Skupni glikozidi Cistanche Deserticola spodbujajo okrevanje nevroloških funkcij z induciranjem nevrovaskularne regeneracije po poti Nrf- 2/Keap-1 pri podganah MCAO/R-Ⅰ

UVOD

Možganska kap velja za glavni vzrok smrti in invalidnosti v svetu. Skoraj 87 % vseh primerov možganske kapi povzroči ishemična možganska kap. Trenutno najučinkovitejše sredstvo in edino zdravilo, ki ga je odobrila FDA in se uporablja zazdravljenje ishemične možganske kapije rekombinantni tkivni aktivator plazminogena. Vendar pa se veliko bolnikov z možgansko kapjo ne odzove na to zdravilo zaradi njegovega ozkega terapevtskega časovnega okna in resnega tveganja za hemoragične zaplete. Glavni izziv trombolitičnega zdravljenja je ishemična/reperfuzijska (I/R) poškodba, ki velja za glavni vzrok za poškodbo možganov in uničenje funkcije. Reperfuzija po cerebralni ishemiji poveča tveganje za možgansko krvavitev, hkrati pa vodi do nevrovaskularne poškodbe in proizvaja prekomerne reaktivne kisikove vrste (ROS), ki poškodujejo krvno-možgansko pregrado. Več študij je potrdilo, da je motnja BBB glavni vzrok za patogenezo ishemične možganske kapi.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA ZDRAVLJENJE ISHEMIČNE MOŽGANSKE KAPE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

BBB je sestavljen predvsem iz endotelijskih celic, pericitov, astrocitov, nevronov in bazalnih membran. Osrednje komponente BBB so cerebralne mikrovaskularne endotelne celice, ki so povezane s tesnimi stiki in tako omejujejo eksogene molekule v možgane. Patološke spremembe tesnih stikov - zlasti okludina, klaudina-5 in zonula occludens-1 (ZO-1) - pomembno vplivajo na funkcijo BBB med ishemično možgansko kapjo, zlasti na prepustnost bariere. Med obdobji I/R je čezmerni ROS eden glavnih dejavnikov, ki vodijo do neposredne poškodbe možganskih nevronov. Prekomerna proizvodnja ROS vodi do degradacije določenih stičišč in motenj BBB, kar ima za posledico vstop eksogenih molekul v možgane skozi BBB, kar vodi do poslabšanja možganske poškodbe. Zato je bila zaščita BBB z antioksidanti obravnavana kot možen način za preprečevanje reperfuzijske poškodbe.

Poleg razgradnje BBB lahko I/R povzroči nevrovaskularno poškodbo in nevronsko smrt. Med možgansko kapjo je lahko povečana smrt nevronskih celic posledica oksidativnega stresa in številne študije so pokazale, da ROS poslabša resnost kapi in nevrološke poškodbe. Čeprav klinična preskušanja niso dala zadovoljivih rezultatov, je nevroprotekcija še vedno obetavna strategija za zdravljenje akutne ishemične možganske kapi. Tako je iskanje učinkovitih nevroprotektivnih zdravil za zdravljenje kapi korist za bolnike z možgansko kapjo.

Tradicionalna kitajska medicina (TKM) sprejema ukrepe za ukrepanje proti notranjemu neravnovesju telesa. Zaradi kompleksne patogeneze ishemičnih možganskih kapi ima multifaktorski učinek TKM in njegovih aktivnih sestavin ključno vlogo pri zdravljenju možganske kapi.Cistanchedeserticola YC Ma, razširjena v sušnih ali polsušnih območjih po vsej Mongoliji in severozahodni Kitajski, je že več kot 1,{2}} leto na Kitajskem široko uporabljena trava tradicionalne medicine za zdravljenje različnih bolezni, kot sta pozabljivost in depresija. Sodobne farmakološke študije so pokazale, da so surovi izvlečki iz C. deserticola pokazali več farmakoloških aktivnosti, kot je npr.izboljšanje delovanja učenja in spomina, nevroprotekcija, imunost, antioksidativni učinki, učinki proti staranju in proti utrujenosti. Kemična analiza C. deserticola je pokazala, da njene glavne sestavine vključujejofeniletanoidni glikozidi, iridoidni glikozidi, polisaharidi in oligosaharidi. Vendar pa aktivne sestavine C. deserticola za zaščito možganov niso zelo jasne.

Nevroprotektivna lastnost C. deserticola nakazuje njen terapevtski potencial pri boleznih, povezanih s kognitivnimi funkcijami, kot sta možganska kap in depresija, pa tudi Alzheimerjeva bolezen. Vendar so raziskave o vplivu C. deserticola na možgansko kap, vključno z njenimi aktivnimi sestavinami in mehanizmi delovanja, zelo omejene. V trenutnem delu smo raziskovali zaščitni učinek treh izvlečkov iz C. deserticola, skupnih glikozidov (TG, feniletanoidni glikozidi in drugi glikozidi), polisaharidov (PS) in oligosaharidov (OS) na cerebralne I/R poškodbe. Naše ugotovitve lahko prispevajo k natančni klinični uporabi C. deserticola in zagotovijo možno sredstvo zazdravljenje ishemične možganske kapi.

MATERIALI IN METODE

Kemikalije in reagenti

Stebla Cistanche deserticola so bila kupljena pri Alashanu v Notranji Mongoliji in jih je identificiral eden od avtorjev (P.-F. Tu). TG, PS in OS so bili pripravljeni v skladu z našo predhodno opisano metodo. Kvantitativno analizo TG smo izvedli s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti (HPLC), kot je opisano prej, njen kromatogram pa je prikazan na sliki 1. Glavne sestavine TG so ehinakozid, tubulozid A, akteozid, izoakteozid in 2'-acetilakteozid; njihove vsebnosti so 163,05 mg/g, 4,125 mg/g, 41,66 mg/g, 22,655 mg/g in 12,045 mg/g. Vsebnost PS in OS je 69,42 % oziroma 65,24 %, kot je bilo ugotovljeno s HPLC oziroma analizo fenola in žveplove kisline.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA ZDRAVLJENJE ISHEMIČNE MOŽGANSKE KAPE PHGS75% ECH 30% ACT 12%

Standardne reference ehinakozida (A0282), tubulozida A (A0942), akteozida (A0280), izoakteozida (A0281) in 2'-acetilakteozida (A0943) so bile kupljene pri Chengdu Must Biotechnology. Čistost vseh standardov je več kot 98 %. Kompleti Nissl stain H&E so bili kupljeni pri Bosterju. Edaravone (T0407-1) ​​je bil kupljen pri Target Mol (Šanghaj, Kitajska). Kupljeni so bili zajčji protipodganji MAP-2 (ab32454), Nrf-2 (ab31163), PDGFRb (ab32570), Keap-1 (ab66620) in mišji protipodganji CD31 (ab24590). od Abcam Inc. Kunčje protipodganje Claudin5 (BS1069), ZO-1 (BS9802M) in Occludin (BS72035) so bili kupljeni pri Bioworld Technology. Cell Signaling Technology Inc. (Boston, MA, ZDA) je bil vir kunčjega protipodganjega sinapsina-1 (SYN,5297T), PSD95 (3450T), a-Smooth Muscle Actin (a-SMA,19245T). GAPDH (HRP-60004) smo kupili pri Proteintech Group, Inc. Sekundarna protitelesa je dobavila Zhongshan Golden Bridge Biotechnology (Peking, Kitajska). Hoechst 33258 je bil pridobljen pri Beyotimeu.

Živali

Podgane Sprague-Dawley (samci, težki 250–300 g) so bile pridobljene iz Vital River Laboratory Animal Technology in nameščene v klimatiziranem prostoru, ki je bil v 12-urnem ciklu svetloba/tema. Vsi poskusi na živalih so bili izvedeni v skladu s smernicami ARRIVE za raziskave na živalih in jih je odobril Odbor za institucionalno oskrbo in uporabo živali Zdravstvenega znanstvenega centra Pekinške univerze.

Protokoli poskusov na živalih

Podgane so bile izpostavljene MCAO/R, kot je opisano prej (Wang et al., 2018). Na kratko, izpostavljene so bile leva skupna karotidna arterija (CCA), zunanja karotidna arterija (ECA) in notranja karotidna arterija (ICA) in 3-0 najlonski monofilamentni šiv je bil vstavljen iz ECA v ICA, dokler ni dosegel sredine možganska arterija (MCA). Po 1,5 urah okluzije MCA je bila reperfuzija simulirana z odstranitvijo filamenta. Med kirurškim posegom je bila telesna temperatura vseh podgan vzdrževana pri 37,0 stopinjah. Zdravilo

Administracija

Podgane so bile naključno razdeljene v šest skupin z uporabo programske opreme SPSS različice 22.0, kot je opisano: normalna skupina (NOR); skupina modelov (MOD); skupina edaravona (pozitivno zdravilo, 6 ml/kg, EDI); skupina TG (280 mg/kg, TG); Skupina PS (280 mg/kg, PS) in skupina OS (280 mg/kg, OS). TG, PS in OS so dajali enkrat na dan po MCAO/R 14 dni. Skupini NOR in MOD sta bili zdravljeni z navadno fiziološko raztopino. Število živali je prikazano v tabeli 1.

Merjenje telesne teže in ocene modificiranega nevrološkega primanjkljaja (mNSS)

Telesno težo smo spremljali 14. dan z uporabo digitalne tehtnice ADVENTURE™ (OHAUS, New Jersey, ZDA). mNSS je bil ocenjen po metodi, ki jo je opisal FJ Wang (Wang et al., 2018), z manjšimi popravki.

2, 3, 5-barvanje s trifeniltetrazolijevim kloridom (TTC)

Volumen infarkta je bil izmerjen, kot je opisano prej. Na kratko, možgane so razdelili na sedem enako razmaknjenih koronarnih blokov (2 mm). Ti odseki so bili obarvani z 2% TTC pri 37 stopinjah 15 minut. Volumen infarkta (%)=(volumen ipsilateralne ishemične hemisfere − volumen kontralateralne ishemične hemisfere)/volumen kontralateralne ishemične hemisfere × 100.

Nissl in H&E barvanje

Podgane so bile globoko anestezirane in celotni možgani so bili nato hitro odstranjeni iz lobanje, fiksirani s 4% paraformaldehidom, vdelanim v parafinski vosek, in razrezani na rezine debeline 7 µm. Odseke smo obarvali z Nisslom in H&E. V tej študiji je bilo v vsakem vzorcu tkiva s svetlobnim mikroskopom zajetih šest naključnih polj 200 × 200 µm. Število Nisslovih trupel je bilo prešteto s programsko opremo IPP različice 6.0.

Evansov modri test

Podganam so injicirali 2 % EB po MCAO/R. Dve uri pozneje so podgane anestezirali in nato hitro odstranili celotne možgane ter jih homogenizirali v acetonu. Supernatante smo analizirali pri 620 nm z čitalcem absorbance 800 TS.

Merjenje aktivnosti katalaze (CAT), superoksid dismutaze (SOD), malondialdehida (MDA) in glutation peroksidaze (GSH-Px)

Vse vzorce seruma smo centrifugirali pri 4,000 × vrtljajih na minuto 15 minut pri 4 stopinjah in nato analizirali za odkrivanje aktivnosti MDA, CAT, SOD in GSH-Px po navodilih proizvajalca.

Western blotting analiza

Možganska tkiva (100 mg), zbrana od vsake podgane, so bila homogenizirana in lizirana v pufru za lizo RIPA in nato analizirana za odkrivanje koncentracije beljakovin z uporabo kompleta BCA. Skupne tkivne beljakovine smo naložili na 10% SDS-PAGE gele in prenesli na nitrocelulozno membrano. Membrana je bila blokirana s 5 % posnetim mlekom, nato pa čez noč inkubirana s primarnimi protitelesi pri 4 stopinjah. Membrana je bila nato inkubirana s sekundarnim protitelesom. Western blot analiza je bila analizirana z uporabo Kodak Digital Imaging System.

Imunofluorescentna analiza

Izvedeno je bilo imunofluorescenčno barvanje za CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, occludin, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2, Nrf-2 in Keap-1. Primarna protitelesa proti Nrf-2, CD31, a-SMA, ZO-1, claudin5, okludinu, PDGFRb, SYN, PSD95, MAP-2 in Keap-1 so bila razredčena na 1 :200 oziroma 1:100. Sekundarna protitelesa Alexa Flur 488 mišji proti kunčjim IgG in rodamin (TRITC) kozji proti kunčjim IgG so bila oba razredčena na 1:200. Jedra so bila obarvana s Hoechst 33258. Slike so bile zajete z avtomatskim sistemom za kvantitativno patološko slikanje Vectra® Polaris™ (PerkinElmer, ZDA). Ekspresijo beljakovin smo analizirali z uporabo programske opreme IPP različice 6.0. Statistična analiza

Vsi podatki so bili opisani kot povprečje ± SD. Za statistično analizo je bila izvedena različica programske opreme SPSS 22.0. Enosmerna ANOVA je bila uporabljena pri primerjavi različnih skupin. P < 0.05 je veljalo za statistično razliko.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA PROTIISHEMIČNO BOLEZEN PHGS75% ECH 30% ACT 12%

REZULTATI

TG povečajo telesno težo in zmanjšajo poškodbe možganov pri podganah MCAO/R

Po 14 dneh zdravljenja s TG, PS, Oss in EDI so ovrednotili telesno maso, nevrološke izpade in infarktne ​​volumne I/R podgan. Rezultati so pokazali, da so se telesne teže v skupini MOD močno zmanjšale, medtem ko so se zmanjšane teže v skupinah TG, PS in EDI povečale (slika 2A). Rezultati nevrološkega primanjkljaja so bili znatno znižani z EDI in TG (slika 2B). Rezine možganov pri podganah iz skupine NOR so bile temno rdeče in ni bilo infarktov, medtem ko so podgane iz skupine MOD pokazale velik ipsilateralni možganski infarkt. Po zdravljenju s TG so se volumni infarkta znatno zmanjšali (sliki 2C, D). Zdravljenje s PS in OS ni pokazalo očitnega učinka na zgornje indekse. Zgornji podatki so pokazali, da lahko TG izrazito ublažijo možgansko poškodbo, ki jo povzroči I/R, vendar PS in OS ne morejo.

TG izboljšajo histopatološke poškodbe pri podganah MCAO/R

Za določitev nekaterih učinkov zdravljenja s TG, PS in OS na histopatološke poškodbe je bilo opravljeno barvanje s H&E, da bi razkrili patološke poškodbe. Histomorfološke strukture možganov v skupini NOR so bile pravilno urejene. Morfološke spremembe v skupinah TG so bile manjše od tistih v skupini MOD. Vendar pa skupine za zdravljenje s PS in OS niso pokazale pomembnega izboljšanja morfoloških sprememb (slika 3).

TG zmanjšajo nevronske poškodbe po I/R-induciranih podganah

Barvanje po Nisslu je pokazalo histopatološke spremembe nevronov v penumbri ishemične regije. Kot je prikazano na sliki 4, so imeli normalni nevroni jasen nukleolus in nedotaknjeno strukturo. V skupini MOD so imeli nevroni povečane medcelične prostore. Nisslova telesa so izginila, skrčena in globoko obarvana. Vendar so bile te spremembe redko opažene v skupinah EDI, TG in PS. Ti rezultati so pokazali, da bi TG in PS lahko znatnozmanjšati nevronsko poškodbo, povzročeno z ishemijo/reperfuzijo.

TG zmanjšajo motnje BBB po podganah, zdravljenih z I/R

Evansov modri test je klasična metoda za raziskovanje spremembe permeabilnosti BBB. Rezultati poskusa so pokazali, da so opazili povečano Evans modro v skupini MOD, medtem ko je bilo znatno zmanjšano Evans modro pri podganah, zdravljenih s TG in EDI. Poleg tega ni bilo pomembne razlike med terapevtskimi skupinami PS in OS (slika 5). Ti rezultati kažejo, da bi lahko TG znatno zmanjšali motnje BBB.

TG spodbujajo angiogenezo pri I/R poškodovanih podganah

Novejše študije kažejo, da ima angiogeneza ključno vlogo pri nevrološkem funkcionalnem okrevanju in prognostičnih rezultatih po akutni ishemični možganski kapi (Yuen et al., 2015). Za ovrednotenje učinkov TG, PS in OS na angiogenezo sta bila CD31 in a-SMA uporabljena za kvantifikacijo kapilarnega števila. Imunofluorescenčno barvanje je pokazalo, da je skupina MOD povzročila izjemno zmanjšanje izražanja CD31 (sliki 6A, B) in a-SMA (sliki 6C, D) v penumbri ishemičnih območij podgan I/R v primerjavi z normalnimi podganami . Ta rezultat je pokazal, da lahko I/R povzroči vaskularno poškodbo v korteksni penumbri ishemičnih hemisfer. Vendar pa je zdravljenje s TG in EDI izjemno povečalo gostoto kapilar, angiogenezo in arteriogenezo, kot kažejo povečane ekspresije CD31 in a-SMA. Ti rezultati kažejo, da bi lahko TG spodbujali angiogenezo v ishemični penumbri I/R podgan, PS in OS pa ne.

TG povečajo izražanje proteinov tesnega stika pri I/R poškodovanih podganah

Motnje BBB lahko povečajo vsebnost vode v možganih in otekanje tkiva, kar povzroči poškodbo možganov. Beljakovine tesnega stika so pomembne strukturne komponente BBB. Da bi preizkusili, ali lahko zdravljenje s TG, PS in OS po možganski kapi vpliva na celovitost BBB, so z imunofluorescenčno analizo izvedli izražanje ZO-1, claudina-5 in okludina. Rezultati so pokazali, da je bilo izražanje claudina-5, okludina in ZO-1 vidno zmanjšano v skupini MOD. Vendar pa so se po 14 dneh njegovega dajanja bistveno povečale. Skupine PS in OS niso pokazale pomembnih sprememb v izražanju teh beljakovin (slika 7). Ti podatki so pokazali, da lahko TG uravnavajo ekspresijo beljakovin tesnega stika in verjetno ohranijo celovitost BBB po poškodbi I/R.

TG povečajo pokritost pericitov na kapilarah pri I/R poškodovanih podganah

Pokritost pericitov na kapilarah igra ključno vlogo pri ohranjanju celovitosti BBB. Tako smo preizkusili, ali je mogoče povečati pokritost pericitov z zdravljenjem s TG, PS in OS. Rezultati analize intenzivnosti imunofluorescence so pokazali, da sta se izrazi PDGFRb in CD31 dramatično zmanjšali v skupini MOD. Dajanje TG podganam I/R je znatno obnovilo ali celo povečalo intenzivnost ekspresije PDGFRb in CD31, vendar v skupinah, zdravljenih s PS in OS, niso opazili nobene razlike (slika 8). Tako bi zdravljenje s TG lahko znatno povečalo pokritost pericitov. Te ugotovitve so nadalje potrdile, da lahko TG ohranijo celovitost BBB po I/R.

NARAVNA CISTANCHE TUBULOSA ZA PREPREČEVANJE ISHEMIČNE MOŽGANSKE KAPE PHGS75% ECH 30% ACT 12%