Program ledvične fibrogeneze nadzirajo mikroRNA, ki uravnavajo oksidativni metabolizem

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Vernica Miguela,*, Ricardo Ramos, Laura García-Bermejob, Diego Rodríguez-Puyolc, d

Santiago Lamesa,**

program fizioloških in patoloških procesov, Centro de Biologia Molecular "Severo Ochoa" (CSIC-UAM), 28049, Madrid, Španija

b Genomski objekt, Parque Científico de Madrid, Madrid, Španija

c Oddelek za patologijo, bolnišnica Universitario "Ramn y Cajal", IRYCIS, Madrid, Španija

d Oddelek za medicino in medicinske specialitete, raziskovalna fundacija Univerzitetne bolnišnice "Principe de Asturias," IRYCIS, Universidad de Alcala´, Alcala´ de Henares, Madrid, Španija

Ključne besede: mikroRNA, fibroza ledvic, oksidacija maščobnih kislin, zunajcelični matriks, CPT1A, mitohondriji

cistanche bodybuilding je zelo dober za delovanje ledvic

A B S T R A C T

Prekomerno kopičenje zunajceličnega matriksa (ECM) je značilnost fibrotičnih bolezni. V ledvicah je končna skupna pot prevladujočih bolezni, ki vodijo v kronično odpoved ledvic. Medtem ko imajo citokini, kot je TGF-, temeljno vlogo pri transformaciji miofibroblastov, je nedavno delo pokazalo, da sta mitohondrijska disfunkcija in okvarjena oksidacija maščobnih kislin (FAO), ki ogrožata glavni vir energije za epitelne celice ledvičnih tubulov, temeljna dejavnika. na razvoj in napredovanje fibroze ledvic. Poročali so, da mikroRNA (miRNA), ki uravnavajo izražanje genov po transkripciji, nadzorujejo ledvično fibrogenezo. Za identifikacijo miRNA, vključenih v presnovno motnjo ledvične fibroze, smo izvedli zaslon niza miRNA v mišjem modelu enostranske ureteralne obstrukcije (UUO). MiR-150-5p in miR-495-3p sta bila izbrana zaradi njune povezave s človeško patologijo, njune vloge v metabolizmu mitohondrijev in njunega ciljanja na encim CPT1A za premikanje maščobnih kislin. Ugotovili smo 2- oziroma 4-kratno povečano regulacijo miR-150-5p oziroma miR-495-5p tako v modelih UUO kot v modelih nefropatije, povzročene s folno kislino (FAN). , medtem ko je TGF- 1 povečal njihovo izražanje v človeški ledvično tubulni epitelijski celični liniji HKC-8. Te miRNA so sinergizirale s TGF- glede njegovega profibrotičnega učinka z izboljšanjem s fibrozo povezanih markerjev Acta2, Col1 1 in Fn1. Bioenergetske študije so pokazale zmanjšanje s FAO povezane stopnje porabe kisika (OCR) v celicah HKC-8 v prisotnosti obeh miRNA. Dosledno so bile ravni ekspresije njihovih z mitohondriji povezanih ciljnih genov CPT1A, PGC1 in mitohondrijskega transkripcijskega faktorja A (TFAM) zmanjšane za polovico v ledvičnih epitelijskih celicah, izpostavljenih tem miRNA. Nasprotno pa nismo zaznali sprememb v mitohondrijski masi in transmembranskem potencialu (ΔѰm) ali mitohondrijske proizvodnje anionskega radikala superoksida. Naši podatki potrjujejo, da lahko miR-150 in miR- 495 prispevata k ledvični fibrogenezi s poslabšanjem presnovne odpovedi, ki je kritično vpletena v tubularne epitelijske celice, kar na koncu vodi do fibroze.

1. Uvod

Kronična ledvična bolezen (CKD) je klinično stanje, pri katerem se ohrani zmanjšano delovanje ledvic. Na splošno velja, da je nepopravljiv in progresiven. Predstavlja pomemben javnozdravstveni problem, ki lahko prizadene 12–14 odstotkov splošne populacije [1]. Lahko je prisoten pri približno 30–40 odstotkih bolnikov z zelo razširjenimi patologijami, kot sta diabetes mellitus in hipertenzija, kjer prispeva k narekovanju razvoja in prognoze. Ne glede na etiologijo bolezni napredovanje kronične ledvične bolezni vodi do tubulno-intersticijske in glomerularne fibroze [2]. Tubulo-intersticijska fibroza vključuje širjenje prostora med tubularno bazalno membrano in peritubularnimi kapilarami z odlaganjem matričnih proteinov (ECM) (predvsem kolagena tipa I in III ter fibronektina) v povezavi z vnetnimi celicami, izgubo tubularnih celic in kopičenjem miofibroblastov. [3].

Transformacijski rastni faktor (TGF-) velja za ključni vseprisotni profibrotični citokin in glavni regulator diferenciacije miofibroblastov pri fibrozi [4]. Nedavne študije so pokazale, da ima globalna napaka v oksidaciji maščobnih kislin (FAO), ki vodi do ogrožanja glavnega vira energije za tubularne epitelne celice, pomembno vlogo pri razvoju fibroze ledvic [5, 6]. TGF- zavira FAO na način, odvisen od SMAD3- in PGC1A, s čimer vpliva na transkripcijske regulatorje privzema in oksidacije maščobnih kislin, vključno s CPT1A [5]. Spremembe v FAO končno povzročijo znotrajcelično kopičenje lipidov in izčrpavanje ATP, kar vodi v fibrozo [5,7]. Tako lahko strategije, namenjene ponovni vzpostavitvi presnovne motnje, ki deluje pri kronični ledvični bolezni, nudijo terapevtske možnosti [8].

MikroRNA (miRNA) so se izkazale kot kritični regulatorji izražanja genov s svojim delovanjem na posttranskripcijsko regulacijo. Pokazalo se je, da imajo miR v ledvicah ključno vlogo pri nefrogenezi, homeostazi in bolezni [9]. MiRNA so tudi sposobne uravnavati fibrotične procese in so jih poimenovali "fibroza" [10]. Poleg tega je bila zaradi pomanjkanja učinkovite terapije za preprečevanje ali povrnitev ledvične fibrogeneze [11] manipulacija izražanja miRNA z in vivo dostavo posnemovalcev ali zaviralcev miRNA predlagana kot obetavna terapevtska strategija za KLB [12]. Poleg tega lahko krožeče miRNA predstavljajo diagnostične in celo prognostične biomarkerje [13].

Nadzor ledvične fibroze, ki ga posreduje MiRNA, poteka predvsem z regulacijo signalizacije TGF- 1 na način, ki je odvisen od celic in konteksta, pri čemer se kot ena od glavnih tarč uporablja pot Smad [14]. V prejšnjem delu smo identificirali več miRNA, ki vplivajo na ledvično fibrozo z uravnavanjem specifičnih presnovnih poti [15,16]. Prekomerna ekspresija miR-9-5p preprečuje dediferenciacijo tubularnih epitelijskih ledvičnih celic in reprogramira s fibrozo povezano presnovno motnjo [16], medtem ko izguba delovanja miR-33, bodisi genetska ali farmakološka, ​​povzroči povečano FAO in preprečevanje kopičenja lipidov v tubularnih epitelijskih celicah. To je povezano s povečano oskrbo z energijo, izboljšano mitohondrijsko bioenergetiko in preprečevanjem eksperimentalne ledvične fibroze [15]. Tako so miRNA, ki uravnavajo celično bioenergetiko, sposobne uravnavati tudi ledvično fibrogenezo. V tej študiji smo uporabili strategijo, ki temelji na nizu miRNA, v modelu kronične poškodbe ledvic z enostransko obstrukcijo sečnice (UUO), da bi identificirali miRNA, ki so vključene v ledvični fibrotični fenotip s spremembo presnovnih poti. Z izbiro več genov, povezanih s funkcijo mitohondrijev (CPT1A, TFAM, PGC1A), smo identificirali miR-150 in miR-495 kot miRNA, ki lahko zmanjšata s FAO povezano stopnjo porabe kisika (OCR) in spodbujata TGF{ {21}}inducirano fibrogeno transformacijo v človeški ledvični tubularni epitelijski celični liniji HKC-8. Naše ugotovitve poudarjajo pomen miRNA kot mitohondrijskih presnovnih regulatorjev, ki sodelujejo pri ledvični fibrogenezi.

2. Material in metode

Celične linije in pogoji gojenja. Človeške ledvične proksimalne tubularne epitelijske celice (HKC-8) so gojili v DMEM/F12 (Dulbeccovo modificirano Eagleovo gojišče 1:1 (v/v)) (Corning, New York, NY), dopolnjeno s 15 mM HEPES, 5 odstotkov (vol/vol) fetalni goveji serum (FBS)

(HyClone Laboratories, Logan, UT), 1x insulin-transferin-selen (ITS) (Gibco, Rockville, MD), 0.5 ug/ml hidrokortizona (Sigma, St. Louis, MO), 50 enot/ mL penicilina in 50 ug/mL streptomicina (Gibco, Rockville, MD) pri 37 °C in 5 odstotkih CO2. To celično linijo je prijazno zagotovil laboratorij dr. Susztaka (Philadelphia, Pennsylvania, ZDA). Zdravljenja s humanim rekombinantnim 10 ng/ml TGF- 1 (R&D Systems, Minneapolis, MN) so izvedli po 12-urnem stradanju celic HKC-8 brez seruma.

Postopek transfekcije. Celice so bile posejane v 60 mm posodice za kulturo, da so dosegli 70-odstotno sotočje. Transfektirali so jih s 40 nM mirVana™ miRNA mimik miR-150, miR-495 ali mirVana™ miRNA mimik negativne kontrole (podjetje Ambion, ZDA) z uporabo lipofektamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA) . Celice smo inkubirali z lipofektaminom-pre-miRNA 37 °C 6 ur. Nato smo v posode s kulturo dodali 5 ml svežega medija, ki je vseboval 10 odstotkov FBS, in celice vzdrževali v kulturi 6 ur, dokler niso bile uporabljene za nadaljnje poskuse. V primeru kombinacije z zdravljenjem s TGF- 1 smo ga nanesli na celice po čezmerni ekspresiji miRNA v skladu s prejšnjim razdelkom.

Imunoblot. Celice smo sprali v PBS, homogenizirali in lizirali v 100 μL liznega pufra RIPA, ki je vseboval 150 mM NaCl, 0,1 odstotka SDS, 1 odstotek natrijevega deoksiholata, 1 odstotek NP-40 in 25 mM Tris– HCl pH 7,6, v prisotnosti proteaze (Complete, Roche Diagnostics, Mannheim, Nemčija) in inhibitorjev fosfataze (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) in pobrano s strganjem. Četrtino vsakega vzorca ledvice (dobljenega po razrezu na polovico vzdolžno in prečno) smo homogenizirali v 300 ul pufru RIPA s 5 mm kroglicami iz nerjavečega jekla (Qiagen, Valencia, CA) z uporabo TissueLyser LT (Qiagen, Valencia, CA) z vibriranjem pri 50 Hz 15 minut pri 4 ◦ C. Vzorce smo zbistrili s centrifugiranjem pri 10,000 g 15 minut pri 4 ◦ C. Peleto smo nato zavrgli, supernatant pa ohranili kot proteinski lizat. Koncentracije beljakovin so bile določene s kompletom BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, Rockford, IL) in izmerjene v Glomax®-Multi Detection System (Promega, Madison, WI). Enake količine beljakovin (10–50 ug) iz celotnega ekstrakta smo ločili na 8–10 odstotnem SDS-poliakrilamidnem gelu in prenesli na nitrocelulozne blotne membrane (GE Healthcare, Chicago, IL) pri 12 V 20 minut v polsuhi posodi. Sistem Trans-Blot Turbo (Bio-Rad, Hercules, Kalifornija).

Membrane so bile blokirane z inkubacijo za 1 uro s 5 odstotki nemastnega mleka v PBS, ki je vseboval 0.5 odstotkov Tween-20, in čez noč popivnane s specifičnimi protitelesi: CPT1A (Ab128568, Abcam; 1:1{ {26}}; 4 ◦ C čez noč), -SMA (sc-32251, Santa Cruz Biotechnology; 1:1000; 4 ◦ C čez noč), GAPDH (MAB374, Millipore; 1:15000; 1 h, sobna temperatura ). Po inkubaciji s sekundarnimi protitelesi IRDye 800 kozjih proti zajcem in IRDye 600 kozjih protimišjih (1:15.000, LI-COR Biosciences, Lincoln, NE) so bile membrane slikane v treh izvodih z Odyssey Infrared Imaging System (LI-COR Biosciences, Lincoln, NE). Pasovno denzitometrijo smo izvedli s programsko opremo ImageJ 1.48 (//rsb.info.nih.gov/ij) in relativno izražanje beljakovin smo določili z normalizacijo na GAPDH. Spremembe krat so bile normalizirane na vrednosti kontrolnega stanja.

Ekstrakcija RNA. Celotno RNK smo ekstrahirali iz celic HKC-8 ali mišjih ledvic z uporabo miRNeasy Mini Kit (Qiagen, Valencia, CA) v skladu z navodili proizvajalca. Količino in kakovost RNA smo določili pri 260 nm s spektrofotometrom Nanodrop-1000 (Thermo Scientific, Rockford, IL).

Analiza ekspresije mRNA. Reverzno transkripcijo (RT) smo izvedli s 500 ng celotne RNA z uporabo kompleta iScript™ cDNA Synthesis (Bio-Rad, Hercules, CA). qRT–PCR je bil izveden z iQ™SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) z uporabo 96-well Bio-Rad CFX96 RT-PCR sistema s C1000 Thermal Cycler (Bio-Rad, Hercules, CA) v skladu z navodili proizvajalca. Vrednost Ct je bila pridobljena iz vsake pomnoževalne krivulje z uporabo programske opreme za analizo CFX96, ki jo je zagotovil proizvajalec. Relativno izražanje mRNA je bilo določeno z uporabo metode 2 − ΔΔCt [17]. Gen 18S je bil uporabljen za namene normalizacije. Sekvence primerjev, uporabljene za kvantifikacijo mRNA, so bile: CPT1A (FW: TGCTTTACAGGCGCAAACTG, RV: TGGAATCGTGGA TCCCAAA), ACTA (FW: TTCAATGTCCCAGCCATGTA, RV: GAAGGAA- TAGCCACGCTCAG), COL1A1 (FW: CGGACGACCTGGTGAGAGA, RV: CATTGTGTCCCAGCTAAT1GCCFTTG), GGGGAATG, RV: CCAATGCCACGGCCATAGCAGTAGC), PGC1A (FW: TGCCCTGGATTGTTGACATGA, RV: TTTGTCAGGCTGGGGGTAGG), TF AM (FW: CATCTGTCTTGGCAAGTTGTCC, RV: CCACTCCGCCCTA- TAAGCATC), 18S (FW: AGCTATCAGGACTTCGTCAATT: ACCTATCAGGACTTCGTCAATT). Spremembe krat so bile normalizirane na vrednosti kontrolnega stanja.

Kvantifikacija izražanja miRNA. Kvantifikacija ekspresije miRNAs je bila izvedena z uporabo miRCURY Locked Nucleic Acid (LNA) miRCURY LNA RT Kit (Exiqon, Feedback, Danska). Po RT je bila šablona cDNA pomnožena s primerji LNA, specifičnimi za mikroRNA, za zrel miR150-5p ali miR-495-3p (Exiqon, Feedback, Danska). qRT–PCR smo izvedli v 96-jamici Bio-Rad CFX96 Real-Time PCR System s C1000 Thermal Cycler z uporabo iQ™ SYBR Green Supermix (Bio-Rad, Hercules, CA) v skladu z navodili proizvajalca . Vrednost Ct za trojne vdolbinice smo pridobili iz vsake pomnoževalne krivulje z uporabo programske opreme CFX Manager Bio-Rad (Bio-Rad, Hercules, CA). Vrednosti Ct so bile normalizirane na endogeno kontrolno 5S rRNA. Ravni miRNA v plazmi so bile normalizirane na miR-103a-5p. Relativna ekspresija miRNA je bila določena z uporabo metode 2 − ΔΔCt [17]. Spremembe krat so bile normalizirane na vrednosti kontrolnega stanja.

Mišji modeli fibroze ledvic. Miši so bile nameščene v objektu za živali brez specifičnih patogenov (SPF) pri CBMSO v skladu s predpisi EU za vse postopke. Z živalmi so ravnali v skladu z navodili za oskrbo in uporabo laboratorijskih živali iz Direktive 2010/63/EU Evropskega parlamenta. Odobritev je izdal lokalni odbor za etično presojo Centro de Biologia Molecular "Severo Ochoa" v Madridu, odbor za etiko pri CSIC in regulativna enota za poskusne postopke na živalih iz Comunidad de Madrid.

Enostranska obstrukcija sečnice (UUO): Kirurški postopek UUO je bil izveden, kot je opisano prej [18]. Na kratko, miši smo anestezirali z izofluranom (3–5 odstotkov za indukcijo in 1–3 odstotke za vzdrževanje) in jih razdelili v dve poskusni skupini: skupino UUO in skupino lažne operacije. V skupini UUO so miši obrili levo stran trebuha, skozi kožo naredili navpični rez s skalpelom in kožo umaknili. Drugi rez je bil narejen skozi peritoneum, da bi razkrili ledvico. Levi sečevod smo dvakrat podvezali 15 mm pod ledvičnim pelvisom s kirurško svilo in nato prerezali sečevod med obema ligaturama. Nato smo podvezano ledvico nežno namestili nazaj v pravilen anatomski položaj in dodali sterilno fiziološko raztopino, da bi nadomestili izgubo tekočine. Zareze so zašili in miši posamezno postavili v kletke. Navidezna operacija je bila izvedena na podoben način, vendar brez ligacije sečnice. Buprenorfin je bil uporabljen kot analgetik. Prvi odmerek je bil apliciran 30 min pred operacijo in nato vsakih 12 ur 72 ur, v odmerku 0,05 mg/kg subkutano. V tem modelu se ledvični pretok krvi in ​​stopnja glomerulne filtracije znatno zmanjšata v 24 urah, intersticijsko vnetje (vrh po 2–3 dneh), tubularna dilatacija, tubularna atrofija in fibroza pa so očitni po 7 dneh. Zamašena ledvica doseže največjo disfunkcijo približno 2 tedna po posegu. Miši so bile žrtvovane s prevelikim odmerkom CO2 in kontrolnimi in obstrukiranimi ledvicami in vzorci krvi so bili pobrani po perfuziji s PBS 3, 5, 7, 10 in 15 dni po UUO.

Nefropatija, povzročena s folno kislino (FAN): V tem modelu je bila fibroza ledvic povzročena z intraperitonealno (ip) injekcijo 250 mg folne kisline (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) na kg telesne mase, raztopljene v 0.3 M natrijev bikarbonat (nosilec), kot je opisano prej [19]. Kontrolne živali so prejele 0,3 ml nosilca (ip). Miši so bile žrtvovane s prevelikim odmerkom CO2, ledvice in vzorci krvi pa so bili pobrani po perfuziji s PBS po 15 dneh dajanja FA.

profiliranje mikroRNA. Za identifikacijo specifičnih miRNA, ki uravnavajo fibrotični izid, je bil kot platforma za profiliranje mikroRNA izbran niz mikroRNA miRCURY LNA (Exiqon, Feedback, Danska). To platformo je sestavljalo skupno 175 edinstvenih testov, specifičnih za mišje miRNA, prisotne v Sanger miRBase v22.1 (http://microrn a.sanger.ac. Združeno kraljestvo). Za vsako mikroRNA je bila za analizo izbrana prevladujoča veriga. Izbor MiR je temeljil na predvidenih ciljnih genih, povezanih z ledvično fibrozo, mitohondrijsko presnovo, redoks procesi in cirkadianim ritmom. Ta analiza je bila opravljena z bioinformatičnimi orodji za napovedovanje cilja miRNA na podlagi zaporedja, microcosm [20] (www.Ebi.ac. UK/Enright-SRV/microcosm), Targetscan 4.1 [21] (www.targetscan.org /vert{ {9}}/) Pictar I [22] (www.pictar.mdc-berlin.de), miRWalk [23] (www.mirwalk.umm.uni-heidelberg.de/) in miRanda [24] (www.mic rorna.org/microrna/). Po ekstrakciji RNA iz 7-dnevnih vzorcev ledvic UUO smo frakcijo miRNA, ki je prisotna v 20 ng celotne RNA, podvrgli reverzni transkripciji z uporabo kompleta miRCURY LNA RT (Exiqon, Feedback, Danska) v skladu z navodili proizvajalca. Nastale cDNA so bile analizirane s ploščami miRCURY miRNA PCR v sistemu Roche LightCycler 480 Real-Time PCR z uporabo miRCURY LNA SYBR Green PCR Master Mix (Exiqon, Feedback, Danska). Vsak vzorec je bil analiziran v dvojniku. Ta postopek je bil izveden v Genomics Facility Fundacion Parque Científico de Madrid (Madrid, Španija). Programska oprema LC480 je bila uporabljena za pridobitev vrednosti Cq (Cq) za vsako miRNA. Vrednost delta Ct (ΔCt) je bila izračunana z normalizacijo vrednosti Ct na endogeno gospodinjsko snRNAU6. Toplotni zemljevid je bil ustvarjen s podatki PCR v realnem času, predstavljenimi kot ΔCt. Hierarhično združevanje je bilo zgrajeno glede na vrednosti ΔCt. Vrednost delta Ct (ΔΔCt) je bila izračunana z odštevanjem ΔCt referenčne vzorčne skupine (kontrolna ledvica) od ΔCt vsakega vzorca obstrukirane ledvice. Relativna kvantifikacija (RQ) ali kratna sprememba vsake miRNA je bila ustvarjena z uporabo metode 2 − ΔΔCt [17]. Diferencialno izražene miRNA so bile identificirane s parametričnim testom Limma. Da bi upoštevali preizkušanje več hipotez, so bile P-vrednosti prilagojene (prilagojene) s popravkom Benjamini–Hochbergove stopnje napačnih odkritij (FDR) [25]. Rezultati so bili grafično prikazani v grafu vulkana.

analiza miRNA v krvni plazmi bolnikov s kronično ledvično boleznijo. Ravni izbranih miRNA so analizirali v vzorcih plazme iz skupine 100 bolnikov s kronično ledvično boleznijo, kar je podrobno opisano spodaj. Periferno vensko kri smo zbrali v vakuumskih posodah, prevlečenih z EDTA (BD, Franklin Lakes, NJ). Za pridobitev plazme smo kri centrifugirali pri 400 g 20 minut, supernatant prenesli v novo epruveto in centrifugirali pri 800 g 20 minut. Plazma je bila zbrana in shranjena zamrznjena v alikvotih pri – 80 ◦ C. MiRNA plazme je bila ekstrahirana iz krvi z uporabo miRCURYTM RNA Isolation Kit—Biofluids in UniSp2 Spike-in RNA (Exiqon, Vedbaeck, Danska). Analize ravni miR-150 v teh vzorcih so bile izvedene, kot je opisano v razdelku kvantifikacije postopka izražanja miRNA. Meritve stopnje porabe kisika. Z oksidacijo maščobnih kislin povezana stopnja porabe kisika (OCR) (povezana z oksidativno fosforilacijo) in zunajcelična stopnja zakisljevanja (ECAR) (povezana s proizvodnjo laktata in glikolizo) so proučevali z uporabo metaboličnega analizatorja Seahorse Bioscience v skladu z navodili proizvajalca [26]. Celice HKC-8 smo zasejali v ploščo p60 in izvedli transfekcijo mikroRNA, kot je opisano zgoraj, ko so 48 ur kasneje dosegle konfluenco 70 odstotkov, celice HKC-8 smo obdelali z 10 ng/ml TGF{{ 18}} 48 ur. Nato smo celice zasejali pri 2 × 104 celic na vdolbino v mikroploščo celične kulture Seahorse Bioscience XFe24 (Seahorse Bioscience, North Billerica, MA). Po oprijemu celic smo rastni medij nadomestili z medijem, omejenim na substrat, Dulbeccovim modificiranim medijem Eagle (DMEM), dopolnjenim z 0,5 mM glukoze in 1 mM glutamata. Eno uro pred testnim merjenjem smo celice inkubirali s testnim medijem Krebs-Henseleit Buffer (KHB), dopolnjenim z 0,2 odstotka karnitina pri 37 ◦ C brez CO2. Petnajst minut pred testom smo v ustrezne vdolbinice dodali zaviralec CPT1 Etomoxir (Eto) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 400 μM in celice inkubirali pri 37 ◦ C brez CO2. Nazadnje, tik pred testom, je bil dodan BSA ali 200 μM palmitat-BSA FAO substrat (Agilent Technology, Santa Clara, CA, ZDA). Takoj je bil izveden XF Cell Mito Stress Test v energetskem analizatorju Seahorse XFe24 z zaporednim dodajanjem več modulatorjev mitohondrijske funkcije. Najprej smo po bazalni meritvi uporabili inhibitor sintaze ATP oligomicin (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (1 μM). To zmanjša pretok elektronov skozi ETC, kar ima za posledico zmanjšanje dihanja mitohondrijev. Nato je bilo dodano sredstvo za odklop cianid 4-(trifluorometoksi) fenilhidrazon (FCCP) (SigmaAldrich, St. Louis, MO) (3 μM), ki zruši protonski gradient in moti potencial mitohondrijske membrane. Posledično je pretok elektronov skozi ETC neoviran in poraba kisika s kompleksom IV doseže največjo vrednost. Tretja in zadnja injekcija je mešanica zaviralcev kompleksa III in I antimicin/rotenon (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) (1 μM). Ta kombinacija zaustavi mitohondrijsko dihanje in omogoči izračun nemitohondrijskega dihanja, ki ga poganjajo procesi zunaj mitohondrijev. Substrati/inhibitorji so bili pripravljeni v istem mediju, v katerem je bil izveden poskus, in so bili samodejno vbrizgani iz odprtin za reagent ob navedenih časih. Meritve so bile zabeležene za 3-min časovna obdobja (v skupnem obdobju 2 h) in vrednosti so bile normalizirane za skupno vsebnost beljakovin. Protein je bil ekstrahiran iz vdolbinic z 0,1-odstotno raztopino NP-40-PBS in kvantificiran s testom beljakovin BCA (Thermo Scientific, Rockford, IL). Za vsako eksperimentalno skupino so bile uporabljene štiri vdolbinice. Mito stresni test celic XFp morskega konjička je bil uporabljen za določitev ključnih parametrov mitohondrijske funkcije: bazalno mitohondrijsko dihanje, dihanje, povezano z ATP, uhajanje protona (poraba kisika, ki ni povezana z -- ATP), maksimalno dihanje, nemitohondrijsko dihanje , in rezervno dihalno kapaciteto, kot je opisano prej [27].

Analiza luciferaze. Za karakterizacijo kandidatnih vezavnih mest za miRNA-150 in miRNA-495 v človeški CPT1A 3'-UTR, luciferazni reporterski test, ki vsebuje CPT1A 3'-UTR (SwitchGear Genomics, Carlsbad, CA, Product ID S814347). Na mesto usmerjene mutacije v semenskih regijah predvidenih mest miR-150 in miR-495 znotraj 3′ - UTR so bile ustvarjene z uporabo kompleta za usmerjeno mutagenezo Multisite-QuikChange (Stratagene, La Jolla, CA) v skladu z protokolu proizvajalca. The primer sequences used were for miR-495 PM1 (FW:GCATCATCCAAGCAGGGTAAACTTTTGTTCTAGAAAAA- GAAAAATGTGTTATTCATTGGTGTCCC, RV: GGGACACCAACTTGAA- TAACACATTTTTCTTTTTCTAGAA- CAAAAGTTTACCCTGCTTGGATGATGC) and PM3 (FW: TGTCTTAACGCAGCCATGGTTTGAATCTA- GAATCTTGGGCTGACCGGTGC, RV: GCACCGGTCAGCCCAAGATTCTA- GATTCAAACCATGGCTGCGTTAAGACA) and for miR{{24} } PM2 (FW: CTCATGCGTGTAATCCCAGCACTTCTAGAGGCCAAGGCGGGCGG, RV: CCGCCCGCCTTGGCCTCTAGAAGTGCTGGGATTACACGCATGAG), vsi konstrukti so bili pred uporabo sekvencirani, da se potrdi njihova pravilna struktura. Celice HKC-8 so bile posejane v ap24-ploščo z jamicami in so bile začasno sotransfektirane z 200 ng pLightSwitch_CPT1A_3′-UTR (intaktne ali mutirane konstrukcije) in 4 ng pGL3-promotor (luciferaza kresničke pod nadzorom promotorja SV40) (Promega Corporation, Madison, WI, ZDA) reporterski plazmidi in 40 nM miRNA mirVana™, ki posnema miR-150, miR -495 ali mirVana™ miRNA negativna kontrola (podjetje Ambion, ZDA) z uporabo lipofektamina 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA), ko so dosegli 70-odstotno sotočje, kot je opisano zgoraj. Za vsako eksperimentalno skupino so bile uporabljene štiri vdolbinice. Testi luciferaze so bili izvedeni 24 ur kasneje z uporabo reporterskega sistema Dual-Luciferase (Promega, Madison, WI). Signale luciferaze vanilije in kresničke smo zaznali z uporabo sistema za več detekcij Glomax (Promega Corporation, Madison, WI, ZDA). Aktivnost renilla luciferaze je bila normalizirana z aktivnostjo luciferaze kresničke.

Mitohondrijski membranski potencial (MMP). Spremembe v MMP so bile določene kot razlike v fluorescenci tetrametilrodamin metil estra (TMRM) (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA). Akumulira se v negativno nabitih polariziranih mitohondrijih in oranžno fluorescira. Ko se potencial mitohondrijske membrane zruši v apoptotičnih ali presnovno stresnih celicah, se reagent TMRM razprši po celičnem citosolu in nivoji fluorescence dramatično padejo. Celice HKC-8 so bile kultivirane in transfektirane, kot je opisano v razdelkih o celični kulturi in postopku transfekcije. Nato smo rastni medij nadomestili s Hankovo ​​uravnoteženo solno raztopino (HBSS) brez fenol rdeče barve z 10 mM Hepes. Zdravljenja z oligomicinom (5 µM) in FCCP (4 µM) 5 minut so uporabili kot pozitivne in negativne kontrolne pogoje. Nato smo celice obarvali z 250 nM TMRM 30 minut pri 37 ◦ C. Celice smo pobrali s tripsinom, centrifugirali (3000 rpm, 5 min) in pelet resuspendirali v 200 μL HBSS z 1 odstotkom Goveji serumski albumin (BSA) in 5 mM etilendiamintetraocetna kislina (EDTA). Intenzivnost fluorescence je bila izmerjena s pretočno citometrijo z uporabo emisijske valovne dolžine 570 nm za TMRM (FL2) [28] v sistemu BD FacsCantoTM II (BD Bioscience, San Jos, CA) in analizirana s programsko opremo FlowJo 10.2 (FlowJo, LLC, Ashland). , ALI). Za vsak poskusni pogoj je bilo analiziranih vsaj 20.000 enojnih vzorcev v treh izvodih.

Proizvodnja mitohondrijskega anionskega radikala superoksida. Vrednotenje proizvodnje aniona superoksidnega radikala je bilo izvedeno z uporabo mitohondrijskega anionskega indikatorja superoksidnega radikala MitoSOX™ Red (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA), visoko selektivnega fluorogenega barvila za anion mitohondrijskega superoksidnega radikala v živih celicah, glede na proizvajalčevo navodila. Celice HKC-8 smo gojili in transfektirali, kot je opisano v razdelkih o celični kulturi in postopku transfekcije. Nato smo rastni medij nadomestili s Hankovo ​​uravnoteženo solno raztopino (HBSS) brez fenol rdeče barve z 10 mM Hepes. Zdravljenje z antimicinom A (150 μM) in karbonil cianidom m-klorofenilhidrazonom (CCCP) (50 μM) za 5 minut smo uporabili kot pozitivne in negativne kontrolne pogoje. Nato smo celice obarvali s 5 μM MitoSOX™ Red 30 minut pri 37 ◦ C. Celice smo pobrali, kot je opisano v razdelku o potencialu mitohondrijske membrane. Intenzivnost fluorescence je bila izmerjena s pretočno citometrijo z uporabo valovne dolžine emisije 580 nm za MitoSOX™ Red (FL2) v sistemu BD FacsCantoTM II (BD Bioscience, San Jos, CA) in analizirana s programsko opremo FlowJo 10.2 (FlowJo, LLC, Ashland, ALI). Za vsak eksperimentalni pogoj je bilo v trojnikih analiziranih vsaj 20 000 singlov.

Označevanje mitohondrijev. Vrednotenje vsebnosti mitohondrijev je bilo izvedeno z uporabo MitoTracker™ green FM (Invitrogen, Carlsbad, CA, ZDA), ki pasivno difundira skozi plazemsko membrano in se kopiči v aktivnih mitohondrijih ne glede na potencial mitohondrijske membrane, po navodilih proizvajalca. Celice HKC-8 smo gojili in transfektirali, kot je opisano v razdelkih o celični kulturi in postopku transfekcije. Nato smo rastni medij nadomestili s Hankovo ​​uravnoteženo solno raztopino (HBSS) brez fenol rdeče barve z 10 mM Hepes. Celice smo obarvali s 150 nM z MitoTracker™ green FM 30 minut pri 37 ◦ C. Za analizo s pretočno citometrijo smo celice pobrali, kot je opisano v razdelku o potencialu mitohondrijske membrane. Intenzivnost fluorescence je bila izmerjena z emisijsko valovno dolžino 516 nm za MitoTracker™ green FM (FL1) v sistemu BD FacsCantoTM II (BD Bioscience, San Jos, CA) in analizirana s programsko opremo FlowJo 10.2 (FlowJo, LLC , Ashland, OR). Za vsak eksperimentalni pogoj je bilo v trojnikih analiziranih vsaj 20 000 singlov. Za fluorescenčno slikanje so bila jedra tudi obarvana z DAPI (Sigma, St. Louis, MO) 5 minut pri sobni temperaturi. Žive celice smo vizualizirali z invertnim konfokalnim mikroskopom Zeiss LSM 710 z opazovano celico, objektivom 63X/1,2 Water C-Apochromat Corr UV-VIS-IR M27 in analizirali s programsko opremo Zeiss Zen2010B sp1 (Zeiss, Oberkochen, Nemčija) .

Določanje števila mitohondrijskih kopij. Genomsko DNK smo ekstrahirali iz celic HKC-8 z uporabo DNeasy Blood & Tissue Kit (Qiagen, Valencia, CA) v skladu z navodili proizvajalca. Številčnost mitohondrijev je bila določena s kompletom za analizo števila kopij človeške mitohondrijske DNA (Detroit R&D, Detroit, MI). Relativno število kopij mtDNA je bilo predstavljeno kot razmerje med mtDNA in jedrno DNA.

Vzorci bolnikov s kronično ledvično boleznijo pri ljudeh. Za analizo ravni miRNA v plazmi je bila izbrana skupina 100 bolnikov s kronično ledvično boleznijo (stopnja 3–4) iz bolnišnice Principe de Asturias. Vključevala je dve različni podskupini, razvrščeni glede na razvoj njihove ledvične funkcije na podlagi kazalnika GFR MDRD [29] v obdobju 24 mesecev: 50 bolnikov je imelo manj kot 10 odstotkovledvicaposlabšanje delovanja ledvic, medtem ko je pri drugih prišlo do vsaj 40-odstotnega zmanjšanja delovanja ledvic ali so začeliledvičnanadomestno zdravljenje (dializa). Kvantificirali smo tudi stopnjo fibroze priledvicabiopsije iz druge skupine 26 bolnikov z disfunkcijo presadkaledvicapresaditev iz bolnišnice Ramn y Cajal. Vse biopsije so bile ocenjene v skladu z merili Banff 2007 [30].

Statistična analiza. Podatki so bili analizirani z uporabo neparametričnih testov, razen kjer je navedeno. Razliko med dvema neodvisnima skupinama smo preverjali z Mann-Whitneyjevim testom, medtem ko smo več kot dve skupini primerjali s Kruskall-Wallisovim testom. P-vrednost 0.05 ali manj je veljala za statistično pomembno (*/#: P < 0.05,="" **/##:="" p="">< 0.01,="" ***/###:="" p="">< 0,001).="" podatki="" so="" bili="" analizirani="" z="" uporabo="" graphpad="" prism="" 6.0="" (graphpad="" software,="" la="" jolla,="" ca).="" podatki="" so="" navedeni="" kot="" povprečje="" ±="" standardna="" napaka="" povprečja="">

3. Rezultati

Podatki o ekspresiji miRNA pri fibrozi, ki jo povzroči UUOledvice. Za dešifriranje prispevka miRNA k presnovni regulacijiledvičnafibrogeneze je bil 7-dnevni model UUO izveden pri miših WT. RNA je bila izolirana iz kontrole in fibrozeledvicavzorcev in profil izražanja miRNA smo analizirali v prilagojenem nizu mikroRNA. Izbira miRNA je temeljila na njihovem potencialnem ciljanju na ključne encime, ki sodelujejo pri metabolizmu mitohondrijev, redoks procesih in cirkadianem ritmu po analizi "in silico" (več podrobnosti v razdelku Metode). Toplotni zemljevid je pri primerjavi fibrotičnih in kontrolnih razkril jasno različne vzorce izražanja v nekaterih miRNAledvicavzorcev (slika 1A). Analiza ploskve vulkana je pokazala, da je bilo 73 od 175 miRNA različno izraženih, 17 reguliranih navzgor in 56 navzdol, v vzorcih fibrotičnih ledvic v primerjavi s kontrolnimi (slika 1B, dodatna tabela 1). Med njimi so bile izbrane specifične miRNA, ki bi lahko uravnavale fibrotični izid v ledvicah prek presnovnih poti. V ta namen je bila izvedena in silico analiza 3′UTR (neprevedene regije) specifičnih genov, ki sodelujejo pri presnovnih in mitohondrijskih funkcijah, CPT1A, TFAM, PGC1A s tremi neodvisnimi orodji za napovedovanje (Targetscan, miRWalk in miRanda). Izbirna merila so vključevala tudi stopnjo ledvične ekspresije, novost tarč, stopnjo poznavanja presnovne poti in biološki pomen. Povezava s človeško patologijo, stopnjo izražanja ledvičnega tkiva, njihovo vlogo pri metabolizmu mitohondrijev in njihovo potencialno ciljanje na encim CPT1A za premikanje maščobnih kislin nas je spodbudila, da smo se osredotočili na tri miRNA, miR-150-5p, miR-495-3p in miR-33-5p, kot kandidate, ki so sposobni uravnavati presnovne spremembe, povezane z ledvično fibrogenezo (slika 1C). Opozoriti je treba, da CPT1A 3′-UTR vsebuje eno semensko mesto za miR-150 in dve semenski mesti za miR-495. Opazili smo, da sta miR-150 in miR-495 zmanjšala aktivnost reporterskega testa luciferaze, ki je vseboval CPT1A 3′-UTR, za ~15 odstotkov oziroma 25 odstotkov. Ta znižana regulacija je bila popolnoma razveljavljena v primeru točkovnih mutacij (PM) v 3′-UTR CPT1A za miR-150 vezavno mesto (PM2) in delno odsotna na obeh miR-495 vezavnih mestih (PM1 in PM3) (dopolnilni sliki 1A in B). Ti podatki kažejo na neposredno interakcijo CPT1A z miR-150 in miR-495. MiR-33-5p je bil predmet ločene študije [15]. MiR-150-5p in miR-495-3p sta bila povečana v vzorcih fibrotičnih ledvic v primerjavi s kontrolnimi, s kratno spremembo 3,69 (P-vrednost: 0.012 ) in 1,95 (P-vrednost: 0,012).

MiR-150 in miR-495 povečata TGF-profibrotični odziv pri človekuledvičnatubularne epitelijske celice. Izvedena je bila kvantitativna reverzna transkripcija–verižna reakcija s polimerazo (qRT–PCR), da se potrdi sprememba izražanja miR-150-5p in miR-495-3p, ki je bila ugotovljena s profiliranjem izražanja miRNA v UUOledvicavzorcev (sl. 2A in B). Poleg tega je bila s qRT-PCR analizirana kinetika izražanja miR-150-5p in miR- 495-3p v ledvicah 3, 5, 7, 10 in 15 dni po postopku UUO. Izražanje teh miRNA se je znatno povečalo za 2--krat 5 dni po UUO in je ostalo povišano 15 dni po UUO (sl. 2C in D). Raven izražanja teh miRNA je bila ovrednotena tudi v modelu nefropatije folne kisline (FAN). Ugotovili smo 4- oziroma 2-kratno povečano regulacijo miR-495-3p oziroma miR-150-5p pri fibrotičnihledvicavzorci iz modela FAN (slika 2E). TGF- 1, eden od glavnih regulatorjev fibrogeneze, je prav tako induciral ekspresijo miR-150 in miR-495 v celicah HKC-8 več kot 2-krat in {{ 6}}krat po 48 urah, kar podpira potencialno vlogo teh miRNA v dogodkih, povezanih s signalizacijo TGF (sliki 3A in B). Da bi ocenili, ali sta miR-150 in miR-495 vključena v profibrotično transformacijo tubularnih epitelijskih celic s TGF- 1, je bila človeška celična linija HKC-8 transficirana z miR -150-5p ali miR-495-3p in zdravljeni s TGF- 1 različne čase. Zvišanje ravni miR-150-5p in miR-495-3p je znatno povečalo ekspresijo ravni mRNA, ki jo povzroči TGF- 1-, markerjev Acta2, Col1 1 in Fn1, povezanih s fibrozo ( sl. 3C in D). Podobno je prekomerna ekspresija miR-150-5p ali miR-495-3p močno zmanjšala CPT1A in povečala številčnost beljakovin -SMA (sliki 3E in F). Ti podatki kažejo, da lahko te miRNA sodelujejo pri patogeneziledvičnafibrozo s spodbujanjem od TGF- 1-odvisne epitelijske dediferenciacije tubularnih celic, kot tudi z ogrožanjem izražanja kritičnega encima, vključenega v FAO.

MiR-150 in miR-495 inducirata mitohondrijske bioenergetske spremembe in zmanjšata izražanje genov, ki sodelujejo pri ključni funkciji mitohondrijev. Da bi dobili vpogled v presnovne posledice, ki jih povzroča dajanje miR-150-5p ali miR-495-3p, smo proučevali bioenergetski profil človekaledvičnatubularne epitelijske celice.

Slika 1. Podatki o izražanju miRNA pri fibrozi, povzročeni z UUO. (A) Toplotni zemljevid, ki prikazuje relativno ekspresijo miRNA kontralateralne in oviraneledvicemiši C57/BL6-J, izpostavljenih postopku UUO 7 dni (n=6). Vrstica lestvice sega od zelene do rdeče (visok do nizek izraz), številke pa predstavljajo vrednosti ΔCt. Na levi strani so označene miRNA, izbrane za študijo. (B) Analiza vulkanske ploskve UUO-moduliranih miRNA. Log10 relativna kvantifikacija (RQ) in negativne ( − ) log10 prilagojene (adj.) P-vrednosti so narisane na osi x oziroma y. Vsaka miRNA je predstavljena s piko. 73 od 175 miRNA je pokazalo spremenjeno izražanje v fibrotičnih vzorcih (prilag. P-vrednost večja ali enaka 0,05). Izbrane miRNA za nadaljnjo analizo so označene. (C) miR-150-5p in miR-495-3p sta bila izbrana na podlagi njune moči za in silico ciljanje genov CPT1A, TFAM in PGC1A. Za vsako izbrano mikroRNA so navedena ohranjena ciljna mesta semena v 3'UTR teh genov, njihova sprememba gube in pomen (prilag. P-vrednost).

Sl. 2. Stopnje izražanja miR-150-5p in miR-495-5p vledviceod modelov UUO in FAN. (A, B) qRT-PCR analiza izražanja miR-150-5p (A) in miR-495- 3p (B) vledviceiz miši 7 dni po UUO v vzorcih, predhodno analiziranih z nizom mikroRNA. (C–E) qRT-PCR analiza ekspresije miR-150-5p in miR-495-3p po modelu FAN (C) ter 3, 5, 7, 10 in 15 dni po UUO za miR-150-5p (D) in miR{{10}}p (E). Stolčni grafikoni predstavljajo povprečje stopenj izražanja spremembe krat ± sem pri 6 (A, B, E) in 3 (C in D) miših na skupino. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0,001="" v="" primerjavi="" z="" njihovimi="" ustreznimi="" kontrolnimi="" pogoji;="" #p="">< 0,05,="" ##p="">< 0,01="" v="" primerjavi="" s="">ledviceiz miši z enakim poskusnim zdravljenjem.

TGF- 1 je bil uporabljen kot modelni citokin, vključen v spremembe, povezane s profibrozo. Za določitev bioenergetskega statusa teh celic so med zaporednim zdravljenjem s spojinami, ki modulirajo aktivnost mitohondrijev v prisotnosti palmitata, izmerili stopnjo porabe kisika (OCR) in zunajcelično stopnjo zakisanosti (ECAR) celic HKC-8, povezano s FAO. , z uporabo analizatorja zunajceličnega toka Seahorse XF24 (več podrobnosti v razdelku Metode). Po 48 urah s TGF- 1 so celice HKC-8 v prisotnosti miR-150-5p pokazale dosledno zmanjšanje bazalnega, OCR, povezanega z nastajanjem ATP, z ATP povezanim dihanjem in maksimalnim dihanjem, kar se nanaša na OCR, občutljiv na FCCP (slika 4A). Okvara v OXPHOS se je odražala v zmanjšanju vsebnosti ATP v celicah HKC-8, ki prekomerno izražajo miR-150-5p (slika 4C). Nismo opazili, da bi te miRNA povzročile variacije v ECAR (podatki niso prikazani). V skladu s tem so stopnje izražanja mRNA njihovih mitohondrijskih

sorodni ciljni geni CPT1A, PGC1 in mitohondrijski transkripcijski faktor A (TFAM), so bili zmanjšani za polovico v celicah, zdravljenih z miR-150 posnemalcem, v primerjavi z miRNA mimičnimi NC-tretiranimi celicami (slika 4E). Študije z enakim eksperimentalnim pristopom z miR-495-3p so dale podobne rezultate (sl. 4B, D, F). Vendar mitohondrijska masa, določena s številom kopij mtDNA in obarvanjem mitohondrijev z MitoTrackerTM green FM, ni bila bistveno modulirana z miRNA-150 in miRNA- 495 tako v bazalnih pogojih kot pri zdravljenju s TGF. Bazalno so opazili trend zmanjševanja tega parametra (dodatna slika 2A, B, C). Na splošno ti podatki podpirajo, da miR-150 in miR-495 spodbujata a

profibrotično delovanje v tubularnih epitelijskih celicah z okvaro mitohondrijske funkcije.

MiR-150 in miR-495 ne spremenita mitohondrijskega transmembranskega potenciala (ΔѰm) in mitohondrijskega superoksidnega radikala

Slika 3. MiR-150 in miR-495 povečata od TGF- 1-profibrotični odziv pri človekuledvičnatubularne epitelijske celice. (A, B) RT-PCR analiza izražanja miR{{0}}p (A) in miR-495-3p (B) v celicah HKC-8, obdelanih z 1{{24 }} ng/ml TGF- 1 za navedene čase. (C, D) ravni mRNA aktina alfa gladke mišice (-SMA), kolagena alfa 1 tipa-1 (Col1 1), fibronektina (FN) iz celic, transficiranih z miR-NC in mimičnim miR -150-5p (C) ali miR-495-3p (D) smo določili s qRT-PCR z uporabo Sybr green. Celice smo obdelali s TGF- 1 (10 ng/ml) po prekomerni ekspresiji miRNA, kjer je bilo navedeno (glejte tudi razdelek o metodah). (E, F) Imunobloti, ki prikazujejo ravni beljakovin CPT1A in -SMA v celicah, transficiranih z miR-NC, in posnemajo miR-150-5p (E) ali miR{{20}}p (F) za navedene časovne točke. GAPDH je bil uporabljen za namene normalizacije. Palični grafi (desne plošče) predstavljajo povprečje izraza spremembe krat ± sem iz 3 neodvisnih poskusov. *P < {{30}},05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001="" v="" primerjavi="" z="" njihovimi="" ustreznimi="" kontrolnimi="" pogoji;="" #p=""><0,05, ##p=""><0,01, ###p=""><0,001 v="" primerjavi="" s="" celicami,="" obdelanimi="" z="" mir-nc="" v="" enakih="" eksperimentalnih="">

Slika 4. MiR-150 in miR-495 povečata TGF 1-inducirano FAO represijo v celicah HKC-8. (A, B) Stopnja porabe kisika (OCR) celic HKC-8, transficiranih z

40 nM miR-NC in mimičen miR-150-5p (A) ali miR-495-3p (B) in izpostavljen 10 ng/ml TGF{{5} } po čezmerni ekspresiji miRNA (glejte tudi razdelek o metodah). Palični grafikoni (desne plošče) prikazujejo stopnje OCR, povezane z bazalnimi, protonskimi, povezanimi z ATP, največjimi in rezervnimi zmogljivostmi ter nemitohondrijskimi respiratornimi statusi. Podatki so po normalizaciji predstavljeni s količino beljakovin. (C, E) Ravni ATP v celicah HKC-8, transficiranih z miR-NC in posnemajo miR-150-5p (C) ali miR-495-3p (E). (D, F) ravni mRNA CPT1A, PGC1A in TFAM v celicah HKC-8, transficiranih z miR-NC in mimičnim miR-150-5p (D) ali miR-495-3p (F), so bile določeno s qRT-PCR z uporabo Sybr green. Palični grafi prikazujejo povprečje ± sem 4 neodvisnih poskusov. *P < 0.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0,001="" v="" primerjavi="" z="" njihovimi="" ustreznimi="" kontrolnimi="" pogoji;="" #p=""><0,05, ##p=""><0,01, ###p=""><0,001 v="" primerjavi="" s="" celicami,="" obdelanimi="" z="" mir-nc="" v="" enakih="" eksperimentalnih="">

proizvodnja anionov. Mitohondrijski membranski potencial (ΔΨm), ki ga ustvarjajo protonske črpalke (kompleksi I, III in IV), je bistvena komponenta v procesu shranjevanja energije med oksidativno fosforilacijo. Povečan ΔѰm lahko vodi do mitohondrijske redoks motnje, medtem ko njegovo zmanjšanje povzroči zmanjšanje proizvodnje ATP, kar ogroža sposobnost preživetja celic [254]. Superoksidni radikal anion (O2•−) je prosti radikal, ki se lahko ustvari v mitohondrijih kot posledica uhajanja elektronov, ki se lahko pojavi v več korakih ETC. Nastajanje O2•− znotraj mitohondrijskega matriksa je kritično odvisno tudi od razmerij NADH/NAD plus in CoQH2/CoQ ter lokalne koncentracije O2 [255]. Njegova prekomerna proizvodnja lahko povzroči izgubo mitohondrijske redoks homeostaze prek različnih mehanizmov, stanje, ki je bilo povezano s številnimi patološkimi stanji, vključno z AKI in kronično ledvično boleznijo [201]. ΔѰm smo pregledali z barvilom TMRM, proizvodnjo aniona superoksidnega radikala pa z barvilom MitoSOX. Najprej smo validirali te teste z obdelavo celic s FCCP in CCCP kot negativnimi kontrolami za TMRM oziroma MitoSOX ter oligomicinom in antimicinom A kot pozitivnima kontrolama za TMRM oziroma MitoSOX v človeški celični liniji HKC{{7} }. V primeru testa TMRM je zdravljenje z oligomicinom povzročilo 3--kratno povečanje povprečja fluorescence TMRM v primerjavi s kontrolnim barvilom, medtem ko je zdravljenje s FCCP povzročilo 9--kratno zmanjšanje. Antimicin A in CCCP sta povzročila 35--kratno povečanje oziroma 2--kratno zmanjšanje v testu MitoSOX (dopolnilni sliki 3A in B). Da bi ugotovili, ali so učinki miR-150 in miR-495 na mitohondrijsko presnovo sprožili spremembe teh parametrov, so celice HKC-8 transficirali z miR-150-5p ali miR{{17} }p mimic ali ustrezen miR-NC. Med pogoji zdravljenja z izbranimi miR in miR-NC niso odkrili nobenih statistično značilnih razlik v kvantifikaciji fluorescence sond TMRM ali MitoSOX (dopolnilna slika 3C).

Na ravni MiR-150 in miR-495 vzorci plazme in ledvic bolnikov s kronično ledvično boleznijo niso prizadeti. Ocenili smo izražanje izbranih miRNA v plazmi in biopsijah ledvic pri bolnikih s kronično ledvično boleznijo. Analiza biopsij ledvic pri 26 bolnikih (bolnišnica Ramn y Cajal) ni pokazala korelacije med stopnjo fibroze in ravnmi miR-150-5p oziroma miR-495-3p (dopolnilni sliki 4A in B) . V kohorti 100 bolnikov s kronično ledvično boleznijo (bolnišnica Príncipe de Asturias) so bile določene tudi plazemske ravni miR-150-5p, miRNA z največjo izraženostjo v ledvicah. Zaradi omejitev glede razpoložljivosti vzorcev nismo mogli določiti serumskih vrednosti miR- 495-3p v tej kohorti. Ti bolniki so bili predhodno razdeljeni v dve podskupini glede na razvoj njihove ledvične funkcije v obdobju 24 mesecev, tako da je bilo pri 50 bolnikih ledvično delovanje manj kot 10-odstotno poslabšano, medtem ko je pri ostalih prišlo do vsaj 40-odstotnega zmanjšanja delovanja ledvic. funkcijo. Kvantifikacija plazemskih ravni miR-150-5p s qRT-PCR ni pokazala jasnega trenda v smeri diferencialne ekspresije v obeh podskupinah bolnikov (dopolnilna slika 4C).

4. Razprava

Odkritje miRNA kot ključnih regulatorjev patofizioloških procesov je spodbudilo raziskave njihove uporabe kot terapevtskih sredstev v skoraj vseh kliničnih okoljih, vključno z boleznijo ledvic [31]. Ledvična fibroza je zelo razširjen izid kronične ledvične bolezni (CKD) z neodvisno etiologijo, njena prisotnost pa je jasen napovedovalec razvoja. Zato je bilo veliko truda vloženega v identifikacijo miRNA, povezanih z ledvično fibrozo [32,33]. V tej študiji smo se osredotočili na vse pomembnejšo vlogo presnovne motnje priledvičnapoškodbein identificirali smo dve miRNA, miR-150 in miR-495, ki sta bili prej neznani akterji prizora. Poleg tega smo ugotovili, da močno vplivajo na celično bioenergetiko s sinergizacijo s TGF in spreminjanjem ključnih presnovnih poti, povezanih z maščobami.kislina oksidacija.

Poškodba epitelija obstaja sočasno z okvaro maščobnega tkivakislinaoksidacija, glavni vir energije za tubularne epitelijske celice [5]. Vodi do njihove dediferenciacije, ki povzroča okvaro tubularne funkcije, sproži zaustavitev celičnega cikla in spodbuja sproščanje kritičnih profibrotičnih citokinov, ki lahko prispevajo k aktiviranju intersticijskih miofibroblastov [5,34]. Izražanje MiR-150 in miR-495 je bilo povečano pri mišihfibrotičniledvicein včlovek ledvicaepitelijskih celic (HKC-8) po zdravljenju s TGF-, kar kaže na njihovo vpletenost v profibrotični odziv. Zanimivo je, da in silico analiza genomskih regij, ki kodirajo miR-150 in miR-495, omogoča identifikacijo vezavnih mest za transkripcijske faktorje, povezane s TGF-signalizacijo in drugimi potmi, vključenimi v poškodbe UUO (iskanje v genecards.org za miR-150 in miR-495). Tako miR-150 kot miR-495 sta zmanjšala raven izražanja svojih ciljnih genov CPT1A, PGC1 in TFAM, kar se je odrazilo v zmanjšani bazalni, na ATP povezani ter največji vsebnosti OCR in ATP po zdravljenju z miR-150 in miR-495. Ta učinek je spremljal povečan TGF-profibrotični odziv v celicah HKC-8. Ugotovili smo, da je TGF zmanjšal mitohondrijsko maso in mitohondrijsko DNA. Po zdravljenju z miRNA-150 in miRNA-495 so opazili trend zmanjševanja vsebnosti mitohondrijev v bazalnih pogojih, čeprav ni dosegel pomembnosti. To kaže na mehanizem, ki je neodvisen od vloge PGC1 ali TFAM in je najverjetneje povezan s presnovnim učinkom, povezanim z znižano regulacijo CPT1A kot glavno spremenljivko, na katero vpliva prisotnost miRNA. Spremembe v mitohondrijski bioenergetiki so kritične pri bolezni ledvic [35]. V skladu s tem smo nedavno pokazali, da je CPT1A kritičen encim za ohranjanje zdravega tubularnega predela, saj njegova prekomerna ekspresija ščiti pred fibrozo ledvic [6]. Vendar pa PGC1

in TFAM geni so prav tako tesno povezani z mitohondrijsko funkcijo in biogenezo [36]. Oslabljeno izražanje teh genov je povezano s kronično ledvično boleznijo, medtem ko njegova ohranitev prispeva k celovitosti ledvic, kot je prikazano v več modelih poškodb. Tako Han et al. ugotovili, da tubularna pridobitev funkcije PGC1 ščiti miši pred fibrozo ledvic, ki jo povzroča Notch, in obrne mitohondrijsko disfunkcijo, povezano s tem modelom [37]. Podobno je ponovna ekspresija Tfam v celicah tubulov preprečila presnovno in profibrotično reprogramiranje, ki ga povzroči Notch [38]. Tako je možno, da zmanjšana ekspresija mRNA teh mitohondrijskih genov, inducirana z miR-150 in miR-495, prav tako prispeva k poškodovanemu epitelijskemu fenotipu.

Upad, ki smo ga opazili pri OCR, povezanem s poškodbo epitelijskih celic, je v skladu s prejšnjimi poročili, vključno z našimi študijami z miR-33 in miR-9 [15,16]. Ker Kang et al. poročali tudi, da je bila oksidacija glukoze nižja pri človeških in mišjih modelih ledvične fibroze [5], naši podatki kažejo, da zmanjšanje OCR, ki ga posreduje mikroRNA, samo po sebi ne povzroči variacij ECAR, kar kaže, da je zaustavitev glikolize v fibrotičnih stanjih najverjetneje odvisna na fibrozne dražljaje in ne na oslabljeno oksidativno fosforilacijo. Več miRNA je bilo opredeljenih kot glavni modifikatorji mitohondrijske funkcije, vključno z arhetipsko profibrotično miRNA, miR-21 [39]. Supresija izražanja PPAR z miR-21 je bila uporabljena kot mehanizem, s katerim ta miRNA izvaja svoje profibrotično delovanje. Poleg zaviranja FAO so ciljni geni za miR-21 pokazali, da ta miRNA utiša širok spekter mitohondrijskih procesov. Drugi primeri vključujejo mir-9 [16], miR-33 [15] in miR-30e [40,41]. Vendar pa, kolikor vemo, obstaja nekaj poročil, ki obravnavajo regulacijo mikroRNA genov CPT1A, PGC1 in TFAM v kontekstu fibroze ledvic. Zanimivo je, da mikroRNA -214, ki spodbuja prehod epitelija v mezenhim (EMT) med ledvično fibrozo, neposredno cilja na TFAM v celicah raka debelega črevesa [42]. O tej represiji so poročali tudi za miR-590-3p [43]. Družina miR-29, eden najbolje opisanih regulatorjev proizvodnje ECM pri fibrozi organov, neposredno cilja na PGC1 in ohranja homeostazo srca. Tako patološko utišanje miR-29 vodi do regulacije PGC1, kar povzroči globoke spremembe v mitohondrijski biogenezi, ki prispevajo k boleznim srca [44]. Medtem ko naši podatki jasno podpirajo vlogo miR-150 in miR-495 pri fibrozi ledvic, bi bile za potrditev te trditve potrebne nadaljnje študije in vivo.

Za ovrednotenje celovitosti mitohondrijske transportne verige elektronov (ETC) smo se osredotočili na dve značilnosti: ΔѰm in proizvodnjo aniona superoksidnega radikala. Opazili smo, da miR-150 in miR-495 nista spremenila teh parametrov. Za sposobnost preživetja celic je potreben stabilen ΔѰm, njegova velikost pa se razlikuje med vrstami celic [45]. Njegovo vzdrževanje je strogo natančno nastavljeno, saj lahko povečanje ΔѰm povzroči motnje v redoks stanju, medtem ko njegovo zmanjšanje povzroči zmanjšanje proizvodnje ATP in lahko sproži apoptozo. V naši študiji so bile spremembe v ΔѰm kvantificirane s kationskim fluorescenčnim barvilom TMRM, medtem ko je bila proizvodnja mitohondrijskega superoksidnega radikalnega aniona izmerjena s fluorogenim barvilom MitoSOX Red. Uporaba teh orodij pri pogojih, ki vplivajo na delovanje ledvic, v literaturi ni opazna. Kljub temu, da v naši študiji ni bilo sprememb, nismo sledili poglobljenim drugim strategijam za oceno redoks hormeze, zato ne moremo izključiti, da lahko te miRNA spremenijo nukleofilni ton ali funkcijo več komponent ETC.

V kliničnem okolju je bila miR-150 predlagana kot profibrotična miRNA pri lupusnem nefritisu z modulacijo TGF-signalizacije [46,47], medtem ko je bila miR-495 povezana z zaščitno vlogo pri diabetični srčni fibroza [48]. Da bi ugotovili njihovo potencialno vpletenost v CKD, smo ovrednotili njihove serumske in parenhimske ravni v dveh različnih skupinah bolnikov. Serumske ravni miRNA so bile predlagane kot možni biomarkerji za napredovanje kronične ledvične bolezni [49, 50]. Tako so ravni miR-21 v serumu in številčnost miR-29c v urinskih eksosomih v korelaciji z ledvično fibrozo, kar kaže na njihovo potencialno vlogo kot biomarkerjev [51, 52]. Vendar se vrednosti miR-150 in miR-495 niso razlikovale niti v vzorcih plazme niti v vzorcih ledvic bolnikov s kronično ledvično boleznijo. Različni vzorci izražanja mikroRNA med vrstami in vrstami celic lahko pojasnijo to odsotnost razlike v ravneh miR-150 in miR-495 v fibrotičnem tkivu [53]. Medtem ko bi lahko v nekaterih primerih plazemske ravni mikroRNA odražale tiste v ledvičnem tkivu, je treba upoštevati tudi druge mehanizme, povezane z izločanjem miRNA v cirkulacijski sistem ali protiutež tega izločanja s strani drugih organov [13, 54].

Na splošno naši rezultati podpirajo, da miR-150 in miR-495 spodbujataledvičnaepitelijskicelicadediferenciacija najverjetneje zaradi pomanjkanja energije, ki jo prenaša zatiranje genov, povezanih s funkcijo mitohondrijev CPT1A, PGC1 in TFAM. Zagotavljajo tudi osnovo za nadaljevanje svoje vloge in vivo, pa tudi njihovo potencialno uporabnost kot diagnostičnih ali prognostičnih biomarkerjev.

Avtorski prispevki

SL je zasnoval in usmerjal raziskave. VM je oblikoval, izvedel in analiziral večino poskusov. RR je pomagal pri analizi niza mikroRNA. DRP in LGB sta izvedli študije v dveh različnih kohortah bolnikov s kronično ledvično boleznijo. Vsi avtorji so pomagali pri razpravi o rezultatih, SL in VM pa sta napisala rokopis.

Izjava o konkurenčnem interesu

Avtorji niso v konfliktu interesov.

Zahvala

To delo je bilo podprto s štipendijami španskega ministrstva za znanost SAF2015-66107-R in PID2019-104233RB-I00 (SL), PI17/ 01513 (DRP), ki jih sofinancira Evropska Sklad za regionalni razvoj, Instituto de Salud Carlos III REDinREN RD12/0021/0009 in RD16/ 0009/0016 (SL in DRP), FIS PI17/00625 (DRP), Comunidad de Madrid "NOVELREN" B2017/BMD3751 (SL in DRP), nepovratna pomoč Španskega združenja za nefrologijo (Fundacin Senefro 2017) SL in Fundacionledvična"Iigo Alvarez de Toledo" (SL) vsi iz Španije. CBMSO prejema institucionalno podporo Fundacion "Ramn Areces". VM je bil podprt s predoktorsko štipendijo programa FPI (BES- 2013-065986) španskega ministrstva za znanost.