Izboljšanje proteomike možganskega tkiva od zgoraj navzdol s FAIMS, 3. del

Ena takojšnja in očitna ugotovitev je, da višji kot je percentil številčnosti, večja je verjetnost identifikacije s TDP. Z drugimi besedami, TDP večinoma identificira zelo bogate beljakovine.

Ko se staramo, veliko ljudi ugotovi, da se je njihov spomin poslabšal. To je pogost pojav, še posebej po dolgotrajnem duševnem stresu, pomanjkanju spanja in neuravnoteženi prehrani.

Toda ali ste vedeli, da je eden od načinov za izboljšanje našega spomina povečanje vnosa beljakovin z visoko vsebnostjo? Beljakovine z visoko vsebnostjo so bogate z aminokislinami, ki lahko v možganih sintetizirajo molekulo, imenovano nevrotransmiter, ter spodbujajo rast in aktivnost nevronov. Nevroni so najosnovnejše enote v možganih in so ključ do naših učnih in spominskih sposobnosti. Zato lahko beljakovine z visoko vsebnostjo izboljšajo naš spomin s krepitvijo delovanja nevronov.

Raziskave so pokazale tudi povezavo med beljakovinami in spominom. Ena študija je na primer pokazala, da je dieta z nizko vsebnostjo beljakovin v primerjavi z dieto z visoko vsebnostjo beljakovin povzročila upad delovanja možganov, vključno s pozornostjo in spominom.

Torej, če želite izboljšati svoj spomin, lahko svoji prehrani dodate nekaj beljakovinskih živil, kot so piščanec, ribe, govedina, jajca, tofu itd. Seveda morate biti pozorni tudi na ravnovesje in raznolikost vaše prehrane, in ne morete jesti samo ene vrste hrane.

Skratka, visoka vsebnost beljakovin lahko pomaga izboljšati naš spomin. Če želite imeti boljši spomin, lahko začnete z dieto in poskušate jesti čim več živil z visoko vsebnostjo beljakovin! To kaže, da moramo izboljšati svoj spomin, in Cistanche lahko bistveno izboljša spomin, saj lahko uravnava tudi ravnovesje nevrotransmiterjev, kot je povečanje ravni acetilholina in rastnih faktorjev, ki so zelo pomembni za spomin in učenje. Poleg tega lahko Cistanche izboljša pretok krvi in ​​spodbuja dostavo kisika, kar lahko zagotovi, da možgani dobijo dovolj hranil in energije, s čimer se izboljša vitalnost in vzdržljivost možganov.

Kliknite poznajte dodatke za povečanje spomina

Približno polovica genov, identificiranih iz naborov podatkov od zgoraj navzdol (z ali brez FAIMS), je bila vsebovana v zgornjih 20 % zabojnikov številčnosti za analizo od spodaj navzgor (slika 6A). Nasprotno pa je bilo 71 genov mogoče najti samo v naborih podatkov od zgoraj navzdol ("NA" koš) (slika 6A).

Zdi se, da ti geni predstavljajo relativno kratke proteine ​​(<150 AA) and contained numerous basic Lys/Arg residues which, presumably, precluded their ability to be detected by bottom-up analysis. 

Na primer, znotraj polja samo od zgoraj navzdol so bili vključeni histonski proteini, kot so H3C1, H4C1, H1–4 in H2BC12. Kot je bilo pričakovano, smo ugotovili, da lahko FAIMS izboljša identifikacijo v nižjih odstotkih v primerjavi z "Brez FAIMS", kar poveča globino opazovanega proteoma.

Z določitvijo razmerja med FAIMS in "Brez FAIMS" v vseh percentilih je opazno povečanje identifikacij pod 40. percentilom v CV-jih v območju od -40 do -50 (slika 6B).

Če pa upoštevamo absolutno število genov, je glavni prispevek prednosti FAIMS prek razširitve spektra identifikacije po vseh percentilih številčnosti.

Povezava med FAIMS CV in prenosom proteoform

Pri FAIMS smo opazili tudi trend med CV FAIMS in molekulsko maso proteoforma (slika 7). Pri –50 CV je mediana masa proteoforma ~5 kDa in se poveča na ~15 kDa pri –20CV.

Na podlagi teh masnih porazdelitev (slika 7) se CV-ji, manjši od –50 V, zdijo zelo primerni za proteomske poskuse od zgoraj navzdol ali od sredine navzdol, medtem ko CV-ji, večji od –50 V, morda najbolj koristijo peptidomskim poskusom ali poskusom od spodaj navzgor.

Opaženi trend molekulske mase domnevno presega –20 CV; vendar smo naše iskanje omejili na –20 CV na podlagi padca v identifikacijah proteoform in genov, kar je privedlo do zmanjšanja donosov v pokritosti sekvence proteoma na zagon.

Upoštevati moramo, da je prejšnje delo z uporabo FAIMS ugotovilo, da je +40 CV idealna napetost za prenos težke verige NIST mAb (~51 kDa) in -20 CV najboljše za ustrezno lahko verigo (~23 kDa), kar podpira idejo da se trend, ki ga opažamo, razširi v pozitivne življenjepise FAIMS.45

Zanimivo je, da čeprav je bilo veliko spektrov, ki identificirajo posamezno proteoformo, omejeno na območje 10 V (3599 od 5165), je bilo v celotnem območju CV od -50 do -20 opaženih sedem proteoform. Verjetno je to mogoče pripisati njihovi visoki številčnosti v vzorcu, zlasti v primeru ubikvitina (UBB), bazičnega mielinskega proteina in proteina, ki veže acilCoA.

Vendar pa je tudi verjetno, da različna stanja naboja teh proteoform sprejmejo več konformacij plinske faze, odvisno od njihove izomerizacije protonov, kar vpliva na njihovo mobilnost.42

Teh sedem proteoform nam je omogočilo, da raziščemo, kako se ovojnica stanja naboja različno prenaša z modulacijo CV. Kot približek za porazdelitev stanja naboja pri vsakem CV smo uporabili mediano stanje naboja, ki temelji na ujemanju spektra proteoform (PrSM), identificiranih pri vsakem CV, in spremljali, kako se je ta vrednost spremenila kot funkcija CV, ki se začne pri –50 CV.

Skeniranje MS1 na sliki S3 prikazuje, kako mediana stanja naboja PrSM sledi porazdelitvi stanja naboja UBB. Od teh sedmih proteoform so štiri sledile obratnemu razmerju, pri čemer se je mediana opaženega stanja naboja povečevala, ko se je CV zmanjševal (slika 8).

Treba je omeniti, da so ta trend na splošno opazili pri peptidih in majhnih beljakovinah. 56, 62–64 Presenetljivo je, da so tri proteoforme pokazale nasprotno razmerje, kjer je zmanjševanje CV zmanjšalo opažena mediana stanja naboja (slika 8).

Površen pregled povprečne mase prekurzorja med obema skupinama kaže, da bodo večji prekurzorji bolj verjetno dajali prednost višjim stanjem naboja, ko se CV zmanjša.

Da bi dodatno potrdili ta razmerja, smo to analizo razširili na proteoforme, ki so bile identificirane v skromnejšem, a še vedno širokem razponu 20–30 CV (n=256 proteoform). Tukaj so proteoforme, katerih mediani naboj je premaknil več kot en naboj celotno območje CV je bilo razvrščeno v dve različni skupini, odvisno od smeri tega premika.

Tiste, ki so premaknili manj kot en naboj, so imeli za "nevtralne" glede spreminjanja življenjepisa. Podobno kot pri prejšnjih rezultatih je bilo večje prekurzorje bistveno bolj verjetno povezano z inverznim razmerjem med opazovanimi stanji naboja in CV (tabela S2).

Z zmanjševanjem CV se zdi, da se večina proteoform prenaša pri nižjih stanjih naboja (n=177) v primerjavi s tistimi, ki dajejo prednost višjim nabojem (n=39). Ostali (n=40) so bili obravnavani kot "nevtralni" glede sprememb v življenjepisu.

Proteoforme, združene znotraj nevtralne skupine, so pokazale povprečno maso prekurzorja med inverzno in neposredno skupino, kar ponovno nakazuje, da je masa proteoforme neločljivo povezana s tem obnašanjem.

Drugi primarni parametri, ki temeljijo na zaporedju, kot sta sestava bazičnih/kislih aminokislin in alifatski indeks, pa niso bili bistveno povezani (tabela S2).

Čeprav so proteini, ki se vnašajo v plinsko fazo, domnevno denaturirani, imajo lahko dejavniki, ki so tipično povezani z naravnimi proteini, kot je dipolni moment ali trkovni presek, boljšo napovedno vrednost za ta pojav.64–66 Naši rezultati kažejo, kako je mogoče CV uporabiti za filtriranje proteinov različnih mase in kako se lahko ovojnica stanja naboja proteina različno prenaša tudi prek FAIMS.

Uporabnost proteinskih fragmentov v poskusih TDP

Presenetljivo je bilo veliko število proteoform, ki smo jih identificirali, fragmenti večjih proteinov. Ugotovili smo, da le 25 % edinstvenih identificiranih proteoform pokriva več kot polovico zaporedja proteina, iz katerega so izpeljane.

Teh 25 % je imelo povprečno maso 11,4 kDa v primerjavi s preostalimi 75 %, ki so imeli povprečno maso 5,7 kDa. K tej ugotovitvi lahko prispeva več dejavnikov, od katerih so nekateri neodvisni od FAIMS.

Na primer, sami ti fragmenti so lahko produkti proteolitičnega cepitve, ki nastanejo v normalnih homeostatskih pogojih kot del celičnega "razgradnje"67 ali kljub različnim sprejetim previdnostnim ukrepom, uvedeni med postmortalnim intervalom in ravnanjem z vzorcem.

Tkivo centralnega živčnega sistema je bogat vir signalnih peptidov, znanih kot "nevropeptidi", ki so običajno pridobljeni tudi iz veliko večjih prekurzorskih proteinov.68

Z navzkrižnim sklicevanjem naših identifikacij proteoform z uveljavljeno bazo podatkov o nevropeptidih (NeuroPedia)69 smo lahko identificirali več takih nevropeptidov, vključno z vazostatinom-1, sekretonevrinom, holecistokininom-58 desnonopeptidom in nevropeptidom y ter številnimi nekanoničnimi različicami zaporedja izhajajo iz znanih genov, ki proizvajajo nevropeptide.

Poleg bioloških dejavnikov lahko nekateri parametri instrumentov vplivajo tudi na opazovanje proteinskih fragmentov. Na primer, nizke napetosti "fragmentacije" v izvoru (med 10 in 20 V) se običajno lahko uporabijo za odstranjevanje aduktov in desolvatiranje proteinskih ionov, medtem ko lahko višje napetosti povzroči disociacijo, ki jo povzroči vir.

Vendar se dovzetnost amidnih vezi za disociacijo lahko zelo razlikuje in ko se velikost proteina poveča, se poveča tudi verjetnost, da bo vseboval labilne amidne vezi, kot je Xaa-Pro. mehanizma, tudi pri nizkih izvornih napetostih, smo se odločili, da se izognemo uporabi izvorne napetosti, da bi zmanjšali možnost vnosa drobnih ionov v instrument.

Možno je tudi, da so proteini dovzetni za dogodke fragmentacije, ko prehajajo skozi električna polja, ustvarjena v FAIMS. Vendar se od teh fragmentov ne pričakuje, da bodo imeli enako mobilnost kot matični ion, z opozorilom, da je to verjetno odvisno tudi od velikosti fragmenta glede na predhodni ion.

Nazadnje je vredno poudariti nekaj dejavnikov, ki lahko vplivajo na opazovanje manjših proteoform (<∼15 kDa). First and foremost is the signal spreading that occurs as the size of a proteoform increases.74 

To širjenje signala lahko v veliki meri pripišemo ovojnici stanja naboja in izotopskim porazdelitvam vsakega stanja naboja. Specifična za našo eksperimentalno postavitev je bila uporaba filtra MWCO velikosti 3K kot končnega koraka filtracije v naši pripravi vzorca, ki je bil v tem primeru izbran za zagotovitev, da se lahko manjše proteoforme amiloida beta učinkovito zajamejo, če so prisotne.

Splošni instrumentalni dejavniki lahko ustvarijo tudi pristranskost proti majhnim proteoformam, vključno z nastavitvijo kvadrupola, elektrodinamičnim zajemom in trki z molekulami preostalega plina v celici Orbitrap, ki vodijo do hitrejšega razpada prehodnega pojava za večje molekule.75 Ne glede na te pristranskosti ali eksaktorigin fragmentov, lahko še vedno zagotovijo vpogled v proteom.

Ti fragmenti so še posebej uporabni v kontekstu nevrodegenerativne bolezni, kjer so motnje v proteostazi običajno povezane s patologijo.76,77

Dejansko se pogosto ugotovi, da so fragmenti tau nevrotoksični in igrajo vlogo pri napredovanju tauopatij, kot je AD.23–26 Na splošno so fragmenti, ki jih opazimo, veliko večji od triptičnih peptidov in v več primerih, ko je veliko fragmentov za določen protein , opazimo precejšnjo pokritost zaporedja.

To je ponazorjeno s preučevanjem fragmentov, ki zagotavljajo pokritost za verigo ~50 kDa tubulinalfa-1B (TUBA1B) in ~70 kDa sinapsina-1 (SYN1), kot je prikazano na sliki 9A, B, oba velika beljakovine, ki bi jih sicer težko opazili v njihovi polni dolžini v TDP kompleksnega vzorca.

Identifikacija proteoform, ki so pomembne za nevrodegenerativne bolezni

Uporaba FAIMS z našo analizo od zgoraj navzdol je omogočila identifikacijo več edinstvenih variant spoja Swiss-Prot in vnosov TrEMBL, z 267 edinstvenimi variantami spoja in 96 vnosi TrEMBL (tabela S3).

Predvsem opažamo več PrSM-jev, ki nedvoumno identificirajo alternativno izoobliko ORF (A{{0}}A0D9SF30) za adhezijsko molekulo živčnih celic1 (NCAM1). Opazili smo tudi proteoforme, pridobljene iz genov, ki imajo znano vlogo pri več nevrodegenerativnih boleznih, zlasti -sinuklein in PARK7.

V obeh primerih prevladujoče proteoforme vsebujejo zaporedje polne dolžine. Zanimivo je, da je bilo ugotovljeno, da večina -sinukleinskih, sinukleinskih in (v manjšem obsegu) -sinukleinskih PrSM vsebuje ~177 Da neznan masni premik blizu C-konca (sinukleinski spekter celotne dolžine z neznano modifikacijo, kot je prikazano na sliki S4A) .

Ta premik mase je bil že opažen pri iskanju po odprtih bazah podatkov in ga na splošno najdemo pri Asp ali Gluresidues.78 Možna razlaga, ki se zelo ujema s povprečno in monoizotopsko maso modifikacije, je sestavljena iz enega kisika s tremi atomi železa ter izgube sedmih atomov vodika ( na podlagi pristopa Unimod #1971).

Primerjava izotopskih vrhov iona fragmenta ay242+ iz -sinukleina (slika S4B) s simuliranim spektrom, ki vsebuje zgoraj omenjene elemente, za katere se domneva, da pripadajo neznani modifikaciji (slika S4C), dokazuje podobnost med obema izotopskima porazdelitvama, pri čemer se številni izotopski vrhovi med seboj poravnajo znotraj 2 ppm.

Prav tako je treba poudariti, da so skrajni levi izotopski vrhovi edinstveni za naravno prisotne izotope železa in da je odsotnost teh vrhov takoj očitna, ko je spekter simuliran brez treh atomov železa (slika S4D), kar močno nakazuje, da je ta neznana modifikacija zelo verjetno sestavljena predlaganih elementov.

Predhodne študije so prav tako opisale visoko afiniteto -sinukleina za različne kovinske ione in regija, za katero opazimo, da vsebuje to modifikacijo, se prekriva z ostanki, za katere je znano, da sodelujejo pri vezavi ― zlasti z motivom 119DPDNEA124 (slika S5).79–81

Naši podatki tudi kažejo, da imata C-terminalni regiji -sinukleina in -sinukleina podobne vloge pri vezavi kovin, saj je bilo več spektrov z istim neznanim masnim premikom usklajenih s podobnimi sekvencami znotraj teh proteinov.

Pri mitohondrijskem proteinu PARK7 smo opazili masni premik ~116.0 Da na njegovem ostanku Cys na enem aktivnem mestu, C106 (slika S6). Ena možna razlaga s podobno sukcinilacijo delta mase, modifikacijo, ki se pripisuje mitohondrijskemu stresu in nastane zaradi Michaelovega dodatka fumarata na tiolno skupino Cys.82

For more information:1950477648nn@gmail.com