Čas in učinki ishemije na fibrozo ledvic po kontralateralni nefrektomiji

Uvod

Pojavnostakutna poškodba ledvic(AKI) se je v zadnjih letih dramatično povečalo po vsem svetu [1]. AKI lahko povzroči presaditev organa, pooperativno perfuzijo, krvavitev, dehidracijo, šok in sepso v klinični praksi [2]. Nedavne epidemiološke in eksperimentalne študije so pokazale, da so resnost, pogostnost in trajanje AKI tesno povezani s kasnejšo pojavnostjokronična ledvična bolezen(CKD). Ledvična fibroza po AKI lahko povzroči KLB ali celokončna ledvična bolezen(ESKD) [3–5], kar pomeni, da sta AKI in CKD povezana sindroma [6]. Kljub številnim eksperimentalnim in kliničnim študijam pa mehanizmi, na katerih temelji prehod iz AKI v kronično ledvično bolezen, ostajajo neznani. Živalski modeli so pomembno orodje za raziskovanje mehanizmov, s katerimi AKI vodi do kronične ledvične bolezni. Ishemijsko-reperfuzijska poškodba ledvic (IRI) je eden glavnih vzrokov za AKI in razvitih je bilo več živalskih modelov AKI, ki jih povzroča IRI [7], vključno z dvostranskim modelom IRI (bIRI), enostranskim modelom IRI z nepoškodovano kontralateralno ledvico. , model uIRI s sočasno kontralateralno nefrektomijo in model uIRI z odloženo kontralateralno nefrektomijo.

Model bIRI je manj dosleden, ker kadar je ishemična poškodba obeh ledvic preblaga, dolgoročno ni pomembnih fibrotičnih sprememb. Ko je AKI prehud, lahko miši poginejo v fazi akutne poškodbe. Poleg tega lahko majhne razlike v poškodbi obeh ledvic po nekaj tednih vodijo do pomembnih razlik v njuni kronični ledvični patologiji [8,9]. Model uIRI s sočasno kontralateralno nefrotomijo je podoben modelu bIRI, saj zaradi nefrektomije na drugi strani ostane le poškodovana ledvica [10]. V modelu IRI z nedotaknjeno kontralateralno ledvico je fibroza ishemične ledvice huda [11,12]. Ta model je zelo dosleden in zanesljiv za dolgoročno opazovanje raziskovalcev. Vendar pa zaradi prisotnosti kontralateralne nepoškodovane ledvice ni mogoče uporabiti za oceno ocenjene hitrosti glomerularne filtracije (eGFR), serumskega kreatinina (SCr) in dušika sečnine v krvi (BUN) [11–14]. V primerjavi z dvema zgoraj omenjenima modeloma uIRI model uIRI z odloženo kontralateralno nefrektomijo premaga te težave in se lahko uporablja tako za dolgoročna opazovanja po AKI kot za spremljanje delovanja ledvic. Zato je ta model primeren za preučevanje prehoda AKI-CKD [15].

KLIKNITE TUKAJ ZA DOBITEV IZVLEČKA CISTANCHE ZAAKUTNA LEDVIČNA POŠKODBA

Kljub temu lahko različna ishemična stanja in interval med kontralateralno nefrektomijo in uIRI pomembno vplivajo na napredovanje in resnost KLB po AKI. Prejšnje študije so se osredotočale na učinek trajanja ishemije na fibrozo ledvic po AKI in niso posvečale veliko pozornosti telesni temperaturi jedra med ishemijo. Na primer, Skrypnyk et al. [12] so kontrolirali ishemično temperaturo pri 38 C s sistemom vodne kopeli, ishemično trajanje 30 minut, kontralateralno nepoškodovano ledvico pa so odstranili 8 dni po uIRI. Rezultat je pokazal, da je imela ishemična ledvica pomembne fibrotične spremembe 28 dni po uIRI. Z enakim trajanjem ishemije sta Xiao et al. [8] je pokazalo, da so se pomembne fibrotične spremembe zgodile 11 dni po uIRI, ko je bila ishemična temperatura nadzorovana pri 37 C 38 C in je bil časovni interval med uIRI in kontralateralno nefrektomijo 10 dni. Nekateri raziskovalci, kot je Colombaro et al. [14] in Li et al. [16] v svojih študijah niso omenili ishemične temperature.

Medtem je malo ljudi raziskovalo učinek časovnega intervala med kontralateralno nefrektomijo in uIRI v tem modelu, kar je povzročilo zelo različne rezultate med različnimi laboratoriji, kar je tudi dramatično vplivalo na nadaljnje poskuse. V tej študiji smo raziskali učinke glavnih dejavnikov, ki vplivajo na ledvično fibrozo po AKI, vključno s časovnim intervalom med kontralateralno nefrektomijo in uIRI, telesno temperaturo jedra med ishemijo in trajanjem ishemije. Želeli smo zagotoviti referenco za izdelavo ustreznega živalskega modela za preučevanje prehoda AKI CKD

Materiali in metode Živalski modeli

Samci miši C57BL/6J (stari 8–10 tednov, približno 22 g teže; GemPharmatech Co., Ltd., Nanjing, Kitajska) so imeli prost dostop do hrane in vode v Centru za poskuse na živalih Medicinske univerze Shanxi. Pogoji vzreje so bili naslednji: vlažnost 40–70 %, temperatura 23 C, razred čistosti zraka 7, nadzorovan cikel 12-h svetloba/tema v pogojih brez patogenov, obsevanje krme s Co60 in prečiščena voda. Vse postopke za to študijo je odobril Odbor za etiko živali druge bolnišnice medicinske univerze Shanxi (etična številka: DW2022028).

Protokoli

Glede na to, da lahko trajanje ishemičnega vnetja, telesne temperature jedra med ishemijo in časi resekcije kontralateralne nepoškodovane ledvice vplivajo na resnost AKI in kasnejše ledvične fibroze, smo raziskali učinke zgornjih treh dejavnikov posamezno, pri čemer sta ostala dva fiksna. Izvedeni so bili trije poskusi, kot sledi.

Protokol 1: Za opazovanje učinka intervala med kontralateralno nefrektomijo in uIRI na delovanje ledvic in fibrozo po AKI je bil ishemični čas leve ledvice fiksiran na 24 minut, temperatura jedra telesa pa je bila fiksirana na 37 C med ledvicami. ishemija medtem. Resekcija desne ledvice je bila izvedena 7. dan, 10. dan oziroma 14. dan (n=8 na skupino) po IRI leve ledvice. Trajanje ishemije in resekcije ledvice smo določili na podlagi rezultatov prejšnjih študij [8,10,12,15] in naših predeksperimentalnih rezultatov. Za protokol študije glejte sliko 1(A–C).

Protokol 2: Za opazovanje učinka telesne temperature jedra med ishemijo na prehod AKI-CKD je bil ishemični čas leve ledvice določen na 24 minut, desna ledvica pa je bila odstranjena 14 dni po IRI leve ledvice. Temperaturo jedra telesa so nadzorovali pri 36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C oziroma 38 C (n=8 na skupino). Za protokol študije glejte sliko 1(D).

Protokol 3: Za opazovanje učinka trajanja ledvične ishemije na prehod iz AKI v kronično ledvično bolezen je bila telesna temperatura med ishemijo fiksirana na 37 C, desna ledvica pa je bila odstranjena 14 dni po IRI leve ledvice. To časovno točko smo izbrali zato, ker je bila ledvična fibroza, ki je bila tipična sprememba po AKI v kronično ledvično bolezen, zelo očitna glede na poročila [8,10,12,15] in naše predeksperimentalne rezultate. Ishemični čas leve ledvice je bil nadzorovan pri 21 min, 24 min, 27 min in 30 min (n=8 na skupino). Za protokol študije glejte sliko 1(E).

Vse miši so bile evtanazirane 8 tednov po IRI leve ledvice. Del tkiva leve ledvice smo shranili pri 70 C za kasnejšo RT-PCR in Western blot analizo, drugi del pa smo fiksirali v nevtralnem formalinu za histopatološko analizo. Vzorce krvi smo zbrali preko retroorbitalnega sinusa za biokemijsko testiranje.

Slika 1. Protokoli enostranske ishemijsko-reperfuzijske poškodbe (uIRI) z odloženo kontralateralno nefrektomijo. (A–C): Leva ledvica je bila izpostavljena IRI na dan 0, resekcija desne ledvice pa je bila izvedena v različnih časovnih točkah (7. dan, 1. dan 0 in 14. dan) s trajanjem ishemije fiksirana na 24 minut z osrednjo telesno temperaturo, fiksirano na 37 C med ishemijo ledvic. (D): Leva ledvica je bila izpostavljena IRI na dan 0, resekcija desne ledvice pa je bila izvedena pri različnih temperaturah jedra (36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C in 38 C) z ishemično čas leve ledvice je bil določen na 24 minut, desna ledvica pa je bila odstranjena 14 dni po IRI leve ledvice. (E): Leva ledvica je bila izpostavljena IRI na dan 0, resekcija desne ledvice pa je bila izvedena v različnih ishemičnih trajanjih (21 min, 24 min, 27 min in 30 min) z jedrno telesno temperaturo, fiksirano na 37 C med ledvicami ishemijo, desna ledvica pa je bila odstranjena 14 dni po IRI leve ledvice. Teža ledvic, delovanje ledvic, histološka poškodba ledvic in fibroza ledvic so bili ocenjeni do 56. dne.

Kirurški poseg

Pred operacijo so vse miši postile 12 ur s prostim dostopom do vode in jim intraperitonealno injicirali 3% natrijev pentobarbital 50 mg/kg. Med anestezijo je bila rektalna temperatura v različnih eksperimentalnih skupinah vzdrževana pri 36 C, 36,5 C, 37 C, 37,5 C oziroma 38 C. Da bi to dosegli, so miško postavili s hrbtom na grelno blazino (CW{{10}}, BARBAROUS GROWTH, Zhejiang, Kitajska) v položaj z iztegnjeno glavo in vratom, da bi zagotovili, da njena dihalna pot ostane neovirano, oči pa pokrijemo s toplo slano gazo, da se prepreči izsušitev med postopkom. Po anesteziji smo dlake na levi strani miške postrigli s strižnikom. Kožo na kirurškem področju smo nato obrisali s 75% alkoholno palčko. Na splošno telesna temperatura miške po britju dlak pade. Kirurški poseg je bil izveden, ko je telesna temperatura v jedru postala konstantna, kar je lahko trajalo približno 15 minut. Levo ledvico je bilo mogoče videti z rezanjem leve hrbtne kože 0,5 cm poleg sredinske črte in 0,5 cm na spodnjem robu prsnega koša miši. Nato smo z eno roko stisnili levi trebuh, da smo levo ledvico izvlekli iz telesne votline, dvignili ledvico s topimi ukrivljenimi kleščami (pazimo, da ne poškodujemo ledvice), odstranili ledvični pecelj in ga hitro stisnili ter namestili stisnjeno ledvice pod kožo, da ostane topla in navlažena. Za uspešno ishemijo je bila značilna postopna sprememba barve ledvice od rdeče do temno vijolične, ki je v različnih eksperimentalnih skupinah trajala 21 minut, 24 minut, 27 minut oziroma 30 minut. Barva ledvic se je spremenila nazaj v rdečo v 2–5 minutah po sprostitvi sponke. Nato smo trebušno votlino zaprli s poplastnimi šivi. Desno dorzalno kožo in mišico so zarezali 7. dan, 10. dan oziroma 14. dan po uIRI v različnih eksperimentalnih skupinah, desna ledvica pa je bila resektirana. Nato zaprite rano s standardnimi šivi. Po vsaki operaciji smo intraperitonealno injicirali 500 l fiziološke raztopine, da bi nadomestili izgubo tekočine med operacijo. Hkrati smo miško hranili na grelni blazini približno 2–3 ure, dokler se ni popolnoma zavedla, preden so jo prenesli v ohišje. Lažna skupina ni vpenjala ledvičnega peclja, ostali kirurški posegi pa so bili enaki kot pri skupini uIRI. Vse kirurške posege je izvajala ista oseba z več kot 2 leti izkušenj pri upravljanju tega modela.

Test delovanja ledvic

Ravni SCr so bile izmerjene s kompletom za kreatinin (metoda Jaffe, 100020170, Biosino Biotechnology and Science). Ravni BUN so bile izmerjene s kompletom Urea (metoda ureaze-glutamat dehidrogenaze, Biosino Biotechnology and Science).

Test teže ledvic

Po uriniranju smo telesno težo miši izmerili z natančno elektronsko tehtnico. Sveže ledvice smo trikrat splaknili v predhodno ohlajeni fiziološki raztopini, nato pa odvečno vodo na ledvicah popivnali s filtrirnim papirjem. Ledvične kapsule so bile olupljene na ledu in ledvice takoj stehtane. Razmerje med težo ledvic in telesno težo je bilo izračunano za oceno korigirane teže ledvic v mg/g.

Barvanje s hematoksilin-eozinom (HE) in ocena poškodbe ledvic

Nevtralna s formalinom fiksirana ledvična tkiva so bila rutinsko dehidrirana, vdelana v parafin, razrezana (3 lm) in obarvana z HE, da bi opazovali poškodbe ledvičnih tkiv. Deset naključno izbranih polj ledvične skorje vsakega dela je bilo zajetih s svetlobno mikroskopijo pri 400 povečavi. Dva patologa sta ločeno ocenila poškodbo glomerula in ledvičnih tubulov. Tubularna poškodba je bila ocenjena na lestvici {{20}}–4 z uporabo naslednjih meril [17]: 0, brez poškodb; 1, ki prizadene 1–25 % površine ledvic; 2, ki prizadene 26–50% površine ledvic; 3, ki prizadene 51–75 % površine ledvic; in 4, ki prizadene 75–100 % površine ledvic. Stopnjo tubularne poškodbe smo ovrednotili polkvantitativno z izračunom površine ledvične tubularne poškodbe. Poškodbo glomerulov so ovrednotili in ocenili na lestvici od 0 do 4 glede na odstotek površine mezangialne ekspanzije ali skleroze z uporabo naslednjih meril [17]: 0, normalni glomeruli; 1, 1–25% poškodovane površine; 2, 26–50 % poškodovane površine; 3, 51–75 % poškodovane površine; in 4, 76–100 % poškodovane površine. Končna ocena poškodbe glomerulov ¼ 0 (% glomerulov stopnje 0) þ 1 (% glomerulov stopnje 1) þ 2 (% glomerulov stopnje 2) þ 3 (% glomerulov stopnje 3) þ 4 (% glomerulov stopnje 4). Več kot 50 glomerulov je bilo ocenjenih na miš.

Massonovo trikromno barvanje

Nevtralna s formalinom fiksirana ledvična tkiva so bila rutinsko dehidrirana, vdelana v parafin, razrezana (3 lm) in obarvana z Massonovim trikromom, da bi opazovali fibrozo ledvic. V Massonovih trikromno obarvanih rezinah je bilo pod 200-kratno povečavo zajetih dvajset neprekrivajočih se polj ledvične skorje. Za samodejno merjenje in analizo je bila uporabljena programska oprema Image-Pro Plus Image Analysis. Odstotek fibrotičnega območja je bil uporabljen za določitev stopnje intersticijske fibroze ledvic [8].

RT-PCR

Celotno mRNA smo ekstrahirali iz ledvičnega tkiva vsake skupine s Trizolom in izmerili njeno koncentracijo, nato pa jo pretvorili v cDNA (Taka Reverse Transcription Kit). Taqmanova fluorescenčna metoda (TB Green Premix Ex Taq II RT-PCR v realnem času) je bila uporabljena za kvantifikacijo ekspresije RNA fibronektina (FN) in kolagena I (COL-I) v tkivih ledvic. Za FN (naprej: 50 -GGAGTGGCACTGTCAACCTC-30 in vzvratno: 50 -ACTGGATGGGGTGGGAAT-30) in COL-I (naprej: 50 -ACATGTTCAGCTTTGTGGACC{) so bili uporabljeni posebni primerji. {9}} in obratno: 50 -TAGGCCATTGTGTATGCAGC-30 ) [18] (zagotovil Sangon Biotech Co., Ltd., Šanghaj, Kitajska). Pogoji pomnoževanja so naslednji: 95 C za 30 s, 95 C za 5 s, 60 C za 30 s, 40 ciklov; 95 C za 10 s, 65 C za 5 s in 95 C/5 C. Po analizi krivulj pomnoževanja in krivulj topnosti produktov so bile relativne ravni mRNA določene s primerjalno CT metodo (2-DDCt) z 18SrRNA (naprej: 50 - CGGACACGGACAG GATTGACAG-30 in vzvratno: 50 -AATCGCTCCACCAACT AAGAACGG-30 ) kot notranja referenca.

Western blot

Za lizo ledvičnih tkiv smo uporabili lizni pufer radioimunoprecitacijskega testa (RIPA) in določili koncentracijo beljakovin z metodo BCA. Za ločevanje proteinov iz 50 lg vzorcev smo uporabili gradientno gelsko elektroforezo. Nato so proteine ​​prenesli na nitrocelulozno membrano. Po 2-urnem blokiranju s 5 % nemastnim mlekom smo membrane čez noč popivali pri 4 °C s kunčjim protimišjim monoklonskim protitelesom proti aktinu gladkih mišic (a-SMA) (1:1000, št. 19245, Cell Signaling Technology). ), FN (1:1000, No.ab2413, ABCam) ali COL-I (1:1000, No.72026, Cell Signaling Technology). Naslednji dan smo membrane ponovno segrevali pri sobni temperaturi 0, 5 ure. Po izpiranju s TBST so bile membrane 2 uri inkubirane s HRP konjugiranim AffiniPure Goat Anti-kunčjim IgG (H þ L) (1:1000, št. BA1054, BOSTER Biological Technology). Po ponovnem izpiranju s TBST so jih obarvali z ultra-visoko občutljivim kemiluminescenčnim reagentom ECL za vizualizacijo imunoblotov. b-aktin je bil izmerjen na isti membrani kot notranja referenca. Ekspresije beljakovin so bile določene s kvantificiranjem relativnih ekspresij ciljnih proteinov v primerjavi z b-aktinom.

Podatki in statistične analize

Vsi pregledani podatki so izraženi kot povprečje ± standardni odklon. Do primerjav med obema skupinama smo dostopali z neodvisnim t-testom. Do primerjav med več skupinami je dostopala enosmerna ANOVA, ko je porazdelitev podatkov normalna in je varianca homogena, Welch ANOVA je bila uporabljena za oceno statistične pomembnosti, ko je bila varianca heterogena, čemur je sledil Tukeyjev post hoc test za večkratne primerjave. Vse statistične analize so bile izvedene s programsko opremo GraphPad Prism 8.0. p < 0.05 velja za statistično pomembno.