenos melanosoma ali z melanogenom povezane signalne poti. Vendar je bilo le nekaj inhibitorjev podvrženih študijam in vivo in so pokazali dobre rezultate (Pillaiyar et al., 2017).

Kurkumin je diarilheptanoidna spojina, izolirana iz korenike Curcuma longa (Zingiberaceae) in se uporablja kot rumena aroma ali pigment v živilih (Zheng J. et al., 2018). Študije so pokazale njegove različne fiziološke funkcije, vključno s protivnetnimi, antioksidativnimi, antiamiloidnimi in protitumorskimi aktivnostmi (Liu et al., 2016; Zheng Y. et al., 2018). Poleg tega kurkumin zavira aktivnost tirozinaze in zavira melanogenezo v melanocitih (Lee et al., 2010; Tu et al., 2012). Toda slaba biološka uporabnost kurkumina omejuje njegovo uporabo (Karthikeyan et al., 2020). Za rešitev tega problema je bil J147 razvit kot močna spojina derivata kurkumina z večjo stabilnostjo in biološko uporabnostjo (Li et al., 2020). J147 ima nevroprotektivni učinek in je trenutno v fazi I kliničnih preskušanj za Alzheimerjevo bolezen. Vendar še vedno ni poročil o učinkih J147 na pigmentacijo in vitro in in vivo.

MATERIALI IN METODE

Reagenti

J147 (J302241), -MSH (M118985) in tirozinazo iz gob (T128536) so pridobili pri Aladinu (Šanghaj, Kitajska). Dobili smo protitelesa proti miozinu Va (sc-365986), KIF5b (sc-133184), GP100 (sc-393094), Cdc42 (sc-8401), Rab27a (sc{{ 13}}), p-JNK (sc-6254), JNK (sc-7345), p-p38 MAPK (sc-166182) in p38 MAPK (sc-398546) iz Santa Cruza (CA, ZDA). Protitelesa proti MITF (97800), p-MEK (2338), MEK (4694), p-ERK (4370) in ERK (4695) so bila pridobljena iz Cell Signaling Technology (MA, ZDA). Protitelesa proti tirozinazi (ab180753), TRP-1 (ab235447), TRP-2 (ab221144), citokeratinu (ab7753) in S100 (ab133519) so bila pridobljena pri Abcam (Cambridge, UK). Zaviralec p38 SB203580 (S1863), zaviralec ERK PD98059 (S1805), komplet za testiranje beljakovin BCA (P0012), pufer za celično lizo (P0013) in -aktin (AF5001) so bili pridobljeni pri Beyotime (Šanghaj, Kitajska). Kompleti RT-qPCR (RR036A) so bili kupljeni pri Takara Biomedical Technology (Peking, Kitajska).

Celična kultura

MTT test

Viabilnost celic so pregledali s testom MTT (Yun et al., 2020). Na kratko, celice so bile zasejane v 96-plošče z vdolbinicami in obdelane z J147 (1–8 μM) 48 ur. Nato celice speremo s PBS in nadomestimo z raztopino MTT (20 μL). Po inkubaciji dodatnih 4 ure smo raztopino supernatanta odstranili in v vsako vdolbinico dodali DMSO (200 μL). Na koncu smo določili optično absorbanco pri 570 nm.

Merjenje vsebnosti melanina

Celice z gostoto 2 × 105 celic/ml so bile posejane v 6-plošče za kulture vdolbinic. Po 24 urah inkubacije smo celice gojili z različnimi odmerki J147 (1, 2, 4 μM) in z ali brez stimulacije z -MSH (60 nM). Po 48 urah obdelave smo celice pobrali in celotni melanin v celični peleti raztopili v 100 μL delovne raztopine NaOH (1 mol/L, 10 odstotkov DMSO) pri 80 stopinjah C za 1 uro in izmerili absorbanco pri 405 nm (Lv et al., 2015; Lv et al., 2019).

Test aktivnosti tirozinaze

Aktivnost celične tirozinaze je bila preučena, kot je opisano prej (Liao et al., 2017; Lv et al., 2020a). Na kratko, celice so bile lizirane s pufrom za celično lizo po trikratnem izpiranju, nato pa smo s centrifugiranjem lizatov pridobili supernatant za testiranje aktivnosti tirozinaze. 100 μL PBS (0,1 M, pH 6,5), ki vsebuje 10 ug beljakovin, pomešanih s 100 μL 0,1-odstotnega L-DOPA. Ploščo smo inkubirali pri 37 stopinjah 1 uro in nato spremljali optično absorbanco pri 475 nm.

Neposredni učinek J147 na aktivnost tirozinaze je bil testiran z brezceličnim sistemom, kot je opisano prej (Lv et al., 2020a). Na kratko, reakcija za določanje aktivnosti gobje tirozinaze je bila izvedena v 96-plošči z jamicami in reakcijska mešanica je vsebovala gobjo tirozinazo (10 enot), L-tirozin (0,03 odstotka, 50 μL) in 100 μL PBS (0,1 M, pH 6,5) z dodajanjem različnih koncentracij J147. Po inkubaciji pri 37 stopinjah 10 minut smo absorbanco pri 475 nm izmerili s spektrofotometrom za mikroplošče.

Masson–Fontana barvanje z amoniačnim srebrom

Za odkrivanje pigmenta melanina so koščke kože in melanocite fiksirali v formalinu in obarvali po standardnem protokolu (Gu et al., 2018; Lv et al., 2020b). Na kratko, stekelca smo 3-krat sprali z deionizirano vodo in nato inkubirali v raztopini amonijevega srebra pri sobni temperaturi 12 ur. Po dobrem izpiranju v deionizirani vodi stekelca 5 minut inkubirali v hipo raztopini. Nato smo stekelca ponovno splaknili in nadaljnjih 5 minut obarvali z nevtralnim rdečim madežem. Nazadnje, po temeljitem izpiranju, stekelca opazovali pod mikroskopom Nikon-Eclipse-Ti.

Imunofluorescenca za prenos melanosoma

Sistem kokulture celic B16F10 in HaCaT je bil vzpostavljen na konfokalni posodi, kot je opisano prej (Lee et al., 2015; Lv et al., 2020c). Po zdravljenju z J147 so bile celice imunsko obarvane z anti-GP100 in anti-Cytokeratin v skladu s standardnim protokolom. Slike so bile posnete z mikroskopom Nikon-Eclipse-Ti.

Imunohistokemija za S-100

Imunohistokemija za S-100 je bila izvedena, kot je opisano prej (Lee et al., 2013; Lv et al., 2020b). Kratek opis je bil naslednji: stekelca so blokirali s 5 odstotki BSA pri 25 stopinjah C za 1 uro in nato inkubirali s primarnim protitelesom proti S-100 pri 4 stopinjah C čez noč. Naslednji dan stekelca 3-krat speremo z raztopino TBST in inkubiramo s sekundarnim protitelesom. Nato smo preparate obdelali z aminoetil karbazolom, da smo razvili reze, in jih opazovali pod mikroskopom.

Povratna transkripcija – PCR

Skupno celično RNA smo ekstrahirali z reagentom TRIzol in kvantificirali spektrofotometrično. Nato je bila reverzna transkriptaza SuperScript II uporabljena za sintezo enoverižnegacDNA po navodilih izdelave.Oligonukleotidne primerje smo kupili pri GenScript(Nanjing, Kitajska). ZaporedjaMITFgenski začetniki so 5′- AGAGCAGGGCAGAGAGTGAGTGTGGG -3′, 5′-AACTTGATTCCAGGCTGATGATGTC -3′. ZaporedjaGAPDHgenprimerki so 5′- AGGTCGGTGTGAACGGATTTG-3′, 5′- TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA -3′. Produkti PCR so bililočimo z elektroforezo na 1-odstotnem agaroznem gelu in detektiramopod ultravijolično svetlobo (Lee et al., 2013).

Western Blotting

Proteine ​​(40 ug) smo ločili z geli SDS-PAGE in jih prenesli na membrane nitroceluloznega filtra (NC) z elektroforetskim prenosnim sistemom (Bio-Rad). NC membrane so bile blokirane s 3 odstotki BSA v raztopini TBST pri sobni temperaturi 1, 5 ure. Nato so bile membrane inkubirane s primarnimi protitelesi pri 4 stopinjah čez noč. Naslednji dan smo madeže 3-krat sprali z raztopino TBST in nato inkubirali s sekundarnimi protitelesi, konjugiranimi s peroksidazo, pri 25 stopinjah 1 uro in vizualizirali z uporabo izboljšane kemiluminiscence (Lv et al., 2020d).

Določanje vsebnosti melanina v modelu cebrice

Na kratko, sinhronizirane zarodke smo zbrali in razporedili s pipeto (tri do štirje zarodki na vdolbino z 200 μL medija za zarodke v 96-ploščah z vdolbinicami). Nato smo J147 in PTU raztopili v 0,1-odstotnem DMSO in dodali v medij zarodka od 35 do 60 ur (25-urna izpostavljenost). Vpliv J147 na melanogenezo cebric so opazovali pod stereomikroskopom (Zheng J. et al., 2018).

Vrednotenje na podlagi fenotipa in model morskega prašička z UVB povzročeno hiperpigmentacijo

8 rjavih morskih prašičkov (6 tednov, približno 250–300 g) je bilo kupljenih pri Inštitutu za laboratorijske živalske znanosti (Peking, Kitajska). Te morske prašičke so hranili same v prostoru s konstantno temperaturo in vlažnostjo v ciklu 12-h svetloba/tema. Ločena območja (1 cm diametralni krog) hrbta vsake živali so bila izpostavljena 500 mJ/cm2 UVB (Sigma SH-4, Šanghaj, Kitajska) enkrat na dan 1 teden, da se vzpostavi model hiperpigmentacije. Nato smo nosilec (PEG400/EtOH=7:3) in J147 (1 odstotek) dajali hiperpigmentiranim območjem (20 μL raztopine na krog) dvakrat na dan 3 tedne. Stopnjo pigmentacije smo ovrednotili z izračunom vrednosti ΔL glede na vrednost L, izmerjeno s spektrofotometrom (YS3010, 3nh, Shenzhen, Kitajska), kot sledi: ΔL=L (pri vsakem izmerjenem dnevu)-L (na dan 0) (Lee et al., 2013; Lv et al., 2020b). Vse postopke na živalih v tej študiji je odobril odbor za nego in uporabo živali Univerze Changzhou.

Statistična analiza

REZULTATI

J147 Zmanjšana melanogeneza in število dendritov v celicah B16F10

Struktura J147 je prikazana na sliki 1A. Najprej je bil izveden poskus preživetja celic, da bi raziskali, ali je J147 citotoksičen za celice B16F10. Kot je prikazano na sliki 1B, po 48 urah niso opazili nobenih citotoksičnih učinkov J147 pri odmernem območju 1–8 μM. Nato smo preučili vpliv J147 na sintezo melanina. Kot je prikazano na sliki 1C, je J147 zaviral bazalno sintezo melanina. -MSH pomembno spodbuja melanogenezo v melanocitih. Povečanje melanogeneze, inducirano z -MSH, se je obrnilo po zdravljenju z J147. Dosledno je barvanje z amonijačnim srebrom Masson–Fontana pokazalo, da je J147 izjemno zmanjšal vsebnost melanina v celicah B16F10 z ali brez -MSH (slika 1D). Poleg tega sta se zmanjšala tudi število in dolžina dendritov ter koncentracija melanina v dendritih v primerjavi z neobdelanimi celicami (slika 1D). Rezultati so pokazali, da je J147 zmanjšal melanogenezo in tvorbo dendritov brez citotoksičnih učinkov.

J147 Zavira aktivnost celične tirozinaze in izražanje tirozinaze, TRP-1, TRP-2

Družina proteinov tirozinaze (tirozinaza, TRP-1 in TRP-2) je sodelovala pri melanogenezi. Med njimi so tirozinaze ključni encimi, ki uravnavajo biosintetično pot melanina (D'Mello et al., 2016). Da bi ugotovili, ali J147 vpliva na aktivnost tirozinaze, smo najprej uporabili metodo oksidacije L-DOPA za določitev učinkov J147 na aktivnost celične tirozinaze. Pokazalo se je, da ima J147 (1–4 μM) močan zaviralni učinek na aktivnost celične tirozinaze v odvisnosti od odmerka v celicah B16F10 (slika 2A). Nato je bil izveden test aktivnosti gobove tirozinaze, da bi določili neposredne učinke J147 na aktivnost tirozinaze. Kot je prikazano na sliki 2B, niso opazili zaviralnih učinkov, kar kaže, da J147 ni vplival na encimske aktivnosti gobje tirozinaze (slika 2B). Kot vemo, je melanogeneza nadzorovana z aktivnostjo in količinami teh tirozinaz. Da bi raziskali, ali so antimelanogeni učinki J147 povezani z izražanjem tirozinaze, je bila izvedena Western blot analiza. Kot je prikazano na sliki 2C, so se stopnje izražanja tirozinaze znatno zmanjšale po zdravljenju z J147 z ali brez -MSH, enake rezultate pa so opazili pri izražanju TRP-1 in TRP-2. Ta opažanja so pokazala, da J147 zavira aktivnost celične tirozinaze in melanogenezo z zmanjšanjem ravni izražanja tirozinaze, TRP-1 in TRP-2.

J147 Zavira transport melanosoma z uravnavanjem ekspresije miozina Va, Rab27a in Cdc42

Pigmentacijo človeške kože določata sinteza melanina in porazdelitev melanina. V melanocitih sesalcev se melanin večinoma tvori v telesu celice inmigrira vzdolž aktinskih filamentovin mikrotubule do dendritov in končnodo sosednjih keratinocitov, da končadistribucijapostopek (Ohbayashi in Fukuda, 2012). Kot je prikazano vSlika 1D, J147 je izrazito zmanjšal tvorbo dendritov.Poleg tega je bila tudi koncentracija melanina v dendritihzmanjšano, ko se pigment melanin agregira v perinuklearjuregije. Nato smo so-gojili celice B16F10 in HaCaTraziščite, ali J147 vplivaprenos melanosoma nakeratinocitov s konfokalno mikroskopijo. Distribucijamelanin je bil viden v celicah HaCaT v sokulturimodel (Slika 3A). V nasprotju s tem, ko je bil model sokulturezdravljen z J147 48 ur, zrnati signali melanosoma vHaCaT celice so bile znatnozmanjšano (Slika 3A).

Za nadaljnjo razjasnitev osnovnega mehanizma zaviralnih učinkov prenosa melanosoma z J147 smo preučili več ključnih dejavnikov, ki sodelujejo pri transportu melanosoma. KIF5b posreduje transport melanosomov navzven vzdolž mikrotubulov, kompleks Rab27a melanofilin-miozin Va pa prispeva k transportu melanosomov vzdolž aktinskih filamentov v melanocitih (Reiner et al., 2020). Poleg tega Cdc42 stimulira tvorbo dendritov v melanocitih, ki prav tako igra bistveno vlogo pri transportu melanosomov. Kot je prikazano na sliki 3B, se je izražanje Cdc42, miozina Va in Rab27a, vendar ne KIF5b, znatno zmanjšalo po zdravljenju z J147 v stanju z ali brez -MSH. Naše ugotovitve so pokazale, da je J147 zaviral transport melanosoma z zmanjšanjem izražanja miozina Va, Rab27a in Cdc42.

J147 Pospešena razgradnja MITF

MITF je eden ključnih regulatorjev za melanogenezo in nadzoruje gensko transkripcijo tirozinaze, TRP-1, TRP-2, Cdc42 in Rab27a (Noguchi et al., 2016; Kim et al., 2019). ). Najprej smo preučili vpliv J147 na transkripte MITF. Kot je prikazano na sliki 4A, je -MSH izjemno povečal transkripcijo MITF, vendar po zdravljenju z J147 niso opazili nobene spremembe, kar kaže, da J147 ne zmanjša ekspresije MITF. Nato smo preverili, ali J147 vpliva na prevod MITF. Kot je prikazano na sliki 4B, so se po zdravljenju z -MSH ravni beljakovin MITF povečale, dosegle vrh pri 4 urah in začele upadati pri 8 urah (slika 4B). Drugače pa se ravni beljakovin MITF niso zmanjšale 4 ure po zdravljenju z J147, vendar so po 8 urah ravni beljakovin MITF hitro padle na nezaznavne ravni, kar kaže, da J147 ne vpliva na prevajanje MITF, ampak izjemno pospeši razgradnjo beljakovin MITF.

J147 Zatrta melanogeneza skozi signalno pot MEK/ERK

Signalna pot mitogen-aktiviranih protein kinaz (MAPK), vključno z zunajcelično signalno regulirano protein kinazo (ERK), p38 in c-jun N-terminalno kinazo (JNK), igra ključno vlogo pri pigmentaciji (Lee et al., 2013). Znano je, da fosforilacija ERK olajša razgradnjo MITF in sčasoma razprši melanogene dražljaje, kar predstavlja glavni mehanizem negativnih povratnih informacij (Kwon et al., 2017). Vendar pa ostaja funkcija p38 in JNK poti sporna. Zato smo preučili učinek J147 na signalne poti MAPK. Kot je prikazano na sliki 5A, je J147 aktiviral MEK/ERK in p38, medtem ko v fosforilaciji signalne poti JNK ni bilo ugotovljenega vpliva.

Za več informacij: david.deng@wecistanche.com WhatApp:86 13632399501