Nedvoumna NMR strukturna določitev (plus)-katehin-lakaza dimernih reakcijskih produktov kot potencialnih označevalcev oksidacije grozdja in vina
Mar 12, 2022
Za več podrobnosti se obrnite na:tina.xiang@wecistanche.com
Povzetek:(plus)-katehin—lakazoksidacijadimerni standardi so bili Hemi-sintetizirani z uporabo lakaze iz Trametes Versicolor je vodno-etanolna raztopina pri pH 3,6. Odkritih je bilo osem frakcij, ki ustrezajo osmim potencialnim oksidacijskim dimernim produktom. Profile frakcij smo primerjali s profili, dobljenimi z dvema drugima oksidoreduktazama:polifenol oksidazaekstrahiran iz grozdja in lakaze iz Botrytis cinerea. Profili so bili zelo podobni, čeprav so nekatere manjše razlike nakazovale možne razlike v reaktivnosti teh encimov. Nato smo izolirali pet frakcij in jih analizirali z 1D in 2D NMR spektroskopijo. Dodatek sledov kadmijevega nitrata v vzorcih, raztopljenih v acetonu, je privedel do popolnoma ločenih NMR signalov fenolnih protonov, kar je omogočilo nedvoumno strukturno določitev šestih reakcijskih produktov, ena od frakcij, ki vsebuje dva enantiomera. Ti produkti se lahko nadalje uporabljajo kot označevalci oksidacije za raziskovanje njihove prisotnosti in razvoja v vinu med vinarstvom in staranjem vina.
Ključne besede: marker oksidacije;( plus )-katehin; fenolni NMR signali; lakaza; kadmijev nitrat; polifenol oksidaza
1. Uvod
Polifenoliso družina kemičnih spojin, ki so široko prisotne v naravi. Najdemo jih v znatnih količinah v čaju [1], kakavu [2,3], borovnicah [4], grozdju [5 l] in fermentiranih izdelkih, kot je vino [6]. Ker so primarne oksidacijske tarče J7,8], se kemične strukture polifenolov nenehno razvijajo. Te spremembe vplivajo na organoleptične lastnosti mnogih vrst hrane; so odgovorni za pojave, kot so porjavitev hrane [9] in spremembe senzoričnih značilnosti vina [10,11. V enologiji se ta oksidacijski pojav dogaja v grozdju ali vinih. V zvezi z encimsko oksidacijo so glavni encimi, odgovorni za porjavitev, oksidoreduktaze, natančneje,polifenol oksidazaprisotna v grozdju in lakazi, ki jo proizvaja Botrytis cinerea [12].
Encimskooksidacijavečinoma se pojavlja v grozdnem moštu, vendar je nadaljnje porjavenje vina lahko posledica kemičnih oksidacijskih reakcij |7,13]ali lakaze Botrytis cinerea, ki je lahko med staranjem vina zelo stabilna14. Na fenolnih substratih se lahko pojavita dve oksidacijski encimski aktivnosti: aktivnost monofenol oksidaze, za katero je značilna hidroksilacija obstoječega sosednjega položaja hidroksilne skupine, in aktivnost difenol oksidaze, ki ustreza oksidaciji orto-dihidroksibenzenov v orto-benzokinone.
Po mnenju Odbora za nomenklaturo Mednarodne zveze za biokemijo in molekularno biologijo (NC-IUBMB) te encimske aktivnosti katalizirajo encimi razreda EC1-, ki ustrezajo oksidoreduktazam. Med njimi so trije glavni razredi oksidoreduktaz, ki katalizirajo oksidacijo polifenolov, EC1.14.18.1 (monofenol monooksigenaza), EC1.11.1 (peroksidaza/POD) in EC1.10.3 (oksidoreduktaze, ki delujejo na difenole).
Ta zadnji razred je razdeljen na različne podrazrede in dva od njih sta se zdela posebej zanimiva za to študijo: EC1.10.3.1 (polifenol oksidaza/PPO) in EC1.10.3.2 (lakaz) (glej sliko S1 dodatnega materiala).
PPO, lakaza in peroksidaza so oksidoreduktaze, ki so v glavnem odgovorne za porjavitev med predelavo grozdja [13]. Porjavitev, ki jo povzroča POD, je pri sadju zanemarljiva, vendar lahko poveča razgradnjo fenolov v kombinaciji s PPO[15]. PPO je naravno prisoten v grozdju in lahko katalizira oksidacijo monofenolov v katehole in kateholov v rjave pigmente [8,13,16]. Lakaze, ki se pojavljajo v grozdju, okuženem z Botrytis, imajo širši spekter delovanja,|17|saj lahko katalizirajo oksidacijo številnih različnih substratov. Glavne oksidacijske tarče lakaz ostajajo 1-2 in 1-4 dihidroksibenzen.
V vinu je lahko benzokinon, proizveden z oksidacijo (PPO ali lakaze), zlahka podvržen nadaljnjim reakcijam, odvisno od njihovih redoks lastnosti in elektronskih afinitet [15]. Lahko delujejo kot elektrofili in reagirajo z amino derivati [18] ali delujejo kot oksidanti in med drugim reagirajo s fenolnimi substrati. Glede na njihovo kemijsko konformacijo (kinon ali semi-kinon) lahko benzokinon povzroči različne produkte oksidacijske reakcije. Pri nevtralnem pH bo (plus)-katehin oksidiran v kinon na položaju A-obroča C5 ali C7 in privede do tvorbe šestih možnih dimernih izomerov, kar kaže na povezavo med položajem B-obroča C2', C5' ali C6' zgornje katehinske enote in položaj obroča A C6 ali C8 spodnje enote [19,20]. Dehidrodikatehin je dobro znan produkt te sklopitve [21]. Položaji označevanja struktur so prikazani na sliki 1. V kislih pogojih so lahko semikinonske oblike prisotne tudi na B-obroču (položaj OH3'ali OH4') in vodijo do štirih možnih dimernih izomerov [20,22] z zgornjo katehinsko enoto in A-obroč spodnje enote (položaj C6 ali C8). Encimsko oksidacijo katehina so raziskali v prejšnjih študijah [22, 23], povezane produkte oksidacije pa so okarakterizirali s HPLC [24], čeprav redkeje izolirani in nikoli popolnoma okarakterizirani z NMR.
Namen tega dela je bil najprej primerjati z UHPLC-MS profile oksidacijskih produktov dimer(plus)-katehin v prisotnosti treh ekstraktov oksidoreduktaze, tj. PPO, ekstrahiranega iz grozdja, lakaze iz glive Botrytis cinerea, ki je prisotna v botritiziranih sladkih vinih. [14] in lakazo iz Trametes Versicolor.
Drugi cilj je bil hemisinteza in karakterizacija struktur nekaterih produktov dimerne oksidacije z NMR spektroskopijo, pridobljenih z lakazo iz Trametes Versicolor.
2. Rezultati in razprava
2.1. Primerjava profilov produktov dimerne reakcije s tremi različnimi oksidoreduktazami in(plus)-katehinom
(plus)-katehin je bil najprej oksidiran v prisotnosti lakaze iz Trametes Versicolor pri pH 3,6 v modelni raztopini vina. Po ločitvi dimerne frakcije od preostalega (plus)-katehina in drugih polimernih frakcij je bilo zbranih osem glavnih frakcij in analiziranih z UHPLC-UV-MS, zabeleženih od N1 do N8 v naraščajočem vrstnem redu retencijskega časa (tabela 1). Masni spekter elektrospreja v pozitivnem načinu je pokazal ionske vrhove [M plus H] plus pri m/z 579 za N1 do N6, kar hipotetično ustreza dimerju, ki ga tvori enojna vez med dvema katehinskima enotama, in [M plus H] plus pri m/577 za N7 in N8, kar hipotetično kaže na nastanek dodatne povezave.
Teh osemoksidacijafrakcije so bile potencialno opažene po kemični depolimerizaciji frakcije tanina v prejšnjih delih [25,26] in bi lahko bile enake tistim, ki so jih že opisali Guyot et al. [20], čeprav so bili eksperimentalni pogoji nekoliko drugačni. Dejansko je bil v tej prejšnji študiji surovi ekstrakt PPO uporabljen pri pH3 in 6, da smo dobili osem frakcij. V tej študiji so primerjali tri različne encime pri pH 3,6 v modelni raztopini vina. Primerjalna analiza LC-MS glavnih oksidacijskih frakcij, dobljenih s tremi različnimi encimi (lakazo iz Trametes Versicolor, lakazo iz Botrytis cinerea in polifenol oksidazo, ekstrahirano iz grozdja), je predstavljena v tabeli 2. Za vsako od osmih frakcij je retenzijski časi so bili skoraj enaki pri različnih encimih, podobni m/z pa so bili določeni z MS analizo. Ti rezultati podpirajo hipotezo, da so bile za vsak encim pridobljene enake frakcije, ki vsebujejo produkte s strukturami, podobnimi tistim, ki so jih domnevali Guyot et al. [20]. Lopez-Serrano in Ros Barcel6 [27] sta izvedla tudi primerjalno študijo produktov oksidacije (plus)-katehina z dvema različnima encimoma: peroksidazo in polifenol oksidazo, oba ekstrahirana iz jagod. Ugotovili so, da so produkti, dobljeni z obema encimoma, kvalitativno enaki. Dodatno spojino z imenom N4' z m/z=578 Th in Rt=15.66 min so opazili v poskusih z lakazo iz Botrytis cinerea in ekstrahiranim PPO, vendar ne z lakazo iz Trametes Versicolor, kar kaže na možne razlike v reaktivnosti za te encime.
2.2. Študija in optimizacija fizikalno-kemijskih parametrov na 1H-NMR fenolnih in alifatskih OH signalih
Strukturno karakterizacijo dimerov procianidinov lahko dobimo z NMR analizo. Zlasti je mogoče določiti natančen položaj povezave med enotami z uporabo korelacijskih spektrov HMBC in/ali ROESY [28, 29] (sliki S2 in S3). V primeru vezi eterskega tipa (COC) je potrebna dodelitev hidroksilnih signalnih protonov. V primeru povezav CC je lahko tudi ključno, če se nekateri alifatski ali aromatski protoni prekrivajo ali če manjkajo nekatere ključne korelacije. Vendar pa se tudi v aprotičnem topilu hidroksilni protoni polifenolov pogosto pojavljajo kot široki signali, iz katerih ni mogoče pridobiti nobenih strukturnih informacij [30]. To vprašanje je bilo okvirno rešeno z dodajanjem sledi
Cd(NO3)2 v raztopinah vzorcev. Dejansko so 'H široki signali OH skupin posledica medmolekularne izmenjave med temi OH protoni in drugimi protoni v topilu ali topljencu. Z zmanjšanjem medmolekularnih vezi lahko prisotnost kadmijevega nitrata v vzorcih zmanjša te izmenjave in tako izboljša ostrino signalov protonov OH.
2.2.1. Učinek dodatka kadmija
Po sušenju z zamrzovanjem smo pet frakcij N2, N3, N4, N6 in N8 raztopili v acetonu-dg. Nato so bili pridobljeni 1D protonski NMR spektri pri 25 stopinjah pred (slika 2A) in po dodatku majhnih količin kadmija (slika 2B). V čistem acetonu-d. so se fenolni OH protoni vseh frakcij pojavili kot široki vrhovi. Po dodatku kadmija so ti protoni pokazali visoko ločljive signale v primeru frakcij N6 in N8, medtem ko so bili pri frakcijah N2, N3 in N4 signali le malo ostrejši. Prav tako je treba omeniti, da povečanje vsebnosti Cd ni vplivalo na ločljivost signala OH, saj ni bilo opaziti ostrine ali širine vrha širine črte, ko smo vzorcem dodali zaporedne majhne količine Cd (podatki niso prikazani).
Visoko ločeni fenolni OH signali iz produktov N2, N3 in N4 so bili doseženi zahvaljujoč dodatnemu sušenju in resolubilizaciji (slika 2C, D).
Razliko v obnašanju ob dodatku Cd med frakcijami je mogoče razložiti z močjo molekularnih interakcij: močnejše v primeru N2, N3 in N4 v primerjavi z N6 in N8, pri čemer je potreben nadaljnji korak za prekinitev teh vezi.
Ta dodatni korak je lahko ključni korak pri uporabi Cd za pridobivanje visoko ločenih fenolnih OH signalov v kateri koli situaciji, ne glede na izvor vzorcev, reakcijo sinteze ali naravne polifenolne produkte.
Prejšnje delo, ki se ukvarja z nedvoumno strukturno karakterizacijopolifenoldimerjev z visoko ločljivostjo OH fenolnih NMR signalov zahvaljujoč dodatku kadmijevega nitrata je bil objavljen leta 1996[30]. Kolikor vemo, od takrat ni bil objavljen noben drug raziskovalni članek, ki bi uporabljal to metodologijo. Kasneje so bile opravljene druge raziskave za dosego tega cilja, bodisi z dodajanjem pikrinske kisline [31] ali z uporabo nizke temperature pridobivanja [32]. To je mogoče pojasniti z nadaljnjim korakom, ki je potreben za odločilen učinek na ostrino vrha OH z dodatkom Cd, kot je opisano zgoraj. Vendar se zdi, da ima kadmij veliko vrednost, saj je mogoče dobiti signale z visoko ločljivostjo brez potrebe po dodajanju natančnih količin, v nasprotju s pridobivanjem pikrinske kisline ali NMR spektrov pri nizkih temperaturah.
2.2.2. Učinek temperature
Znižanje temperature s 25 stopinj C na 15 stopinj ni vplivalo na ostrino fenolnih OH ali alifatskih OH signalov. Kljub temu so nam premiki izmenljivih protonskih vrhov navzdol omogočili ločitev nekaterih prekrivajočih se fenolnih in alifatskih OH signalov, zaradi česar je njihova identifikacija bolj očitna (slika 3). Z znižanjem temperature se je hitrost izmenjave protonov zmanjšala in lahko bi pričakovali ostrejše vrhove alifatskih OH [31]. Temperatura 15 stopinj očitno ni dovolj nizka, da bi dobili dobro ločene alifatske OH signale. Vendar nam je omogočilo jasno identifikacijo resonance dveh alifatskih OH protonov v vzorcih N3 in N6 ter enega v vzorcu N8. Spekter vzorca N2 je pokazal tudi dva signala alifatskih protonov OH, ki sta bila bolj razločljiva pri 25 stopinjah C kot pri 15 stopinjah (slika 2E). V primeru vzorca N4 so bili signali, ki izhajajo iz alifatskih OH, le delno vidni v spektrov, ne glede na to, ali je bila temperatura nastavljena na 25 stopinj ali na 15 stopinj C, zaradi vztrajnega prekrivanja (slika 2E).
2.3. Strukturna karakterizacija dimernih standardov—NMR spektralna analiza
NMR spektri frakcij N2, N3, N4, N6 in N8 so pokazali, da so bili produkti oksidacije visoke čistosti, saj so bile intenzitete signala drugih zaznanih spojin manjše od 10 odstotkov v primerjavi s tistimi teh produktov.
V vseh spektrih je mogoče razločiti štiri področja kemijskega premika lH, značilna za katehinske enote (slika 2C): signale alifatskih protonov piranskih obročev (obroči C) najdemo v območju od 2,3 do 5.0 ppm, in tisti aromatskih signalnih protonov rezorcinolnih obročev (A obroči) in kateholnih obročev (Brings) od 5,5 do 6,3 ppm oziroma 6,3 do 7,1 ppm. Fenolni signali OH obeh obročev A in B so se pojavljali od 7,1 do 10 ppm. NMR spektri obeh frakcij so pokazali prisotnost različnih signalnih sklopov katehinskih enot v konstantnem razmerju intenzivnosti: v spektrih frakcij N2, N3, N6 in N8 smo opazili dva niza signalov v skladu s prisotnostjo dimerov in štiri sklope v spektrih N4, ki lahko ustrezajo enemu tetrameru, dvema dimeroma ali mešanici različnih oligomerov, to je en trimer plus en monomer. Da bi določili stopnjo oligomerizacije produktov, prisotnih v frakciji N4, je bil izveden 'H DOSY poskus z uporabo mešanice, ki je vsebovala alikvote obeh frakcij N4 in N2. Difuzijski koeficienti vseh signalov so pokazali podobne vrednosti (slika 4), kar kaže na prisotnost dveh dimerov katehina v frakciji N4.
Zahvaljujoč popolnoma ločenim signalom fenola OH, ki zagotavljajo zanesljive kvantitativne rezultate, je mogoče vrsto povezave med katehinskimi enotami neposredno razbrati iz integracije površine vrha. Tako je za obe frakciji, N3 in N6, pomanjkanje enega OHfenola (ki pripada resorcinolu ali kateholnemu obroču) in pomanjkanje enega resorcinolnega aromatskega protona nakazalo interflavansko povezavo (IFL) eterskega tipa, kar pomeni opozicijo v A ali B obroč in položaj C6 ali C8 v A obroču. V primeru vzorca N2 sta manjkala dva aromatska protona, eden iz obroča B in eden iz obroča A, kar nakazuje CA-CB IFL. 1D 'H spekter frakcije N4 je pokazal, da manjkata dva protona obroča B in dva protona obroča A. Vezi med dimernimi enotami frakcije N4 sta torej obe vrsti CC. Spektri frakcije N8 so se precej razlikovali od štirih drugih. Nekateri signali so bili značilni za katehinske enote, v katerih manjkajo trije OH fenoli, en aromatski obroč A in en proton obroča B ter en alifatski OH. Po drugi strani pa so nekateri drugi signali NMR netipični za katehinsko enoto: metilen z zaslepljenimi kemičnimi premiki 13C (~40 ppm) in ketonska skupina (~192 ppm).
Sistemi vrtenja protonov obročev C, A in B so bili določeni z uporabo spektrov H 1D in 1H 2D TOCSY (ni prikazano). V spektrih frakcij N2, N3, N6 in N8 so opazili dva vrtilna sistema ABMX C-ring (tipično za katehin), za frakcijo N4 pa štiri. V spektrih frakcij N2, N3, N6 in N8 sta bila dva meta-sklopljena dubleta (J~2Hz) in en sam v območju aromatskega obroča A dodeljena protonom obroča A nepovezane katehinske enote in na preostali proton obroča A C6-ali C8-povezane katehinske enote. V spektrih N4 so bili zaradi prisotnosti dveh dimerjev odkriti štirje meta-sklopljeni dubleti in dva singleta, ki so bili dodeljeni, kot je opisano zgoraj. Obročne protonske sisteme B je bilo prav tako enostavno določiti iz teh spektrov in nam je omogočilo identifikacijo dveh protonskih spinskih sistemov ABM za dimera frakcij N3 in N6, medtem ko sta bila za dimer N2 zaznana en protonski spin sistem ABM in en AB ter en ABM in en AM proton spin sistemi za dimer N4. Dimer N8 je pokazal samo en vrtilni sistem ABM B-obroča, značilen za katehinski monomer.
2.3.1. Določitev položaja obroča A IFL dimerjev frakcij N2, N3, N4 in N6
Vzpostavitev mostu, ki se nahaja na obroču dimerjev A (tj. položaj C6A ali C8A), zahteva pripis preostalega protona HA katehinske enote, povezane s CA. Zahvaljujoč visoko ločljivim fenolnim OH signalom je bilo enostavno izhodišče identifikacija dveh OHfenolnih protonov z obročem povezanih enot A, tj. obroča A, ki
had one isolated lHspin. This may be achieved using lH-13C long-range correlations, as illustrated in Figure5. The OH5A has readily been identified thanks to a correlation with the C4aC. This quaternary carbon is indeed characterized by both its chemical shift at~100 ppm and a long-range correlation observed with the H4Cprotons. OH5A also correlated with two other carbons∶ the most deshielded （δ>145 ppm） was obviously C5A, while the other (6>125 ppm) was C6A, which also showed a correlation with the other OHA phenol proton,i.e., OH7A. This latter correlated with two other carbons: a deshielded quaternary carbon（δ>145ppm） and a more shielded carbon（δ>125 ppm）, kar je bilo enostavno pripisati C7A oziroma C8A. Ko sta C6A in C8A dodeljena, se lahko preostali proton HA neposredno pripiše spektrom HSQC. Tako je bilo ugotovljeno, da je bil ta preostali proton HA H6A za vse frakcije N2, N3, N4, N6. IFL med katehinskimi enotami je tako impliciral položaj C8A za vse dimerje.
2.3.2. Določitev položaja obroča B IFL
Dimeri frakcij N2 in N4. Spektri frakcije N2 so pokazali dve različni vrsti protonskih vrtilnih sistemov obroča B: enega AMX, ki ustreza obroču B nepovezane enote, in enega AM s sklopitveno konstanto približno 8 Hz, značilno za H6'B in H5' B enote, povezane s C2'B. Povezava med enotami dimera N2 je torej C2'B-C8A. NMR spektri frakcije N4 so pokazali tudi različne B spin sisteme: dva AMX, ki ustrezata nepovezanemu B-obroču, in dva AXspin sistema, oba prikazujeta sklopitvene konstante približno 2 Hz, ki sta značilni za H2'B in H6' B protoni C5'B-povezanih enot. Prisotnost korelacije dolgega dosega 'H/13C med pasom H6' in C8A, ki so bile opažene v spektrih HMBC obeh dimerjev, je v skladu s povezavo C5/'B-C8A (slika 5).
Dimeri frakcij N3 in N6. Spektri frakcij N3 in N6 so pokazali prisotnost dveh protonskih sistemov AMX B-obroča in pomanjkanje enega OH fenolnega signala. Ker so bili identificirani vsi fenolni protoni OHA dimernih enot (kot je opisano zgoraj), je lahko manjkajoči fenolni signal OH signal OH3'B ali signal OH4'B.
Položaj OH (3'B ali 4'B) je mogoče zlahka določiti s korelacijami ROE s H2'Bor H5'B oziroma z uporabo korelacije HMBC dolgega dosega, kot je prikazano na sliki 5.
Pripis preostalega OH obročev B je bil zlahka izveden z uporabo HMBC ali ROESY korelacije dolgega dosega, kot je prikazano na sliki 5. V primeru dimera N3 je bila korelacija ROE opažena med H5'B in preostalim OH 'B katehinske enote, povezane preko njenega obroča B. Ta OH je bil tako identificiran kot OH4'B. V primeru frakcije N6 je bil preostali OH'B dodeljen OH3'B, saj je bila med tem OH in H2'B opažena korelacija ROE. Dolgoročne korelacije HMBC so v skladu s temi pripisi. Položaja povezav teh dveh dimerjev smo nato določili na naslednji način: CO3'B-C8A in CO4'B-C8A za N3 in N6. oz.
Frakcija N8. Spektralna analiza dimera N8 je pokazala, da je ena enota tega dimera katehin z dvema veznima položajema, enim na obroču A, enim na položaju C8A in drugim na položaju C-O7A, saj sta protona H8A in OH7A manjka. Druga enota tega dimera je pokazala posebne spektralne značilnosti, kar kaže na izgubo aromatičnosti obroča B in prisotnost več položajev povezav na obročih B in C.
'H NMR signala, ki izhajata iz obroča B, sta bila dva dubleta pri 2,49 in 2,71 ppm, ki kažeta geminalno sklopitev ~15 Hz (12,03 ppm), značilno za metilensko skupino, in singlet pri 6,38 ppm, ki izhaja iz etilenskega protona. Ker ti protoni metilena in etilena niso bili sklopljeni, so verjetno na položajih 2'B in 5'B. Spekter HIMBC je pokazal vse korelacije, kar je omogočilo natančno pripisovanje teh ogljikovih obročev B, kot je prikazano na sliki 5. H2C te enote je dal tri korelacije z ogljikovimi obroči B: ena je metilenski ogljik pri ~45 ppm, ki je bil tako pripisan C2'B in preostala dva z ogljikoma, ki resonirata pri ~90 ppm in ~162 ppm, kar je mogoče pripisati C1'B in C6'B. H5'B je dal samo močne korelacije 3J z dvema kvartarnima ogljikoma tega B obroča : eden je ogljik, ki je bil prej dodeljen C3'B (~95 ppm), drugi, ki je odmeval pri ~90 ppm, pa bi ga tako lahko pripisali C1'B. Nato je bilo ugotovljeno, da je ogljik pri ~162 ppm C6'B.
Prisotnost alifatskega OH (~5,8 ppm) na položaju C3'B (~95 ppm) je bila določena s korelacijo ROE z obema protonoma H2'B. Poleg tega je OH3/B dal korelacijo HMBC s kvartarnim ogljikom pri ~192,5 ppm, kar je značilno za ketonsko skupino na položaju C4'B.
Zaščita tega C1'B približno 40 ppm je v skladu z izgubo aromatičnosti obroča B. Poleg tega je pomanjkanje OH na položaju C7A druge enote v skladu z etrsko povezavo C1'BO-C7A.
Podatki NMR so pokazali, da obroč C te enote nima OH3C. Prisotnost povezave C3C-O-C3'B je v skladu z zaščito C3C približno 1,5 ppm kot tudi kemičnim premikom C3'B, ki je značilen za hemiketalni ogljik (95 ppm).
Skupaj nam NMR spektralni podatki omogočajo sklep, da ta dimer ustreza dehidrokatehinu A, ki so ga prej opisali Winges et al.[33] in nato Guyot et al.[20].
Strukture šestih dimernih spojin, določene s temi analizami NMR, so prikazane na sliki 6, kjer so N2, N3, N6 in N8 čisti produkti, N4 pa je zmes dveh izomerov.
3. Materiali in metode
3.1.Kemikalije
(plus)-katehin hidrat Večji ali enak 98 odstotkom; lakaza iz Trametes Versicolor (0.94 U·mg-1); natrijev fosfat dvobazični dihidrat Večji ali enak 98 odstotkom; citronska kislina (ACS reagent, kadmijev nitrat tetrahidrat 99,997 odstotka; mravljinčna kislina in Amberlite XAD7HP sta bila pridobljena pri Sigma-Aldrich) (Saint-Louis, MO, ZDA). Aceton-dg je bil kupljen pri Euriso-top (Saarbrüicken, Nemčija) in trifluoroocetna kislina (TFA) iz Roth Labo (Karlsruhe, Nemčija). Vodna LC-MS, acetonitril LC-MS (ACN) in metanol LC-MS (MeOH) so bili vsi iz VWR (Radnor, PA, ZDA).
3.2. Priprava raztopine modelnega vina
Modelna raztopina vina je bila raztopina etanol/voda (12/88;o/o) z 0.033 M vinsko kislino, naravnano na pH 3,6 z NaOH 1 M [34].
3.3. Surovi izvlečki PPO grozdja
Ekstrakt PPO je bil pripravljen, kot je predhodno opisalo Singleton et al [35]. Zamrznjeno grozdje smo najprej zmešali v acetatni pufr (1,5 M, pH5; 10 gL-l askorbinske kisline). Zmes smo nato filtrirali in centrifugirali (3000 g; 10 min). Ostanek smo končno sprali z acetonom (80 odstotkov) in posušili na zraku.
3.4 Lakaza iz Botrytis Cinerea
Lakaza iz Botrytis cinerea je bila pridobljena, kot so opisali Quijada-Morin et al. [36]. Proizveden je bil iz seva VA612 (zbran v 2005 v vinogradu v Hautvillersu, Champagne, Francija, iz sorte modri pinot). Na kratko, kulture na trdnem mediju sladnih kvasovk smo pustili en teden pri 24 stopinjah pod modro svetlobo. Spore so nato postrgali in inokulirali v 500 ml erlenmajerico, ki vsebuje 125 ml gojišča kulture (4{{30}} gL-1glukoze, 7 gL{{10}}glicerola, 0,5 g·L-1L-histidina,0,1 g:L-1 CuSO,1,8gL-1 NaNO3,0,5g:L -1 KCl,0,5gL-1 CaCl2·H2O,0,05g:L-1 FeSO4,7H2O, 1,0g L-1KH2PO4 in 0,7 gL-1 MgSO 4-7H2O). Po 3 dneh inkubacije in 2 dneh rasti v istem prejšnjem mediju smo predkulturam dodali galno kislino (2 gL-1). Po 5 dneh smo tekoči medij filtrirali in supernatant podvrgli tangencialni filtraciji v filtrirnem sistemu Quixstand (GE Healthcare UK, Little Chalfont, Anglija), opremljenem z membrano z molekulsko maso 30 kDa. Koncentrat je bil na koncu izpostavljen diafiltraciji proti destilirani vodi in obdržane so bile samo frakcije, ki so pokazale oksidativno aktivnost proti ABTS (-80 stopinja).
3.5. Postopek oksidacije
Raztopino lakaze (1 gL-1) v fosfatno-citratnem pufru smo predhodno pripravili in dodali k 6g.L-1( plus ) raztopini katehina (modelno vino), da dobimo končno koncentracijo lakaze { {6}}.3 gL-1. Dobljeno raztopino smo nato počasi mešali (180 vrt/min) pri sobni temperaturi 2 uri. Koncentracije so bile predhodno optimizirane in eksperimentiranje je bilo izvedeno v treh izvodih.
3.6. Zaustavitev reakcije na smoli Amberlite XAD7HP
Jantarno svetlo kolono smo kondicionirali z etanolom (absolutnim) in splaknili z dvema volumnoma kolone mili-O vode. Prejšnji reakcijski medij lakaza/(plus)-katehin je bil nakapan na kolono in najprej eluiran z dvema volumnoma kolone mili-Qvode [37]. Kolono smo nato eluirali z etanolom, dokler zbrana frakcija ni bila obarvana. Samo etanolne frakcije smo hranili, uparili in liofilizirali. Prašek je bil do uporabe shranjen pri -80 stopinjah.
3.7. Postopek čiščenja dimerne frakcije z uporabo bliskovne kromatografije
Liofiliziran prašek smo najprej očistili s sistemom za bliskovno kromatografijo puriflash430, opremljenim z UV detektorjem, nastavljenim na 280 nm, in kolono Puriflash diol 50 um f0025. Binarna mobilna faza je bila sestavljena iz acetonitrila (topilo A) in metanola (topilo B), oba nakisana z 0,1 % TFA. Serija injekcij je bila izvedena pri konstantni hitrosti pretoka 20 ml·min-1 z uporabo naslednjega gradienta: 100 odstotkov A za 4,4 min; 0-10 odstotkov B v 10 minutah; 10 odstotkov B za 5 minut; 10-90 odstotkov B v 5 minutah; 90 odstotkov B za 3 minute; 90-10 odstotkov B v 2 minutah; 10 odstotkov B za 10 minut. Injekcijski volumen je bil 1 ml (300 mg liofiliziranega praška, raztopljenega v 1 ml topila A). Vsakič so bile zbrane tri različne frakcije. Prva je ustrezala rezidualnemu (plus)-katehinu, tretja pa je bila mešanica polifenolov z visoko molekulsko maso. Drugo eluirano frakcijo, ki je vsebovala mešanico produktov dimerne oksidacije, smo uparili in liofilizirali pred drugo stopnjo čiščenja.
3.8. Postopek čiščenja produktov oksidacije iz dimerne frakcije z uporabo polpripravnega kromatografskega sistema
Frakcijo, ki je vsebovala produkte dimerne oksidacije, smo očistili s polpreparativnim srednjetlačnim kromatografskim sistemom Bio-Rad NGC 10, opremljenim s kolono Varian Dynamax C18 Microsorb z reverzno fazo (250 × 21,2 mm; 3 um). Binarna mobilna faza je bila sestavljena iz vode milli-O (topilo A) in 80 odstotkov acetonitrila, 20 odstotkov vode Milli-Q （topilo B）, oboje nakisano z 0,05 odstotka TFA. Serija injekcij (300 µL) liofiliziranega praška (20 mg, raztopljenega v 200 uL topila A in 100 uL ACN) je bila izvedena pod naslednjimi pogoji eluiranja: 100 odstotkov A 4 minute; 0-35 odstotkov B v 46 minutah;35-100 odstotkov B v 2 minutah; 100 odstotkov B za 5 minut. Vsakič je bilo zbranih osem različnih frakcij, ki ustrezajo čistim signalom UPLC pri 280 nm. Vsako frakcijo smo uparili in liofilizirali pred NMR analizo.
3.9. Priprava vzorca za NMR analizo
Približno 1 mg vsakega liofiliziranega praška, stehtanega v Eppendorfovih epruvetah, smo raztopili v 500 μL acetona-dg. Nato smo vzorcem dodali ~10 uL koncentrirane raztopine kadmijevega nitrata v acetonu-d in dobljene raztopine prenesli v 5 mm NMR epruvete za NMR analizo. Za nekatere vzorce je bil izveden dodatni korak: po solubilizaciji liofiliziranih praškov v acetonu-dg v prisotnosti sledov kadmija so bili vzorci uparjeni do suhega in nato ponovno raztopljeni v acetonu-d brez nadaljnjega dodajanja Cd.
3.10 Specifikacije instrumenta
UPLC-MS analiza. Reakcije smo spremljali z uporabo dveh sistemov UPLC-MS. Prvi je bil uporabljen za natančno identifikacijo retencijskih časov izdelkov z uporabo metode dolgega gradienta. tj. Watersova tekočinska kromatografija z reverzno fazo ultra visoke ločljivosti, povezana z masno spektrometrijo (UHPLC-MS). Sistem za tekočinsko kromatografijo je bil Acquity UPLC (Waters, Milford, MA, ZDA), opremljen z detektorjem niza fotodiod. Uporabili smo kolono Acquity UPLC HSS T3 (1,8 um, 2,1 × 150 mm). Temperatura kolone je bila 25 stopinj. Binarna mobilna faza je bila sestavljena iz 0,1 odstotka mravljinčne kisline v vodi (topilo A) in acetonitrila (topilo B). Ločevanje je bilo izvedeno pri konstantnem pretoku 0.25mL·min-1 z uporabo naslednjega gradienta:8-11 odstotek B v 2 minutah; 11 odstotkov B 8 minut; 11-25 % B v 15 min;25-55 % Bin 5 min;55-99 % Bin 1 min;99 % B za 4 min;99-8 % Bin1 min;8 % B za 4 min. Volumen injekcije je bil 5 μL. Masni spektrometer je bil preprost kvadrupol Waters Acquity QDa z elektrosprejno ionizacijo (ESI) (Waters, Milford, MA, ZDA). Kapilarna napetost je bila nastavljena na 0,8 kV. Masni spektri so bili pridobljeni v masnem razponu 200-900 Thin pozitivni ionski način.
Drugi sistem UHPLC-MS, uporabljen za hitro preverjanje med koraki čiščenja, je bil enak kot je opisan prej, z ogrevano kolono Acquity UHPLC HSS T3 （1,8 μm, 2,1 × 100 mm） pri 38 stopinjah. Ločevanje je bilo izvedeno pri konstantnem pretoku 0,55 ml·min-1 z uporabo naslednjega hitrega gradienta: 0.1-40 odstotkov B v 5 minutah; 40-99 odstotkov B v 2 min; 99 odstotkov B za 1 minuto; 99-0.1 odstotek B v 1 minuti. Volumen injekcije je bil 2 μL. Masni spektrometer je bila ionska past Bruker Amazon X z elektrosprejno ionizacijo (ESI) (Bruker Daltonics, Bremen, Nemčija). Kapilarna napetost je bila nastavljena na -5.5 kV. Masni spektri so bili pridobljeni v masnem razponu 50-2000 Thin pozitivni ionski način.
Vse analize UPLC-MS so bile izvedene v treh izvodih.
NMR instrumentacija. Vsi NMR spektri so bili posneti na spektrometru Agilent DD{{0}} MHz (Agilent Technologies, Santa Clara, CA, ZDA), ki deluje pri 500,05 in 125,74 MHz za protonska in ogljikova-13 jedra, z uporabo 5 mm indirektne zaznavne sonde, opremljene z gradientno tuljavo.1D'H in 13C, 2Dhomonuklearni1H TOCSY in ROESY ter heteronuklearni lH/13C HSQC in HMBC Eksperimenti so bili izvedeni z uporabo klasičnih impulznih sekvenc in analizirani z uporabo VNMRJ4.2 in MestReNova 14.2 .1 (Mestrelab Research, Španija) programska oprema. Meritve DOSY so bile pridobljene in obdelane, kot je opisano prej 38]. Parametri pridobivanja zaporedja impulzov DgcsteSL so bili naslednji: čas difuzijske zakasnitve in širina impulza gradienta sta bila nastavljena na 50 ms oziroma 2 ms, jakost gradienta (g) je bila povečana v 16 korakih z enakim razmikom g2 od 0,3 do 32G·cm-I. Po fazni korekciji so bili 2D DOSY spektri zgrajeni iz meritve višine vrha z uporabo programske opreme VNMRJ4.2.
Vsi spektri so bili referenčni na signale topila aceton-dg (signal ostanka H pri 2,05 ppm in signal 13C pri 29,92 ppm).
4. Sklepi
Raziskovali so delovanje treh različnih oksidoreduktaz (polifenol oksidaze, ekstrahirane iz grozdja, lakaze iz Botrytis cinerea in lakaze iz Trametes Versicolor) na (plus)-katehin in dobljeni profili LC-UV-MS so bili zelo podobni, čeprav nekaj manjših razlik. predlagal možne razlike v reaktivnosti teh encimov.
Strukture šestih katehin-lakaznih oksidacijskih produktov (z uporabo lakaze iz Trametes Versicolor) so bile pridobljene na podlagi specifičnih NMR podpisov (štirje čisti produkti, tj. N2, N3, N6 in N8 ter N4, ki ustrezajo mešanici dva izomera). Popolna atribucija fenolnih OH signalov je bila mogoča zahvaljujoč dodatku kadmijevega nitrata s postopkom priprave vzorca, ki je omogočil nedvoumno pripisovanje povezav med katehinskimi enotami za nekatere zanimive spojine. Ta postopek bo zelo poenostavil NMR analizo zmesi polifenolov, bodisi sintetiziranih ali ekstrahiranih iz naravnih proizvodov.
Standardi, pridobljeni v tem delu, se lahko v prihodnosti uporabljajo kot označevalci oksidacije za raziskovanje njihove prisotnosti in razvoja med zorenjem grozdja in staranjem vina. Poleg katehina se lahko kot substrati lakaze za pridobitev dodatnih novih standardov uporabljajo tudi druge polifenolne spojine, vključno s flavonoidi in neflavonoidi.
Okrajšave
NMR: jedrska magnetna resonanca,
Cd: kadmij,
TOCSY: popolna korelacijska spektroskopija,
ROESY: Spektroskopija z jedrskim Overhauserjevim učinkom z vrtljivim okvirjem,
HSQC: heteronuklearni enokvantni korelacijski eksperiment,
HMBC: heteronuklearna večpasovna povezljivost,
DOSY: difuzijsko urejena spektroskopija.
Reference
1. Khan, N.; Mukhtar, H. Polifenoli čaja za krepitev zdravja. Life Sci. 2007, 81, 519–533. [CrossRef]
2. Fayeulle, N.; Vallverdu-Queralt, A.; Meudec, E.; Hue, C.; Boulanger, R.; Cheynier, V.; Sommerer, N. Karakterizacija novih flavan-3-Ol derivatov v fermentiranih kakavovih zrnih. Food Chem. 2018, 259, 207–212. [CrossRef] [PubMed]
3. Rimbach, G.; Melchin, M.; Moehring, J.; Wagner, AE Polifenoli iz kakava in vaskularno zdravje – kritični pregled. Int. J. Mol. Sci. 2009, 10, 4290–4309. [CrossRef]
4. Avram, AM; Morin, P.; Brownmiller, C.; Howard, LR; Sengupta, A.; Wickramasinghe, SR Koncentracije polifenolov iz ekstrakta borovničevih tropin z uporabo nanofiltracije. Hrana Bioprod. Proces. 2017, 106, 91–101. [CrossRef]
5. Antoniolli, A.; Fontana, AR; Piccoli, P.; Bottini, R. Karakterizacija polifenolov in ocena antioksidativne zmogljivosti v grozdnih tropinah Cv. Malbec. Food Chem. 2015, 178, 172–178. [CrossRef]
6. Saucier, C. Kako se vinski polifenoli razvijajo med staranjem vina? Cerevisia 2010, 35, 11–15. [CrossRef]
7. Oliveira, CM; Ferreira, ACS; De Freitas, V.; Silva, AMS Oksidacijski mehanizmi, ki se pojavljajo v vinih. Food Res. Int. 2011, 44, 1115–1126. [CrossRef]
8. Singleton, VL Kisik s fenoli in sorodne reakcije v moštih, vinih in modelnih sistemih: opažanja in praktične posledice. Am. J. Enol. Vitić. 1987, 38, 69–77.
9. Mathew, AG; Parpia, HAB Porjavitev hrane kot reakcija polifenola. Napredek v raziskavah hrane; Chichester, CO, Mrak, EM, Stewart, GF, ur.; Academic Press: Cambridge, MA, ZDA, 1971; Zvezek 19, str. 75–145. [CrossRef]
10. Gambuti, A.; Rinaldi, A.; Ugliano, M.; Moio, L. Razvoj fenolnih spojin in trpkosti med staranjem rdečega vina: Učinek izpostavljenosti kisiku pred in po stekleničenju. J. Agric. Food Chem. 2013, 61, 1618–1627. [CrossRef] [PubMed]
