Izvleček:Z uporaboCistanche DesertIcolaParazitiranje dveh gostiteljskih rastlin (haloksilon ammodendron in atripleks canescens) kot preskusni materiali, je ta študija določila vsebnost polisaharida v C. desesericola različnih gostiteljev, ki uporabljajo metodo fenol-sulfurinske kisline. Sekvenciranje in analiza transkripta za haloksilon-cistanča inZdruženja Atriplex-cistančaso bili izvedeni z uporabo zaporedja Illumina Novaseq 6000. Raziskava se je osredotočila na raziskovanje razlik v transkriptu v C. desestrecola pri različnih gostiteljih, pregledovanje ključnih encimskih genov, ki sodelujejo pri presnovi polisaharida, in preverjanje izbranih genov s preverjanjem QRT-PCR. Namen te študije je zagotoviti teoretično podlago za raziskovanje novih gostiteljskih rastlin in genetsko izboljšanje C. desesericola. Rezultat je pokazal, da je bila vsebnost polisaharida, ki jo najdemo v Atriplex Quadriptera-C.Deserticola, boljša od tiste, ki je bila prisotna v Haloxylon Ammodendron-C. Desesericola. S primerjalno analizo transkripta je bilo 14089 različno izraženih genov (DEG) prikazanih iz mesnatih stebel Atriplex Quadriptera-C. Deseric in Haloxylon Ammodendron-C. Desesericola. Rezultati analize obogatitve KEGG so pokazali, da so bili ti DEG najbolj obogateni na poteh, povezanih s presnovo ogljikovih hidratov, presnovo galaktoze, presnovo aminokislin in metabolizmom maščobnih kislin. Poleg tega je bilo skupno 26 DEG pridobljenih iz štirih poti, povezanih s presnovo polisaharida, med katerimi so ravni ekspresije gena fruktozidaze in gena -galaktozidaze v haloksilonu ammodendronu -C. Desistencola je bila bistveno višja od tistih v Atriplex Quadriptera-C. Desesericola. Ravni ekspresije gena UDP-glukoze dehidrogenaze in mannoze -1- fosfat gvanilat transferaze v Atriplex Quadriptera-C. Desistencola je bila bistveno višja od tistih v haloksilonu Ammodendron-C. Desesticola, ki so lahko ključni encimski geni za uravnavanje razlike presnove polisaharida v C. desesickoli.

Ključne besede Cistanche DesertIcola; sekvenciranje transkripta; gostitelji; razlika presnove polisaharida

Cistanche DesertIcola

 

Cistanche desesericola yc ma, predvsem distribuirano vGansu, Xinjiang, Ningxia in Inner Mongolia, je tradicionalno kitajsko zdravilno zelišče, ki je nedavno vključeno v"Zdravilna in hrana homologna"Katalog. Ima različne zdravstvene koristi, na primertonificiranje ledvičnih jang, negovalno bistvo in kri ter spodbujanje gibanja črevesja, zaradi česar se široko uporablja vzdravila, zdravstveno varstvo in prehrambena industrija[1]. Zaradi tegaheterotrofna narava, Cistanche DesertIcolaparazitira različne gostiteljske rastline, zHaloksilon Ammodendronin na novo predstavljenoPol-zeleni grmAtriplex Canescens(Pursh) Nutt.kot njeni glavni gostitelji.

Polisaharidi so ključne aktivne snovi pri ocenjevanjuCistanche DesertIcolakakovost. Pod različnimi pogoji gostiteljakopičenje in presnovna sestavaodCistanchePolisaharidi se močno razlikujejo [2]. Medicinske raziskave so to pokazaleCistanchePolisaharidi imajoAntioksidant, nevroprotektivni, imunsko regulacija in povečanje spominafarmakološki učinki, učinkovito lajšajoAlzheimerjeva bolezen, Parkinsonova bolezen in pomanjkanje vranine, ki jo povzroča jetra[3]. Z napredkom v sodobnemTehnike ekstrakcije in tehnologije za analizo več spektra,Vsebina, sestava in strukturne značilnostiodCistanchePolisaharidi se postopoma razjavljajo in širijo svoje aplikacije.

V smisluRaziskave molekularne biologijenaprejCistanchevrste, študije sekvenciranja transkriptoma so se osredotočale predvsem naCistanche TubulosainHaloksilon-Cistanchezapleteni sistemi.Na primer,Hou et al.[4] izvedenoCelotno sekvenciranje transkripta in profiliranje genske ekspresijeodCistanche Tubulosaz uporaboPacbio in bgiseq -500 RNA-seq tehnologije, identifikacija237.772 edinstveni prepisiin pregledovanje ključnih encimskih genov, vpletenih vbiosinteza feniletanoidne glikozida. Podobno,Feng et al.[5] izvedenotranskriptomske in presnovne analizehaustorije in sosednjih tkivHaloksilonske korenine inCistanchemesnata stebla, ki razkriva vlogo gostitelja pri kopičenjuCistanchepresnovki. Njihova študija je poudarila, dagostiteljska rastlina ne vpliva samo na donosCistanchepa tudi njena kakovost. Vendar raziskaveCistancheparazitiranje različnih gostiteljskih rastlin ostaja omejeno.

Atriplex Canescens, a Globoko zakoreninjene in zelo odporne na stres, se razlikuje od tradicionalnegaHaloksilon gostiteljin izvira izpolsušne planote osrednjih Združenih držav Amerike. V zadnjih letih je bil uveden in promoviran kotnov gostitelj zaCistanche DesertIcolagojenjevSeverozahodna Kitajska. Qing et al.[6] analizirali in primerjalikopičenje polisaharidaCistancheparazitiranje haloksilona in atripleksana istem proizvodnem območjupomembne razlike v vsebnosti polisaharidamed obema pogojem gostitelja.

Tako je ta študija namenjenazaporedje mesnate steblaCistanche DesertIcolaparazitiranje haloksilona in atripleksa, analiziranjeDiferencialna ekspresija ključnih encimskih genov, ki sodelujejo v biosintezi polisaharida. Ugotovitve bodo zagotovile aTeoretični temelj za nadaljnje raziskovanjeCistancheMehanizmi biosinteze polisaharida, obogatitve transkriptomičnih študij na atripleksu-Cistanchesistemi in spodbujajo inovacije v kakovostiCistancheGermplasm viri.

 

Materiali in metode

1.1 Eksperimentalni materiali

Cistanche DesertIcolaVzorci parazitirajoHaloksilon AmmodendroninAtriplex Canescensso bili zbrani izCistanchebaza gojenja vXiquan Town, okrožje Jingtai, provinca Gansu(širina36 stopinj 5 'n, dolžina103 stopinj 42 'E). ObaHaloksiloninAtriplex Canescensso bili gojeni v istem okolju. Vzorci so bili razvrščeni kotHaloksilon-Cistanche(Vzorec a)inAtriplex-Cistanche(Vzorec h),s tremi ponovitvami za vsako kategorijo (pet rastlin na ponovitev). Vzorčenje je bilo izvedeno vApril 2024, in vzorci so bili identificirani kotCistanche DesertIcolamesnate žarniceProfesor Guo YehongodVisoka šola za kmetijstvo, kmetijska univerza Gansu.

PoSmernice za vzorčenje Shanghai OE Biotech Co., Ltd.,CistancheMesnata stebla smo sprali z ultravsko vodo in odvečno vlago odstranili s filtrirnim papirjem. Tanke rezine so bile odvzete izVrh, srednji in spodnji delvsakega stebla, temeljito zmešamo in damo v kriogene viale. Vzorci so bilihitro zamrznjen v tekočem dušikuza2 uriPreden so bili premeščeni v a-80 zamrzovalnik stopinjza shranjevanje [7].

1.2 Eksperimentalne metode

1.2.1 Vzpostavitev standardne krivulje in določanje vsebnosti polisaharida

A 10 mgvzorecD-glukozni standardje bil natančno tehtan in raztopljen v100 ml volumetrične bučkez destilirano vodo za pripravo a100 ug · ml⁻¹ delniška rešitev. Kalibracijske rešitve{{0}}}. 2, 0. 4, 0. 6, 0. 7, 0. 8 in 0,9 mlraztopine so bile prenesene v10 ml epruvete, razredčen z vodo1. 0 mlin nato pomešano z1. 0 ml 6% raztopine fenolain5 ml koncentrirane žveplove kisline. Po vrtincu smo rešitve segreli v vreli vodni kopeli za20 minut, nato se ohladi v ledeni kopeli za10 minut. A prazen nadzorje bil pripravljen z uporabo1. 0 ml destilirane vodenamesto raztopine glukoze. Absorbanca je bila izmerjena na482 nmz uporaboUV-vis spektrofotometerin aStandardna krivuljaje bil ustvarjen zKoncentracija (x) kot vodoravna osinabsorbanca (y) kot navpična os.

Po spremenjenem pristopuLi Jie in sod. [8], 0. 2 g posušenegaCistancheprahje bil natančno tehtan in postavljen v20 ml zamaška epruveta. 10 ml 80% etanolasmo dodali in mešanico podvrgliultrazvočna ekstrakcija pri 80 stopinjah (100 W, 40 kHz) 30 minut. Ekstrakt smo filtrirali, ko je bil vroč in postopek ponovil enkrat. Po sušenju ostanka,10 ml destilirane vodeje bil dodan in ultrazvočno ekstrakcijo ponovimo dvakrat. Filtrate smo združili in razredčili20 mlz destilirano vodo.1. 0 ml te rešitveje bil nadalje razredčen10 mlz destilirano vodo.

A 1. 0 ml alikvotpripravljenegaCistancheRaztopino vzorca smo analizirali po istem postopku kot glukozni standard. Absorbanca pri482 nmje bila izmerjena in vsebnost polisaharidaCistancheIz različnih gostiteljskih rastlin je bilo izračunano.

1.2.2 Ekstrakcija RNA, gradnja knjižnice cDNA in zaporedje

Skupna RNA je bila izvlečenaCistanche DesertIcolaVzorci parazitirajoHaloksilon AmmodendroninAtriplex Canescensz uporaboTiangen DP441 RNA komplet (Kitajska), poTrizol Reagent protokol. Čistost RNA je bila ocenjena z aNanodrop 2000 spektrofotometer (Thermo Scientific, ZDA), medtem ko sta bila koncentracija in celovitost RNA ocenjena z uporaboAgilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies, ZDA).

Knjižnice transkriptov so bile zgrajene z uporaboVahts Universal V6 RNA-seq knjižnice za pripravo. Po nadzoru kakovosti zAgilent 2100 Bioanalyzer, knjižnice so bile sekvencirane naPlatforma Illumina Novaseq 6000, ustvarjanje150 bp branje v paru.

1.3 Analiza podatkov

1.3.1 Transcriptome Sklop in funkcionalna opomba

Raw bere vFormat fastqso bili obdelani z uporaboTrimmomatskiza odstranitevPLOY-N berejo in berejo nizke kakovosti, ki ima za posledicoČisti odčitki. Odstranjene so bile adapterske sekvence in nizkokakovostna območja in čisti odčitki so bili sestavljeniContigs(izražene zaporedne oznake) z uporaboTrinity Software. Najdaljši prepis iz vsakega grozda je bil izbran kot aUnigeneza nadaljnjo analizo.

Funkcionalno opombo Unigenes je bilo izvedeno tako, da smo jih primerjali zNCBI nerazredna (NR) beljakovinska baza podatkov, švicarska prota in evolucijska rodoslovje genov: baza podatkov o ortoloških skupinah, ki niso pod nadzoromz uporaboDiamond Software (e-vrednost <1e -5). Opombe o evkariontskih ortoloških skupinah (KOG)je bil izveden za identifikacijo homolognih genov. Poleg tega so bili Unigenes preslikaniKjotska enciklopedija genov in genomov (KEGG)Za pripisovanje presnovne poti.Klasifikacija in funkcionalno opombo o genski ontologiji (GO)so bili izvedeni z uporabo preslikav iz baze podatkov Swiss-Prot.

1.3.2 Analiza ekspresije genov in identifikacija različno izraženih unigenov (DEG)

Ravni ekspresije genov smo količinsko opredelili z uporaboBowtie2uskladiti čiste branja Unigenes. Vrednosti ekspresije so bile izračunane kotFragmenti na kilobazo prepisa na milijon preslikanih odčitkov (FPKM)z uporaboExpress Software. Analiza diferencialne ekspresije je bila izvedena z uporaboProgramska oprema Deseq2, zNegativni testi binomne porazdelitve (NB)Uporablja se za testiranje pomembnosti. Diferencialno izraženi geni (DEG) so bili opredeljeni kot tisti zQ-vrednost <0. 05inSprememba gube (FC)> 2.

1.3.3 QRT-PCR Validacija različno izraženih genov

Ključni encimski geni, vpleteni vBiosinteza polisaharidazPomembno diferencialno izražanjeso bili izbrani zaKvantitativna validacija PCR v realnem času (QRT-PCR). Vzorci RNA so bili preverjeni kakovosti, vrednosti OD pa so bile izmerjene pred obratno transkripcijo. sinteza cDNA je bila izvedena z uporaboTranscript all-in-ene prve pramenske sinteze cDNA Supermix za komplet QPCR. Sintetizirana cDNA smo razredčili10- krat, in QRT-PCR je bil izveden z uporabo aFluorescenčni sistem QPCRv različnih pogojih kolesarjenja.ACTB (beta-aktin) je bil uporabljen kot notranji referenčni gen, in relativne ravni ekspresije genov so bile izračunane z uporabo2⁻ΔΔct metoda.

 

Tabela 1 zaporedja temeljnih premazov

Gensko id	Ime gena	FORWERDER PRIMER (5 '-3')	Povratni temeljni premaz (5 '-3')
Trinity _ dn 21412_ c 0_ g 1_ i 1_2	GMPP	Gatagtggctacacatccactt	CCTCCTTCTCGTCGTAGGATTC
Trinity _ dn 30174_ c 0_ g 1_ i 17_2	Pfp	Tatatgggaccatggaaccaa	Gaccataggccgtgatcgatc
Trinity _ dn 25715_ c 0_ g 2_ i 4_1	Ugdh	Aaagatcttccagttcgtaagc	ACCAATTCGTTGATGCTACC
Trinity _ dn 28766_ c 1_ g 1_ i 6_1	lacz	GTCTCCTTGTTATTCGTGAGGAT	GTCGATGGTGGTGAAGCAGAT
Trinity _ dn 24102_ c 0_ g 6_ i 1_1	saca	TTACGAGGATAGTGAGGTGCTA	Aatggaagatgaggaggttga
Trinity _ dn 21508_ c 1_ g 2_ i 4_2	lacz	GGCACAGTCAAGGAGTACGATG	CACTGGCATCGACGAGGAAAG
-	ACTB	Caatggatgatgatatcgccgcgt	CACTGGCATCGACGAGGAAAG

 

 

1.4 Analiza podatkov

Hierarhična analiza grozdaDiferenčno izraženi geni (DEG)je bil izveden z uporaboR (v3.2.0)za vizualizacijo vzorcev ekspresije genov v skupinah in vzorcih. GO (Gene Ontology) Analiza obogatitve inKEGG (Kjotska enciklopedija genov in genomov) Analiza obogatitve potiso bili izvedeni z uporaboR, ki temelji nahipergeometrična porazdelitev. S pomočjo znatno obogatenih funkcionalnih izrazov so bili prikazani z uporabočrtne karte, ploskve z mehurčki in parcele obogatitve.

2 rezultati in analiza

2.1 Rezultati določanja vsebine polisaharida

Linearna regresijska enačba, pridobljena z meritvami absorbance, je bila:

y {{0}}. 0 154x - 0.1636 (r 2=0. (R^2=0. 9963) y =0. 0154x - 0.1636 (r 2=0. 9963)

z linearnim razponom20–90 ug · ml⁻¹. Natančnost, ponovljivost, stabilnost in stopnja obnovitve vzorcev{{0}}}. 38%, 0. 86%, 0,53%in 99,67%, oziroma.

Izmerjenovsebnost polisaharidavCistanche DesertIcolaVzorci iz različnih gostiteljskih rastlin so bili:

Haloksilon-Cistanche: 6.51%

Atriplex-Cistanche: 11.83%

2.2 Transcriptome zaporedje in sklop podatkov

Transcriptome zaporedješest vzorcevustvaril skupno41,77 g čistih podatkov. Veljavni podatki na vzorec so segali od6,89 g do 7,04 g, zQ30 Osnovni odstotki med 95,38% in 95,91%in anPovprečna vsebnost GC 45,13%.

Skupaj61.423 Unigenesso bili sestavljeni s skupno dolžino65.962.858 bpin anPovprečna dolžina 1.073,91 bp.

2.3 GENE FUNKCIJA

Skupaj61.423 Unigenesso bili pridobljeni iz zaporedjaCistanche DesertIcolaVzorci, ki parazitirajo dve različni gostiteljski rastlini. Rezultati pripomb so naslednji:

30.689 Unigenes (49,96%)so bili označeni vNR (nerazrešena) beljakovinska baza podatkov.

18.698 Unigenes (30,44%)so bili označeni vBaza podatkov švicarske proteke.

3.998 Unigenes (6,51%)so bili označeni vBaza podatkov KEGG.

17.188 Unigenes (27,98%)so bili označeni vBaza podatkov kog (evkariontske ortološke skupine).

25.280 Unigenes (41,16%)so bili označeni vEggnog (evolucijska rodoslovje genov: neobvladljive ortološke skupine) baza podatkov.

16.210 Unigenes (26,39%)so bili označeni vGO (genska ontologija) baza podatkov.

16.153 Unigenes (26,30%)so bili označeni vBaza podatkov PFAM (beljakovine).

Med temi,21.650 Unigenesso bili daljši od1 kb.

Homologija analiza, ki temelji naNR baza podatkovrazkril, da so bile prve tri najbolj povezane vrste:

Paulownia Fortunei (30,23%)

Phtheirospermum japonicum (14,15%)

Chenopodium kvinoja (7,1%)

 

 

Tabela 2 Podatki o pripisuCistanche DesertIcolaFunkcija gena

Baza podatkov	Številka gena za pripombe	Delež (%)
Št	30,689	49.96
Švicarska prot	18,698	30.44
Kegg	3,998	6.51
Kog	17,188	27.98
jarb	25,280	41.16
Pojdi	16,210	26.39

 

 

2.4 GO in Kegg Funkcionalna opomba in razvrstitev

TheGO (genska ontologija) baza podatkovje bil uporabljen za nadaljnje pripisovanje Unigenov, identificiranih vNR baza podatkov, kar ima za posledico16.210 Unigenes. Te unigene so bile razvrščene vTri glavne funkcionalne skupine:

Biološki proces (BP)

Molekularna funkcija (MF)

Celična komponenta (CC)

Vkategorija biološkega procesa (BP), Najpogostejši grozdi Unigene so bili:

"Celični proces" (11.023 Unigenes)

"Metabolični proces" (9,117 Unigenes)

ZaKategorija celične komponente (CC), 17 podkategorijso bili identificirani, pri čemer vsaka podkategorija vsebuje vsaj30 Unigenes. Največji grozdi so bili:

"Celica" (13.947 Unigenes)

"Del celice" (13.918 Unigenes)

Vkategorija molekulske funkcije (MF), najbolj obogatene funkcionalne skupine so bile:

"Vezava" (10.039 Unigenes)

"Katalitična aktivnost" (8.490 Unigenes)

Fig.2 Go

 

Kegg funkcionalna opomba in klasifikacija

Medsekvenciranje transkripta, skupaj3.998 Unigenesso bili označeni vKEGG (Kjoto Enciklopedija genov in genomov) baza podatkov. Te unigene so bile razvrščeneŠest primarnih kategorij, z ustreznimi štetji in razmerji na naslednji način:

Celični procesi: 326 Unigenes (8.15%)

Okoljska obdelava informacij: 299 Unigenes (7.47%)

Genetska obdelava informacij: 1.771 Unigenes (44.30%)

Človeške bolezni: 14 Unigenes (0.35%)

Metabolizem: 1.465 Unigenes (36.64%)

Organizmalni sistemi: 123 Unigenes (3.07%)

Teh šest primarnih kategorij je bilo nadalje razdeljenih na20 ravni sekundarne klasifikacije. Med njimi,Genetska obdelava informacijimel najvišji delež, sledil jeMetabolizem. ZnotrajMetabolizemkategorija, najpogostejše poti so bile:

Metabolizem ogljikovih hidratov

Metabolizem maščobnih kislin

Flavonoidna metabolizem

Slika 3 Kegg presnovna pot Opombe Unigenes

 

2.5 Diferencialna genska ekspresija in obogatitvena analizaCistanche DesertIcolaod različnih gostiteljev

Podatki o sekvenciranju transkripta so bili filtrirani s pomočjoMerila za izbiro diferencialnih izrazov, kar ima za posledico identifikacijo14.089 različno izraženih genov (DEG):

6.576 genov je bilo reguliranih

7.513 genov je bilo znižanih

A Plot vulkanaje bil ustvarjen za vizualizacijo celotne porazdelitve DEG.

VTop 30 GO GO AGHTION FUNKCIJAOd DEG -jev je bilo opaziti, da:

V primerjavi zBiološki proces (BP)inCelična komponenta (CC)kategorije,Molekularna funkcija (MF)je pokazal pomembnejšo obogatitev DEG.

Najpomembnejši obogateni DEG so bili povezani zPresnova nukleinske kisline, presnova beljakovin in ključni encimi v presnovi galaktoze.

Poleg tega so bili DEG -ji znatno obogateniPogoji, povezani s presnovo polisaharida, vključno z:

Presnovni postopek škroba

Biosintetski proces glikogena

Katabolični proces saharoze

Aktivnost glukozidaze

UDP-L-Rhamnose Syntase Activity

Aktivnost polisaharidne hidrolaze

Slika 4 Vulkanski zemljevid različno izraženih genov

 

Kegg Analiza obogatitve poti DEG vCistanche DesertIcolaod različnih gostiteljev

Za nadaljnjo preiskavoDiferenčno izraženi geni (DEG)vCistanche DesertIcolaiz različnih gostiteljskih rastlin,Analiza obogatitve poti keggje bil izveden. Analiza je pokazala, da:

DEG so bili preslikani na 117 presnovnih poti.

TheTop 20 potiprikazanoPomembno obogatitev DEG, z najbolj obogatenimi potmi, vključno z:

Metabolizem maščobnih kislin

-Linolenska kislina metabolizem

Metabolizem galaktoze

Degradacija lizina

Nadaljnja analiza obogatitveTop 20 metaboličnih kategorij z najmanjšimi Q-vrednostminakazal, da so bili DEG znatno obogateni v:

Organizmalni sistemi

Metabolizem

Genetska obdelava informacij

Med temi kategorijami"Metabolizem"imel najvišje število obogatenih DEG -jev in je pokazal najpomembnejšo obogatitev. Poleg tega v obogatenih presnovnih potehdelež reguliranih in znižanih Unigenes je bil skoraj enak.

Te ugotovitve to kažejoPresnovne poti igrajo ključno vlogov diferencialnem genskem izražanjuCistanche DesertIcolaiz različnih gostiteljskih rastlin, zlasti vpresnova lipidov, ogljikovih hidratov in aminokislin.