Pot do napredka Predklinične študije s starostjo povezanih nevrodegenerativnih bolezni: pogled na modele glodalcev in HiPSC, 2. del

Poleg transgenih modelov, ki so jih razvili posamezni akademski laboratoriji, Nacionalni inštituti za zdravje (NIH) trenutno vodi projekt ciljnega odkrivanja in predklinične validacije Accelerating Medicines Partnership-AD (AMP-AD), ki je konzorcij večinstitucionalnih in multidisciplinarnih nepovratnih sredstev ki skupaj nameravajo pospešiti cevovode za odkrivanje zdravil za AD (https://www.nia.nih.gov/research/dn/amp-ad-target-discovery-and-preclinicalvalidation-project).

S hitrim razvojem biotehnologije se transgena tehnologija postopoma uporablja na biološkem področju. Transgena tehnologija je tehnologija genskega inženiringa, ki vnaša tuje gene v organizme, da ti pokažejo posebne značilnosti. Vendar pa je prišlo do polemike o razmerju med transgenimi modeli in spominom.

Nekateri raziskovalci menijo, da lahko transgeni modeli pozitivno vplivajo na spomin. Nekateri poskusi na transgenih živalih so na primer pokazali, da je mogoče s spreminjanjem določenih genov izboljšati sposobnost učenja in spomin živali. Ti eksperimentalni rezultati kažejo, da lahko transgena tehnologija potencialno izboljša človeške kognitivne sposobnosti.

Čeprav so ti rezultati raziskav zelo zanimivi, moramo biti tudi previdni, ker rezultati po teh eksperimentalnih procesih niso posledica človeške promocije ali prenagljene uporabe. Izvesti moramo več raziskav o tej tehnologiji, da bi razumeli morebitna tveganja za okolje in ljudi ter izmerili njen možen družbeni vpliv. Hkrati pa moramo tudi priznati, da izboljšanje spomina ni odvisno samo od genov, ampak tudi od fizičnega zdravja in zdravih življenjskih navad lahko dosežemo dobro stanje spomina po normalnih kanalih.

Skratka, veseliti se moramo pozitivnih vidikov transgene tehnologije in jo ustrezno regulirati ter ovrednotiti. Z racionalno uporabo transgene tehnologije lahko spremenimo svoj genom, kar nam bo pomagalo pri reševanju nekaterih zdravstvenih in okoljskih problemov, hkrati pa spodbujalo človeški napredek na številnih področjih, vključno z izboljšanjem spomina. Vidimo lahko, da moramo izboljšati spomin in Cistanche lahko bistveno izboljša spomin, ker ima antioksidativne, protivnetne učinke in učinke proti staranju, kar lahko pomaga zmanjšati oksidacijo in vnetne reakcije v možganih, s čimer ščiti zdravje živčnega sistema. Poleg tega lahko Cistanche spodbuja tudi rast in popravilo živčnih celic ter tako izboljša povezljivost in delovanje nevronskih mrež. Ti učinki lahko pomagajo izboljšati spomin, sposobnost učenja in hitrost razmišljanja ter lahko tudi preprečijo pojav kognitivnih motenj in nevrodegenerativnih bolezni.

Kliknite Spoznajte načine za izboljšanje delovanja možganov

Za ta pregled je še posebej pomembna veja AMP-AD, imenovana pobuda za razvoj in vrednotenje modelnega organizma LOAD (MODEL-AD). Cilj MODEL-AD je ustvariti nove transgene linije miši, ki natančno modelirajo fenotipe AD in služijo kot izboljšana platforma za cevovod za razvoj zdravil ter bolj prevedljive in biološko pomembne modele za predklinično validacijo DMT.

Pobudo MODEL-AD sestavljajo Center na Medicinski fakulteti Univerze Indiana, Laboratorij Jackson, Sage Bionetworks, Medicinska fakulteta Univerze v Pittsburghu in center na Kalifornijski univerzi Irvine.

Ta konzorcij namerava skupaj vzpostaviti naslednjo generacijo in vivo AD modelov, ki temeljijo na podatkih o ljudeh na strog in visoko nadzorovan način. Pri tem želi uskladiti patofiziološke značilnosti modelov AD z ustreznimi stopnjami klinične bolezni z uporabo prevedljivih biomarkerjev kot sredstva za povečanje prevedljivosti predkliničnih ugotovitev.57

Do danes je bilo ustvarjenih 54 mišjih modelov AD, vključno z mišmi fAD, APOE, APP, MAPT/tau, kot tudi modeli LOAD, ki temeljijo na kopičenju Ab in drugih predhodno identificiranih različicah, povezanih z LOAD (https://www.model-ad.org /strain-table/), ki so na voljo prek JAX/IU/Pitt AD Precision ModelsCenter.

Kemično-toksinski modeli AD

Poleg novejših transgenih modelov so modeli AD glodalcev zgodovinsko temeljili na izpostavljenosti strupenim spojinam, ki povzročajo selektivno nevrodegeneracijo, ki vodi do kognitivnih in vedenjskih motenj, podobnih tistim, opaženim pri bolnikih z AD.

Medtem ko so bili v študiji AD in PD uporabljeni različni modeli izpostavljenosti toksinom, so bili modeli AD večinoma nadomeščeni z novejšimi transgenskimi modeli, o katerih smo razpravljali zgoraj.

Kemijski modeli AD inducirajo AD podobno patologijo z uporabo bodisi spojin, ki selektivno in reverzibilno motijo ​​aktivnost holinergičnih nevronov, bodisi toksinov, ki trajno motijo ​​procese celične homeostaze, kar vodi v celično smrt, kot so okadaična kislina in različni razredi težkih kovin 58 (tabela 2). Čeprav ti modeli povzročajo nekatere nevrološke in vedenjske pomanjkljivosti, ki spominjajo na simptome AD, vključno z oslabljenim učenjem in spominom, v veliki meri nimajo patoloških lezij AD (tj. Ab plakov in NFT).

Živalski modeli, ki se eksplicitno osredotočajo na motnje holinergičnih nevronov, temeljijo na zdaj nekoliko zastareli holinergični hipotezi AD.59 V takšnih modelih se antagonisti muskarinskih receptorjev, na primer spojina skopolamin, dostavijo v ciljne možganske regije, kot je HP, da blokirajo endogeno aktivnost acetilholina in povzročajo kognitivne motnje pri učenju in spominu.60

Drugi modeli kemičnih posegov AD vključujejo lokalno ali periferno dajanje nevrotoksinov, ki vodijo do nespecifične smrti nevronskih celic61–64 (tabela 2).

Transgeni modeli PD

Kot velja za AD, transgeni mišji modeli PD omogočajo preučevanje kliničnih značilnosti bolezni, povzročenih z manipulacijo genetskih lokusov, povezanih z mendelskimi oblikami bolezni, in na stotine edinstvenih linij je zdaj komercialno na voljo za nakup.

Tako kot AD je večina kliničnih primerov PD razvrščenih kot sporadičnih, pri čemer dedne oblike bolezni predstavljajo manj kot 1 % vseh primerov.89 Genetske spremembe v genih SNCA, LRRK2 in UCH-L1 so povezane z avtosomno dominantnimi oblikami PD, medtem ko so spremembe v genih PRKN, PINK1 in DJ-1 povezane z avtosomno-recesivnimi oblikami90 (tabela 1).

Dva gena, ki sta najpogosteje tarča transgenih modelov PD, sta SNCA in LRRK2.91,92 Mutacije v teh genih povzročajo družinsko PD in so bile povezane tudi s sporadično obliko PD preko GWAS.93

Poleg tega je bila vloga prekomerne ekspresije SNCA pri družinski (primeri treh/podvojitev) in občasni PD dobro ugotovljena.94

Do danes večina transgenih modelov, ki manipulirajo s SNCA, ne samo uvajajo družinske missense mutacije, temveč uporabljajo tudi strategijo prekomerne ekspresije z vstavitvijo več kopij človeškega ali mišjega gena SNCA za posnemanje povečane proizvodnje a-sinukleina (a-syn), samega ali v kombinaciji z družinska misenska mutacija.95–97

Misenčna mutacija v LRRK2 je najpogosteje prijavljena mutacija, povezana z družinsko PD,98 in več transgenih mišjih linij je bilo ustvarjenih na podlagi različnih znanih mutacij LRRK2.

Mutacija GS2019S na primer povzroči mutacijo pridobitve funkcije z okrepljeno aktivnostjo kinaze.99 Drugi modeli, kot so mutacije R1441C/G, T1348N in A2016T, poročajo o spremembah v izražanju ali agregaciji ina-syn in v nekaterih primerih nominalni motorični primanjkljaji; vendar se natančni primanjkljaji in klinične značilnosti med modeli močno razlikujejo.89,92,100

Poleg genov SNCA in LRRK2 je bilo ustvarjenih več drugih transgenih linij, v katerih so ciljni drugi geni, povezani s PD (tabela 1). Medtem ko mnogi od teh modelov uspešno spremenijo izražanje in agregacijo a-syn, večina kaže le malo ali nič nevrodegeneracije in posledično ostanejo motorične funkcije relativno neokrnjene92 (tabela 1).

Skrbna analiza a-syn agregatov, proizvedenih v mnogih od teh transgenih linij, je nadalje razkrila, da oblikovani vključki niso podobni naravno prisotnim Lewyjevim telescem (LB), opaženim v posmrtnih možganih PD, ampak namesto tega kažejo edinstveno strukturno sestavo.101

Neuspeh transgenih modelov pri reprodukciji tako molekularnih kot nevrodegenerativnih vidikov PD je verjetno posledica kombinacije več dejavnikov. Glavni med temi pomisleki je, da sta narava in obseg vpletenosti družinsko povezanih genov in bolj pogosta sporadična oblika bolezni še vedno nejasna, kar postavlja pod vprašaj ustreznost modelov, ki temeljijo na manipulaciji teh genov, za veliko večino primerov PD.

Druga omejitev je, da transgeni modeli povzročijo prekomerno izražanje transgena, ki ne posnema fizioloških ravni in tako lahko povzroči artefakte. Poleg tega sporadična oblika bolezni verjetno vključuje spremembe v več genih, pri čemer na dovzetnost dodatno vplivajo okoljske komponente, kar kaže, da imajo monogeni transgeni modeli lahko omejeno uporabnost.

Na splošno veliko istih vprašanj, ki pestijo transgenske modele AD, velja za modele PD: trenutno ni dovolj razumevanja natančne vloge genov, povezanih z družino, v etiologiji PD in obsega, v katerem prispevajo k sporadičnim oblikam bolezni.

Ta vprašanja so zelo otežila izdelavo transgenega modela PD, ki zvesto reproducira kopičenje a-syn in tvorbo LB, kar vodi do vzorca nevrodegeneracije in vedenjskih motenj, ki se ujemajo s tistimi, opaženimi v kliničnih populacijah.

Trenutni transgeni modeli povzemajo le nekatere od teh značilnosti in posledično so se izkazali za malo napovedne veljavnosti za ocenjevanje učinkovitosti potencialnih DMT. Nasprotno pa se kemično-toksinski modeli PD še vedno pogosto uporabljajo zaradi svoje sposobnosti zveste reprodukcije selektivne nevrodegeneracije DA, značilne za PD.

Kemijsko-toksinski modeli PD

V zadnjega pol stoletja je bilo za modeliranje vzorca nevrodegeneracije, opažene pri PD, uporabljenih veliko različnih strupenih spojin. Od teh so se pojavili štirje modeli kemičnih poškodb, ki se najpogosteje uporabljajo v predkliničnih raziskavah, njihovi učinki pa so bili obsežno opisani.

Ti vključujejo 6-hidroksidopamin (6-OHDA), analog kateholamina; 1-metil-4-fenil1,2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP), sintetični opioidni analog; rotenon, pesticid; in parakvat, herbicid102 (tabela 2). Drug netransgenski model PD temelji na vbrizganju predhodno oblikovanih fibril (PFF; rekombinantni monomerni a-syn proteini, pretvorjeni v fibrilarno agregatno obliko) v možgane živali, kar sproži hiperfosforilacijo endogenih a-syn proteinov in izzove LB-podobno patologijo v SN pars compacta (SNpc)87,88 (tabela 2).

Ti modeli, ki temeljijo na toksinih, lahko z različnimi stopnjami inducirajo agregacijo a-syn in selektivno nevrodegeneracijo DA nevronov v nigrostriatalni poti, kar je opazna pomanjkljivost njihovih primerkov transgenega modela.

Poti, vključene v sprožitev celične smrti, in obseg izgube nevronov DA pa se bistveno razlikujejo med modeli, ki so bili podrobno pregledani drugje.103 Na koncu je rezultat izgube celic DA pri PD ta, da motorična jedra striatuma ne morejo več vzdrževati. normalne fiziološke funkcije, kar povzroča širok spekter motenj motoričnih sposobnosti.

Vendar pa izguba nigrostriatalnih nevronov DA sama po sebi ni model PD sama po sebi, temveč posnema bolj splošen parkinsonizem, za katerega je značilen širši spekter motoričnih simptomov.104

Medtem ko nekateri modeli na osnovi toksinov, vključno s PFF, kroničnim MPTP in dajanjem rotenona, lahko inducirajo a-syn agregate in LB podobno tvorbo, se razlikujejo od značilnih vključkov LB v PD in celotne porazdelitve teh agregatov. ne odraža vzorca, opaženega pri PDbrains.102

Ti modeli imajo tudi omejeno sposobnost modeliranja progresivne narave PD in širjenja patologije v druge možganske regije, saj bolniki s PD prav tako trpijo za nevrodegeneracijo v subkortikalnih in sčasoma kortikalnih regijah v kasnejših fazah bolezni.105

Če povzamemo, modeli, ki temeljijo na izpostavljenosti toksinom, kažejo nekatere podobnosti s patologijami, opaženimi pri PD; vendar se mehanizem celične smrti, ki ga povzročijo toksini, verjetno razlikuje od mehanizma, ki je osnova izgube nevronov pri PD. leta.

Te omejitve kažejo, da modeli, ki temeljijo na izpostavljenosti toksinom in so namenjeni induciranju selektivne smrti nevronov DA v nigrostriatalni poti, predstavljajo nepopolno sliko PD in zagotavljajo razlago, zakaj prizadevanja za identifikacijo DMT v takšnih modelih v kliničnih preskušanjih niso bila učinkovita.12

Virusni vektorski modeli za PD in AD Prednosti virusnih vektorskih sistemov

Dostavni sistemi virusnih vektorjev ponujajo številne prednosti, ki jih je težko doseči z drugimi pristopi.108 Prvič, sistemi virusnih vektorjev zagotavljajo robusten nadzor nad časovnim izražanjem gena, ki nas zanima.

Drugič, staranje je primarni dejavnik tveganja za motnje spektra AD-PD in možnost dostave vektorja na kateri koli točki v življenjski dobi živali predstavlja veliko prednost za načrtovanje študije. Tretjič, virusni vektorji podpirajo lokalno transgensko dostavo in izražanje, s čimer omogočajo natančno in specifično ciljanje na možganske regije, ki vas zanimajo.

Četrtič, natančne manipulacije z odmerki je mogoče zlahka doseči z uporabo virusnih vektorjev. Petič, model, ki nas zanima, je mogoče ustvariti v več živalskih vrstah, od majhnih glodalcev do velikih nečloveških primatov.

Šestič, različne variacije genov je mogoče zlahka narediti, da dobimo fenotip, ki nas zanima. Sedmič, vsestranskost in prilagodljivost različnih vektorskih platform, ki se uporabljajo za virusno posredovan prenos genov v centralni živčni sistem, sta ogromni.

Virusni sistemi, vključno z rekombinantnimi adeno-povezanimi vektorji (UAV) in lentivirusnimi vektorji (LV), učinkovito in robustno podpirajo kratkoročno ali dolgoročno izražanje genov, tako lokalno kot globalno. Nazadnje, sistemi, ki temeljijo na virusnih vektorjih, so bistveno bolj ekonomični , tako glede truda kot glede stroškov v primerjavi z drugimi modeli bolezni.

Modela virusnih vektorjev AD in PD: AAV in LV

Pristop virusnega vektorja za modeliranje fenotipov AD in PD in vivo je uporabilo več različnih skupin z uporabo rAAV ali LV. Od njihove prve uporabe na začetku tisočletja so bili razviti in uporabljeni številni modeli na osnovi virusov za AD.

Začetni modeli AAV-tauopatije so izrabljali AAV2/2 za izražanje proteina humantau P301L v možganih miši in podgan.109,110 V teh študijah je bil vektor AAV-tau-P301L vbrizgan v bazalni prednji del možganov odraslih podgan, kar je povzročilo povečane ravni tau. vsaj 8 mesecev po transdukciji. Pomembno je, da so 3 do 4 tedne po transdukciji našli hiperfosforilirane tauand agregate, ki spominjajo na NFT.110,111

Te študije so zagotovile prvi dokaz koncepta, da lahko vbrizgavanje AAV-P301L tau povzroči trajno izražanje proteina in njegovo agregacijo pri miših in podganah.

Dosledno je vbrizgavanje AAV-divjega tipa (WT) ali trojno mutiranega APP povzročilo nastanek Ab plakov, vendar ne očitne nevrodegeneracije. Te ugotovitve so v nasprotju z zgornjimi opažanji, da sta lahko AAV-WTtau ali AAV-P301L tau povzročila znatno nevrodegeneracijo piramidnih nevronov HP.112

V novejših poskusih je bil AAV2/5 uporabljen za dostavo WT tau in kontrolnega vektorja GFP v dorzalni HP starih podgan Fischer 344.113 Oba virusa sta bila močno izražena v nevronih HP in sta povzročila aberantno aksonsko strukturo, degeneracijo aksonov in fragmentacijo tau v Aksoni HP v primerjavi s kontrolnimi aksoni, ki izražajo GFP, ki so bili videti normalni.

V drugem modelu je bil tau P301L, izražen iz promotorja človeškega sinapsina I, dostavljen z vektorjem AAV2/9 v lateralno entorinalno skorjo, kar je avtorjem omogočilo odkrivanje več oblik fosforiliranih in agregiranih variant tau pred izgubo sinaps perforantne poti in nevrodegeneracijo.114

Ti podatki podpirajo uporabnost pristopov, ki temeljijo na AAV, pri AD, zlasti pri modeliranju zgodnjih patoloških sprememb, kot sta aksonska degeneracija in degradacija. Več študij je uporabilo modele, ki temeljijo na virusih, katerih namen je bil inducirati druge patološke vidike LOAD.115,116 Na primer, AAV-BRI-Ab42 in Vektorji AAV-BRI-Ab40 so bili uporabljeni za nadzorovano izražanje in izločanje peptidov Ab pri HP glodavcev.116

Zlasti živali, ki so jim vbrizgali AAV-BRIAb42-, so pokazale, da so ti vektorji sposobni inducirati tvorbo plakov, vendar tega niso opazili pri izražanju rAAV2/1-BRIAb40.

V drugi študiji je bil AAV2/2 uporabljen za dostavo Ab40 in Ab42, C-terminalnega fragmenta APP, ki vsebuje peptide Ab (C100), in V717F mutanta C100 miši HP in cerebellumof.

Zanimivo je, da sta mutanta Ab42 in V717F pokazala večjo indukcijo mikroglioze in motenj krvno-možganske pregrade (BBB) ​​v primerjavi z oblikami Ab40, vendar nista aktivirala tvorbe plakov, indukcije astrocitov ali nevrodegeneracije. Uporaba tehnologije AAV in LV za izražanje različnih oblik Ab in njegovih prekurzorjev bo še naprej bistvena metoda za preučevanje njihove vloge pri LOAD.117

Nedavno je bil LV uporabljen za izražanje TDP-43, Ab42 ali obojega v motorični skorji podgan, kar je odkrilo, da izguba TDP-43 implicira mikroglijo kot vzrok za sinaptično degeneracijo, opaženo pri LOAD. 118

Poleg tega je lenti-TDP-43 sprožil spremembe v obdelavi APP, povezane s proizvodnjo Ab42, in inducirano aktivnostjo kaspaze in nevrovnetjem, kar so podobno opazili pri lenti-Ab42.

Kombinirana ekspresija obeh proteinov TDP-43 in Ab42 je povzročila izid, podoben kot sam TDP-43, vendar z dodano značilnostjo izgube nevronov, kar kaže na možen sinergistični učinek med obema dejavnikoma. Druga študija, ki je uporabljala LV za izražanje TDP-43 v motoričnem korteksu, je odkrila spremenjeno presnovo aminokislin, oksidativni stres in smrt nevronov.119

Ti rezultati skupaj dokazujejo uporabnost modelnih sistemov AD, ki temeljijo na LV, za pojasnitev ključnih patogenih dejavnikov, povezanih z disfunkcijo beljakovin, vpletenih v AD, medtem ko sta bila Ab in tau obsežno testirana v LOAD, kar je skladno z dolgotrajnim prepričanjem, da je Ab ključni osumljenec v patogenezi AD . Kljub temu nenehni neuspehi pri preskušanjih zdravil, namenjenih znižanju ravni amiloida, zahtevajo preusmeritev prizadevanj na druge možne krivce.

Številne nedavne študije so pokazale, da lahko APOEε4 prispeva k toksičnosti, povezani s fenotipom AD, in do danes APOE ostaja najpomembnejši in ponovljivi genetski dejavnik tveganja za AD.120

Glede na vlogo APOEε4 v patogenezi AD in potencialni zaščitni učinek izooblike ε2 so Hu in sodelavci121 ustvarili mišje modele z uporabo izooblik AAV8-APOE, ki jih poganja promotor GFAP, specifično izražen v astrocitih v vseh možganskih regijah, kar je povzročilo splošno povečanje ravni APOE v vseh mišjih možganih.

Virusno posredovana čezmerna ekspresija APOEε4 pri miših APOEε{2}}TR je povečala slabo lipidirane lipoproteinske delce APOE in zmanjšala z APOE povezan holesterol pri miših APOEε4-TR. Nasprotno pa je čezmerna ekspresija APOEε2 pri APOEε4-TR miši povečali lipidacijo APOE in s tem povezan holesterol.

Poleg tega je prekomerna ekspresija APOEε4 zvišala ravni endogenega Ab, medtem ko je prekomerna ekspresija APOEε2 težila k znižanju endogenega Ab. Na podlagi teh podatkov avtorji kažejo, da je povečanje APOEε2 pri nosilcih APOEε4 koristna strategija za zdravljenje AD, medtem ko je povečanje APOEε4 pri nosilcih APOEε4 škodljivo. V drugi študiji je bila izvedena direktna intracerebralna injekcija z uporabo AAV za izražanje APOEε2.

Študija je poročala, da je prekomerna ekspresija APOEε2 izrazito zmanjšala ravni v možganih topnih (vključno z oligomernimi) in netopnih Ab, kot tudi amiloidno obremenitev, pri dveh mišjih modelih možganske amiloidoze, pri katerih je patologija odvisna bodisi od izražanja mišjih ali človeških izooblik APOEε4.122

Zhao et al.122 so nadalje pokazali, da je mogoče doseči razširjeno zmanjšanje možganskega Ab z eno samo injekcijo virusa prek intratalamične dostave AAV, ki izraža APOEε2.

Skupaj ti podatki kažejo, da lahko dostava APOEε2 gena AAV z uporabo AAV reši škodljive učinke APOEε4 na možgansko amiloidno patologijo; tako lahko ta pristop predstavlja uspešno terapevtsko pot za zdravljenje ali preprečevanje LOAD.

For more information:1950477648nn@gmail.com