Tirozin kinaza C-Abl okrepi z interferonom posredovano protivirusno imunost s fosforilacijo STAT1

POVZETEK

Z interferonom (IFN) inducirana aktivacija pretvornika signala in aktivatorja družine transkripcije (STAT) je pomemben dogodek v protivirusni imunosti. Tukaj smo pokazali, da nereceptorske kinaze c-Abl in Arg neposredno sodelujejo s STAT1 in potencirajo fosforilacijo STAT1 na Y701. c-Abl/Arg bi lahko posredoval fosforilacijo STAT1 neodvisno od Janus kinaz v odsotnosti IFNg in okrepil fosforilacijo STAT1, posredovano z IFNg. Poleg tega dimerizacijo STAT1, jedrsko translokacijo in transkripcijo genov navzdol uravnava c-Abl/Arg. Pomanjkanje c-Abl/Arg (abl1/abl2) znatno zavira protivirusne odzive v celicah, okuženih z virusom vezikularnega stomatitisa. V primerjavi z nosilcem je dajanje selektivnega zaviralca c-Abl/Arg AMN107 povzročilo znatno povečano umrljivost pri miših, okuženih z virusom človeške influence. Naša študija dokazuje, da ima c-Abl bistveno vlogo v signalni poti aktivacije STAT1 in zagotavlja pomemben pristop k regulaciji protivirusne imunosti.

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

UVOD

Interferoni (IFN) igrajo ključno vlogo pri prirojeni imunosti proti virusni okužbi in imunskem nadzoru z uravnavanjem aktivacije Janus kinaz (JAK) ter signalnega pretvornika in aktivatorja transkripcije (STAT) ter z reprogramiranjem izražanja celičnih genov (Stark in Darnell, 2012). Vezava IFN-jev na njihove ustrezne receptorje povzroči navzkrižno fosforilacijo treh povezanih JAK-jev (JAK1, JAK2 in TYK2) in rekrutiranje STAT-jev, kar omogoča fosforilacijo posameznih tirozinskih ostankov blizu C-terminalnih koncev teh STAT-ov z JAK-ji. (Platanias, 2005). Aktivirani STAT se nato dimerizirajo, migrirajo v jedro in se vežejo na promotorje genov, ki se odzivajo na IFN, da inducirajo njihovo transkripcijo. Fosforilacija tirozina STAT je bistven korak v poti JAK-STAT signalizacije IFN in je vključena v dimerizacijo STAT, translokacijo jedra in vezavo DNA (Stark in Darnell, 2012). Tako fosforilacija tirozina deluje kot aktivacijsko stikalo STAT. Dokazi, pridobljeni s ciljno motnjo genov JAK pri miših, kažejo, da so JAK najpomembnejše STAT tirozin kinaze (Villarino et al., 2017). Vendar pa se je tudi pokazalo, da so tirozinski ostanki v STAT1, STAT3 in STAT5 fosforilirani v celicah s pomanjkanjem JAK z epidermalnim rastnim faktorjem in receptorji rastnega faktorja, pridobljenimi iz trombocitov, z intrinzično aktivnostjo tirozin kinaze (Leaman et al., 1996; Vignais et al. ., 1996). Poleg tega so opazili konstitutivno aktivacijo STAT v transformiranih celicah, ki izražajo onkogene tirozin kinaze, kot so v-Src, v-Abl in BCR-Abl, vendar je treba še ugotoviti, ali so STAT neposredni substrati teh kinaz (Danial in Rothman , 2000; Reddy et al., 2000). Abelsonova kinaza c-Abl pri sesalcih, kodirana z genom c-abl (abl1), in z Abl soroden genski protein Arg, kodiran z genom arg (abl2), sta člana družine intracelularnih nereceptorskih tirozin kinaz, ki so potrebne za številne celične procese, vključno s proliferacijo, apoptozo, adhezijo, celično migracijo in odzivi na stres (Bradley in Koleske, 2009; Colicelli, 2010; Greuber et al., 2013; Pendergast, 2002). Kinazna aktivnost c-Abl je v normalnih fizioloških pogojih strogo regulirana. Dogodki retrovirusne transdukcije in kromosomske translokacije povzročijo izražanje v-Abl oziroma BCR-Abl, onkogene oblike Abl (Advani in Pendergast, 2002). Poleg tega ciljana delecija gena c-abl pri miših povzroči pleiotropne fenotipe, povezane z imunsko disfunkcijo, vključno z visoko perinatalno smrtnostjo, atrofijo vranice in timusa, limfopenijo in povečano dovzetnostjo za okužbe (Schwartzberg et al., 1991). Poleg tega je zdravljenje BCR-Abl-pozitivne kronične mieloične levkemije (CML) z zaviralcema Abl STI571 (imatinib) in AMN107 (nilotinib) povezano z imunosupresijo pri podskupini bolnikov (Dietz et al., 2004; Hochhaus et al., 2016; Mattiuzzi et al., 2003). Prejšnje študije so pokazale, da ima cAbl vlogo pri regulaciji signalne transdukcije, razvoja, proliferacije in proizvodnje citokinov, posredovanih s TCR (celični receptor T) in BCR (celični receptor) (Gu et al., 2009; Pendergast, 2002). ; Silberman et al., 2008). Miši s pomanjkanjem Abl kažejo tudi zmanjšano število celic T/B (Gu et al., 2009; Liberatore in Goff, 2009; Schwartzberg et al., 1991). Vendar pa mehanizmi, na katerih temelji oslabljena imunost, ki se pojavi v odsotnosti ali inhibiciji c-Abl, ostajajo nedosegljivi. Obširno so poročali, da je signalna pot JAK-STAT bistvena za BCR-Abl-inducirano transformacijo (Carlesso et al., 1996; Danial et al., 1998; de Groot et al., 1999). Zato je vredno raziskati, ali lahko JAK-STAT prispeva tudi k prirojeni imunosti, ki je vključena v c-Abl. Tukaj poročamo, da STAT1 medsebojno deluje s c-Abl in ga fosforilira na JAK-neodvisen način, s katerim se uravnavajo dimerizacija, jedrska lokalizacija in genska transkripcija STAT1. Te ugotovitve so pokazale, da je poleg kinaze JAK c-Abl nepogrešljiv za popolno aktivacijo STAT1 in kasnejše protivirusne odzive, posredovane z IFN.

Prednosti cistanche tubulosa- okrepiti imunski sistem

Kliknite tukaj za ogled izdelkov Cistanche Enhance Imunity

【Vprašajte za več】 E-pošta:cindy.xue@wecistanche.com / Whats App: 0086 18599088692 / Wechat: 18599088692

REZULTATI

Transkripcijo nizvodno zaporednih genov, aktiviranih z interferonom gama, uravnava Abl kinaza

Our previous study suggested that c-Abl widely participates in the regulation of gene transcription (Dong et al., 2017). To illustrate the role of c-Abl in gene expression, the transcription of approximately 22,000 genes in wild-type (WT) and c-abl / arg / MEFs (mouse embryonic fibroblasts) was detected using Affymetrix GeneChips (Mouse Genome 430 2.0) (GEO accession: GSE154568). A total of 1,744 differentially expressed genes (DEGs) with fold changes >4 so bili identificirani v c-abl/arg dvojnem izločitvi (DKO) in WT MEF, od katerih jih je bilo 960 reguliranih navzgor in 784 znižanih (slika 1A, levo). Za nadaljnjo raziskavo potencialnih celičnih funkcij in povezanih poti teh DEG smo izvedli analizo genske ontologije (GO) (za izraze v biološkem procesu, molekularni funkciji in celični komponenti) (slika S1A). Geni, ki jih regulirata c-Abl in Arg, so bili v glavnem povezani z obrambnimi odzivi virusa (GO: 0009615, GO: 0051607 in GO: 0045071) in imunskimi odzivi (GO: 0002376, GO: 0045087). Nadaljnja analiza je pokazala, da so bili geni, specifični za IFN (Liu et al., 2012), obogateni med znižano reguliranimi geni (sliki 1A, desno in S1B). Za potrditev profilov diferencialne ekspresije so bile ravni transkriptov protivirusnih genov, vključno s cxcl10, psmb9, tap1 in isg15, določene s kvantitativnimi testi verižne reakcije s polimerazo v realnem času (RT-PCR) in normalizirane na ravni psma5 , ki ni zelo reguliran s c-Abl. V primerjavi z WT MEF so c-abl / arg / MEF pokazali bistveno nižje ravni transkripta teh genov, vendar so bila zmanjšanja, ki jih povzroča DKO, popolnoma obrnjena z reševanjem c-Abl na način, ki je odvisen od odmerka (sliki 1B in S1C). Ti podatki kažejo, da je bila skupina genov, induciranih z IFN, regulirana s c-Abl in Arg. Za raziskovanje ključnih transkripcijskih elementov, ki jih regulirajo Abl kinaze kot odziv na IFN, je bil konstruiran reporterski sistem luciferaze, ki temelji na skupnem dvosmernem promotorju tap1/psmb9, ki ga regulira IFNg (slika 1C). Kot je bilo pričakovano, je c-Abl/Arg-selektivni inhibitor AMN107 znatno zaviral transkripcijsko aktivnost promotorja tap1 (rdeč) (slika 1D). Predvsem v nasprotju z izbrisom elementov konsenznega zaporedja, ki deluje na NFkB (modro) ali elementov konsenznega zaporedja IFN (rumeno), je zdravljenje z AMN107 imelo majhen učinek, če sploh, na aktivnost promotorja tap1, ko je bil izbrisan element gama-aktiviranega zaporedja (GAS) (zelen) (slika 1D). ). Te ugotovitve kažejo, da je cis-element GAS, usmerjen v STAT1-, vključen v transkripcijo tap1, ki je regulirana s c-Abl, kar močno nakazuje, da je STAT1 odgovoren za regulacijo izražanja gena, ki se odziva na IFN, s posredovanjem c-Abl.

c-Abl neposredno sodeluje s STAT1

Z IFN inducirano ekspresijo TAP1 uravnava c-Abl, po možnosti prek STAT1, kar kaže, da je STAT1 morda povezan s c-Abl. Za potrditev te hipoteze smo lizate celic MCF-7 izpostavili imunoprecipitaciji proti c-Abl, ki ji je sledilo imunoblotiranje s protitelesom proti STAT1. STAT1 je bil prisoten v imunoprecipitatih anti-c-Abl, ne pa tudi v imunoprecipitatih IgG (slika 2A). Nato smo celice 293T kotransficirali z Myc-cAbl in Flag-STAT1 ali Flag-Vector kot kontrolo. Prisotnost Myc-c-Abl v imunoprecipitatih proti Flag, pripravljenih iz celic, ki sočasno izražajo Flag-STAT1, vendar ne Flag-Vector, je pokazala povezavo med ektopično izraženim Myc-c-Abl in Flag-STAT1 (slika 2B, levo). Podoben rezultat smo dobili tudi v recipročnem poskusu (slika 2B, desno). Poleg tega je drugi član družine Abl, Arg (Abl2), ki je zelo homologen c-Abl v svoji N-terminalni domeni (NTD), prav tako sodeloval s STAT1 (slika S2A).

Slika 1. c-Abl regulira promotorje genov, ki se odzivajo na IFN, prek elementov GAS

Nato smo lizate, pripravljene iz celic 293T, ki izražajo Flag-c-Abl, inkubirali z GST-STAT1, konjugiranim z agarozo, ali samim GST, in Flag-c-Abl je bil odkrit v GST-STAT1, ne pa tudi v adsorbatih GST (slika 2C). Da bi izključili posredno vezavo, posredovano z drugimi komponentami v celičnih lizatih, smo imunoprecipitate anti-Flag, pripravljene iz celic 293T, ki izražajo Flag-c-Abl, izpostavili SDS-PAGE (elektroforezi v natrijevem dodecil sulfatu–poliakrilamidnem gelu) in proteine ​​prenesli v membrano PVDF (poliviniliden fluorid) in nato popivnano s topnim GST-STAT1 ali GST (kot kontrola). Rezultati so pokazali, da je GST-STAT1, ne pa GST, vezal c-Abl neposredno in vitro (slika 2D). Za definiranje domene, ki veže c-Abl, smo z agarozo konjugiranim in z GST spojenim STAT1 polne dolžine ali skrajšani STAT1 (slika 2E, zgornja plošča) inkubirali z lizati celic 293T, ki izražajo Flag-c-Abl. Analiza adsorbatov z imunoblotingom s protitelesom proti Flag je pokazala, da so aminokisline 577–750 STAT1, ki sestavljajo regijo, ki vsebuje domeno SH2 in transaktivacijsko domeno, odgovorne za interakcijo c-Abl (slika 2E, spodnja plošča) . Podobno je bil Flag-STAT1, imunoprecipitiran s protitelesom proti Flag, frakcioniran s SDS-PAGE in prenesen na membrano PVDF. Nato je bila membrana popivnana samo s topnim GST-c-Abl SH3 ali GST-c-Abl SH2 in GST. Rezultat je pokazal, da je bila domena c-Abl SH3 glavna domena, odgovorna za povezavo STAT1 (slika 2F). Poleg tega je bila in situ interakcija endogenega c-Abl s STAT1 ocenjena z Duolink proximity ligation testom (PLA). Komplekse STAT1:c-Abl so opazili predvsem v citoplazmi, tvorbo teh kompleksov pa je znatno okrepila stimulacija z IFNg (slika 2G). Te ugotovitve skupaj kažejo neposredno povezavo med c-Abl in STAT1 tako in vitro kot in vivo.

Slika 2. c-Abl sodeluje s STAT1

c-Abl posreduje od JAK neodvisno fosforilacijo STAT1

Da bi raziskali, ali je STAT1 substrat c-Abl, smo očiščen His-označen STAT1 inkubirali z rekombinantnim c-Abl (ki vsebuje katalitično domeno pri aminokislinah 237–643) v prisotnosti ATP za in vitro test kinaze. Imunobloting reakcijskega produkta z anti-fosfo-tirozinom in anti-fosfo-STAT1 Y701 je pokazal, da je bil STAT1 neposredno fosforiliran s c-Abl na ostanku(-ih) tirozina, vključno z Y701, in vitro (slika 3A). Nato smo ugotovili, da je bil Flag-STAT1, izražen v celicah 293T, tirozin fosforiliran, zlasti na ostanku Y701, z Myc-c-Abl, ne pa s kinazno neaktivnim mutantom Myc-c-Abl (K290R). Poleg tega je bila po zdravljenju s c-Abl/Arg-selektivnim zaviralcem AMN107 fosforilacija STAT1, posredovana s c-Abl, skoraj odpravljena, kar kaže, da je fosforilacija tirozina STAT1 odvisna od aktivnosti c-Abl kinaze (slika 3B). Fosforilacija STAT1, posredovana s c-Abl, je bila bistveno oslabljena, ko je bil STAT1 Y701 substituiran s fenilalaninom, kar kaže, da je Y701 glavni fosfozit Abl (slika 3C). Poleg tega je bil STAT1 tudi fosforiliran z Arg (slika S2B). Za nadaljnjo razmejitev specifičnih ostankov STAT1, fosforiliranih s c-Abl, je bil Flag-STAT1, sočasno izražen z Myc-c-Abl, podvržen tekočinski kromatografiji skupaj z analizo tandemske masne spektrometrije. Poleg dobro opredeljenega in funkcionalno pomembnega fosfozita STAT1 Y701 (Schindler et al., 1992; Shuai et al., 1993) sta bila identificirana tudi dva druga fosfozita, Y106 in Y665 (slika S4A). V primerjavi z WT STAT1 sta mutanta Y106F in Y701F pokazala ogroženo fosforilacijo tirozina (slika 3C). Vendar fosforilacija Y106 in Y665 ni bistveno vplivala na fosforilacijo STAT1 Y701, kar kaže, da lahko Y106 in Y665 igrata različni vlogi (slika S4B). Te ugotovitve skupaj kažejo, da se lahko tirozinske ostanke STAT1, vključno s predhodno prijavljenim ostankom Y701, fosforilira s kinazami družine Abl.

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

JAK so primarno odgovorni za fosforilacijo STAT1 Y701, ki jo povzroči IFN (Villarino et al., 2017). Kot je bilo pričakovano, je fosforilacijo STAT1 Y701 induciral IFNg in jo znatno zaviral ruksolitinib, bispecifični zaviralec JAK1 in JAK2 (slika 3D). Ogroženo fosforilacijo Y701 so opazili tudi pri inhibiciji Abl (slika 3D, pas 4), kar kaže, da c-Abl delno prispeva k aktivaciji STAT1, ki jo povzroči IFNg. Poleg tega je fosforilacijo STAT1 Y701 induciral tudi DPH, aktivator c-Abl, prepusten za celice, v manjši meri kot IFNg, ki bi ga lahko popolnoma obrnil AMN107 (slika 3E). Za potrditev aktivacije Abl, ki jo povzroča DPH, je bila odkrita tudi fosforilacija c-Abl Y412, indikator aktivacije Abl (slika 3E). Dokazano je bilo, da se aktivacija JAK2 pojavi najprej in je potrebna za kasnejšo aktivacijo JAK1 (Briscoe et al., 1996). Da bi izključili učinek JAK2 na aktivacijo STAT1, smo prek CRISPR vzpostavili celično linijo jak2-KO MCF-7. Zmanjšano, a zaznavno fosforilacijo STAT1 Y701 so opazili v celicah jak2-KO MCF-7 v primerjavi s tistimi v starševskih celicah MCF-7, ki bi se lahko podobno okrepila v prisotnosti Myc-c-Abl vendar ne Myc-c-Abl (K290R) (slika 3F) in se je po zdravljenju z AMN107 dodatno zmanjšal. V c-abl / arg/celicah je bila z IFNg inducirana fosforilacija STAT1 pri Y701 močno ogrožena na način, odvisen od časa in odmerka (slika 3G). Vsa ta opažanja kažejo, da lahko c-Abl kinaza neposredno fosforilira in aktivira STAT1 neodvisno od signalne poti IFNg-JAK in da imata ti dve kinazi lahko sinergistične učinke na fosforilacijo STAT1 pri Y701.

Slika 3. STAT1 je fosforiliran s c-Abl

Slika 4. c-Abl spodbuja tvorbo dimera STAT1 in uvoz jedra

Fosforilacija, posredovana s c-Abl, uravnava transaktivacijsko aktivnost STAT1

Fosforilacija tirozina STAT je bistven korak v poti JAK-STAT signalizacije IFN in je vključena v dimerizacijo STAT, jedrsko translokacijo in vezavo DNA. Da bi raziskali, ali fosforilacija, posredovana s c-Abl, uravnava dimerizacijo STAT, sta bila GFP-STAT1 in Flag-STAT1 sočasno izražena v celicah 293T v prisotnosti ali odsotnosti Myc-c-Abl. Ravni GFP-STAT1 v imunoprecipitatih anti-Flag so bile pregledane, da bi pokazale dimerizacijo STAT1. Kot je prikazano na sliki 4A, je koekspresija c-Abl potencirala tvorbo homodimerjev STAT1-STAT1. Imunofluorescenčna mikroskopija celic MCF-7 je nadalje pokazala, da je ablacija c-abl/arg ali zdravljenje z AMN107 pomembno oslabila jedrno translokacijo STAT1, ki jo povzroči IFNg (sliki 4B in 4C).

Poleg tega so bili uporabljeni testi premika elektromobilnosti za analizo aktivnosti vezave promotorja STAT1. Kot detekcijska sonda je bila uporabljena z biotinom označena promocijska regija IRF1, ki vsebuje konsenzno sekvenco vezave STAT1 (Aaronson in Horvath, 2002). To sondo smo inkubirali z jedrskimi ekstrakti iz celic 293T, ki eksogeno izražajo STAT1 z ali brez c-Abl, kar je bilo uravnoteženo na podlagi slike S5A. Kot je prikazano na sliki 4D, so v jedrskih izvlečkih opazili številne komplekse, vezane na sondo IRF1, ki vsebujejo STAT1 (slika 4D, pas 1). Tvorba kompleksa se je rahlo povečala z zdravljenjem z IFNg (slika 4D, pas 2) in se je znatno povečala v celicah, ki ektopično izražajo c-Abl (slika 4D, pas 3). Vendar pa je c-Abl v primerjavi z WT STAT1 pokazal majhen učinek, če sploh, na vezavo promotorja STAT1, ki vsebuje Y701F (slika 4D, progi 7 in 8), medtem ko mutacije Y106F in Y665F niso pokazale skoraj nobene razlike z WT STAT1. Specifičnost kompleksov, ki vsebujejo STAT1 in detekcijsko sondo, je bila potrjena po dodatku neoznačene konkurenčne sonde (slika 4D, steza 9). Poleg tega je dodatek protitelesa proti STAT1 povzročil nastanek superpremikanega pasu (slika 4D, pas 11). Ko so označene sonde inkubirali z jedrskimi izvlečki celic 293T kot kontrolo, niso opazili nobenih kompleksov (slika 4D, pas 10). Ti rezultati kažejo, da fosforilacija STAT1 Y701, posredovana s c-Abl, potencira vezavo STAT1 z njegovimi ciljnimi promotorji.

Slika 5. c-Abl uravnava izražanje genov, povezanih z IFN

Nato je bila z IFNg inducirana transaktivacija glavnih STAT{1}}reguliranih genov, vključno s ccl5, cxcl10, cxcl11, gbp2, ido1, ifi35, irf1, isg15, oasl, psmb9 in tap1, ocenjena v WT ali c-abl/ arg DKO MCF-7 celic preko RT-PCR. Kot je bilo pričakovano, je bila transkripcija genov znatno oslabljena zaradi izčrpanja c-abl/arg (slika 5A). Poleg tega genov, ki jih tipično inducirata IFNg in IFNa, ni uspelo stimulirati z IFN v prisotnosti AMN107 (sliki 5B in 5C). Te ugotovitve kažejo, da je aktivnost transaktivacije STAT1 pozitivno regulirana s c-Abl.

c-Abl spodbuja od IFN odvisne protivirusne učinke

TAP1 in PSMB9 sta vključena v proizvodnjo in predstavitev peptidov v poti obdelave antigena MHC razreda I (Ghannam et al., 2014; Vitale et al., 1998). V skladu s prejšnjimi ugotovitvami je bila predstavitev antigena ovalbumina s celicami JAWS II celicam B3Z bistveno zavrta z AMN107 zaradi zmanjšane proizvodnje IL2 (slika 6A). Za nadaljnjo oceno protivirusnih bioloških posledic regulacije STAT1 s c-Abl so bili WT in c-abl / arg / MEF, predhodno obdelani s serijsko razredčenim IFNg ali brez njega, okuženi z virusom vezikularnega stomatitisa (VSV). Okužba z VSV je povzročila hujšo celično smrt v celicah c-abl / arg / MEF in WT, zdravljenih z AMN107, kot v WT MEF, zdravljenih z nosilci (slika 6B). Zdravljenje z IFNg je opazno zmanjšalo celično smrt, ki jo je povzročila virusna okužba, vendar je imelo veliko manj izrazit učinek v prisotnosti AMN107. V skladu s to ugotovitvijo je ablacija c-abl/arg v MEF povzročila neobčutljivost na stimulacijo z IFN, vendar je bil ta učinek opazno obrnjen z reševanjem c-Abl (slika 6B). Nato so bile celice A549, zdravljene z ali brez AMN107, okužene z virusom atipične kokošje kuge (NDV), ki je izražal GFP, in rezultati so pokazali, da je bila replikacija virusa potencirana tudi z zdravljenjem z AMN107, vendar potlačena z ekspresijo c-Abl (slika 6C). V skladu z ugotovitvijo, da transfekcija DNA povzroči aktivacijo endogenega odziva IFN (Park et al., 2003), je transfekcija z vektorjem pcDNA zavirala virusno proliferacijo. Predvsem je transfekcija z Flag-c-Abl povzročila bolj izrazit zaviralni učinek na proliferacijo virusa kot transfekcija s praznim vektorjem (slika 6C). Poleg tega je imelo zdravljenje z IFNg majhen učinek, če sploh, na virusno okužbo v prisotnosti c-Abl-selektivnega inhibitorja AMN107 (slika 6D). Ti podatki kažejo, da ima c-Abl pomembno vlogo pri STAT1-protivirusnih učinkih. Nato smo raziskali vlogo c-Abl pri virusni okužbi pri call/fl, Lck-Cre (c-abl-pogojno izločenih, c-abl-cKO) miših, pri katerih je bil c-abl specifično izločen v timocitih (slika S7A ), ker izpad gena c-abl v zarodni liniji povzroči tek in smrt v prvih dveh tednih po rojstvu (Koleske et al., 1998; Schwartzberg et al., 1991). Nato so miši WT in c-abl-cKO intranazalno okužili z virusom influence A (IAV). Med mišmi c-abl-cKO so opazili statistično nepomembno večjo smrtnost kot med mišmi WT. Miši WT, ki so jim nenehno dajali AMN107, ki sistematično zavira c-Abl/Arg kinaze v vseh tkivih, so pokazale znatno povečano občutljivost na IAV (slika 6E). Skupaj te ugotovitve kažejo, da je c-Abl potreben za protivirusno imunost pri živalih.

Slika 6. c-Abl spodbuja protivirusne učinke, odvisne od IFN

DISKUSIJA

IFNg je eden najpomembnejših imunomodulirajočih citokinov in ima ključno vlogo pri prirojeni imunosti proti virusni okužbi. Pri kanoničnem signaliziranju IFNg se po stimulaciji IFNg JAK1 in JAK2 rekrutirata v citoplazemske repe agregiranih receptorjev IFNg (IFNGR) in aktivirata prek zaporednih dogodkov avtofosforilacije in transfosforilacije (Stark, 2007; Villarino et al., 2017). Nato se STAT1 priklopi na IFNGR s povezavo svoje domene SH2 z zaporedjem prepoznavanja v IFNGR (Y440DKPH444), znotraj katerega je Y440 fosforiliran z JAK (Greenlund et al., 1995). Po fosforilaciji pri Y701 z JAK se STAT1 dimerizira in translocira v jedro, kjer spodbuja transkripcijo niza genov, ki se odzivajo na IFNg (Aaronson in Horvath, 2002; Stark in Darnell, 2012). Ablacija Stat1 pri miših povzroči odsotnost transkripcijskih odzivov na IFN in pomanjkanje z IFN induciranih protimikrobnih in protivirusnih aktivnosti v celicah (Meraz et al., 1996). Stat1 / miši kažejo tudi povečano dovzetnost za razvoj spontanih in kemično (3-metilholantren) povzročenih tumorjev (Kaplan et al., 1998) in preobčutljivost za nekatere vnetne patologije (Bettelli et al., 2004; Villarino et al. ., 2010). Poleg tega signalizacija STAT1 ščiti celice T pred citotoksičnostjo, ki jo posredujejo celice naravne ubijalke (Kang et al., 2019).Te ugotovitve kažejo, da STAT1 posreduje prirojeno imunsko aktivacijo in tumorsko imunost.

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

Schlatterer et al. poročali, da lahko c-Abl, vendar ne Arg, povzroči izgubo nevronov s spodbujanjem aktivacije STAT1 in proizvodnje interferona. Vendar natančen mehanizem, ki je odgovoren za aktivacijo STAT1, odvisno od c-Abl, ni bil pojasnjen (Schlatterer et al., 2012). Tukaj prikazujemo, da se c-Abl veže in fosforilira STAT1 in sodeluje s STAT2 neposredno in vitro (sliki 2 in 3, S8A, S9A in S10A). STAT1 Y701 je izključno fosforiliran s kinazami JAK, ki uravnavajo tvorbo dimera STAT1 (Schindler et al., 1992; Shuai et al., 1993) in nukleocitoplazmatsko premikanje med signaliziranjem IFNg (Mao et al., 2005; Mertens et al., 2006; Zhong et al., 2005). Naša študija je nepričakovano ugotovila, da c-Abl, druga kinaza, ki ni JAK, prav tako neodvisno prispeva k fosforilaciji STAT1 Y701 (slika 3). Čeprav fosforilacija Y701, ki jo posreduje c-Abl, ni tako močna kot fosforilacija JAK, se zdi, da mora Y701 doseči največjo fosforilacijo, saj so opazili resno oslabljeno fosforilacijo Y701 v c-abl / arg/celicah ob dražljaju IFNg in IFNg- inducirano fosforilacijo STAT1 Y701 je inhibiral AMN107, od 1,25 mM do 5 mM, na način, odvisen od odmerka (sliki 3G in S11A). Vendar na fosforilacijo Y701 ne vpliva veliko fosforilacijsko stanje Y106 in Y665, drugih dveh fosfozitov c-Abl, kar kaže, da potencirana fosforilacija STAT1 Y701 ni posledica fosforilacije STAT1 na več mestih, posredovane s c-Abl, ampak je verjetno pripisati povečani aktivnosti JAK. Prejšnje študije so pokazale, da so opazili konstitutivno aktivacijo JAK1 in spremenljivo aktivacijo JAK2 v celicah, ki izražajo BCR-Abl (Chai et al., 1997; Henderson et al., 1997; Shuai et al., 1996). Poleg tega se je pokazalo, da BCR-Abl zmerno aktivira STAT1 in STAT2 s tirozinsko fosforilacijo JAK1, JAK2 in JAK3 (Henderson et al., 1997). Trenutni dokazi podpirajo, da imajo lahko Abl in JAK izrazite sinergistične učinke na fosforilacijo STAT1 pri Y701 (slika 3E).

Poleg Y701 je bila istočasno identificirana fosforilacija Y106 in Y665 (sliki 3C in S4A). Ti fosfoziti niso bili vključeni v fosforilacijo STAT1 Y701 ali homodimerizacijo STAT1 (sliki S4B in S4C). Vendar pa so Murphy in sodelavci ugotovili, da je interakcija med NTD (N-terminalna proteinska interakcijska domena, aminokisline 1–136) monomerov potrebna za dimerizacijo nefosforiliranih STAT molekul polne dolžine (Ota et al., 2004). Mutanti STAT1 (F77A in/ali L78A) ne tvorijo nefosforiliranih dimerjev in ti mutanti kažejo fenotipsko obstojno fosforilacijo v celicah, obdelanih z IFN, in odpornost na defosforilacijo, ki jo posreduje TC45- in vitro (Mertens et al., 2006). Y106 v NTD, ki je blizu F77 in L78, je lahko odgovoren za vzdrževanje STAT1 v stanju fosforiliranega dimera in za vzdrževanje STAT1 v jedru pod ionizirajočim sevanjem (sliki S6A in S6B). Poleg tega domena SH2 medsebojno deluje s fosforilirano domeno, ki vsebuje tirozin, ko IFN inducira tvorbo fosforiliranega homodimera (Shuai et al., 1994). Y665, ki leži v domeni SH2, lahko vpliva na dimerizacijo. Funkcije fosforilacijskih mest, posredovanih s c-Abl (Y106 in Y665), zahtevajo nadaljnje preiskave.

Podobno kot JAK fosforilacija, posredovana s c-Abl, uravnava tvorbo dimerja STAT1 (vključno s tvorbo homodimera STAT1- STAT1 in STAT1-STAT2 heterodimera (slike 4A, S12A in S12B)), translokacijo jedra, vezavo DNA , in prepisovanje genov, stimuliranih z IFN. Motnja Abl je prispevala k povečani virusni proliferaciji in povečani z virusom povzročeni celični smrti (slike 6B, 6C in 6D). Poleg tega smo ugotovili, da je ionizirajoče sevanje (IR) povzročilo jedrsko translokacijo STAT1 v odsotnosti inhibitorja c-Abl (sliki S6A in S6B). IR neposredno aktivira c-Abl (Pendergast, 2002) in posledično STAT1-odvisno signalizacijo IFNg, ki lahko zagotovi osnovni mehanizem, s katerim obsevanje sproži kaskadni prirojeni in adaptivni imunski napad na tumor z IFN (Burnette et al. ., 2011) in nudi močnejši prirojeni imunski status kot odziv na IR dražljaje. V primerjavi s sorodniki WT iz legla so miši, pri katerih je bil c-abl pogojno izločen v timocitih, pokazale višjo, vendar ne statistično pomembno smrtnost. Predvsem miši, ki so jim sistematično dajali zaviralec c-Abl/Arg AMN107, so imele višjo smrtnost (slika 6E), kar kaže, da je izražanje c-Abl v različnih tkivih prispevalo k protivirusni imunosti pri živalih. Iz teh podatkov predlagamo, da endogeni Abl nudi latentno bazalno odpornost proti virusni okužbi in da aktivirani Abl, stimuliran z ionizirajočim sevanjem, ščiti celice. Abl kinaze so pri večini bolnikov s CML konstitutivno aktivirane. Zaviralca Abl kinaze STI571 in AMN107 predstavljata prvo linijo zdravljenja CML. Vendar pa pogosto opazimo okužbo zgornjih dihalnih poti in imunosupresijo, ki ju lahko povzroči zatiranje imunske regulacijske poti, posredovane s STAT (Hochhaus et al., 2016; Mattiuzzi et al., 2003). Naše ugotovitve so dodale teoretično podlago za optimizacijo terapije.

cistanche tubulosa - izboljšanje imunskega sistema

Če povzamemo, je bilo ugotovljeno, da se tirozin kinaza c-Abl povezuje s STAT1 in vivo in in vitro, da spodbuja fosforilacijo STAT1 pri Y701 neodvisno od JAK, da potencira transaktivacijo in posreduje prirojene imunske odzive proti okužbi, zlasti v kontekstu c -Abl povezan stres. Naša ugotovitev zagotavlja dopolnilni pristop za aktivacijo STAT1, ki prispeva k vse večjemu obsegu znanja o regulaciji spodnje signalne poti IFN.

REFERENCE

Aaronson, DS, in Horvath, CM (2002). Načrt za tiste, ki ne poznajo JAK-STAT-a. Znanost 296, 1653–1655.

Advani, AS, in Pendergast, AM (2002). Različice BcrAbl: biološki in klinični vidiki. Leuk. Res. 26, 713–720.

Bettelli, E., Sullivan, B., Szabo, SJ, Sobel, RA, Glimcher, LH, in Kuchroo, VK (2004). Izguba T-bet, vendar ne STAT1, prepreči razvoj eksperimentalnega avtoimunskega encefalomielitisa. J. Exp. med. 200, 79–87.

Bradley, WD, in Koleske, AJ (2009). Regulacija celične migracije in morfogeneze s kinazami družine Abl: nastajajoči mehanizmi in fiziološki konteksti. J. Cell Sci. 122, 3441–3454.

Briscoe, J., Rogers, NC, Witthuhn, BA, Watling, D., Harpur, AG, Wilks, AF, Stark, GR, Ihle, JN, in Kerr, IM (1996). Kinaza-negativni mutanti JAK1 lahko vzdržujejo gensko ekspresijo, inducibilno z interferonom gama, ne pa protivirusnega stanja. EMBO J. 15, 799–809.

Carlesso, N., Frank, DA, in Griffin, JD (1996). Fosforilacija tirozila in aktivnost vezave DNA signalnih pretvornikov in aktivatorjev transkripcije (STAT) proteinov v hematopoetskih celičnih linijah, transformiranih z Bcr/Abl. J. Exp. med. 183, 811–820.

Chai, SK, Nichols, GL, in Rothman, P. (1997). Konstitutivna aktivacija JAK in STAT v celičnih linijah, ki izražajo BCR Abl, in celicah periferne krvi, pridobljenih iz levkemičnih bolnikov. J. Immunol. 159, 4720–4728.

Colicelli, J. (2010). ABL tirozin kinaze: razvoj delovanja, regulacija in specifičnost. Sci. Signal. 3, re6.

Danial, NN, Losman, JA, Lu, T., Yip, N., Krishnan, K., Krolewski, J., Goff, SP, Wang, JY, in Rothman, PB (1998). Neposredna interakcija Jak1 in v-Abl je potrebna za v-Abl-inducirano aktivacijo STAT in proliferacijo. Mol. Cell Biol. 18, 6795–6804.

Danial, NN, in Rothman, P. (2000). JAK-STAT signalizacija, ki jo aktivirajo onkogeni Abl. Oncogene 19, 2523–2531.

de Groot, RP, Raaijmakers, JA, Lammers, JW, Jove, R., in Koenderman, L. (1999). Aktivacija STAT5 z BCR-Abl prispeva k transformaciji celic levkemije K562. Blood 94, 1108–1112.

Dietz, AB, Souan, L., Knutson, GJ, Bulur, PA, Litzow, MR, in Vuk-Pavlović, S. (2004). Imatinib mesilat zavira proliferacijo T-celic in vitro in zapoznelo preobčutljivost in vivo. Kri 104, 1094–1099.

Dong, Q., Li, C., Qu, X., Cao, C. in Liu, X. (2017). Globalna regulacija diferencialne genske ekspresije s c-abl/arg onkogenimi kinazami. med. Sci. Monit. 23, 2625–2635.

Ghannam, K., Martinez-Gamboa, L., Spengler, L., Krause, S., Smiljanović, B., Bonin, M., Bhattarai, S., Grutzkau, A., Burmester, GR, Haupl, T. , et al. (2014). Povečana regulacija podenot imunoproteasomov pri miozitisu kaže na aktivno vnetje z vpletenostjo celic, ki predstavljajo antigen, T-celic CD8 in IFNGamma. PLoS One 9, e104048.

Greenlund, AC, Morales, MO, Viviano, BL, Yan, H., Krolewski, J. in Schreiber, RD (1995). Rekrutacija stat s tirozinom fosforiliranimi citokinskimi receptorji: urejen reverzibilen proces, ki ga poganja afiniteta. Imuniteta 2, 677–687.

Greuber, EK, Smith-Pearson, P., Wang, J. in Pendergast, AM (2013). Vloga kinaz družine ABL pri raku: od levkemije do solidnih tumorjev. Nat. Rev. Cancer 13, 559–571.

Gu, JJ, Ryu, JR, in Pendergast, AM (2009). Abl tirozin kinaze v T-celični signalizaciji. Immunol. Rev. 228, 170–183.

Henderson, YC, Guo, XY, Greenberger, J. in Deisseroth, AB (1997). Potencialna vloga bcr-abl pri aktivaciji kinaze JAK1. Clin. Cancer Res. 3, 145–149.

Hochhaus, A., Saglio, G., Hughes, TP, Larson, RA, Kim, DW, Issaragrisil, S., le Coutre, PD, Etienne, G., Dorlhiac-Llacer, PE, Clark, RE, et al. (2016). Dolgoročne koristi in tveganja prve linije nilotiniba v primerjavi z imatinibom za kronično mieloično levkemijo v kronični fazi: 5-letna posodobitev randomiziranega preskušanja ENESTnd. Levkemija 30, 1044–1054.

Kang, YH, Biswas, A., Field, M. in Snapper, SB (2019). Signalizacija STAT1 ščiti celice T pred citotoksičnostjo, ki jo posredujejo celice NK. Nat. Komun. 10, 912.

Kaplan, DH, Shankaran, V., Dighe, AS, Stockert, E., Aguet, M., Old, LJ, in Schreiber, RD (1998). Prikaz sistema za nadzor tumorja, odvisnega od interferona gama, pri imunokompetentnih miših. Proc. Natl. Akad. Sci. ZDA 95, 7556–7561.

Koleske, AJ, Gifford, AM, Scott, ML, Nee, M., Bronson, RT, Miczek, KA, in Baltimore, D. (1998). Bistvene vloge tirozin kinaz Abl in Arg pri nevrulaciji. Neuron 21, 1259–1272.

Leaman, DW, Pisharody, S., Flickinger, TW, Commane, MA, Schlessinger, J., Kerr, IM, Levy, DE, in Stark, GR (1996). Vloge JAK pri aktivaciji STAT in stimulaciji ekspresije gena c-fos z epidermalnim rastnim faktorjem. Mol. Cell Biol. 16, 369–375.