Vloga genetskega testiranja v diagnostičnem poteku pediatričnih bolnikov z ledvičnimi boleznimi: izkušnje ene same ustanove

PovzetekNamenPodedovane ledvične bolezni so med glavnimi vzroki za odpoved ledvic pri otrocih, kar povzroča povečano umrljivost, visoke stroške zdravstvenega varstva in potrebo po presaditvi organov. Tehnologije sekvenciranja naslednje generacije lahko pomagajo pri diagnozi redkih monogenih stanj, kar omogoča optimizirano zdravljenje in terapevtske izbire.

Metode Klinično sekvenciranje eksomov (CES) je bilo izvedeno na kohorti 191 pediatričnih bolnikov iz ene ustanove, čemur je sledilo sekvenciranje po Sangerju za potrditev identificiranih različic in za študije družinske segregacije. Rezultati Vsi bolniki so imeli klinično diagnozo ledvične bolezni: glavne kategorije bolezni so bile bolezni glomerulov (32,5 %), ciliopatije (20,4 %), CAKUT (17,8 %), nefrolitiaza (11,5 %) in tubularna bolezen (10,5 %). 7,3 % bolnikov je imelo druge bolezni. Dokončen genetski test, ki temelji na validaciji CES in Sanger, je bil pridobljen pri 37,1 % bolnikov. Najvišja stopnja odkritja je bila dosežena pri ciliopatijah (74,4 %), sledijo nefrolitiaza (45,5 %) in tubularne bolezni (45 %), medtem ko večina glomerularnih bolezni in CAKUT ostaja nediagnosticiranih. Zaključki Rezultati kažejo, da lahko genetsko testiranje, ki se dosledno uporablja v diagnostičnem poteku dela otrok s kronično ledvično boleznijo, (i) potrdi klinično diagnozo, (ii) zagotovi zgodnjo diagnozo v primeru dednih stanj, (iii) in genetski vzrok za predhodno neprepoznano bolezen. bolezni in (iv) prilagojene programe presaditev.

Ključne besede Klinično sekvenciranje eksomov, Sekvenciranje naslednje generacije,Bolezni ledvic, Genetsko testiranje, Pediatrična kohorta

KLIKNITE TUKAJ ZA DOBITEV CISTANCHE ZAKONČNA LEDVIČNA BOLEZEN

Uvod

Pediatrične nefropatije obsegajo zelo različne bolezni v smislu klinične slike, razvoja in terapevtskih možnosti [1–4]. Približno 30 % otrok s kronično ledvično boleznijo (CKD) trpi zaradi monogenskega stanja, odstotek se poveča, če upoštevamo otroke s končno odpovedjo ledvic (ESRD) [5, 6]. Mnogi od teh otrok v času presaditve ostanejo nediagnosticirani [4, 6, 7]. Doseganje diagnoze za te bolnike ne pomeni le konca diagnostične odisejade, ampak predstavlja številne prednosti za prognozo, obvladovanje in zdravljenje.

Pionirske študije so dosledno pokazale, da je izvajanje tehnik sekvenciranja naslednje generacije (NGS) znatno izboljšalo diagnostični izkoristek pri bolnikih s dednimi boleznimi ledvic (IKD) [8]. V zadnjem času je široka uporaba NGS omogočila dostopno genetsko diagnozo v razumnem času in po dostopnih cenah, pri čemer se postavlja vprašanje, ali in kdaj naj se vključi v rutinski diagnostični potek [5].

Genetska diagnoza pri otrocih je izrednega pomena za različne vidike. Prvi je, da je lahko pomemben v kliničnem pristopu k bolezni, tipičen primer je nefrotski sindrom, kjer identifikacija strukturnih variant v genih, povezanih s podociti, nasprotuje imunosupresivnim terapijam, ki bi se sicer rutinsko uporabljale v obdobju več mesecih [9]. Drugi je, da je lahko zelo pomembno za otrokovo družino in za identifikacijo drugih članov, ki prenašajo različico, ki se lahko prenaša na prihodnje generacije. Ko je pri probandu identificirana patogena različica, sta standardna praksa v klinični genetiki kaskadno testiranje družinskih članov in genetsko svetovanje pri nosilcih različic [5]. Tretjič je, da je poznavanje patogene različice bistveno v kontekstu presaditve, kjer je lahko darovalec sorodnik. Dejansko je ključnega pomena izključiti prisotnost istih različic pri darovalcu organa, prav tako je ključnega pomena identificirati vse družinske člane, ki potencialno potrebujejo presaditev. Četrtič, nekatere bolezni predstavljajo visoko tveganje za ponovitev po presaditvi organa, kot je žariščna segmentna glomeruloskleroza [10], ali pa se lahko njihov izid izboljša z bolj prilagojeno izbiro presaditve, kot je v primeru primarne hiperoksalurija, kjer lahko kombinirana presaditev ledvice in jeter povzroči boljši izid [11]. Nenazadnje je lahko bolniku koristno imeti jasno diagnozo bolezni, da sodeluje v kliničnih preskušanjih in izkoristi nove možnosti zdravljenja [12, 13].

Konec leta 2018 smo v sodelovanju med pediatri nefrologi in genetiki začeli izvajati genetske teste za monogena stanja, ki bi lahko vodila do končne odpovedi bolezni in s tem do presaditve. Naša bolnišnica je največja v severozahodni Italiji in izteka iz območja s približno 5 milijoni ljudi. Izbrali smo vrsto analize "ena velikost za vse", s sekvenciranjem kliničnega eksoma, tj. približno 6700 genov, ki so povezani z monogenskimi stanji, s poudarkom na analizi genskih panelov, prilagojenih kliničnemu sumu, in s tem omejevanjem naključnih ugotovitev in zmanjšanje časa za analizo zaporedja.

Na splošno smo z uporabo tega cevovoda dobili diagnostični izkoristek v skladu z objavljenimi podatki, z nekaj heterogenostjo med različnimi kliničnimi sumi, kot je bilo pričakovano. Dobljeni rezultati potrjujejo pomembnost vključitve rutinskega genetskega testiranja in svetovanja v diagnostični potek dela pediatričnih bolnikov z nefropatijami. Dejansko je identifikacija vzročnih različic ključnega pomena za njihovo klinično obvladovanje in potencialno za optimalno izbiro živih darovalcev.

Materiali in metode

Zaposlovanje pacientov

Študija je temeljila na diagnostični kohorti 191 zaporednih pediatričnih bolnikov (starost ob vključitvi < 18 let), ki so jih vključili oddelki za pediatrično nefrologijo, dializo in transplantacijo v otroški bolnišnici Regina Margherita in jih napotili v službo za imunogenetiko in transplantacijsko biologijo genetske analize. Vsi bolniki, vključeni v študijo, so dali pisno informirano soglasje, ki sta ga podpisala oba starša, kadar koli je to bilo mogoče.

Priprava vzorcev, sekvenciranje in bioinformatske analize

Ekstrakcija nukleinske kisline iz periferne krvi, analiza kakovosti DNK, priprava knjižnice in sekvenciranje so bili izvedeni, kot je bilo že opisano [14]. Neobdelani podatki, pridobljeni s sekvenciranjem, so bili pretvorjeni v datoteke FASTQ in nato usklajeni z orodji Enrichment 3.1.0 ali DRAGEN Enrichment (Illumina) in preslikani v manifest TruSight One Expanded v2.0 z uporabo genoma Homo Sapiens UCSC GRCh37 kot referenca za pridobitev enonukleotidnih različic, različic števila kopij (CNV) in strukturnih različic datotek. Za identifikacijo števila kopij je bila uporabljena osnovna linija iz podatkov o zaporedju 5 različnih bolnikov, vsi negativni za CNV (glede na podatke primerjalne genomske hibridizacije niza). Ta pristop omogoča odkrivanje CNV tudi v spolnih kromosomih, saj so referenčno skupino sestavljali posamezniki ženskega in moškega spola, med fazo poravnave pa je bil vedno določen spol subjekta, ki ga je treba analizirati. Klicanje variant in prioriteta sta bila izvedena po opredeljenih kriterijih. Poravnavo odčitkov in pokritost eksonov zanimivega gena je preveril in prikazal Integrative Genomics Viewer IGV, ki je brezplačno na voljo na UC San Diego – Univerza v Kaliforniji in Broad Institute MIT in Harvard University – Boston (https://software.broadinstitute. org/software/igv/). Različice, ki bodo vključene v končno genetsko poročilo, so bile razvrščene v skladu z merili Ameriškega kolidža za medicinsko genetiko in genomiko (ACMG).

Ustvarjanje seznama genov bolezni in silico

Geni, ki jih je treba upoštevati za identifikacijo različic in prednostno razvrščanje, so bili opredeljeni na podlagi kliničnih sumov. Seznami genov in silico so bili ustvarjeni z ujemajočimi se (i) podatki iz različnih baz podatkov, korelacijo genotipa s fenotipom (OMIM, PanelApp England, ClinGen, Malacards) in (ii) podatki iz literature. Razpoložljivi seznami genov se posodobijo enkrat letno na podlagi novih dokazov o povezavi genov z boleznimi.

Sangerjevo sekvenciranje in pomnoževanje sonde, odvisno od multipleksne ligacije (MLPA)

Sangerjeve analize zaporedja in/ali MLPA so bile izvedene za potrditev variant, ki jih je identificiral NGS, in za študije družinske segregacije. Na kratko, DNK smo ekstrahirali iz drugega neodvisnega alikvota periferne krvi probanda in od staršev. Področja DNA, ki nas zanimajo, so bila pomnožena s PCR ob uporabi posebnih eksperimentalnih pogojev. Čistost in specifičnost pomnoženih regij smo preverili z 0.8 ali 1,5 % agaroznim gelom. Pomnožene produkte PCR smo nato Sangerjevo sekvencirali z uporabo istih primerjev. Za različice PKD1 je bila validacija izvedena z uporabo PCR dolgega dosega, ki mu je sledil ugnezdeni PCR, da bi se izognili kakršnemu koli sklepanju na podlagi psevdogenov.

Rezultati

Opredelitev kriterijev za vračilo rezultatov genetskih analiz

We previously reported on the design and set-up of a "kidney" gene panel that comprises>400 genov, ki sodelujejo pri različnih oblikah bolezni ledvic [14]. Za to študijo smo izvedli analizo s podpaneli, osredotočenimi na specifično klinično kategorijo suma (npr. CAKUT, glomerulopatija, tubulopatija itd.) in predhodno določili specifično skupino genov za analizo. Ta pristop je omejil število analiziranih genov, poenostavil analize in zmanjšal število naključnih ugotovitev. Šele ko je bil na koncu analitičnega polja z ustreznimi ploščami genetski rezultat negativen in (i) klinični fenotip ni jasno označen ali (ii) se prekrivajo različne kategorije bolezni, je bila genetska analiza razširjena na t.i. "kidney full-list ali kidneyome", super-panel, ki vsebuje vse gene, vključene v podpanele.

Kot prvi korak smo opredelili nabor kriterijev za interpretacijo rezultatov NGS. Po izvedbi kliničnega sekvenciranja eksomov (CES) in poravnave podatkov je bil določen cevovod analize za filtriranje v ustreznih različicah. Natančneje, na podlagi kliničnega suma so bile identificirane različice filtrirane na podlagi seznamov genov in silico, specifičnih za različne makrokategorije bolezni. Sinonimne različice, ki ne vplivajo na mehanizem spajanja, ali intronske različice, ki niso preslikane v območju spajanja, so bile izključene, pri čemer so bile upoštevane samo nesinonimne različice, nesmiselne različice, različice s premikanjem okvirja in različice, ki vplivajo na spajanje. Vključenih je bilo deset le redkih različic (pogostnost manj kot 1 % v populaciji) in različice s frekvenco alelov pri bolniku vsaj 0.2 in pokritostjo najmanj 20 odčitkov. Preostale različice so bile označene in nadalje kurirane na podlagi (i) načina dedovanja, (ii) ohranjanja nukleotidov, (iii) vpliva beljakovin, izkoriščanja različnih baz podatkov za preverjanje rezultatov in (iv) literature, če obstaja. Na tej točki so bile filtrirane različice navedene v tako imenovanem "tehničnem poročilu". Tehnično poročilo je interpretiral medicinski genetik, da bi izdelal končno genetsko poročilo za bolnika in njegovo/njeno družino. Med genetskim posvetovanjem so bile predlagane študije družinske segregacije, da (i) potrdijo različice v probandu in (ii) vključijo/izključijo nekauzativne različice na podlagi njihove segregacije v družini (slika 1).

S sprejetjem teh meril smo lahko opredelili tri različne kategorije genetskih poročil. Najprej "dokončno poročilo", ki je vključevalo patogene (C5) in verjetno patogene (C4) različice. Poročila o različicah neznanega pomena (C3) so veljala za dokončna le, če so popolnoma združljiva s klinično sliko in če so študije družinske segregacije potrdile njihovo možno vlogo. Drugič, "negotovo poročilo", ki je vključevalo različice C3, ki jih je identificiral CES, ki še niso ali jih ni bilo mogoče potrditi v okviru študij družinske segregacije, ali različice C4/C5, ki niso bile popolnoma v skladu s kliničnim fenotipom. Tretjič, "nedokončno poročilo", ki je vključevalo (i) negativno analizo CES, kar pomeni, da NGS ni odkril nobenih različic; (ii) posamezne različice v recesivnih genih; in (iii) različice C3, ki niso v skladu s kliničnim fenotipom, ugotovljene, ko je bila analiza razširjena na vsegeni, povezani z boleznijo ledvic(Slika 1).

Glavne značilnosti rekrutirane kohorte

Ta študija opisuje kohorto 191 pediatričnih bolnikov (0–18 let), ki jih je od novembra 2018 do maja 2022 zaporedoma napotil pediatrični nefrološki oddelek na genetsko analizo, pri čemer je bilo vsako leto vključenih povprečno 50 novih bolnikov . Merila za genetsko testiranje so bila (i) nefropatija, povezana s pozitivno družinsko anamnezo ledvične bolezni ali (ii) klinični sum na monogensko stanje ali (iii) potreba po izključitvi monogenskega stanja (kot v primeru nefrotskih sindromov, kjer je treba razlikovati monogenih v primerjavi z nemonogenimi boleznimi je klinično pomembna za prognozo in zdravljenje).

Kohorta je bila razdeljena na podlagi kliničnega suma ob upoštevanju 6 različnih makrokategorij bolezni: prirojene nepravilnosti ledvic in sečil (CAKUT; n=34), ciliopatije (n=39), glomerulopatije (n=62), nefrolitiazo (n=22), tavopatije (n=20) in druge bolezni, ki so vključevale tudi sindromne fenotipe (n=14). Razen za CAKUT in tubulopatije, ki so pokazale enakomerno porazdelitev med ženskami in moškimi, so v vseh drugih kategorijah prevladovali moški (slika 2a). Če pogledamo starost zaposlitve, ni bila poudarjena nobena bistveno drugačna porazdelitev med različnimi skupinami, s povprečno starostjo od 6,7 do 10 let v "drugih boleznih" oziroma glomerulopatijah. Če pa pogledamo mediano starost, so bolezni CAKUT pokazale najnižjo vrednost (4,6 leta), kar je v skladu s prirojenim fenotipom. Z vidika etnične pripadnosti, neodvisno od obravnavane makrokategorije bolezni, je bila večina bolnikov Evropejcev, sledili so Afričani, pri čemer je bilo le nekaj bolnikov Azijcev, Latinske Amerike ali križancev (slika 2b). Med kohorto je imelo le 8 bolnikov sokrvne starše.

Slika 1 Cevovod za analizo genetskih podatkov in merila za vključitev različic. Shematski prikaz analitičnega cevovoda, sprejetega za identifikacijo različic in določanje prednosti, vključno z vsemi kriteriji za filtriranje in filtriranje. Nastale različice so bile vključene v končno genetsko poročilo. Kadarkoli je bilo mogoče, so bile izvedene validacije različic in študije družinske segregacije. Genetska poročila so bila razvrščena kot dokončna, negotova ali nedokončna glede na navedena merila. Na podlagi te razvrstitve je bila izračunana diagnostična stopnja našega delovnega toka sekvenciranja naslednje generacije (NGS). 1 KG: podatkovna zbirka 1000 genomov; Alt fr: spremenjena frekvenca; C3: različica neznanega pomena; C4: verjetno patogena različica; C5: patogena varianta; AR: avtosomno recesivno

Nazadnje, ob upoštevanju družinske anamneze ledvičnih bolezni pri moških in ženskah ločeno, je bila heterogenost v porazdelitvi med pozitivnimi in negativnimi primeri očitna glede na različne kategorije bolezni. Na splošno za večino izbrane kohorte in neodvisno od spola ni bila značilna pozitivna družinska anamneza, kot je prikazano za CAKUT, glomerulopatije, tauopatije in druge ledvične bolezni. Vendar pa je bil pri ciliopatijah in nefrolitiazi pomemben delež primerov s pozitivno družinsko historijo z različno porazdelitvijo med ženskami in moškimi (13 primerov od 22 za ciliopatije in 5 od 12 za nefrolitiazo; slika 2c).

S kliničnega vidika je bila kohorta precej heterogena z različnimi primarnimi boleznimi (slika 2d). Med njimi so bili najpogosteje ponavljajoči se klinični sumi na policistično ledvično bolezen (n=27), CAKUT (n=25), nefrotski sindrom (n=19), žariščno segmentno glomerulosklerozo (FSGS; n =14) in Alportov sindrom (n=13; slika 2d).

Podporna storitev Wecistanche-največjega izvoznika cistanche na Kitajskem:

E-pošta:wallence.suen@wecistanche.com

Whatsapp/telefon:+86 15292862950

Trgovina za več podrobnosti o specifikacijah:

https://www.xjcistanche.com/cistanche-shop

KLIKNITE TUKAJ ZA NARAVNI ORGANSKI IZVLEČEK CISTANCHE S 25 % EHINAKOZIDA IN 9 % AKTEOZIDA ZA OKUŽBO LEDVIC