Trombomodulin izboljšuje kronično ledvično bolezen, posredovano s transformacijskim rastnim faktorjem b1, prek signalne poti receptorja 15/Akt, vezanega na G-protein

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Atsuro Takeshita1,2,8, Taro Yasuma1,2,8, Kota Nishihama1, Corina N. D'Alessandro-Gabazza2, Masaaki Toda2, Toshiaki Totoki4, Yuko Okano1,2, Akihiro Uchida1, Ryo Inoue6, Liqiang Qin7, Shujie Wang5, Valeria Fridman D'Alessandro2, Tetsu Kobayashi3, Yoshiyuki Takei4, Akira Mizoguchi5, Yutaka Yano1,9 in Esteban C. Gabazza2,9

1 Oddelek za sladkorno bolezen, presnovo in endokrinologijo, Medicinska fakulteta univerze Mie, Tsu-city, Mie, Japonska; 2 Oddelek za imunologijo, Medicinska fakulteta Univerze Mie, Tsu-city, Mie, Japonska; 3 Oddelek za pljučno in intenzivno nego Medicinske fakultete Univerze Mie, Tsu-city, Mie, Japonska; 4 Oddelek za gastroenterologijo in hepatologijo, Medicinska fakulteta Univerze Mie, Tsu-city, Mie, Japonska; 5 Oddelek za nevronsko regeneracijo in celično komunikacijo, Medicinska fakulteta Univerze Mie, Tsu-city, Mie, Japonska; 6 Centralni inštitut za poskusne živali, Kawasaki-ku, Kawasaki, Kanawaga, Japonska; in 7 Oddelek za nefrologijo, bolnišnica Taizhou, Medicinska univerza Wenzhou, Lihai, provinca Zhejiang, Ljudska republika Kitajska.

Kidney International (2020) 98, 1179–1192; https://doi.org/10.1016/ j.kint.2020.05.041

Avtorska pravica ª 2020, Mednarodno združenje za nefrologijo. Izdalo Elsevier Inc. To je članek z odprtim dostopom pod licenco CC BY-NC-ND (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).

Korespondenca: Esteban C. Gabazza, Oddelek za imunologijo, Medicinska fakulteta Univerze Mie, Edobashi 2-174, Tsu-city, Mie 514-8507, Japonska. E-pošta: gabazza@doc.medic.mie-u.ac.jp; ali Yutaka Yano, Diabetes, Metabolism and Endocrinology, Mie University Graduate School of Medicine, Edobashi 2-174, Tsu-city, Mie 514-8507, Japonska. E-pošta: yanoyuta@clin.medic.mie-u.ac.jp 8 AT in TY sta enako prispevala k temu delu. 9 YY in ECG sta soavtorja. Prejeto 1. septembra 2019; revidirano 24. aprila 2020; sprejet 7. maja 2020

KLJUČNE BESEDE: apoptoza; kronična ledvična bolezen; G-protein sklopljeni receptor; rekombinantni humani trombomodulin; transformacijski rastni faktor-b1

Ledvična fifibroza je pogosta posledica kroničnih ledvičnih bolezni, ki nezadržno napreduje v končno ledvično bolezen z odpovedjo organa, ki jo je mogoče zdraviti le z nadomestnim zdravljenjem. Ker je transformirajoči rastni faktor-b1 glavni akter v patogenezi ledvične fifibroze, smo postavili hipotezo, da lahko rekombinantni trombomodulin izboljša progresivno ledvično fifibrozo in odpoved, ki jo povzroča transformirajoči rastni faktor-b1. Da bi preverili našo hipotezo, smo ustvarili novo transgeno miško s človeškim transformirajočim rastnim faktorjem b1, specifično za glomerule, da bi ocenili terapevtski učinek rekombinantnega trombomodulina. Pri tej transgeni miši se je razvila progresivna glomerularna skleroza in tubulointersticijska fifibroza z odpovedjo ledvic. Terapija z rekombinantnim trombomodulinom v trajanju štirih tednov je v primerjavi z nezdravljenimi transgenskimi mišmi pomembno zavirala fifibrozo ledvic in izboljšala delovanje organa. Zdravljenje z rekombinantnim trombomodulinom je znatno zaviralo apoptozo in mezenhimsko diferenciacijo podocitov z interakcijo z G-proteinom vezanim receptorjem 15, da se aktivira signalna pot Akt in poveča izražanje anti-apoptotičnih proteinov, vključno s survivinom. Tako naša študija močno kaže na potencialno terapevtsko učinkovitost rekombinantnega trombomodulina za zdravljenjekronična ledvična bolezenin posledično odpoved organa.

cistanchelahkozdravijo bolezni ledvicizboljšati delovanje ledvic

Prevajalska izjava

Fibroza in disfunkcijaledviceso trenutno velike zdravstvene težave po vsem svetu. Trenutno ni odobrenega antifibrotičnega zdravila za zdravljenje ledvične fifibroze. Transformacijski rastni faktor-b1 je glavno in pogosto gonilo ledvične fibrogeneze pri kronični ledvični bolezni, ki jo povzročajo številne motnje. Tu smo ugotovili, da rekombinantni trombomodulin, zdravilo, odobreno na Japonskem za zdravljenje diseminirane intravaskularne koagulacije, zavira napredovanje glomerularne skleroze, tubulointersticijske fifibroze in ledvične odpovedi, ki jo povzroča prekomerna ekspresija človeškega transformirajočega rastnega faktorja-b1, kar kaže na njegovo potencialno terapevtsko vrednost za zdravljenje odkronične bolezni ledvic.

Kronična ledvična bolezenje velik javnozdravstveni problem, povezan z visoko obolevnostjo in umrljivostjo, ki prizadene približno 13 odstotkov odraslega prebivalstva v razvitih državah.1 Svetovna zdravstvena organizacija je poročala, dakronična ledvična bolezen(CKD) je bil leta 2012 vzrok za 1,5 odstotka smrti po vsem svetu.1 Poleg tega nedavni epidemiološki podatki kažejo na globalno vztrajno naraščanje števila bolnikov s KLB.2,3 V večini primerov se patološki proces postopoma razvija, kar na koncu vodi do konca. stadij ledvične odpovedi, ki je ozdravljiva le z vseživljenjsko dializo ali presaditvijo ledvice.4,5 Sladkorna bolezen (DM) in arterijska hipertenzija sta najpogostejša vzroka kronične ledvične bolezni, sledijo ji ishemija, glomeruloskleroza neznane etiologije, urološke obstrukcije in kronične okužbe.6 Ne glede na osnovno motnjo je končna in pogosta patološka posledica CKD fifibroza ledvic.7 Ledvična fifibroza je nenormalno celjenje in preoblikovanje parenhimskih struktur ledvic, ki so izpostavljene dolgotrajni ali ponavljajoči se poškodbi, za katero je značilna prisotnost tubulointersticijske fifibroze, glomeruloskleroza in tubularna atrofija.8 Glavno gonilo ledvične fifibrogeneze je transformacija dejstva rasti ali (TGF)-b1.8,9 TGFb1 lahko spodbuja fifibrozo s spodbujanjem izločanja proteinov zunajceličnega matriksa in kemotaktičnih faktorjev ali proliferacijskih faktorjev fibroblastov, z zaviranjem metaloproteinaz in s spodbujanjem epitelno-mezenhimskega prehoda.10 Poleg zdravljenja osnovne bolezni , odobreno zdravilo, ki cilja specifično na ledvično fifibrozo, trenutno ni na voljo.6

Trombomodulin (TM) je transmembranski glikoprotein z več biološkimi funkcijami, vključno z modulacijo sistema strjevanja krvi, imunskim odzivom, vnetnimi reakcijami in preživetjem celic.11 Molekularna struktura TM vsebuje domeno, podobno lektinu, 6 domen, podobnih epidermalnemu rastnemu faktorju. , s serinom/treoninom bogato domeno, transmembranski del in citoplazemski rep.12 Trombin, prokoagulantni faktor, ki nastane med aktivacijo koagulacijskega sistema, po vezavi na TM postane antikoagulant in antifibrinolitični faktor.13 Kompleks TM-trombina poveča nastajanje aktiviranega proteina C (APC), antikoagulanta s protivnetnim in citoprotektivnim delovanjem, z aktiviranjem proteina C. Poleg tega lahko samo TM neposredno zniža vnetni odziv z zaviranjem aktivnosti proteina B skupine z visoko mobilnostjo-1 (HMGB1), z zaviranjem imunogenih dendritičnih celic, eozinofilcev, mastocitov in sistema komplementa.13–18

Objavljeni so rezultati, ki kažejo preventivne učinke TM pri diabetični renopatiji in ishemično-reperfuzijski ledvični poškodbi.19-21 Vendar pa nobena študija ni ocenila učinka rekombinantne TM na progresivno ledvično fifibrozo, ki jo povzroča TGFb1, pogost povzročitelj ledvične fibroze pri več bolezni, ki povzročajo KLB. Postavili smo hipotezo, da lahko TM izboljša fifibrozo ledvic in ledvično odpoved, ki jo povzroča TGFb1-. Da bi preverili to hipotezo, smo ovrednotili terapevtski učinek rekombinantne TM pri na novo razviti za glomerule specifične TGFb1 transgene (TG) miši, ki razvije progresivnoledvična fifibroza in odpoved ledvic.

cistanche za ledvice

REZULTATI

Povečano kroženje fragmentov TM je povezano z ledvično disfunkcijo

TM, glikoprotein, vezan na membrano endotelijskih celic, se razcepi na fragmente in izgubi svoje zaščitne funkcije med endotelno poškodbo.22 Diabetična nefropatija je povezana z endotelno poškodbo.23,24 Bolniki s sladkorno boleznijo z nefropatijo so v primerjavi z bolniki brez nefropatije pokazali pomembno visoko ravni TM v obtoku (4,4 proti 3,3 pg/ml) in aktivnega TGFb1 (0.28 proti 0.24 ng/ml) (dodatna tabela S1, dodatna slika S1A). TM je pomembno povezan s kreatininom, aktivnim TGFb1 in topnim podocinom (dodatna slika S1B). Ta opažanja kažejo, da je izguba funkcionalnega membransko vezanega TM povezana s povečanim sproščanjem aktivnega TGFb1 in disfunkcijo ledvic.

TG miška z za glomerule specifično ekspresijo celotnega človeškega gena TGFb1

Razvili smo TG miško, ki prekomerno izraža človeški gen TGFb1 celotne dolžine v podocitih. Miško smo ustvarili s postavitvijo človeškega TGFb1 pod nadzor promotorja podocina na konstrukt bakterijskega umetnega kromosoma (BAC) (dodatna slika S2; dopolnilna slika S3). Dobili smo 5 miši začetnic, ki izražajo 3 kopije, in 3 miši začetnice, ki izražajo 1 kopijo človeškega transgena TGFb1. Ekspresija transgena je bila specifična za ledvice in potomci ustanoviteljev so bili sposobni preživeti (dodatna slika S3). Miši so imele donošene nosečnosti in leglo je bilo normalne velikosti. Miške so bile rojene v pričakovanem mendelskem razmerju.

Za karakterizacijo miši TG smo izmerili večledvični parametrivsake 4 tedne v obdobju 16 tednov (dodatna slika S4). Koncentracije TGFb1 v plazmi in urinu so bile pri miših TGFb1- TG znatno povečane v primerjavi z mišmi divjega tipa (WT) od prvih tednov po rojstvu in so nato ostale stabilne na visoki ravni (slika 1a). TGFb1-TG miši so pokazale znatno povečanje vsebnosti hidroksiprolina v ledvičnem tkivu v 20. tednu (190.5 v primerjavi s 96.0 mg/ledvico ), mezangialno širjenje od 4. tedna (1,9 v primerjavi z 1,1 rezultatom) in pri odlaganju kolagena od 12. tedna (0,9 odstotka v primerjavi z 0,1 odstotka) po rojstvu v primerjavi z njihovimi primerki WT (slika 1a–f). ). Konvencionalna optična mikroskopija je pokazala razširitev bazalne membrane Bowmanove kapsule, odebelitev glomerularne bazalne membrane, povečano odlaganje kolagena v mezangialnih in intersticijskih prostorih ter tubularno atrofijo (slika 1bd). Transmisijska elektronska mikroskopija je pokazala glomerulosklerozo, vključno s transformacijo mikrovil in izbrisom nožnega procesa podocitov, zmanjšano fenestracijo endotelija glomerularnih kapilar, zadebelitev glomerularne bazalne membrane in povečano odlaganje mezangialnega matriksa (slika 2a–i). Koncentracije zgodnjih označevalcev nefropatije v urinu beljakovine, ki veže maščobne kisline (185,1 proti 87,0 pg/ml) inpoškodba ledvicmolekule 1 (441,9 proti 256,9 pg/ml) so bile znatno povečane pri miših TGFb1-TG od 4. oziroma 8. tedna starosti v primerjavi z njihovimi starostno usklajenimi WT mišmi (dodatna slika S5). Celotna proteinurija in skupno razmerje med beljakovinami in kreatininom v urinu sta se znatno povečala v 4., 8., 12., 16. in 20 tednu pri miših TGFb1-TG v primerjavi z njihovimi primerki WT (slika 3a) . Raven dušika sečnine v krvi je bila pri miših TGFb1-TG pomembno povišana od 4. tedna (5,1 v primerjavi s 4,1 mg/dl), koncentracija kreatinina pa od 8. tedna (1,1 v primerjavi z 0,4 mg/dl). v primerjavi z njihovimi primerki WT (slika 3b).

rhTM zavira glomerulosklerozo in tubulointersticijsko fifibrozo

V primerjavi z mišmi TGFb{{0}}TG, zdravljenimi s fiziološko raztopino (SAL), in mišmi WT, zdravljenimi z rekombinantnim humanim (RH) TM ali SAL, so miši TGFb1-TG, zdravljene z ritmom, pokazale znatno zmanjšano mezangialno ekspanzija/celičnost (1,3 v primerjavi s 3{{30}} oceno) in znatno nizko tubulointersticijsko odlaganje kolagena in glomeruloskleroza (121,3 odstotka v primerjavi s 139,7 odstotka) (slika 4a–e). V skladu s temi opažanji so vsebnost hidroksiprolina (11,7 v primerjavi z 19,9 mg/g), koncentracije kolagena I v ledvičnem tkivu (101,3 v primerjavi s 196,7 ng/mg beljakovin) in periostina (21,7 v primerjavi s 40,8 ng/g/g). mg proteina), relativna ekspresija mRNA kolagena I pa se je znatno zmanjšala v ledvičnih tkivih miši TGFb1-TG, zdravljenih z rhTM, v primerjavi z ledvičnimi tkivi kontrolnih miši (slika 4f, dodatni tabeli S2 in S3). Transmisijska elektronska mikroskopija je pokazala znatno zmanjšanje izbrisovanja stopalnega procesa podocitov in zadebelitev glomerularne bazalne membrane pri miših, zdravljenih z rhTM, v primerjavi z mišmi, zdravljenimi samo s SAL (dopolnilni sliki S6AB in B). Poleg tega so bile koncentracije profibrotičnih citokinov monocitne kemoatraktantne beljakovine -1 (45,0 proti 76,1 pg/mg beljakovin), interlevkina -13 (612,1 proti 1002,0 pg/mg beljakovin) in aktivnega TGFb1 v tkivu ledvic (131,0 v primerjavi s 151,5 pg/mg beljakovin) so bile znatno zmanjšane pri miših TGFb1-TG, zdravljenih z rhTM, v primerjavi s kontrolnimi mišmi (dodatna slika S7). Koncentracija HMGB1 v ledvičnem tkivu je bila prav tako pomembno zmanjšana v ledvičnem tkivu miši TGFb1-TG, zdravljenih z rhTM, v primerjavi zledvična tkivaiz kontrolnih miši (dodatna slika S7). Plazemska koncentracija trombinskega antitrombinskega kompleksa je bila v skupini s TGFb1-TG/SAL znatno povečana v primerjavi s skupino z WT/SAL, vendar med skupinama s TGFb1-TG/rhTM in WT/rhTM niso ugotovili nobene razlike (Dodatna slika S8A). Kot je bilo pričakovano, je bila v plazmi miši TGFb1-TG in WT, zdravljenih z rhTM, visoka koncentracija TM. Plazemska koncentracija kompleksa APC/antitripsin se je pomembno zmanjšala v skupini s TGFb1-TG/SAL v primerjavi s skupinama z WT/SAL in TGFb1-TG/rhTM (280,5 v primerjavi s 384,6 pg/ml) in ni bilo pomembne razlike v ravni zaviralca aktivatorja plazminogena-1 (dodatna slika S8A). Ravni C5a v plazmi, urinu inledvičnega tkiva(630.1 v primerjavi z 1075,0 pg/mg beljakovin) in plazemsko topni podocin sta se znatno zmanjšala pri miših TGFb1-TG, zdravljenih z rhTM, v primerjavi z mišmi TGFb1-TG, zdravljenih s SAL (Dodatna slika S8B). Raven podocina v urinu je bila višja v skupini TGFb1-TG/SAL kot v skupinah WT/SAL in TGFb1-TG/rhTM (dodatna slika S9A–C).

Slika 1|Transgenska (TG) miška človeškega transformirajočega rastnega faktorja b1 (TGFb1) razvije progresivno fifibrozo ledvic. (a) Koncentracije proteina TGFb1 v plazmi in urinu so bile izmerjene z encimskim imunskim testom, vsebnost tkivnega hidroksiprolina pa s kolorimetričnim testom. (b–d) Odseki ledvičnega tkiva so bili obarvani z (b) periodično kislino–Schiff (palice ¼ 20 mm) in (c,d) Massonov trikrom (palice ¼ 10{{ 40}} mm) in nato (e, f) kvantificirano z uporabo točkovalnega sistema ali programske opreme za slikanje WinROOF (Mitani Corporation, Tokio, Japonska). Število miši za oceno ledvičnega tkiva: za miši divjega tipa (WT) n=4 pri 4, 12 in 20 tednih; za miši TG, n=7 pri 4 tednih, n=8 pri 16 tednih in n=9 pri 20 tednih. Število miši za oceno plazme in urina: za miši WT, n=12 pri 4 tednih, n=8 pri 8 tednih, n=7 pri 12 tednih in n=4 pri 16 in 20 tednih; za miši TG, n=24 pri 4 tednih, n=17 pri 8 in 12 tednih in n=9 pri 16 in 20 tednih. Podatki so izraženi kot mediana interkvartilnega razpona. Statistična analiza z Mann-Whitneyjevim U testom. *P <0,05, **p=""><0,01, ****p=""><0,0001. ns,="" ni="" pomembno.="" za="" optimizacijo="" gledanja="" te="" slike="" si="" oglejte="" spletno="" različico="" tega="" članka="" na="">

Slika 2|Ugotovitve transmisijskega elektronskega mikroskopa v modelu ledvične fifibroze, ki jo povzroča transformirajoči rastni faktor b1. Fiksacija, ravnanje in odstranitev ledvic iz miši so bili izvedeni, kot je opisano v Metodah. (a,b) mikrovilozna transformacija in (a,b,d,e,g) izbris nožnih procesov (bele puščice) podocitov, (c–e) zmanjšana glomerulna kapilarna endotelna fenestracija (rumene puščice), (f) zadebelitev prisotna sta glomerularna bazalna membrana (zvezdice) in (h,i) povečano odlaganje mezangialnega matriksa (bele puščice). CL, kapilarni lumen. Za optimizacijo gledanja te slike si oglejte spletno različico tega članka na www.kidney-international.org.

rhTM izboljšuje delovanje ledvic

Ravni beljakovine, ki veže L-maščobne kisline (197.0 v primerjavi s 313,4 pg/ml),molekula poškodbe ledvic1 (299,9 v primerjavi s 596,2 pg/ml), dušik sečnine v krvi (12,9 v primerjavi s 34,8 mg/dl), kreatinin (0.5 v primerjavi z 1,4 mg/dl) in razmerje albumin-kreatinin so se znatno zmanjšali v TGFb1-TG miši z ledvično fibrozo, zdravljene z rhTM, v primerjavi z njihovimi nezdravljenimi TG miši (slika 5). Celotne beljakovine v urinu in razmerje med skupnimi beljakovinami in kreatininom sta se prav tako zmanjšala pri miših TGFb1-TG, zdravljenih z rhTM, v primerjavi z njihovimi nezdravljenimi mišmi (slika 5).

rhTM zmanjša apoptozo glomerularnih celic

Končno označevanje dUTP nick končnega označevanja s terminalno deoksinukleotidil transferazo je pokazalo znatno zmanjšano število apoptotičnih celic v glomerulih miši TGFb1-TG, zdravljenih z rhTM, v primerjavi z glomeruli miši TGFb1- TG, zdravljenih s SAL (dopolnilni Slika S10A in B). Razcepitev kaspaze-3 je bila tudi znatno zmanjšana v tkivih ledvic miši TGFb1-TG, zdravljenih z rhTM, v primerjavi z tkivi ledvic miši TGFb1-TG, zdravljenih s SAL (dodatna slika S10C). Theledvična tkivaiz miši TGFb1-TG, zdravljenih z rhTM, so v primerjavi s tistimi iz TGFb1-TG, zdravljenih s SAL, pokazale znatno zvišanje ravni mRNA B-celičnega limfoma 2 (Bcl-2), B -celični limfom-zelo velik (Bcl-XL), bakulovirusni zaviralec apoptoze, ki vsebuje ponovitev 5 (BIRC5, znan tudi kot survivin), in BIRC6 (Apollon) s povečanim razmerjem Bcl-2–Bax (dodatna slika S11) ).

Slika 3|Transgena (TG) miš človeškega transformirajočega rastnega faktorja b1 (TGFb1) ima ledvično disfunkcijo. (a) Celotne beljakovine in (b) dušik sečnine v krvi (BUN) so merili s kolorimetričnimi metodami, kreatinin pa z encimsko metodo. Število miši za oceno plazme in urina: za miši divjega tipa (WT) n=12 pri 4 tednih, n=7 pri 8 in 12 tednih in n=4 pri 16 in 2{ {21}} tednov; za miši TG, n =24 pri 4 tednih, n=17 pri 8 in 12 tednih in n=9 pri 16 in 20 tednih. Podatki so izraženi kot mediana ± interkvartilni razpon. Statistična analiza z Mann-Whitneyjevim U testom. *P < 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ****="" p=""><>

rhTM zavira apoptozo podocitov

Predobdelava podocitov z rhTM je znatno zmanjšala apoptozo podocitov, gojenih v prisotnosti TGFb1, kot je bilo ocenjeno s številom celic v fazi subG1 (3,2 odstotka v primerjavi s 5,2 odstotka), s končno deoksinukleotidil transferazo posredovano dUTP nick end-labeling-pozitivne celice ( 1.0 v primerjavi s 5,4 celic/Field) in stopnjo cepitve kaspaze-3 (razmerja 0.9 proti 1,1) (slika 6a–e). Preverjanje antiapoptotičnih faktorjev v gojenih podocitih je pokazalo, da rhTM znatno poveča ekspresijo mRNA antiapoptotičnega faktorja Bcl-2 v primerjavi z ekspresijo v neobdelanih celicah (dodatna slika S12). Ekspresija mRNA antiapoptotičnega faktorja BIRC5 se je povečala tudi v celicah, zdravljenih z rhTM, v primerjavi z ekspresijo v neobdelanih celicah (dodatna slika S12). Izražanje mRNA proapoptotičnega faktorja Bax je bilo znatno zmanjšano z zdravljenjem z rhTM v primerjavi z brez zdravljenja (dodatna slika S12). Zdravljenje z rhTM je tudi znatno zaviralo izražanje aneksina V in končno deoksinukleotidil transferazo posredovano dUTP nick končno označevanje obarvanja v podocitih, gojenih v prisotnosti vodikovega peroksida (dodatna slika S13A–E) in v pogojih visoke glukoze (dodatna slika S14A–E ), kar dodatno potrjuje antiapoptotično lastnost rhTM na podocitih. Raziskovanje poti antiapoptotične protein kinaze B (Akt) 25 je pokazalo, da rhTM poveča fosforilacijo Akt v človeških primarnih podocitih, gojenih v prisotnosti vodikovega peroksida ali TGFb1 (dopolnilni sliki S15A in B). Nato smo izolirali podocite iz vsake skupine miši in ovrednotili fosforilacijo Akt z Western blotom. V podocitih, izoliranih iz skupine TGFb{{30}}TG/rhTM, je bila znatno povečana fosforilacija Akt v primerjavi s podociti iz nezdravljene skupine (razmerja 1,1 proti 0,7) (dodatni sliki S16A in B).

GPR15 posredovanje

Prejšnje študije so poročale, da TM aktivira znotrajcelične poti z interakcijo z receptorjem fibroblastnega rastnega faktorja 1 (FGFR1) inG-protein sklopljeni receptor15 (GPR15).26,27 Podociti izražajo FGFR128, vendar ni jasno, ali izražajo GPR15. Tu smo izolirali podocite iz vsake skupine miši in pokazali, da podociti izražajo tudi GPR15 (dodatna slika S17A–E). Ugotovili smo, da podociti iz zdrave kontrole in bolnika z glomerulosklerozo izražajo tudi GPR15 (dodatna slika S18). Da bi pojasnili, ali FGFR1 ali GPR15 posredujeta zaviralno aktivnost rhTM na apoptozo podocitov, smo ovrednotili antiapoptotično aktivnost rhTM v podocitih, obdelanih s TGFb1-, v prisotnosti zaviralca FGFR1 ali po transfekciji celic z majhno motečo RNA (siRNA) proti FGFR1 ali GPR15. Predobdelava podocitov z zaviralcem FGFR1 (dopolnilni sliki S19A in B) ali FGFR1 siRNA (13,2 odstotka proti 7,9 odstotka) (slika 7a in b) ni mogla odpraviti inhibitorne aktivnosti rhTM na apoptozo podocitov. Vendar pa je transfekcija celic s siRNA GPR15 popolnoma odpravila inhibitorno aktivnost rhTM (14,6 odstotka proti 13,8 odstotka) naapoptoza podocitov(Slika 7a–c).

Slika 4|Rekombinantni humani trombomodulin (rhTM) zavira glomerulosklerozo in tubulointersticijsko fifibrozo. Odseki ledvičnega tkiva so bili obarvani (a, b) s periodično kislino–Schiff in (c, d) z Massonovim trikromom in (e) nato kvantificirani z uporabo točkovalnega sistema ali programske opreme za slikanje WinROOF. (e) Srednja vrednost skupine divjega tipa (WT)/fiziološke raztopine (SAL) je bila vzeta kot 100 odstotkov. Statistična analiza z Mann-Whitneyjevim U testom. (f) Vsebnost tkivnega hidroksiprolina je bila izmerjena s kolorimetrično metodo, koncentracija kolagena I-a1 (Col1a1) in periostina z encimskim imunskim testom, ekspresija mRNA pa z verižno reakcijo reverzne transkriptaze-polimeraze. Statistična analiza Kruskal Wallisove analize variance in popravljenega Dunnovega testa. n=8 v vsaki skupini. Palice {{10}} (a,c) 50 mm in (d) 20 mm. Podatki so izraženi kot mediana ± interkvartilni razpon. *P <0,05, **p=""><0,01, ***p=""><0,001, ****p=""><0,0001. tg,="" transgeni;="" tgfb1,="" transformirajoči="" rastni="" faktor="" b1.="" za="" optimizacijo="" gledanja="" te="" slike="" si="" oglejte="" spletno="" različico="" tega="" članka="" na="">

rhTM zavira EMT podocitov

Pri miših TGFb1-TG/SAL je bilo znatno povečano območje s pozitivnim obarvanjem za podocin in aktin a-gladkih mišic (a-SMA) (1,4 odstotka v primerjavi z 11,2 odstotka) v primerjavi s TGFb1-TG / rhTM miši (slika 8a in b). Nato smo gojili in vitro primarne človeške podocite, predhodno obdelane z rhTM, preden smo v gojišče dodali protein TGFb1. Fibroblastom podobna morfologija in povečana ekspresija a-SMA sta bili potlačeni v podocitih, zdravljenih z rhTM, v primerjavi z neobdelanimi celicami (dodatna slika S20A). Poleg tega je rhTM zaviral izražanje mRNA fibronektina in vimentina, čeprav je povečal izražanje mRNA E-kadherina v podocitih v primerjavi z izražanjem v neobdelanih celicah (dodatna slika S20B). Člani družine SMAD 2 (Smad2) in Smad3 igrajo ključno vlogo pri TGFb1-posredovanem epitelno-mezenhimskem prehodu (EMT).29 Zdravljenje z rhTM je znatno zavrlo aktivacijo Smad2 in Smad3 pri TGFb1-TG miših v primerjavi z nezdravljenimi mišmi TG (slika 8c) in v človeških podocitih, gojenih v prisotnosti TGFb1 (dodatna slika S20C).29 Miši TG, zdravljene z rhTM (TGFb1-TG/rhTM), prav tako kažejo manjšo ekspresijo a-SMA (3,7 odstotka proti 17,2 odstotka) v tubularnih epitelijskih celicah v primerjavi z njihovimi nezdravljenimi primerki (dopolnilni sliki S21A in B).

Slika 5|Rekombinantni humani trombomodulin (rhTM) lajša poškodbe ledvic in ledvično disfunkcijo. Kreatinin smo izmerili z encimsko metodo; skupne beljakovine s kolorimetrično metodo; in dušik sečnine v krvi (BUN) in albumin, molekula poškodbe ledvic 1 (KIM-1), protein, ki veže L-maščobne kisline (L-FABP), in skupni transformirajoči rastni faktor b1 (TGFb1) z encimskim imunskim testom. n=8 v vsaki skupini. Podatki so izraženi kot mediana±interkvartilni razpon. Statistična analiza s Kruskal-Wallisovo analizo variance in nekorigiranim Dunnovim testom. * P < {{10}}.05,="" **p="">< 0.01,="" ***p="">< 0,001,="" ****="" p="">< 0,0001,="" #p="0.06." ns,="" ni="" pomembno;="" sal,="" fiziološka="" raztopina;="" tg,="" transgeni;="" wt,="" divji="">

GPR15 posreduje zaviralno aktivnost rhTM na EMT

Transfekcija podocitov s siRNA FGFR1 ni mogla odpraviti zaviralne aktivnosti rhTM na relativne ekspresije mRNA tako kolagena I-a1 kot a-SMA v podocitih, obdelanih s TGFb1- (dodatna slika S22). Vendar pa je transfekcija celic s siRNA GPR15 znatno odpravila zaviralno aktivnost rhTM na relativne ekspresije mRNA tako kolagena I-a1 kot a-SMA v podocitih, obdelanih s TGFb1- (dodatna slika S22).

DISKUSIJA

TGFb1 in poškodba glomerularnih celic

Pogosta posledica motenj, ki povzročajo KLB, je ledvična fifibroza.8,30,31 TGFb1 je pogost dejavnik fibrogeneze v ledvicah, povezanih s KLB, ki jo povzročajo bolezni, vključno z diabetesom mellitusom, arterijsko hipertenzijo in avtoimunskimi motnjami.10 Celice iz glomerulusa in tubulointersticijskih prostorov lahko izloča latentne oblike TGFb1, ki lahko, če se prekomerno aktivirajo med poškodbo tkiva, povzročijo brazgotinjenje ledvic.32 Ker lahko TGFb1 stimulira lastno izločanje, postane fibrotični proces na splošno začaran krog.8 Zgodnji dogodek v patogenem procesu TGFb 1- posredovanofibroza ledvicje poškodba podocitov in glomerularnih endotelijskih celic.33–35 Plazemska raven topnega TM je marker endotelne poškodbe. V skladu z vlogo TGFb1 pri poškodbi ledvičnih celic smo tukaj našli pomembno korelacijo aktivnega TGFb1 s topnim TM, topnim podocinom in kreatininom v plazmi bolnikov z DM. Preslušavanje med glomerularnimi endotelijskimi celicami in podociti med apoškodba ledvicvodi do lokalne ekspresije proteaz, ki povzročajo razgradnjo glomerularne bazalne membrane.34–36 To lahko pojasni odkrivanje topnega podocina in njegovo pomembno korelacijo s topnim TM pri naših bolnikih z DM.

Slika 6|Rekombinantni humani trombomodulin (rhTM) zavira apoptozo podocitov, ki jo povzroči transformirajoči rastni faktor b1 (TGFb1). (a) rhTM smo dodali v gojišče podocitov 1 uro pred indukcijo apoptoze z 10 ng/ml TGFb1 za 48 ur. ( b ) Odstotek celic v fazi subG1 je bil zaznan s sosednjo citometrijo. (a,b) n=3 v vsaki skupini. (c, d) Število celic s fragmentacijo DNA je bilo izmerjeno z analizo dUTP nick end-labeling (TUNEL), ki jo posreduje končna deoksinukleotidil transferaza (n=3 v skupinah fiziološke raztopine [SAL]/SAL in rhTM/SAL; n=6 v skupinah SAL/TGFb1 in rhTM/TGFb1) in (e) stopnja cepitve kaspaze-3 je bila izmerjena z Western blottingom (n=4 v vsaki skupini). Palice=100 mm. Podatki so izraženi kot mediana ± interkvartilni razpon. Statistična analiza z Mann-Whitneyjevim U testom. *P <0,05. dapi,="" 40="" ,6-diamidino-2-fenilindol;="" hpf,="" visokozmogljivo="" polje;="" ns,="" ni="" pomembno.="" histogrami="" so="" prikazani="" kot="" največji="" odstotek="" (odstotek="" največje="" vrednosti),="" pri="" čemer="" se="" vsaka="" krivulja="" spreminja="" v="" način="100" odstotkov.="" za="" optimizacijo="" gledanja="" te="" slike="" si="" oglejte="" spletno="" različico="" tega="" članka="" na="">

Ledvična fibroza, specifična za podocite, povezana s prekomerno ekspresijo TGFb1

Zdravilo, ki lahko prepreči učinek TGFb1, bi bilo idealno za blokiranje ledvične fifibroze. Tukaj smo ustvarili miško TG, ki prekomerno izraža človeški gen TGFb1 v glomerulu, ki razvije spontano in progresivno glomerularno sklerozo in tubulointersticijsko fifibrozo z odpovedjo ledvic že 4 tedne po rojstvu. Model prikazuje napredovalo glomerulopatijo s poškodbo podocitov in glomerulnih endotelijskih celic; zadebelitev glomerularne bazalne membrane in mezangialna ekspanzija z intersticijskim brazgotinjenjem; povečani markerji poškodbe ledvičnega tkiva in ledvične disfunkcije; in povečan TGFb1 v plazmi,ledvičnega tkiva, in urin. Povečanje izločanja beljakovin, TGFb1 z urinom in aktivacija sistema komplementa lahko pojasnita sočasni razvoj intersticijskih brazgotin v našem sedanjem modelu.37–40 Nadaljnji poskusi so pokazali povečano število apoptotičnih celic in aktivacijo proteinov Smad v ledvičnem tkivu iz nezdravljenega TGFb{ {3}}Miši TG v primerjavi z mišmi WT. Na splošno te ugotovitve kažejo na to novo mišjo TGFb1-TG kot primeren model za odkrivanje zdravil vfibroza ledvic.

Slika 7|G-protein vezani receptor (GPR15) posreduje pri zaviranju apoptoze rekombinantnega humanega trombomodulina (rhTM) v podocitih. Človeške primarne podocitne celice smo za 48 ur transfektirali z majhno motečo RNA (siRNA), GPR15 siRNA ali kodirano siRNA receptorja fibroblastnega rastnega faktorja 1 (FGFR1), nato pa smo celični kulturi dodali rhTM 1 uro pred obdelavo s transformirajočim rastnim faktorjem b1 (TGFb1). Apoptotične celice so bile (a) ocenjene s sosednjo citometrijo in (b) nato kvantificirane. ( c ) Celični lizati so bili pripravljeni za Western blot. n{{10}} v vsaki skupini. Podatki so izraženi kot mediana ± interkvartilni razpon. Statistična analiza z Mann-Whitneyjevim U testom. *P < 0,05,="" #p="0.1." sal,="" fiziološka="">

Slika 8|Inhibicija epitelno-mezenhimskega prehoda z rekombinantnim humanim trombomodulinom (rhTM). ( a ) Podocin in aktin a-gladkih mišic (a-SMA) sta bila obarvana, kot je opisano v metodah. ( b ) Območje, pozitivno za barvanje z a-SMA, je bilo kvantificirano s programsko opremo za obdelavo slik WinROOF. n=3 v skupinah divjega tipa (WT)/fiziološke raztopine (SAL) in WT/rhTM in n=5 v skupinahtransformirajoči rastni faktor-b1–transgeni(TGFb{{0}}TG)/SAL in TGFb1-TG/rhTM skupine. ( c ) Celotne ( t ) in fosforilirane ( p ) beljakovine članov družine SMAD (Smad) so bile ocenjene z Western blottingom. n=8 v vsaki skupini. Podatki so izraženi kot mediana ± interkvartilni razpon. Statistična analiza s Kruskal-Wallisovo analizo variance in popravljenim Dunnovim testom. *P < 0.05,="" **p="">< 0,01,="" ***p="">< 0,001,="" #p="0.08." za="" optimizacijo="" gledanja="" te="" slike="" si="" oglejte="" spletno="" različico="" tega="" članka="" na="">

rhTM blaži fifibrozo ledvic

Pokazali smo, da rhTM izboljša pljučno fifibrozo, ki se je razvila pri miših s čezmerno izraženim človeškim TGFb1 v pljučih, tako da zavira apoptozo alveolarnih epitelijskih celic.41 Klinična preskušanja so pokazala tudi izboljšanje idiopatske pljučne fifibroze po zdravljenju z rhTM.42,43 Ta prejšnja opažanja kažejo na potencial rhTM za zdravljenje fibroze organov. Domnevali smo, da bi bil rhTM učinkovit pri fifibrozi ledvic, povezani s TGFb1-. Da bi preizkusili to hipotezo, smo miši TGFb1-TG, specifične za ledvice, zdravili z rhTM.44 Dajanje rhTM 4 tedne je znatno zmanjšalo poškodbe, disfunkcijo in fifibrozo ledvic. Miši, zdravljene z rhTM, so pokazale nizke ravni celotnega proteina, albumina, TGFb1, C5a v urinu in zmanjšane ledvične ravni profibrotičnih citokinov, C5a in HMGB1.45 Terapija z rhTM je zavirala tudi apoptozo in EMT podocitov. Vendar rhTM ni vplival na trombinski antitrombinski kompleks, označevalec aktivacije koagulacije, čeprav je povečal nastajanje APC, antikoagulantnega faktorja s protivnetnim in antiapoptotičnim delovanjem.23 Treba je omeniti, da lahko trombin, prokoagulacijski encim, paradoksalno spodbujajo antikoagulacijo v protrombotičnih stanjih nizke stopnje s tvorbo kompleksa TM/trombin, ki poveča nastajanje antikoagulanta APC. Vendar pa trombin deluje predvsem kot prokoagulant v čezmernih protrombotičnih stanjih (npr. sepsa).46 Ta dvojni in paradoksalen učinek trombina lahko pojasni očitno neučinkovitost rhTM pri zaviranju aktivacije koagulacije v našem modelu, ki je v protrombotičnem stanju nizke stopnje. . Na splošno ta opažanja kažejo, da rhTM amelio pospešuje progresivno fifibrozo in disfunkcijoledvices podaljšanjem preživetja ali preprečevanjem EMT glomerulnih celic in z zaviranjem vnetja, aktivacije komplementa in aktivnosti rastnega faktorja neposredno ali posredno prek aktivacije poti proteina C in zmanjšanja izražanja HMGB1. Izboljšanje diabetične nefropatije pri miših s povečano krožečo TM domeno, podobno lektinu, in poslabšanje bolezni pri miših, ki nimajo domene, podobne lektinu, podpirata ugoden učinek rhTM na fifibrozo ledvic. 20, 21

Inhibicija apoptoze podocitov

Podociti igrajo ključno vlogo pri vzdrževanju pregrade za glomerularno filtracijo in oblikovanju diafragme z režami, da preprečijo izgubo bistvenih beljakovin v obtoku.47Poškodba ledvicki ga povzročajo reaktivne kisikove vrste, visoka glukoza ali vnetni mediatorji, vključno s TGFb1, inducira apoptozo podocitov, kar vodi do izčrpanja podocitov, kar lahko sčasoma povzroči ledvično disfunkcijo.47 Po vezavi in ​​aktiviranju transmembranskega heteromernega receptorskega kompleksa serin/treonin kinaze tipa I in tipa II , TGFb1 oddaja znotrajcelične signale prek družine transkripcijskih faktorjev Smad ali prek od Smad neodvisnih signalnih poti. 48 Aktivacija poti, odvisne od Smad, se pojavi, ko aktivirani receptor TGFb1 fosforilira Smad2 in Smad3, ki se s Smad4 preneseta v jedro. 49 Smad2/ Kompleks Smad3/Smad4 stimulira transkripcijo proapoptotičnih faktorjev in zmanjša transkripcijo antiapoptotičnih faktorjev, ki vodijo v celično apoptozo.49 V skladu s tem smo ugotovili visoko ledvično raven proapoptotičnega faktorja Bax in nizko raven antiapoptotičnih faktorjev Bcl2 in Bcl-XL. pri miših TGFb1- TG. TM lahko zavira apoptozo različnih vrst celic.21,41,49 V skladu s tem smo tukaj ugotovili, da rhTM zavira apoptozo podocitov, ki jo povzročijo vodikov peroksid, visoka koncentracija glukoze ali TGFb1, in ta ugotovitev lahko pojasni koristen učinek rhTM pri kronični ledvični bolezni . Poleg tega je rhTM nagnil tehtnico v smeri inhibicije apoptoze z zmanjšanjem izražanja Bax, s povečanjem izražanja Bcl2, Bcl-XL, BIRC5 in BIRC6 ter s povečanjem aktivacije poti Akt vledvična tkiva. Na splošno ta opažanja kažejo, da rhTM stimulira preživetje podocitov s spodbujanjem aktivacije Akt in izražanja antiapoptotičnega faktorja.

cistanche za kronično ledvično bolezen

Zaviranje EMT

EMT podocitov prav tako prispeva k fifibrozi ledvic. Podociti, ki so podvrženi EMT, sproščajo proteine ​​zunajceličnega matriksa, ki se kopičijo in odlagajo med ledvično fifibrogenezo, povezano s TGFb1-.50 TGFb1 spodbuja EMT prek receptorsko posredovane aktivacije kompleksa Smad2/Smad3/Smad4. Fosforilirani Smad3 spodbuja EMT s spodbujanjem transkripcije matričnih proteinov in z zmanjšanjem izražanja epitelijskih markerjev.51 V skladu s tem smo ugotovili povečan EMT podocitov pri TGFb1-TG miših in podocitih, gojenih v prisotnosti TGFb1 ali pod oksidant ali visoka glukoza. Prejšnja poročila so nakazovala, da rhTM zavira EMT.52,53 Tu smo ugotovili, da rhTM zavira EMT podocitov in tubulointersticijskih epitelijskih celic pri miših TGFb1-TG. Zdi se, da je zaviranje aktivacije proteina Smad mehanizem ugodnega učinka rhTM na EMT, ker so miši TGFb1-TG in primarni podociti, zdravljeni z rhTM, prikazali znatno zmanjšano fosforilacijo Smad2 in Smad3 v primerjavi z nezdravljenimi stanji. Te ugotovitve podpirajo zaviralno aktivnost TM na EMT.

Receptorsko posredovanje pri zaščitni aktivnosti rhTM

Prejšnje študije so pokazale, da GPR15 ali FGFR1 posredujeta citoprotektivno aktivnost TM.26,27,54 Preizkusili smo, ali ti receptorji posredujejo zaščitno aktivnost rhTM proti apoptozi in EMT. Medtem ko je znižanje regulacije proteina GPR15 s siRNA popolnoma odpravilo supresivno aktivnost rhTM na apoptozo podocitov, posredovano s TGFb1-, je nista odpravila niti siRNA FGFR1 niti njen inhibitor, kar kaže, da GPR15 posreduje zaščitno aktivnost rhTM. V kultiviranih podocitih in podocitih, izoliranih iz TGFb1-TG miši po zdravljenju z rhTM, je bila povečana fosforilacija Akt, kar kaže na vpletenost znotrajcelične poti Akt. Delo, ki kaže, da rhTM aktivira pot Akt v endotelijskih celicah, podpira to ugotovitev. 55 Aktivacija signalne poti Akt lahko dodatno okrepi učinek rhTM s povečanjem površinske ekspresije GPR15. 56 Ta opažanja kažejo, da rhTM ščiti podocite pred apoptozo v našem TGFb{ {13}}TG miši z aktiviranjem osi GPR15/Akt, kar vodi do povečane ekspresije anti-apoptotičnih faktorjev in zmanjšane ekspresije proapoptotičnih faktorjev.57 Po drugi strani pa so prejšnje študije pokazale, da lahko anafilatoksina C3a in C5a prek svojih GPR-jev prispevata k CKD s poškodbo podocitov in da lahko APC zavira apoptozo podocitov in ledvično fifibrozo prek endotelnega receptorja za protein C in receptorja, aktiviranega s proteazo 1.23,58–61 Tu smo ugotovili, da rhTM zavira sistem komplementa in poveča nastajanje APC. Zato lahko poleg aktivacije poti GPR15/Akt zaviranje faktorjev komplementa in povečana aktivacija proteina C in njegovih receptorjev prav tako pojasnita koristne učinke rhTM v našem TGFb1-povezanemmodel ledvične fifibroze.

Poleg tega je znižanje regulacije GPR15, ne pa tudi FGFR1, blokiralo zaviralni učinek rhTM na EMT, kar kaže, da GPR15 posreduje tudi to zaščitno aktivnost rhTM. Inhibicija proteinov Smad je vključena v supresijo EMT, ker je zdravljenje z rhTM zaviralo fosforilacijo tako Smad2 kot Smad3 pri miših TGFb1-TG in kultiviranih podocitih. Vendar natančen mehanizem zaviranja proteina Smad prek GPR15 ni jasen. Nekateri dokazi kažejo, da lahko pot Akt presluša signalno pot Smad in jo uravnava, 62–64 in da lahko Akt prepreči fosforilacijo Smad3 z neposredno interakcijo z nefosforiliranim Smad3, da se sekvestrira izven jedra, kar povzroči zaviranje transkripcije in EMT.62– 64 Na podlagi teh poročil je možno, da se Akt aktivira po vezavi rhTM na GPR15, sekvestrira nefosforilirani Smad3, kar vodi do inhibicije EMT podocitov. Treba je omeniti, da je ta z Akt posredovani ugoden učinek opažen samo v nemalignih celicah.65–67 V malignih celicah lahko interakcija TGFb1 z njegovimi receptorji neposredno aktivira pot fosfoinozitid 3-kinaza/Akt/polž in povzroči EMT.65–67 Na splošno rezultati naše študije podpirajo vlogo GPR15 kot receptorja, ki posreduje pri koristnih učinkih rhTM na podocite.

Zaključek

Če povzamemo, tukaj prvič poročamo o novi transgeni miši TG, ki čezmerno izraža celotno dolžino človeškega gena TGFb1, posebej v glomerulih, ki razvijejo spontano in progresivno glomerularno sklerozo, tubulointersticijsko fifibrozo inodpoved ledvicin izboljšanje ugotovljene ledvične fifibroze/odpovedi ledvic z interakcijo rhTM z GPR15, ki zavira apoptozo in mezenhimski prehod podocitov.

METODE

Generacija miške TGFb1 BAC TG

Miš TGFb1-BAC-TG, ki izraža človeški gen TGFb1 celotne dolžine pod nadzorom promotorja mišjega podocina, je bila ustvarjena s pronuklearno injekcijo v 392 mišjih zarodkov C57BL/6J (CLEA Japan, Inc., Tokio, Japonska). Ocenili smo ustanovitelje TG in prenos zarodne linije konstrukta BAC TG s Southern blottingom (dodatni materiali in metode).

Poskusne živali

Miši TGFb1-TG so bile pred uporabo v poskusih vzrejene več kot 10 generacij v ozadju C57BL/6. WT sorodniki iz legla so bili uporabljeni kot kontrolne živali. Vse živali so bile vzdrževane v posebnem okolju brez patogenov in izpostavljene 12--urnemu ciklu svetloba-tema pri sobni temperaturi in vlažnosti med 22 in 26 stopinjami ter 40 in 70 odstotki ter z dostopom ad libitum do hrane in vode v živalski hiši univerze Mie (dodatni materiali in metode).

Etična izjava

Odbor za varnost eksperimentov z rekombinantno DNK (št. odobritve I-629; datum: 19. september 2013) in Odbor za raziskave na živalih univerze Mie (št. odobritve 27-4; datum: 19. avgust 2015) odobril protokole študije. Vsi postopki na živalih so bili izvedeni v skladu z institucionalnimi smernicami univerze Mie in po mednarodno odobrenih načelih oskrbe laboratorijskih živali, ki jih je objavil Nacionalni inštitut za zdravje (https://olaw.nih.gov/).

Za klinično preiskavo so pisno informirano soglasje dali vsi bolniki in zdravi preiskovanci, protokol študije pa je odobril Etični odbor za klinične preiskave Univerze Mie (št. odobritve 1043 in 2194).

Eksperimentalna zasnova

Za karakterizacijoledvicafifibroznega modela smo dodelili samce miši TGFb{{0}}TG (n=24) in samce miši WT (n=12), stare 4 tedne in težke od 20 do 23 g, v 3. skupine z 8 mišmi TGF b1-TG in 4 mišmi WT v vsaki skupini. Miši iz vsake skupine WT in TGFb1-TG so bile evtanazirane v tednih 0, 8 ali 16, da so zbrali vzorce urina, krvi in ​​ledvic za oceno sprememb parametrov fifibroze in ledvične funkcije skozi čas.

Za ovrednotenje terapevtske učinkovitosti rhTM (rhTM je prijazno zagotovilo Asahi Kasei Pharma Corporation, Tokio, Japonska) pri ledvični fibrozi, TGFb1-TG miših (n= 8) ali WT sorodnikih iz legla (n {{2 }}) smo zdravili z rhTM (3 mg/kg) z ip injekcijo, 3-krat na teden v 4 tednih pred usmrtitvijo miši. TGFb1-TG miši (n =8) ali WT sorodniki iz legla (n= 8), ki so prejemali enako količino fiziološkega SAL z ip injekcijo, so bile uporabljene kot miši negativne kontrole.

Protokol te študije je sledil smernicam raziskav na živalih: poročanje o poskusih in vivo (ARRIVE) za raziskave na živalih. Miši so bile randomizirane in raziskovalci, ki so merili parametre, so bili zaslepljeni glede skupin zdravljenja.

Biokemična analiza

Koncentracije celotne beljakovine (komplet za testiranje beljakovin BCA; Pierce, Rockford, IL), TGFb1 (R&D System, Minneapolis, MN), monocitnega kemoatraktantnega proteina-1 (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA), trombina, antitrombinskega kompleksa (Cedarlane Laboratories, Hornby, Ontario, Kanada) so bili izmerjeni s komercialnimi kompleti za encimsko imunoanalizo po navodilih proizvajalca (dodatni materiali in metode).

Kultura celic

Primarne celice človeških podocitov so bile kupljene pri CELPR OGEN (Torrance, CA). Primarne celice človeških podocitov so gojili v Dulbeccovem modificiranem mediju Eagle v vlažni atmosferi s 5 odstotki CO2 pri 37 stopinjah. Medij je bil dopolnjen z 10 odstotki toplotno inaktiviranega fetalnega govejega seruma (Bio Whittaker, Walkersville, MD), 100 ie/ml penicilina, 100 mg/ml streptomicina in L-glutamina (dodatni materiali in metode).

Statistična analiza

Podatki so izraženi kot mediana±interkvartilni razpon. Statistično razliko med spremenljivkami smo izračunali s Kruskal-Wallisovo analizo variance s post hoc analizo z uporabo Dunnovega testa. Mann-Whitneyjev U test je bil uporabljen za oceno razlik med 2 skupinama. Statistične analize so bile narejene z uporabo GraphPad Prism različice 8.0.1 (GraphPad Software, San Diego, CA). Statistična pomembnost je bila obravnavana kot P <>

RAZKRITJE

ECG, CND-G in YY imajo patent za miško TGFb1-TG zledvična fibrozauporabljen v tej študiji. CND-G in YY sta za to študijo prejela štipendijo Ministrstva za izobraževanje, kulturo, šport, znanost in tehnologijo Japonske. ECG, TY, CND-G in MT so prejeli donacijo Shionogi Pharmaceuticals. Vsi drugi avtorji so izjavili, da nimajo konkurenčnih interesov.

ZAHVALA

Ta raziskava je bila delno podprta z donacijami Ministrstva za izobraževanje, kulturo, šport, znanost in tehnologijo Japonske (Kakenhi št. 17K09824 za YY; Kakenhi št. 17K08442 za CND-G) in delno z donacijo Shionogi & Co, Ltd., Japonska. Financerji niso imeli nobene vloge pri načrtovanju študije, analizi podatkov, odločitvi o objavi ali pripravi rokopisa.

Del tega dela je bil objavljen v obliki povzetka.

AVTORSKI PRISPEVKI

AT je pripravil model bolezni in napisal prvi osnutek rokopisa. TY, KN, TT, RI in CND-G so pripravili modele bolezni in izmerili parametre. AM in SW sta izvedla transmisijsko mikroskopsko študijo. MT, YO in AU so izmerili parametre in izvedli poskuse in vitro. YT, LQ, TK in VFD so zagotovili intelektualne prispevke. YY in ECG sta popravila osnutek rokopisa in oblikovala študijo.

cistanche za simptome odpovedi ledvic

DODATNO GRADIVO

Dodatna datoteka (PDF) Dodatni materiali in metode.

Tabela S1. Značilnosti predmetov.

Tabela S2. Primerji za RT-PCR mišjih tkiv.

Tabela S3. Primerji za RT-PCR človeških podocitov.

Slika S1. Topni fragmenti trombomodulina korelirajo s TGFb1 in kreatininom pri bolnikih s sladkorno boleznijo.

Slika S2. Človeški TGFb1–konstrukt bakterijskega umetnega kromosoma (BAC). Slika S3. Miši ustanoviteljice, ki izražajo celotno dolžino človeškega gena TGFb1.

Slika S4. Karakterizacija glomerulus-specifičnega transformirajočega rastnega faktorja b1 transgene miši.

Slika S5. Človeška transgena miš TGFb1 ima povečane označevalce poškodbe ledvic.

Slika S6. Terapija z rekombinantnim humanim trombomodulinom (rhTM) zmanjša izbris podocitov in zadebelitev glomerularne bazalne membrane.

Slika S7. Transgene miši TGFb1, zdravljene z rekombinantnim človeškim trombomodulinom (rhTM), imajo nizko koncentracijo profibrotičnih faktorjev in HMGB1 v ledvičnem tkivu. Slika S8. Terapija z rekombinantnim humanim trombomodulinom (rhTM) poveča nastajanje aktiviranega proteina C, zavira sistem komplementa, zmanjša kroženje topnega podocina, čeprav ne vpliva na koagulacijski sistem pri transgenih miših TGFb1.

Slika S9. Zdravljenje z rekombinantnim humanim trombomodulinom (rhTM) zmanjša koncentracijo podocina v urinu.

Slika S10. Zdravljenje z rekombinantnim humanim trombomodulinom (rhTM) zmanjša apoptozo glomerularnih celic.

Slika S11. Zdravljenje fifibroze ledvic, povezane s prekomerno ekspresijo TGFb1-, z rekombinantnim humanim trombomodulinom (rhTM) zavira apoptozo v ledvičnem tkivu.

Slika S12. Rekombinantni humani trombomodulin (rhTM) poveča izražanje antiapoptotičnih faktorjev v podocitih.

Slika S13. Rekombinantni humani trombomodulin (rhTM) zavira apoptozo podocitov, ki jo povzroči vodikov peroksid.

Slika S14. Rekombinantni humani trombomodulin (rhTM) zavira apoptozo podocitov, ki jo povzročajo visoke ravni glukoze.

Slika S15. Rekombinantni humani trombomodulin (rhTM) poveča aktivacijo poti Akt v podocitih.

Slika S16. Terapija z rekombinantnim humanim trombomodulinom (rhTM) poveča fosforilacijo Akt v podocitih miši TGFb1-TG.

Slika S17. Podociti iz vsake tretirane skupine miši izražajo GPR15 mRNA.

Slika S18. Barvanje GPR15 v podocitih zdravega posameznika in bolnika s fokalno segmentno glomerulosklerozo.

Slika S19. Receptor fibroblastnega rastnega faktorja-1 ni vključen v zaviralno aktivnost rekombinantnega humanega trombomodulina (rhTM) v podocitih.

Slika S20. Rekombinantni humani trombomodulin (rhTM) zavira epitelno-mezenhimski prehod podocitov.

Slika S21. Terapija z rekombinantnim humanim trombomodulinom (rhTM) zavira izražanje aktina gladke mišice a v ledvičnih tubulih.

Slika S22. G-protein sklopljeni receptor (GPR15) posreduje zaviralno aktivnost rekombinantnega humanega trombomodulina (rhTM) na epitelno-mezenhimskem prehodu podocitov.

Dodatne reference.

REFERENCE

1. Webster AC, Nagler EV, Morton RL, et al. Kronična ledvična bolezen. Lanceta. 2017; 389: 1238–1252.

2. Bello AK, Levin A, Tonelli M, et al. Ocena globalnega zdravstvenega stanja ledvic. JAMA. 2017; 317: 1864–1881.

3. Levin A, Tonelli M, Bonventre J, et al. Globalno zdravje ledvic 2017 in pozneje: načrt za odpravo vrzeli v oskrbi, raziskavah in politiki. Lanceta. 2017; 390: 1888–1917.

4. Ackland P. Razširjenost, odkrivanje, vrednotenje in obvladovanje kronične ledvične bolezni. BMJ. 2014;348:f7688.

5. Turner JM, Bauer C, Abramowitz MK, et al. Zdravljenje kronične ledvične bolezni. Kidney Int. 2012; 81: 351–362.

6. Breyer MD, Susztak K. Naslednja generacija terapevtikov za kronično ledvično bolezen. Nat Rev Drug Discov. 2016; 15: 568–588.

7. Liu Y. Ledvična fifibroza: nov vpogled v patogenezo in terapevtiko. Kidney Int. 2006; 69: 213–217.

8. Liu Y. Celični in molekularni mehanizmi ledvične fifibroze. Nat Rev Nephrol. 2011; 7: 684–696.

9. Xavier S, Vasko R, Matsumoto K, et al. Omejitev endotelnega signaliziranja TGF-beta zadostuje za zmanjšanje endotelno-mezenhimskega prehoda in fifibroze pri kronični ledvični bolezni. J Am Soc Nephrol. 2015; 26: 817–829.

10. Higgins SP, Tang Y, Higgins CE, et al. Signalizacija TGF-beta1/p53 pri fifibrogenezi ledvic. Celični signal. 2018; 43: 1–10.

11. Conway EM. Trombomodulin in njegova vloga pri vnetju. Semin Immunopathol. 2012; 34: 107–125.

12. Martin FA, Murphy RP, Cummins PM. Trombomodulin in vaskularni endotelij: vpogled v funkcionalne, regulativne in terapevtske vidike. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 2013;304:H1585–H1597.

13. Morser J. Trombomodulin povezuje koagulacijo z vnetjem in imunostjo. Curr Drug Targets. 2012; 13: 421–431.

14. Roeen Z, Toda M, D'Alessandro-Gabazza CN, et al. Trombomodulin zavira aktivacijo eozinofilcev in mastocitov. Cell Immunol. 2015; 293: 34–40.

15. Takagi T, Taguchi O, Toda M, et al. Zaviranje alergijske bronhialne astme s trombomodulinom posredujejo dendritične celice. Am J Respir Crit Care Med. 2011; 183: 31–42.

16. Tateishi K, Imaoka M, Matsushita M. Dvojne modulacijske funkcije trombomodulina v alternativni poti komplementa. Biosci Trendi. 2016; 10: 231–234.

17. Toda M, D'Alessandro-Gabazza CN, Takagi T, et al. Trombomodulin modulira dendritične celice prek antagonizmov proteina B1 skupine visoke mobilnosti in neodvisnega mehanizma. Allergol Int. 2014; 63: 57–66.

18. Van de Wouwer M, Plaisance S, De Vriese A, et al. Lektinu podobna domena trombomodulina moti aktivacijo komplementa in ščiti pred artritisom. J Tromb Hemost. 2006; 4: 1813–1824.

19. Sharfuddin AA, Sandoval RM, Berg DT, et al. Topni trombomodulin ščiti ishemične ledvice. J Am Soc Nephrol. 2009; 20: 524–534.

20. Wang H, Vinnikov I, Shahzad K, et al. Lektinu podobna domena trombomodulina blaži diabetično glomerulopatijo z inhibicijo komplementa. Tromb Hemost. 2012; 108: 1141–1153.

21. Yang SM, Ka SM, Wu HL, et al. Trombomodulinska domena 1 izboljša diabetično nefropatijo pri miših prek vnetja, ki ga posreduje anti-NF-kappaB/NLRP3, povečanja antioksidativne aktivnosti NRF2 in zaviranja apoptoze. Diabetologija. 2014; 57: 424–434.

22. Ohlin AK, Larsson K, Hansson M. Aktivnost topnega trombomodulina in topni antigen trombomodulina v plazmi. J Tromb Hemost. 2005; 3: 976–982.

23. Gil-Bernabe P, D'Alessandro-Gabazza CN, Toda M, et al. Eksogeno aktivirani protein C zavira napredovanje diabetične nefropatije. J Tromb Hemost. 2012; 10: 337–346.

24. Yasuma T, Yano Y, D'Alessandro-Gabazza CN, et al. Izboljšanje sladkorne bolezni s proteinom S. Diabetes. 2016;65:1940–1951.

25. Havasi A, Borkan SC. Apoptoza in akutna okvara ledvic. Kidney Int. 2011; 80: 29–40.

26. Kuo CH, Sung MC, Chen PK, et al. FGFR1 posreduje angiogenezo, ki jo povzroča rekombinantna domena trombomodulina. Cardiovasc Res. 2015; 105: 107–117.

27. Pan B, Wang X, Kojima S, et al. Peta regija trombomodulina, podobna epidermalnemu rastnemu faktorju, ublaži sepso, ki jo povzroči LPS, prek interakcije z GPR15. Tromb Hemost. 2017; 117: 570–579.

28. Lu Y, Ye Y, Bao W, et al. Genomska identifikacija genov, bistvenih za citoskelete podocitov, na podlagi enoceličnega sekvenciranja RNA. Kidney Int. 2017; 92: 1119–1129.

29. Vigolo E, Marko L, Hinze C, et al. Kanonično signaliziranje BMP v tubularnih celicah posreduje okrevanje po akutni poškodbi ledvic. Kidney Int. 2019; 95: 108–122.

30. Nangaku M. Kronična hipoksija in tubulointersticijska poškodba: zadnja pogosta pot do končne odpovedi ledvic. J Am Soc Nephrol. 2006; 17: 17–25.

31. Thomas R, Kanso A, Sedor JR. Kronična ledvična bolezen in njeni zapleti. Prim Care. 2008; 35: 329–344, vii.

32. Mozes MM, Bottinger EP, Jacot TA, et al. Ledvična ekspresija proteinov fibrotičnega matriksa in izooblik transformirajočega rastnega faktorja beta (TGF-beta) pri transgenih miših TGF-beta. J Am Soc Nephrol. 1999; 10: 271–280.

33. Arif E, Solanki AK, Srivastava P, et al. Motorični protein Myo1c uravnava transformirajoči rastni faktor-beta-signalizacijo in fifibrozo v podocitih. Kidney Int. 2019; 96: 139–158.

34. Ebefors K, Wiener RJ, Yu L, et al. Endotelinski receptor-A posreduje pri razgradnji površinske plasti glomerularnega endotelija preko patološkega preslušavanja med aktiviranimi podociti in glomerularnimi endotelijskimi celicami. Kidney Int. 2019; 96: 957–970.

35. Fu J, Lee K, Chuang PY, et al. Poškodba glomerulnih endotelijskih celic in navzkrižni pogovor pri diabetični bolezni ledvic. Am J Physiol Renal Physiol. 2015; 308: F287– F297.

36. Masum MA, Ichii O, Elewa YHA, et al. Modificirana vrstična elektronska mikroskopija razkriva patološko preslušavanje med endotelnimi celicami in podociti v mišjem modelu membranoproliferativnega glomerulonefritisa. Sci Rep. 2018; 8: 10276.

37. Abbate M, Zoja C, Rottoli D, et al. Proksimalne tubularne celice spodbujajo fifibrogenezo s TGF-beta1-posredovano indukcijo peritubularnih miofibroblastov. Kidney Int. 2002; 61: 2066–2077.

38. Liu BC, Tang TT, Lv LL, et al. Poškodba ledvičnih tubulov: gonilna sila k kronični ledvični bolezni. Kidney Int. 2018; 93: 568–579.

39. Loefffller I, Wolf G. Transformacijski rastni faktor-beta in napredovanje ledvične bolezni. Presaditev Nephrol Dial. 2014; 29 (dodatek 1): i37–i45.

40. Murakami K, Takemura T, Hino S, et al. Urinski transformirajoči rastni faktor-beta pri bolnikih z glomerulnimi boleznimi. Pediater Nephrol. 1997; 11: 334–336.

41. Fujiwara K, Kobayashi T, Fujimoto H, et al. Zaviranje celične apoptoze in izboljšanje pljučne fifibroze s trombomodulinom. Am J Pathol. 2017; 187: 2312–2322.

42. Kataoka K, Taniguchi H, Kondoh Y, et al. Rekombinantni humani trombomodulin pri akutnem poslabšanju idiopatske pljučne fifibroze. Prsni koš. 2015; 148: 436–443.

43. Tsushima K, Yamaguchi K, Yokoyama T, et al. Trombomodulin za akutna poslabšanja idiopatske pljučne fifibroze: dokaz koncepta študije. Pulm Pharmacol Ther. 2014; 29: 233–240.

44. Umemura Y, Yamakawa K. Optimalna izbira bolnikov za antikoagulantno terapijo pri sepsi: na dokazih temelječ predlog iz Japonske. J Tromb Hemost. 2018; 16: 462–464.

45. Chen Q, Guan X, Zuo X, et al. Vloga okvirja 1 skupine z visoko mobilnostjo (HMGB1) v patogenezi bolezni ledvic. Acta Pharm Sin B. 2016; 6: 183–188.

46. ​​Miyake Y, D'Alessandro-Gabazza CN, Takagi T, et al. Od odmerka odvisni diferencialni učinki trombina pri alergijski bronhialni astmi. J Tromb Hemost. 2013; 11: 1903–1915.

47. Assady S, Wanner N, Skorecki KL, et al. Novi vpogled v biologijo podocitov pri zdravju in boleznih glomerulov. J Am Soc Nephrol. 2017; 28: 1707–1715.

48. Derynck R, Zhang YE. Od Smad odvisne in Smad neodvisne poti v signalizaciji družine TGF-beta. Narava. 2003; 425: 577–584.

49. Schuster N, Krieglstein K. Mehanizmi apoptoze, posredovane s TGF-beta. Cell Tissue Res. 2002;307:1–14.

50. Greka A, Mundel P. Celična biologija in patologija podocitov. Annu Rev Physiol. 2012; 74: 299–323.

51. Isaka Y. Usmerjanje signalizacije TGF-beta pri fifibrozi ledvic. Int J Mol Sci. 2018; 19: 2532.

52. Chang YJ, Cheng YW, Lin RK, et al. Trombomodulin vpliva na preživetje bolnikov z nemetastatskim rakom debelega črevesa in danke prek prehoda epitelija v mezenhim (EMT). PLoS One. 2016; 11: e0160550.

53. Zheng N, Huo Z, Zhang B, et al. Trombomodulin zmanjša tumorogeni in metastatski potencial celic pljučnega raka s povečano regulacijo E-kadherina in znižano ekspresijo N-kadherina. Biochem Biophys Res Commun. 2016; 476: 252–259.

54. Pan B, Wang X, Nishioka C, et al. G-protein sklopljeni receptor 15 posreduje pri angiogenezi in citoprotektivni funkciji trombomodulina. Sci Rep. 2017; 7: 692.

55. Chen PS, Wang KC, Chao TH, et al. Rekombinantni trombomodulin izvaja anti-avtofagično delovanje v endotelijskih celicah in zagotavlja antiaterosklerozni učinek pri miših s pomanjkanjem apolipoproteina E. Sci Rep. 2017; 7: 3284.

56. Chung JJ, Okamoto Y, Coblitz B, et al. PI3K/Akt signalno posredovana površinska ekspresija proteina, ki jo zazna interakcijski motiv 14-3-3. FEB J. 2009; 276: 5547–5558.

57. Sanchez-Capelo A. Dvojna vloga TGF-beta1 pri apoptozi. Cytokine Growth Factor Rev. 2005; 16: 15–34.

58. Griffifin JH, Zlokovic BV, Mosnier LO. Aktiviran protein C, receptor 1, aktiviran s proteazo, in nevroprotekcija. kri. 2018; 132: 159–169.

59. Isermann B, Vinnikov IA, Madhusudhan T, et al. Aktivirani protein C ščiti pred diabetično nefropatijo z zaviranjem apoptoze endotelija in podocitov. Nat Med. 2007; 13: 1349–1358.

60. Klos A, Tenner AJ, Johswich KO, et al. Vloga anafilatoksinov v zdravju in bolezni. Mol Immunol. 2009; 46: 2753–2766.

61. Morigi M, Perico L, Corna D, et al. Blokada receptorja C3a ščiti podocite pred poškodbami pri diabetični nefropatiji. JCI Insight. 2020; 5: e131849.

62. Conery AR, Cao Y, Thompson EA, et al. Akt neposredno sodeluje s Smad3 za uravnavanje občutljivosti na apoptozo, ki jo povzroči TGF-beta. Nat Cell Biol. 2004; 6: 366–372.

63. Derynck R, Muthusamy BP, Saeteurn KY. Sodelovanje signalne poti pri epitelno-mezenhimskem prehodu, ki ga povzroči TGF-beta. Curr Opin Cell Biol. 2014; 31: 56–66.

64. Remy I, Montmarquette A, Michnick SW. PKB/Akt modulira signalizacijo TGF-beta z neposredno interakcijo s Smad3. Nat Cell Biol. 2004; 6: 358–365.

65. Hamidi A, Song J, Thakur N, et al. TGF-beta spodbuja signalizacijo PI3K-AKT in migracijo celic raka prostate s TRAF6-posredovano vseprisotnostjo p85alfa. Sci Signal. 2017;10:eaal4186.

66. Peng Z, Weber JC, Han Z, et al. Dihotomični učinki signalizacije Akt pri raku dojke. Mol Rak. 2012; 11:61.

67. Zhou F, Geng J, Xu S, et al. Signalizacija FAM83A inducira epitelijski mezenhimski prehod po poti PI3K/AKT/polž v NSCLC. Staranje (Albany NY). 2019; 11: 6069–6088.