Terapevtski učinek feniletanoidnih glikozidov na s ciklopfosfamidom povzročeno diszoospermijo pri miših in njen mehanizem

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

ZHAO Dong-hail, ZHANG Lei?, ZHANG Yan², QI Ling', ZOU Xiang-ming'

Povzetek: Cilj Raziskati terapevtski učinek feniletanoidnih glikozidov na s ciklofosfamidom (CTX) povzročeno diszoospermijo pri miših in predhodno razjasniti mehanizme, vključene v proces. Metode Feniletanoidni glikozid smo ekstrahirali z ekstrakcijo z etanolom. Štirideset samcev miši BALB/C smo naključno razdelili v kontrolno skupino, modelno skupino, skupino z nizkimi odmerki feniletanoidnih glikozidov (50 mg·kg-I) in skupino z visokimi odmerki feniletanoidnih glikozidov (100 mg). ·kg-). Razen pri kontrolni skupini je bil mišji model diszoospermije vzpostavljen s peritonealno injekcijo CTX v dnevnem odmerku 80 mg · kg-i, enkrat na dan zaporednih 5 dni. Po modeliranju smo feniletanoidne glikozide intragastrično dajali v ustreznih odmerkih vsaki skupini feniletanoidnih glikozidov. Miši v kontrolni skupini in modelni skupini so dajali enako količino normalne fiziološke raztopine z gastrogavažo. Vsa zdravila so bila uporabljena enkrat na dan zaporednih 30 dni. Tkivo mod je bilo pridobljeno 24 ur po zadnjem intragastričnem dajanju. Raven testosterona v tkivnem homogenatu mod je bila določena z encimskim imunskim testom. Primerjali so število semenčic, stopnje gibljivosti in stopnje teratozoospermije v različnih skupinah. Morfološke spremembe tkiva mod smo opazovali z barvanjem s HE. Rezultati V primerjavi s kontrolno skupino sta se število semenčic in stopnja gibljivosti zmanjšala, stopnja teratozoospermije se je povečala, raven testosterona v tkivnem homogenatu testisov pa se je zmanjšala v modelni skupini (P<0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" counts="" and="" the="" motility="" rates="" were="" increased,="" the="" teratozoospermia="" rates="" were="" decreased,="" and="" the="" testosterone="" levels="" in="" the="" testis="" tissue="" homogenate="" were="" increased="" in="" phenylethanoid="" glycosides=""><0.05 or=""><0,01). the="" histological="" results="" showed="" atrophy="" and="" degeneration="" of="" seminiferous="" tubule,="" thicker="" seminiferous="" epithelium,="" and="" azoospermic="" lumina="" in="" the="" model="" group;="" the="" number="" of="" seminiferous="" epithelial="" layers="" was="" increased="" and="" the="" seminiferous="" cells="" orderly="" arranged,="" and="" many="" sperms="" were="" found="" in="" the="" tubules="" in="" phenylethanoid="" glycosides="" groups.="" conclusion="" phenylethanoid="" glycosides="" have="" obviously="" therapeutical="" effects="" on="" ctx-induced="" dyszoospermia="" in="" mice,="" and="" their="" mechanisms="" might="" be="" correlated="" with="" recovering="" the="" testosterone="">

Ključne besede: feniletanoidni glikozidi; ciklofosfamid; spermatogena okvara; miši, BALB/C

Cistanche deserticola ima številne učinke, kliknite tukaj za več informacij

Zaradi pospešenega družbenega ritma, slabih življenjskih navad in onesnaženosti okolja ter drugih dejavnikov je nenormalna kakovost sperme, kot sta oligospermija in astenospermija, postala glavni vzrok za moško neplodnost [1]. Trenutno je manj zdravil za zdravljenje oligospermije in astenospermije, terapevtski učinek pa ni očiten. Recepti tradicionalne kitajske medicine ali učinkovine dobro vplivajo na izboljšanje reproduktivne funkcije moških [2-6]. Vendar pa zaradi široke palete zdravil na recept razmerje med farmakološkimi učinki in učinkovitimi sestavinami zdravila ni jasno, kar omejuje promocijo in uporabo spermatogenih zdravil. Raziskave in razvoj učinkovitih sestavin tradicionalne kitajske medicine ter preučevanje njenih terapevtskih učinkov pri reproduktivnih poškodbah imajo dobro uporabno vrednost. Thefeniletanoidni glikozidiv Cistanche so cistanche ena najpomembnejših učinkovin v Cistanche. Običajno so naravni glikozidi, ki vsebujejo estrske in okso-glikozidne vezi z -glukozo kot jedrom. Široko so prisotni v dvokaličnicah 7]. Študije [8] so pokazale, da lahko fenetanol glikozidi Cistanche zaščitijo spermo podgan pred oksidativnimi poškodbami in vitro, vendar ni poročil o njeni spermatogenezi. Ta poskus preučuje terapevtske učinke Cistanchefeniletanoidni glikozidio spermatogenezi miši s ciklofosfamidom inducirano spermatogenezo in zagotavlja eksperimentalno in teoretično osnovo za uporabo glikozidov fenetilnega alkohola Cistanche pri zdravljenju motenj spermatogeneze.

1 Material in metode

1.1 Poskusne živali, glavni reagenti in instrumenti

40 odraslih miši SPF BALB/C, starih 6-8 tednov, teže 20-22 g, kupljenih pri Animal Experimental Center School of Basic Medicine Univerze Jilin, številka potrdila o živalih: SCXK (Kirgizistan) {{3} }. Miši so bile prilagojeno vzrejene 5 dni pred poskusom. Pogoji hranjenja: 22 stopinj -25 stopinj, cirkadiani ritem (12 h/12 ​​h), brezplačna pitna voda in hrana. Cistanche je izdelek Xinjiang Dakang Trading Company, ciklofosfamid za injiciranje je bil kupljen pri Jiangsu Hengrui Pharmaceutical Co., Ltd. (št. serije 11061921), komplet za encimski imunski test homogenata testisnega tkiva je bil kupljen pri Tianjin Jiuding Medical Bioengineering Co., Ltd. (številka serije 20120812), vsi drugi reagenti so domače proizvedene analitske stopnje. Čitalnik mikroplošč PLUS384 (MDC, ZDA), invertni mikroskop TE2000U (Nikon, Japonska), centrifuga J-26XP (Nanodrop, ZDA).

1.2 Priprava cistančfeniletanoidni glikozidi

10 gCistanche tubulosaprašek refluktiramo s 70-odstotnim etanolom, dvakrat po 2 uri, da dobimofeniletanoidni glikozidosredotočiti. Koncentrirano raztopino smo izpostavili kromatografiji na koloni z makroporozno smolo D101 in eluirali s 70-odstotnim etanolom, da smo dobiliCistanche feniletanoidni glikozidalkohol. UV spektrofotometer je ekstrakt identificiral pri valovni dolžini 333 nm.

1.3 Priprava živalskega modela in metode dajanja

40 samcev miši BALB/C je bilo 5 dni prilagojeno hranjenih in miši so bile naključno razdeljene v 4 skupine (10 miši v vsaki skupini): kontrolna skupina, modelna skupina, Cistanche cistanche nizek odmerek feniletanoidnih glikozidov in visok odmerek Cistanche fenetil alkohola skupino glikozidov. Razen kontrolne skupine so druge tri skupine miši dobile intraperitonealno injekcijo ciklofosfamida 80 mg·kg-1 za vsako miško 5 zaporednih dni, da so pripravili živalske modele motnje spermatogeneze. Ko je bil model pripravljen, so miši v skupinah z nizkimi in visokimi odmerkiCistanche feniletanoidso dajali 50 oziroma 100 mg·kg-'·d-'. , 1-krat na dan 30 zaporednih dni. Vse miši so žrtvovali 24 ur po zadnjem dajanju in opravili dvostranske teste. Desni testis je bil fiksiran v formaldehidu. Epididimis in testis so vzeli z leve strani. Testis smo homogenizirali in centrifugirali pri 3,000 r·min 10 minut. Supernatant smo vzeli in shranili v hladilniku pri 20 stopinjah za testiranje. Levi epididimis je bil testiran na gostoto semenčic, gibljivost semenčic in stopnjo deformacije.

1.4 Določanje gostote semenčic, gibljivosti semenčic in stopnje deformacije

Epruveto, ki vsebuje 10 ml hranilne raztopine sperme, postavite v vodno kopel s konstantno temperaturo, da se segreje na 37 stopinj, odstranite vezivno tkivo in maščobo z ene strani epididimisa, tkivo odrežite in ga dajte v epruveto pri 37 stopinjah. za 10 min. Ko se semenčice popolnoma sprostijo, kanite 1 kapljico na ploščo za štetje krvnih celic in izračunajte gostoto semenčic v skladu z metodo štetja celic. Rezultat je izražen kot število semenčic na mililiter; poleg tega vzemite 5 μL suspenzije semenčic iz epruvete in jo zmešajte z enako količino Eosin-Y Enally, postavite na sobno temperaturo za 10 minut, dodajte pokrovno steklo in opazujte s svetlobnim mikroskopom. Mrtve semenčice so obarvane rožnato, žive semenčice pa niso obarvane, vendar je citoplazma prozorna. Preštejte 200 semenčic na vzorec, izračunajte viabilnost semenčic in rezultat izrazite v odstotkih, viabilnost semenčic=število živih semenčic/skupno število semenčic × 100 odstotkov. Drugih 5 μL suspenzije sperme smo 5 minut fiksirali v metanolu, posušili in 1 uro obarvali z 2-odstotno vodno raztopino eozina, splaknili in posušili s fenom. Pod mikroskopom z nizko močjo poiščite dele z manj prekrivanjem semenčic in z mikroskopom z visoko močjo preverite morfologijo semenčic v zaporedju. Vsaka miška je pregledala 1000 popolnih semenčic. Glavice semenčic so bile odvezane, bananaste oblike, amorfne, debele glave, dvoglave itd. so bile ocenjene kot deformacije. Izračunali smo stopnjo deformacije semenčic in rezultate izrazili v odstotkih. Stopnja deformacije semenčic=število deformiranih semenčic/skupno število semenčic × 100 odstotkov.

1.5 Določanje reproduktivnih hormonov

Testis smo olupili in dali v posodo z vialo ter predhodno ohlajen homogenizacijski medij (0.01 mol·L-saharoze, 0,01 mol·L{{ 6}}Tris-HCl, 0,1 mmol· L-1raztopine EDTA-Naz, pH 7,4), z oftalmološkimi škarjami prerežemo tkivo mod, vlijemo v stekleno homogenizacijsko epruveto in homogeniziramo, centrifugiramo pri 4 000 ×g 10 minut pri nizki temperaturi, vzemite supernatant in uporabite encimsko vezan imunski reagent. Raven testosterona v homogenatu testisnega tkiva je bila določena s škatlo in za vsak vzorec so bili testirani 3 vzporedni vzorci. Eksperimentalni koraki in metode so bili dokončani v skladu z navodili kompleta.

1.6 Morfološko opazovanje tkiva mod

Vzemite parafinske reze mišjega testisa, HE madeže in pod svetlobnim mikroskopom opazujte porazdelitev spermatogonijev in spermatogenih celic v tkivu testisa.

1.7 Statistična analiza

Statistična analiza je bila izvedena s statistično programsko opremo SPSS 17.0. Gostota semenčic, stopnja gibljivosti semenčic, stopnja deformacije semenčic in raven testosterona v testisih miši v vsaki skupini so bili izraženi kot z±s, primerjava med skupinami pa je bila izvedena z enosmerno analizo variance.

2. rezultati

2.1 Gostota semenčic, sposobnost preživetja semenčic in stopnja deformacije semenčic vsake skupine miši

V primerjavi s kontrolno skupino sta se gostota semenčic in stopnja gibljivosti semenčic v modelni skupini zmanjšali (P<0.01), and="" the="" sperm="" deformity="" rate="" increased=""><0.01). compared="" with="" the="" model="" group,="" the="" sperm="" density="" and="" sperm="" motility="" rate="" of="" mice="" in="" each="" dose="" group="" of="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" increased=""><0.05 or=""><0.01), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><0.05 and=""><0.01). compared="" with="" the="" low-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group,="" the="" high-dose="">Cistanche fenetil alkoholni glikozidpovečana gostota semenčic in gibljivost semenčic (P<0.05), and="" the="" rate="" of="" sperm="" deformity="" decreased=""><>

2.2 Ravni testosterona v tkivih testisov miši v vsaki skupini

Ravni testosterona v homogenatih testikularnega tkiva kontrolne skupine in modelne skupine so bile (10.26±0.57) oziroma (5,33±0,84) nmol·L-'. Raven testosterona v modelni skupini je bila bistveno nižja kot v kontrolni skupini (P<0.01). the="" testosterone="" levels="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="" low-dose="">Cistanche feniletanoidni glikozidskupini sta bili (7,55±1,21) in (10.35±0,94) nmol·L-1. Ravni testosterona nizkega in visokega odmerka Cistanchefeniletanoidni glikozidskupine so bile znatno višje od tistih v modelni skupini (P<0.05 or=""><0.01). the="" level="" of="" testosterone="" in="" the="" testicular="" tissue="" homogenate="" of="" the="" high-dose="" cistanche="" phenethyl="" alcohol="" glycoside="" group="" was="" significantly="" higher="" than="" that="" of="" the="" low-dose="" group=""><>

2.3 Morfologija testisov miši v vsaki skupini

Opazovano s svetlobnim mikroskopom; spermatogene tubule v testisih normalne skupine so gosto razporejene, raven in število zarodnih celic je veliko, semenski epitelij je lepo urejen in semenske tubule tvorijo semenčice. V modelni skupini so bili semenski tubuli v testisih miši atrofirani in degenerirani, semenski epitelij je bil znatno stanjšan, število epitelijskih plasti zmanjšano, razporeditev je bila neurejena in število semenčic v votlini je bilo zmanjšano. V primerjavi z modelno skupino je število semenskih tubulov in plasti semenskega epitelija pri nizkih odmerkihCistanche feniletanoidni glikozidskupina se je povečala, razporeditev epitelija je bila bolj pravilna in poškodbe semenskih tubulov so se bistveno izboljšale; visok odmerekCistanche feniletanoidni glikozidskupina bolj izboljšala strukturo semenskih tubulov, Število in število semenskega epitelija se je močno povečalo, so lepo razporejeni, v semenskih tubulih so zrele semenčice in struktura se je načeloma normalizirala. Glej sliko 1 (vložek 6).