Razumevanje razvrščanja adenovirusnih kapsidov po vnosu; Priložnost za spremembo lastnosti vektorja cepiva 1. del

Povzetek:

Genetska cepiva na osnovi adenovirusnih vektorjev so se izkazala kot močna strategija proti zdravstveni krizi SARS-CoV-2. Ta uspeh ni nepričakovan, saj adenovirusi združujejo številne zaželene lastnosti genetskega cepiva. So zelo imunogeni in imajo nizek in dobro opredeljen patogeni profil v kombinaciji s tehnološko dostopnostjo. Stalna prizadevanja za izboljšanje vektorjev adenovirusnega cepiva vključujejo uporabo redkih serotipov in nečloveških adenovirusov. V tem pregledu se osredotočamo na virusno kapsido in na to, kako izbira genotipov vpliva na privzem in poznejše podcelično razvrščanje. Opisujemo, kako lahko razumevanje lastnosti kapside, kot je stabilnost med postopkom vstopa, spremeni usodo vstopajočih delcev in kako se to prevede v razlike v rezultatih imunosti. Podrobno razpravljamo o tem, kako mutacija membranskega litičnega kapsidnega proteina VI vpliva na razvrščanje po vnosu virusov vrste C in na kratko razpravljamo o tem, ali bi takšni pristopi lahko imeli širše posledice za razvoj cepiva in/ali vektorja.

Kliknite čisti cistancheizdelek

For more information:1950477648nn@gmail.com

1. Uvod

Virusne okužbe za razliko od bakterijskih okužb, ki jih je mogoče zdraviti z antibiotiki, ostajajo nevarnost za zdravje, saj obstaja zelo malo protivirusnih zdravil. Zato je cepljenje edina široko uporabna strategija za zaščito človeške (in živalske) populacije pred virusnimi okužbami.

Do nedavnega je bilo cepljenje proti virusnim okužbam obravnavano predvsem v okviru preprečevanja otroških bolezni ali kot vsakoletno cepivo proti gripi za preprečevanje okužbe z gripo. Z izbruhom zdravstvene krize SARS-CoV-2 leta 2020 se je cepljenje vrnilo v središče pozornosti javnosti, saj zdaj velja za edini trajnostni izhod iz te pandemije. V tem kontekstu so se cepiva na osnovi adenovirusov (Ad) pojavila kot ena od dveh glavnih uspešnih strategij cepljenja. Po odobritvi v nujnih primerih se cepiva Ad sedaj vbrizgavajo v velik del zemeljskega prebivalstva v prizadevanjih brez primere za vzpostavitev planetarne imunosti proti SARS-CoV-2.

Cepiva proti adenovirusnim vektorjem pred izbruhom COVID-19 niso bila široko uporabljena, vendar njihov uspeh ni nepričakovan. Virusi so na splošno zelo primerne platforme za cepiva. So biološko optimizirani in prilagojeni za transport nukleinskih kislin ter izzovejo imunske odzive. Adenovirusi imajo veliko lastnosti, zaradi katerih so še posebej idealni kandidati za cepivo. Imajo nizek in dobro opredeljen patogeni profil v kombinaciji z visoko infektivnostjo. So tehnološko dostopni in se v veliki meri uporabljajo za vektorizacijo. Njihov visok proizvodni donos in stabilnost omogočata industrijsko proizvodnjo pod pogoji dobre proizvodne prakse (GMP) in zagotavljata praktične lastnosti (tj. skladiščenje) za regionalno distribucijo po nižji ceni [1]. Poleg tega je dostava celic Ad v celice, ki predstavljajo antigen, učinkovita in naravno izzovejo prirojeni imunski odziv, ki deluje kot adjuvans za povečanje uspeha cepljenja [2,3].

Razumevanje biologije oglasov je bilo ključnega pomena pri razvoju vektorjev (cepiva), ki temeljijo na oglasih. Na primer, uporaba nečloveških ali redkih serotipov Ad v nekaterih trenutno trženih cepivih proti SARS-CoV-2 je bila namerno izbrana, da bi preprečili, da bi že obstoječa vektorska imunost zmanjšala učinkovitost cepiva. Uporaba vektorjev z izbrisanim virusnim genom zagotavlja izboljšano varnost vektorjev. Vendar pa še vedno obstaja veliko vidikov življenjskega cikla virusa, ki niso bili upoštevani pri razvoju vektorjev cepiv, ki temeljijo na oglasih, in znanje o redkih ali nečloveških genotipih je omejeno, vključno s tistimi, ki se trenutno uporabljajo kot cepiva proti SARS-CoV-2 . S tem pregledom želimo povečati ozaveščenost o morebitnih spremembah, ki bi jih lahko izkoristili pri razvoju vektorjev oglasov za medicinske namene, vključno s cepljenjem.

Osredotočamo se na virusno kapsido in na to, kako izbira genotipov vpliva na privzem in kasnejše podcelično razvrščanje. Opisujemo, kako lahko razumevanje lastnosti kapside, kot je stabilnost med postopkom vstopa, spremeni usodo vstopajočih delcev in kakšne različne rezultate imunosti opazimo. Kot primer, kako je mogoče spremeniti stabilnost in usodo kapside, podrobno razpravljamo o tem, kako mutacija membranskega litičnega kapsidnega proteina VI vpliva na viruse vrste C. Nazadnje na kratko razpravljamo o tem, ali je mogoče takšne pristope izkoristiti za razvoj cepiva in/ali vektorja.

1.1. Adenovirusi sestavljajo raznoliko družino infekcijskih patogenov

Zgodovinsko gledano je bil Ad prvič izoliran leta 1953 iz adenoidov bolnikov z okužbami dihal [4], kmalu zatem pa je bil izraz "adenovirus" splošno sprejet [5]. Družina Adenoviridae ima več kot 120 članov, razdeljenih v pet rodov – odvisno od tega, ali okužijo sesalce (npr. Mastadenoviridae), ptice (npr. Aviadenoviridae), plazilce (npr. Atadenoviridae), dvoživke (Siadenoviridae) ali ribe (Ichtadenoviridae). ) [6,7]. Rod Mastadenoviridae predstavlja tudi več kot 70 tipov človeških Ads [8,9], ki so razvrščeni v sedem vrst (A–G) glede na njihove morfološke, biološke in fizikalno-kemijske lastnosti, kot je navedeno v tabeli 1 [10, 11].

Poleg tega se lahko Ads tudi spontano rekombinira in tako ustvari nove vrste [12], kot je bil primer za AdE4, ki je edini virus človeške vrste E in je verjetno posledica rekombinacije med človeško vrsto B in opičjim Ad [13]. ]. Čeprav so okužbe pri ljudeh z nečloveškimi oglasi po naravi redke, niso nemogoče [14,15]. Zmožnost različnih nečloveških oglasov, da okužijo (ali transducirajo) človeške celice, jih naredi privlačne vektorske platforme (cepiva). Med njimi so oglasi, pridobljeni iz šimpanzov [16–18], goril [19], ovac [20], krav [21], psov [21,22] ali opic novega sveta [23].

Okužbe z adenovirusi lahko povzročijo različne patologije glede na njihov celični ali tkivni tropizem, vključno z boleznimi dihal, oči, sečil ali prebavil (glejte tabelo 1). Tkivni tropizem je pogosto posledica različne uporabe receptorjev pri različnih Ads in je lahko povezan tudi z intrinzično stabilnostjo delcev [24]. Večina okužb z Ads je blagih ali asimptomatskih pri imunsko kompetentnem gostitelju. Primarne okužbe z Ad se večinoma pojavijo v otroštvu in povzročijo močno zaščitno imunost. Nasprotno pa lahko Ads pri imunosupresiranih posameznikih povzroči nenadzorovane, hude in smrtno nevarne sistemske okužbe, ki vodijo do resne celične toksičnosti, kar lahko povzroči prekomerno vnetje in odpoved več organov, kar povzroči visoko smrtnost [12].

Najbolj raziskani človeški oglasi so virusi vrste C tipa 2 in 5, ki jih najdemo predvsem pri bolnikih z okužbami zgornjih dihalnih poti in prebavil [25] in ki bodo glavni poudarek tega pregleda. Adenovirusi so lahko odgovorni za občasne izbruhe, kot so virusi vrste B, ki povzročajo pljučnico (npr. Ad3, 7 in 14) med imunsko kompetentnimi posamezniki [26] ali Ad40/41 vrste F ter Ad12, 18 in 31 vrste A , ki okužijo gastrointestinalni trakt (kot je opisano v [26,27]). Virusi vrste D so zelo raznolika skupina in so nagnjeni k rekombinaciji in so glavni povzročitelj okužb oči [28].

1.2. Adenovirusne kapside so metastabilne strukture

Kljub svoji raznolikosti vsi oglasi sledijo podobnemu strukturnemu in organizacijskemu okviru. Adenovirusi so virusi DNA brez ovojnice, ki vsebujejo relativno velik, 26–45 kb linearni dvoverižni genom DNA [29–31]. Kapsida ima premer ~70–90 nm in ima obliko ikozaedra z 20 fasetami in 12 oglišči [32]. Kapsida je sestavljena iz treh glavnih strukturnih proteinov (hekson, penton in vlakno) in različnih manjših cementnih proteinov (tj. IIIa, VI, VIII in IX pri virusih vrste C), ki stabilizirajo strukturo. Visoko ločljiva struktura več Ad kapsid je bila pridobljena s krioelektronsko mikroskopijo in rentgensko kristalografijo [24, 33–36]. Ikozaedrična kapsida ima psevdo-T25 strukturo s 720 eksoni, sestavljenimi v različnih trimerjih, odvisno od njihove lokacije v kapsidi. 20 faset kapside je sestavljenih iz devetih sestavljenih eksonov (tako imenovanih GON za skupino devetih), medtem ko so na 12 ogliščih eksoni sestavljeni v GOS (za skupino šestih) (za več podrobnosti glejte [37,38] ). Pentamerna baza pentona je vstavljena v 12 oglišč in služi kot osnova za štrleče trimerno vlakno [39,40]. Interakcija med glavnimi in manjšimi kapsidnimi proteini stabilizira kapsido, predvsem z interakcijo s heksagoni.

Na primer, GON stabilizira IX [41]; IX in IIIa sta sama stabilizirana z interakcijo z VIII, ki ju povezuje z GOS oziroma GON [37]. Molekule VIII orisujejo GON in pomagajo stabilizirati šesterokotnike na notranji strani kapside. Protein VI prav tako stabilizira hekson z vezavo osrednje votline trimera heksona, ki je izpostavljena notranjemu virusnemu lumnu [42–44].

Kapsida obdaja in ščiti virusno jedro, sestavljeno iz virusnega genoma, proteinov virusnega jedra (tj. V, VII, Mu pri virusih vrste C) in končnega proteina (TP), ki je kovalentno vezan na vsak 5' konec genom Ad. Manjši kapsidni proteini medsebojno delujejo z jedrnimi proteini, ki vzpostavljajo povezavo med kapsido in genomom; vendar je njihova prostorska organizacija med jedrnimi proteini še vedno slabo razumljena. Pokazalo se je, da V ohranja DNK znotraj kapside z interakcijo z VI (stran kapside) in VII (stran genoma) [45–47] in verjetno prispeva k sproščanju genoma v jedrni pori [48]. VII je glavni kapsidni protein, povezan z virusno DNK in spodbuja njeno kondenzacijo znotraj kapside [49–51]. VII tudi ščiti virusni genom pred imunskim odkrivanjem prek celičnih dejavnikov [50, 52–54]. Zanimivo je, da sta kapsidna proteina IX in proteina V prisotna samo v Mastadenoviridae [55,56], virusne kapside pa je mogoče proizvesti brez IX [57] ali proteina VII [58], kar kaže nekaj prožnosti v strukturi kapside.

Genom človeških oglasov kodira približno 45 proteinov (vključno s strukturnimi proteini), organiziranih v časovno regulirane transkripcijske enote [59]. Transkripcijski faktor E1A je prvi izraženi protein in je potreben za sprožitev ekspresije virusnega gena [60]. Genom vsebuje tudi 5' inkapsidacijsko sekvenco in obrnjene končne ponovitve (ITR) na vsakem koncu, ki so potrebne za replikacijo [59,61–64]. Adenovirusi kodirajo adenovirusno proteazo (AVP), ki je zapakirana v delec in obdeluje več proteinov (tj. IIIa, VI, VII, VIII, µ, TP in 52,55K pri virusih vrste C) [65–67]. Ta korak je potreben za tvorbo zrelih infektivnih delcev in inducira tvorbo metastabilnih (tj. manj stabilnih) kapsid, pripravljenih za razstavljanje kapside po pritrditvi in ​​vstopu v celico [68,69]

Obstajajo tudi vrstno specifične razlike v strukturi človeških Ads, npr. v dolžini vlaken in prožnosti, kar neposredno vpliva na vezavo na receptorje [70–72]. Razlike lahko opazimo tudi pri sestavi pentona. Pentoni virusov vrste B lahko tvorijo medpentonske stike, kar povzroči alternativne in manj stabilne virusu podobne delce, ki so brez genomov in občasno brez vlaken. Takšne delce imenujemo dodekaedri in jih proučujemo za celični prenos plazmidov ali peptidov kot alternativo vektorjem Ad. Dodekaedri bolje izpostavijo RGD kratki peptidni motiv, prisoten v pentonu večine vrst Ad, ki je potreben za vezavo ciljnih celic [73,74]. Razlike v stabilnosti kapside, kot je razloženo spodaj, so lahko pomembna lastnost, ki določa vstopno usodo delcev Ad.

1.3. Adenovirusi sledijo litičnemu življenjskemu ciklu

Cikel okužbe z oglasi je bil obsežno pregledan drugje [75–77]. Tukaj se na kratko osredotočimo na vstopni del življenjskega cikla in, če ni navedeno drugače, se bomo sklicevali na viruse vrste C, ki so najbolje raziskani (slika 1). Adenovirusi uporabljajo kapsidno vlakno kot primarno celično pritrdilno molekulo. Večina Ads, vključno z virusi vrste C, uporablja coxsackievirus in Ad receptor (CAR) za vezavo ciljnih celic [78–81]. V nasprotju s tem se nekateri virusi vrste B prednostno vežejo na receptor CD46 [82] ali desmoglein 2 [83], nekateri virusi vrste D pa medsebojno delujejo s sialnimi kislinami [84,85] ali neposredno z integrini v (glejte tabelo 1) [ 86].

Tako je preklapljanje vlaken med vrstami privlačna strategija za spreminjanje tropizma [87–89]. Primarna vloga vlaknene molekule je posredovanje fizične povezave s ciljnimi celicami, čemur sledi druga interakcija med pentonom in integrini, kot je v 5 [90]. To interakcijo posreduje peptidni motiv RGD v zaporedju pentona [91]. Odsotnost tega motiva, tako kot pri virusih vrste F, je povezana z manj učinkovitim vstopom v celico [92]. Vezava integrina povzroči združevanje integrina v skupine na celični površini [93], ki sproži signalno kaskado, kar vodi do reorganizacije aktinskega citoskeleta [94,95] in endocitnega privzema prek endocitoze ali mikropinocitoze, ki jo posreduje klatrin [96,97]. Vezava RGD lahko tudi destabilizira kapsido [98] z zmanjšanjem stikov med pentonom in heksonom, kar pomaga kapsidi odstraniti plašč [99]. Posledično delci Ad izgubijo svoja vlakna in znotraj endosoma lahko najdemo disociirana hekson in penton [100–102]. Endosom je dinamičen organel, pripravljen za zorenje v degradativne lizosome, oglasi pa morajo hitro pobegniti v citosol. Zakisanje endosoma lahko pospeši proces uhajanja z dodatno oslabitvijo kapside [100,103]. Proces penetracije endosoma temelji na sproščanju notranjega kapsidnega proteina VI [103,104].

Za sproščeni VI je značilna N-terminalna amfipatska vijačnica, ki se veže na notranji listič endosoma in inducira pozitivno ukrivljenost membrane, kar ima za posledico lokalno omejeno rupturo membrane [75,103,105,106]. Celice se odzovejo na z virusom povzročeno rupturo membrane in aktivirajo lokaliziran odziv avtofagije, da očistijo poškodovano organelo [107–109]. Da bi se izognili razgradnji, Ads prekinejo avtofagijo prek kratkega peptidnega motiva PPxY v proteinu VI, dokler delec ne doseže varnosti citosola [104,108]. Pokazalo se je, da virusi vrste C uhajajo iz zgodnjih endosomov [110]. Druge vrste, vključno z A, B in D, najprej pridejo do lizosoma, preden pobegnejo v citosol [111–113], kar lahko vpliva na imunsko aktivacijo, ki jo sprožijo ti virusi [114].

Ko oglasi dosežejo citosol, sodelujejo z motorji dyneina in uporabljajo retrogradni transport vzdolž mikrotubulov, da dosežejo središče za organiziranje mikrotubulov [115–117]. Motorično vezavo verjetno posreduje hekson [115] in lahko zahteva kislo pripravo [118]. V bližini jedra kapside zamenjajo smer transporta, verjetno tako, da se vežejo na motorične proteine ​​kinezina in se kopičijo v jedrni ovojnici [115,117,119,120]. Pristanejo na kompleksu jedrnih por, nato se kapside popolnoma razstavijo, genomi pa se sprostijo in uvozijo v jedro [51,121–124]. Ko je enkrat v jedru, se cikel nadaljuje s transkripcijsko aktivacijo genoma in izražanjem takojšnjega zgodnjega gena E1A, ki služi kot transkripcijski faktor za vse druge zgodnje transkripcijske enote [60,125–130]. Po izražanju replikacijskih encimov se virusni genomi replicirajo in kopičijo na obrobju replikacijskih centrov [131].

Nato se strukturni proteini izrazijo iz pozne ekspresijske enote pod nadzorom glavnega poznega promotorja [132,133]. Izražanje poznih genov doseže vrhunec v proizvodnji in jedrskem kopičenju vseh strukturnih proteinov, kjer se sestavijo v potomstvo in pakirajo na novo sintetizirane genome. Jedrsko sestavljanje naslednje generacije oglasov nato povzroči izstop delcev in lizo celic [42,134–136]. Kot je bilo omenjeno zgoraj, sestavi kapsid sledi zorenje, tj. proteolitično cepitev več kapsidnih proteinov s strani AVP, da nastanejo infektivni delci [66]. Pomen tega procesa je ponazorjen s temperaturno občutljivim mutantom, Ts1, ki je bil prvotno identificiran na zaslonu mutageneze v Ad2. Pri nedopustni temperaturi ta mutant ne zapakira AVP in sestavljeni delci ne dozorijo, kar ima za posledico hiperstabilne delce [137]. Odgovorna mutacija AVP je bila genetsko vnesena v Ad5 in ohranila ta fenotip. Kapside Ts1 se še vedno lahko pritrdijo na celične receptorje in se endocitozirajo, vendar ostanejo ujete v endosomu, ker ne morejo sprostiti proteina VI [103,138,139].

2. Imunsko odkrivanje adenovirusa

Adenovirusi so zelo razširjeni in s tem virusom se je soočila velika večina prebivalstva, predvsem v otroštvu. Adenovirusi so zelo imunogeni in vsako srečanje izzove razvoj specifične imunosti proti Ad, tako prirojene kot adaptivne, ki lahko traja vse življenje. To je pomembno v boju proti virusu in naredi Ads manj škodljive za imunsko kompetentnega gostitelja, vendar je lahko ovira pri uporabi Ads kot vektorja v vakcinologiji ali genski terapiji [140,141]. Razumevanje, kako Ad (in njegovi vektorski derivati) aktivira imunski sistem, nam bo omogočilo izboljšati učinkovitost in varnost cepiv. Opazovanja in vivo pri pacientih, ki so sodelovali v kliničnih preskušanjih, so jasno pokazala, da lahko vektorji na osnovi Ad inducirajo močno imunsko aktivacijo [142,143], včasih s smrtnimi posledicami [144].

Poleg tega različne študije, izvedene in vitro ali na živalskih modelih [145] kažejo na ključno vlogo samega virusnega delca (tj. kapside in vgrajene DNK) pri aktiviranju začetnega imunskega odziva. Tukaj se na kratko osredotočimo na imunske odzive, povezane z vstopno kapsido; za bolj poglobljen pregled glejte prej objavljene ocene [146–149].

2.1. Adenovirusi sprožijo celično intrinzično imunost

Z razvojem Ads kot vektorjev je postalo očitno, da je celično intrinzična ali prirojena imunost, ki jo povzroči Ads, odziv na invazijo viriona. Zanimivo je, da tako replikativni kot nereplikacijski virusi (tj. UV-inaktivirani virusi, nereplikacijski vektorji ali prazne kapside) aktivirajo imunske odzive v okuženih celicah, kar kaže, da ima kapsida pri tem odzivu ključno vlogo [145,150–156]. .

Na splošno celice zaznavajo oglase v več korakih v celotnem življenjskem ciklu virusa in aktivirajo poti prirojene imunosti (slika 1). Ta aktivacija se začne z vezavo vlaken Ad na receptor CAR na celični površini, ki aktivira signalizacijo protein kinaze, aktivirane z mitogenom (MAPK), ki vodi do aktivacije transkripcijskega faktorja NF-κB. Ta sprožilec povzroči nastajanje vnetnih citokinov (IL-6, IL-8) [157,158]. Vendar pa lahko uporaba drugih receptorjev, odvisno od vrste Ad, modulira moč signalne kaskade, ki sodeluje pri izražanju citokinov [159]. Interakcija med virusnim pentonom in celičnim integrinom je nadaljnji sprožilec imunske aktivacije. Študija na mišjih makrofagih je pokazala, da ta vezava aktivira izražanje IL-1 preko RGD motiva [160]. To je lahko omejeno na imunske celice, ker v drugih celičnih modelih (npr. HeLa, linija epitelijskih celic) vloga interakcije integrin/RGD pri proizvodnji kemokinov in protivnetnih citokinov ni bila potrjena [151,161,162]. To kaže na pomembnejšo vlogo samega procesa internalizacije pri imunski aktivaciji kot interakcija z integrini. Dejansko vezava pentona na integrin aktivira tudi signalizacijo fosfoinozitid 3-kinaze (PI3K), da se poveča internalizacija virusa [163].

Poleg tega je bilo dokazano, da aktivacija PI3K po okužbi z Ad sproži proizvodnjo pro-vnetnih citokinov, kot je TNF [164], in postopek internalizacije je bil opisan kot potreben za imunsko aktivacijo [165]. Te študije kažejo, da se imunska aktivacija večinoma pojavi v koraku po ponotranjenju, kar poudarja pomen razvrščanja po vstopu (pregledano v [166]).

Ko so v endosomu, so Ads izpostavljeni intraluminalnim receptorjem za prepoznavanje patogenov (PRR), kot je TLR9, ki je senzor dvoverižne DNA, omejen na imunske celice. Mišji makrofagi lahko zaznajo vektorje Ad prek TLR9, da inducirajo tvorbo protivnetnih citokinov [167]. TLR9 je bil prav tako strogo potreben za IFN / proizvodnjo, ko so bile mišje plazmocitoidne dendritične celice (pDC) izzvane z Ad [168]. Vendar se je v modelih miši z izločitvijo TLR9 še vedno proizvajal IFN /, kar kaže na to, da v celicah, ki niso pDC, proizvodnja IFN poteka neodvisno od signalizacije TLR9 [168,169].

Virusni genomi (ali vektorski genomi) postanejo dostopni za zaznavanje med ali po endosomskem pobegu virusa. Ko dosežejo citosol, jih zazna senzor citosolne dvoverižne DNA cGAS [168,170]. Po prepoznavanju virusnega genoma cGAS spodbuja fosforilacijo in jedrsko translokacijo transkripcijskega faktorja IRF3, da poganja IFN / ekspresijo, inducira protivirusno stanje. Endosomski prehod zahteva z virusom povzročeno poškodbo endosomske membrane, da se olajša endosomsko uhajanje virusnih delcev. Raztrganje membrane tako znatno prispeva k imunski aktivaciji, kar je poudarjeno z dejstvom, da Ts1 mutant s pobegom ne uspe aktivirati popolnega in učinkovitega imunskega odziva [161,162,170,171]. Ključno vlogo pri vnetnem odzivu po prodiranju membrane Ad igra kinaza, ki veže rezervoar, TBK1, domnevno del spodnjega citosolnega zaznavanja virusnega genoma preko poti cGAS/STING [168,170].

Poškodba adenovirusne membrane povzroči tudi sproščanje katepsina B iz endolizosomskega predela, kar povzroči oksidativni stres, ki aktivira vnetje NLRP3, kar povzroči zorenje IL-1 [114]. Virusi vrste C pobegnejo iz zgodnjih endosomov, medtem ko virusi vrste B potujejo do poznih endosomov, verjetno zaradi razlik v uporabi receptorjev. Zakisanje v poznem endosomu/lizosomu bo bolj verjetno aktiviralo lizosomske kislinske hidrolaze. Obe vrsti inducirata aktivacijo inflamasoma [172], vendar se verjetno zaradi časa zadrževanja v endosomu obseg njunih odzivov razlikuje. Globalno gledano virusi vrste B inducirajo močnejšo prirojeno in prilagodljivo imunsko aktivacijo kot virusi vrste C [113,173,174]. To lahko pojasni, zakaj so virusi vrste B bolj patogeni in povzročajo izbruhe pri imunsko kompetentnih gostiteljih [26]. Nadalje nakazuje, da lahko celice razlikujejo prostor za penetracijo (tj. endosom proti lizosomu [109]) in prilagodijo učinkovitost imunosti. Poškodba endosomske membrane med postopkom Ad escape je lahko tudi sama po sebi znak nevarnosti. Kot je podrobno razloženo spodaj, povzroči poškodba membrane citosolno izpostavljenost intraluminalnim glikanom, ki jih celica zazna kot signale nevarnosti (kot je opisano v [109]). Odkrivanje izpostavljenih glikanov z galektini nato aktivira avtofagijo, kar sproži drugo vejo protivirusne imunosti [108].

2.2. Adenovirusi ob vstopu v celico izzovejo prilagodljivi imunski odziv in izničijo protivirusno avtofagijo

Prirojeni imunski odzivi, ki jih izzovejo Ads ali njihovi vektorji, se nato prevedejo v adaptivno imunost prek izločanja kemokinov, ki pritegnejo imunske celice (nevtrofilce, naravne celice ubijalke in makrofage) in okrepijo močno predstavitev antigena [153,154]. Adenovirusi so zelo imunogeni in njihovi glavni imunogeni so glavni kapsidni proteini (hekson, penton in vlakna), ki sprožijo vrstno specifično proizvodnjo nevtralizirajočih protiteles v celicah B [175–177].

Nevtralizirajoča protitelesa so večinoma usmerjena proti hiper-variabilnim zankam proteina hexon [178–180] in predstavljajo veliko omejitev za uporabo Ads kot vektorjev, izpeljanih iz istega serotipa. Temu problemu so se izognili z uporabo manj seroprevalentnih ali nečloveških oglasov [181–185]. Kljub tej protivektorski imunosti, ko se oglasi uporabljajo kot platforme za cepiva (npr. za izzivanje imunske zaščite proti eboli v kliničnih preskušanjih), še vedno povzročijo močan odziv celic B, kar omogoča proizvodnjo protiteles proti želenemu imunogenu cepiva, ki lahko traja do 6 mesecev [186]. Poleg tega bi lahko že obstoječo vektorsko imunost premagali z višjimi odmerki vektorja cepiva, kot v primeru vektorja cepiva SARS-CoV-2, ki temelji na visoki seroprevalenci AdC5 [187].

Tako kot pri nevtralizirajočih protitelesih tudi okužbe z Ad sprožijo obstojno T-celično imunost, predvsem z aktivacijo CD4 plus. To zaščito lahko še vedno najdemo pri odraslih, kar kaže na dolgotrajno imunost od otroštva [188–190]. Poleg tega je opisano tudi aktiviranje CD8 plus za vzdrževanje citotoksičnega odziva [191–193]. Ta aktivacija celic T ni nujno specifična za serotip in omogoča navzkrižno zaščito pred različnimi podskupinami in serotipi Ad [192–194].

Poleg tega so pri bolnikih s presajenimi matičnimi celicami, okuženimi z Ad, opisali močno aktivacijo CD4 plus in CD8 plus [195]. Ta aktivacija je usmerjena proti heksonskim peptidom in vodi do očistka Ad viremije, kar poudarja glavno vlogo aktivacije T-celic CD4 plus in CD8 plus pri imunski zaščiti. Medtem ko je ta imunost, ki temelji na celicah T, usmerjena proti delcu Ad, Ads sproži tudi močno celično imunost, ki temelji na odzivu celic T proti antigenu cepiva, kar je prednost za dolgotrajno imunost pri uporabi rekombinantnih vektorjev Ad kot platform za cepivo [196,197]. ]. Pomembno je, da so podatki iz kliničnih preskušanj potrdili, da ko se Ad uporablja kot platforma za cepivo (z želenim antigenom kot transgenom), inducira citotoksično aktivacijo celic CD8 plus T in CD4 plus T-celic, kar vodi do imunosti spomina proti izražen transgen [184,186,198–202].

Aktivacija T-celic temelji na predstavitvi virusnih peptidov skozi glavni histokompatibilni kompleks (MHC). Na kratko, predstavitev antigena z MHC razreda I je posledica proteasomske razgradnje in dobljeni peptidi bodo inducirali aktivacijo CD8 plus T-celic, kar bo omogočilo pripravo in proliferacijo citotoksičnega T-celičnega odziva. Predstavitev antigena MHC razreda II je posledica lizosomske proteolize in nastali peptidi bodo po predstavitvi inducirali aktivacijo CD4 in celic T, kar bo sprožilo kasnejšo aktivacijo celic B [203]. Zdaj je dobro opredeljeno, da avtofagija spodbuja predstavitev peptidov molekulam MHC razreda II [204]. Ni presenetljivo, da je avtofagija eden najstarejših obrambnih mehanizmov pred okužbo in pomemben del celičnega repertoarja pred napadajočimi patogeni, ki sodeluje pri prirojenih in adaptivnih imunskih odzivih. Lahko neposredno zaseže patogen za razgradnjo (ksenofagija) in sodeluje pri njegovi predstavitvi imunskemu sistemu [205–207]. Makroavtofagija (pogosteje imenovana avtofagija) je ohranjena lizosomska razgradna pot, ki sodeluje v številnih temeljnih fizioloških procesih, kot so homeostaza ter prirojena in adaptivna imunost [208–210]. Za avtofagijo je značilna tvorba vezikla z dvojno membrano, imenovanega "avtofagosom", ki zajame citoplazemske obremenitve (tj. organele, agregate in patogene), namenjene razgradnji (slika 2). Med tem procesom se avtofagosomi, ki vsebujejo tovor, spojijo z lizosomi, da se razgradijo in reciklirajo.

Predstavitev antigena prek avtofagije je bila opisana tako za MHC razreda I kot razreda II [204]. Po indukciji avtofagije se znotrajcelični antigeni zajamejo v avtofagosome, ki se zlijejo z oddelki, ki vsebujejo MHC razreda II, da jim zagotovijo zunanji patogeni material (slika 2) [211]. Vloga avtofagije pri tej posebni predstavitvi antigena MHC razreda II je bila prvič opisana za okužbo z virusom Epstein-Barr, kjer je inhibicija avtofagije povzročila zmanjšano aktivacijo CD4 in T-celic [212,213]. Do danes primeri vključujejo več virusov, vključno z virusom herpes simplex [214], virusom gripe [215] in virusom humane imunske pomanjkljivosti tipa 1 (HIV-1) [216], in se verjetno razširi na oglase (glejte spodaj). Predstavitev MHC razreda II je skladna s procesom avtofagije, saj je citosolni obrambni mehanizem. Avtofagija je prav tako vključena v navzkrižno predstavitev zunajceličnih antigenov MHC razreda II [214]. Dejansko je MHC predstavitev zunajceličnega ovalbumina učinkovitejša, ko deluje mehanizem za avtofagijo (in zlasti ATG5), in pokazalo se je, da privzem zunajceličnega materiala vključuje nekanonično obliko avtofagije, imenovano fagocitoza, povezana z LC3-( LAP) [217].

Ko so prisotni v LAP-some, se lahko nekateri zunajcelični antigeni izpostavijo s predstavitvijo MHC razreda II [218]. Avtofagija je do neke mere vključena tudi v predstavitev MHC razreda I, čeprav je velika večina epitopov predstavljena preko mehanizma, ki je strogo odvisen od transporterja, povezanega s kompleksom za obdelavo antigena (TAP) [219]. Predstavitev, neodvisna od TAP, ki jo posreduje avtofagija, je bila doslej prikazana samo v pogojih izčrpanosti TAP [219,220]. Če ta način predstavitve res obstaja, ostaja sporno [221] in o njem razpravljajo drugje [204,222,223].

Da bi preprečili predstavitve MHC, Ads namenijo velik del svojega genoma, in sicer regijo E3, da bi spodkopali predstavitveni sistem MHC v celicah [224–228]. V večini vektorjev (v cepivu) ti geni niso prisotni in nedavna dela kažejo, da bi povečana predstavitev antigena z MHC lahko izboljšala učinkovitost cepiva Ad [229,230]. Avtofagija igra ključno vlogo pri obdelavi antigenov Ad za predstavitev MHC razreda II pri imunosti, ki jo povzroči Ad [108,229].

Montespan et al. je pokazalo, da Ads inducirajo avtofagijo po penetraciji endosoma in da so vstopajoči delci, očiščeni z avtofagijo v tem procesu, učinkovito predstavljeni imunskemu sistemu [108]. Ta ugotovitev je skladna s študijo, ki so jo objavili Klein et al. ki kaže, da v kontekstu onkolitičnih oglasov virusni antigeni dozorijo z JNK-odvisno obliko avtofagije [229]. Vendar ima avtofagija v kontekstu raka dvojno vlogo. Kot vzdrževalec homeostaze avtofagija omejuje nastanek tumorja [231], medtem ko pri napredovalem raku avtofagija deluje kot proces preživetja, ki spodbuja rast tumorja [232,233]. Zato je treba v kontekstu onkolitičnih vektorjev skrbno ovrednotiti tumorsko specifične značilnosti avtofagije.

3. Adenovirusi kot vektorji (cepiva).

Vektorizacija virusa vključuje izkoriščanje njegovih naravnih lastnosti ob hkratnem zmanjšanju s tem povezanega biološkega tveganja. V tem smislu so Ads odlični vektorski kandidati za razvoj cepiva [234]. Adenovirusni vektorji so stabilni, jih je enostavno proizvesti do visokega titra in imajo velike klonske zmogljivosti. To omogoča vstavitev transgena, tj. izražanje antigena po izbiri. Imajo širok spekter infektivnosti in transducirajo celice, ki se ne delijo, njihov genom pa je neintegrativen [1]. Kot je opisano zgoraj, izzovejo tudi vnetni odziv v celicah, ki predstavljajo antigene (APC), ki opravljajo adjuvantno funkcijo za ojačanje imunskega odziva, potrebnega za učinkovito cepljenje [2,3,142,235,236].

Poleg tega so bili vektorji, pridobljeni iz Ad, obširno uporabljeni v predkliničnih in kliničnih preskušanjih za dokazovanje njihove varnosti [237,238]. Za odpravo nezaželenega dela cikla replikacije je treba replikacijo virusa zatreti, da preprečimo celično lizo in širjenje virusa. Razvoj adenovirusnih vektorjev se je začel v zgodnjih 1990-ih kot platforma za širok nabor terapevtskih pristopov, kot so genska terapija, onkolitični vektorji in razvoj cepiva. Večina zgodnjega razvoja vektorjev je bila spremenjenih različic virusov vrste C.

3.1. Razvoj adenovirusnega vektorja, generacijski pristop

Prva generacija vektorja Ad je bila narejena z brisanjem regij E1 in E3 iz virusnega genoma, predvsem s kodiranjem takojšnjega zgodnjega transkripcijskega faktorja, kar preprečuje podvajanje teh vektorjev. Ti vektorji so imeli sposobnost kloniranja okoli 8 kb za vstavljanje transgena z regulatornimi sekvencami [239–241]. Vektorji prve generacije so bili proizvedeni v celicah človeških embrionalnih ledvic (HEK), ki so bile stabilno transformirane z delom virusnega genoma Ad5, ki dopolnjuje regijo E1 v transu [242–247]. Ena glavnih pomanjkljivosti tega sistema je, da omogoča rekonstitucijo genomov, sposobnih za replikacijo, po spontani rekombinaciji [248]. Dodatna delecija E3, ki ni potrebna za proizvodnjo vektorja, poveča velikost transgenske kasete [243] in spodbuja boljši imunski odziv [240].

Na žalost vektorji Ad prve generacije niso bili popolnoma transkripcijsko inertni in so še vedno izzvali močan imunski odziv proti virusnim kapsidnim proteinom, ki so bili izraženi na izhodiščnih ravneh [141,249,250]. Ta lentivektorska imunost je prispevala k vektorski toksičnosti in kratkoročni eliminaciji transduciranih celic [145]. Druga generacija vektorjev Ad je imela dodatno odstranjeni regiji E2 in E4 iz vektorskega genoma. E2 kodira replikacijske encime, E4 pa dodatne regulatorne proteine ​​[251–253]. To je omogočilo prostor za 10,5 kb transgenskih sekvenc, vključno z do štirimi ekspresijskimi kasetami [254]. Podobno so dodatne delecije močno zmanjšale neželeno rekombinacijo in podaljšano izražanje transgena [255]. To je verjetno posledica zmanjšane aberantne ekspresije virusnega gena, ki dodatno zmanjša protivektorsko imunost [141,250,251]. Adenovirusni vektorji tretje generacije so konceptualno drugačni. Sestavljeni so iz zapakiranega vektorskega genoma in nepakiranega virusnega genoma (virus pomočnik), ki proizvaja vektorske delce. Takšni vektorji so znani tudi kot vektorji "odvisni od pomočnika", "brez črevesja" ali "visokozmogljivi" (HC-Ad). Imajo največjo možno zmogljivost kloniranja in lahko prenašajo zaporedja do 36 kb [256–258]. Visoko zmogljivi oglasi nimajo nobene virusne kodirne sekvence, razen ITR-jev in kratkega inkapsidacijskega signala, ki omogoča pakiranje genoma in ki ni v virusu pomočniku [259–262]. Ta strategija nam je omogočila, da smo končno premagali večino protivektorske imunosti, kar je omogočilo dolgoročno izražanje transgenov [263–267]. Vendar HC-Ads niso del trenutnega repertoarja vektorjev cepiva.

3.2. Adenovirus kot vektor cepiva

Preden raziščemo, kako so bili vektorji Ad izkoriščeni, je treba omeniti, da je bilo cepljenje proti samim virusom Ad vrste B tipa 4 in tipa 7 razvito v zgodnjih sedemdesetih letih [268]. To peroralno živo cepivo je obvezno od leta 2011 za vojaške rekrute v ZDA in je dramatično zmanjšalo stopnjo okužbe, ki je dosegla skoraj nič [269–271]. To je poudarilo notranjo učinkovitost in varnost Adsa kot cepiva in odprlo polje za uporabo Adsa kot platforme za cepljenje. Do danes je bilo v kliničnih preskušanjih več kot 200 cepiv, ki temeljijo na oglasih [272]. Veliko jih je usmerjenih proti nalezljivim patogenom, kot sta HIV-1 in ebola [230,273,274]. Cepiva na osnovi adenovirusa niso brez pomanjkljivosti. Nedavno razvito cepivo proti HIV, ki temelji na virusu Ad5 vrste C, je uporabilo mešanico vektorjev, ki izražajo HIV-1 gene gag, pol in nef [275,276]. Vektorji so bili varni, imunogeni in dobro prenašani. Na žalost je bilo treba nastalo klinično preskušanje STEP predčasno ustaviti [277–279]. Ne samo, da se je izkazalo, da to cepivo ne ščiti pred okužbo z virusom HIV, ampak epidemiološki podatki kažejo, da je cepljenje z Ad v tem primeru povečalo tveganje za okužbo z virusom HIV [280–282]. Že obstoječa imunost proti Ad5 je bila opredeljena kot potencialni dejavnik tveganja po cepljenju [283,284]. Vendar ta ugotovitev ni bila potrjena v podobnih študijah [285,286] in ostaja mehanično nejasna [287,288]. Poleg virusa HIV so bila v boju proti eboli (Ad-EBOV), ponavljajoči se grožnji v Zahodni Afriki, razvita vektorska cepiva na osnovi Ad [289]. Vsa cepiva Ad-EBOV uporabljajo glikoprotein ebole (GP) kot antigen cepiva. Začetna predklinična preskušanja na glodalcih in primatih so uporabljala Ad5 in pokazala zaščito v 3 mesecih s proizvodnjo nevtralizirajočih protiteles in aktivacijo CD8 plus [273,290–292]. To cepivo je šlo skozi fazo II kliničnega preskušanja; vendar je že obstoječa imunost na Ad5 pri cepljeni populaciji povzročila razlike v ravni izzvanih nevtralizirajočih protiteles [293–297]. Da bi rešili to težavo, so razvili cepiva na osnovi manj razširjene vrste D Ad26 [186,298,299].

Vendar pa je Ad26 manj imunogen pri ljudeh, kar ima za posledico zmanjšano učinkovitost cepljenja in zahteva prvo okrepitev z uporabo cepiva na osnovi virusa ošpic (MVA). Ta režim cepljenja je dosegel fazo III kliničnih preskušanj [289,300,301]. V razvoju je bila tudi uporaba nečloveških Ad vektorjev [184]. Uporaba ChAd3 šimpanzov kot platforme cepiva proti EBOV je pokazala zaščito pri glodavcih in šimpanzih [302,303], klinična preskušanja, ki uporabljajo te vektorje, pa so na različnih stopnjah napredka [17,300,301,304–306].

Do nedavnega sta bila cepiva proti HIV-1 in EBOV dva glavna primera uporabe cepiv, ki temeljijo na vektorju Ad, vendar nista edina. Izvedeni so bili različni poskusi uporabe vektorjev Ad cepiva proti različnim patogenom, kot so Mycobacterium tuberculosis [307–310], virus denge [311–313], hepatitis B in C [314–320], steklina [321–324] ali influenca. [325–328]. Vendar pa je bila njihova učinkovitost vedno pod pričakovanji (za več podrobnosti glejte [18,142,300,329]). Kandidat za cepivo EBOV je ostalo edino praktično uporabljeno cepivo Ad in se uporablja z nekaterimi omejitvami v Demokratični republiki Kongo. To cepivo temelji na tipu Ad26 (Ad26-ZEBOV/MVA-BN-FILO) in maja 2020 je prvi odmerek cepila 20.339 ljudi, 9560 pa je bilo v celoti cepljenih [230.301.330].

Cepiva, vektorizirana z adenovirusi, so prejela veliko podporo javnosti kot odgovor na pandemijo SARS-CoV-2. Nujnost razmer je omogočila izkoriščanje njihovega razvoja, vključno z izkušnjami, pridobljenimi s cepivi proti koronavirusom, ki so povzročila prejšnje regionalno omejene izbruhe SARS-CoV-1 [331]. Glikoprotein coronavirus spike (S) je bil opredeljen kot najboljši antigen cepiva za imunost na okužbe s koronavirusom [332,333]. Do danes so štiri vektorska cepiva Ad, ki kodirajo spike antigen, v naprednem stanju in so bila odobrena za nujno uporabo v velikih delih sveta. Uporabljene vektorske strategije so bile nekoliko drugačne, vendar v bistvu vključujejo uporabo vektorjev prve generacije. Segajo od uporabe vektorjev vrste C na podlagi Ad5- (Ad5-nCoV), premagovanja že obstoječe imunosti z visokim odmerkom vektorja (CanSino) [187,334], do uporabe manj razširjenega virusa vrste D Ad26 z uporabo stabiliziranega spike glikoproteina (JNJ-78436735/Ad26.COV2.S) [335]. Alternativni pristop uporablja ChAdOx1-S-(AZD1222), vektor Ad iz šimpanzov [336,337]. Edino cepivo v uporabi, ki temelji na heterologni strategiji začetnega pospeševanja za premagovanje vektorske imunosti (Gam-COVIDVac/Sputnik V), najprej uporabi vektor na osnovi Ad26-in nato v obnovitveni injekciji uporabi vektor Ad5 [338,339]. V vseh primerih so bili podatki iz kliničnih preskušanj zelo obetavni, saj so pokazali visoko raven inducirane zaščitne imunosti, v več državah pa je bila odobrena nujna uporaba za uporabo cepiv, ki temeljijo na Ad. Poleg tega epidemiološke raziskave tekočih kampanj cepljenja v različnih državah kažejo na izjemen uspeh pri uporabi cepiv SARS-CoV-2, ki temeljijo na oglasih.

4. Modulacija učinkovitosti vektorja adenovirusa (cepiva), kapsida vodi

Zasnova vektorja adenovirusa (cepiva) mora upoštevati več dejavnikov. Ti vključujejo vzdrževanje dolge in trajne ekspresije kodiranega antigena in aktivacijo imunološkega konteksta (adjuvantni učinek), ki omogoča učinkovito prevajanje ekspresije antigena v obstojno adaptivno imunost, usmerjeno proti imunogenu, ne pa proti vektorju samemu. Imunološki kontekst je zagotovljen s prirojeno imunsko aktivacijo, ki jo vektor cepiva izzove med dajanjem. V tem kontekstu je pomembna učinkovitost, s katero prirojeni imunski senzorji zaznajo vektor, in bo nato določila amplitudo prilagoditvenega odziva. Kot je opisano v zgornjih razdelkih, prirojeno imunsko zaznavanje poteka predvsem na stopnji po vstopu, sočasno s prodiranjem Ad endosoma. Učinkovita ekspresija antigena (cepiva) je nato odvisna od ravnovesja med stopnjo očistka vektorja v primerjavi z uspešno dostavo in ekspresijo vektorskih genomov v jedro. Z razvojem kapsidnih prikazovalnih vektorjev izražanje transgena ni potrebno za izzivanje imunske aktivacije. Ta strategija temelji na vstavitvi epitopa, ki nas zanima, v kapsidne proteine ​​Ad, kar omogoča njegovo neposredno izpostavljenost imunskemu sistemu. Tudi če ima ta pristop nekaj prednosti, se večina vektorjev cepiva opira na genetsko kodirane gene. Za nadaljnje branje o kapsidnih prikazovalnih vektorjih si oglejte te ocene, [340,341].

Že obstoječa imunost proti virusnemu vektorju (npr. 30–90 odstotkov proti virusu Ad5 vrste C, odvisno od geografske lokacije) lahko zmanjša privzem vektorja in zmanjša izražanje antigena ter posledični imunski odziv [342–344]. Razvitih je bilo več strategij za zmanjšanje imunosti proti vektorjem, ki so bile nedavno pregledane [249]. Na kratko, nevtralizirajoča protitelesa večinoma prepoznajo hipervariabilno zanko eksonov in so posledično specifična za serotip [178–180]. Te hipervariabilne zanke je zato mogoče nadomestiti s tistimi drugega, manj razširjenega serotipa [178,345]. To preprečuje nevtralizacijo in inaktivacijo prenašalca. Ker je Ad5 najbolj seroprevalentna vrsta, bi se z uporabo redkih serotipov, kot so Ad26, Ad35 ali nečloveški Ads, prav tako izognili tej težavi [177,346–350].

Vendar pa je velika pomanjkljivost uporabe redkih vrst njihova nižja imunogenost, zaradi česar so manj učinkoviti pri razvoju cepiva [298]. Zato je treba strategije za zmanjšanje protivektorske imunosti razviti vzporedno s strategijami za izboljšanje vektorske imunogenosti, da bi dobili najučinkovitejši vektor. Tudi če je začetna raven nevtralizirajočih protiteles proti vektorju nizka, lahko cepljenje z določeno vrsto vektorja sproži odziv, ki prepreči njegovo prihodnjo uporabo. Priprava protivektorskega odziva poteka tudi na stopnji po vnosu, ko so vektorski delci razvrščeni in obdelani kot sami antigeni. Izzivanje imunološko ugodnega konteksta za uspeh cepljenja lahko pride na račun povečane priprave za vektorsko imunost. Razumevanje parametrov, ki določajo usodo vektorjev oglasov po prevzemu, je lahko priložnost za načrtovanje vektorjev.

4.1. Stabilnost je v vrsti

Receptorsko posredovani privzem in pobeg iz endolizosomskega predela sta značilnosti okužbe z Ad in vektorske transdukcije. Začetni privzem je določen z interakcijo virusnih vlaken in molekul pentona s celičnimi receptorji. Vlakna in penton so skupni vsem Adsom, vendar glede na njihovo vrsto sodelujejo z različnimi celičnimi receptorji (tabela 1). Virusi vrste C uporabljajo CAR in vstopajoči delci pobegnejo iz zgodnjega endosomskega predela [79]. Če so virusi vrste C (Ad5) zasnovani tako, da vsebujejo molekulo vlaken iz virusa vrste B (Ad16), nastali delec (Ad5F16) nato uide iz lizosomskega predela (kot je prikazano z barvanjem z lizosomskim markerjem LAMP1) namesto zgodnjega endosom [351]. Ta zapozneli pobeg iz lizosomov je značilnost vseh testiranih virusov vrste B [111,352,353].

Poleg tega hibridni virusi Ad5F16 in virusi vrste B izzovejo močnejši protivnetni odziv kot virusi vrste C [159,351]. To pripisujejo povečanemu odkrivanju preko intraluminalnega TLR9 v imunskih celicah [354]. Poleg tega poškodba lizosomske membrane za razliko od zgodnje poškodbe endosoma povzroči močan oksidativni stres. Raztrganje lizosoma sosprošča lizosomske hidrolaze, kot je katepsin B, ki lahko poškodujejo mitohondrije in tako okrepijo odziv na poškodbe z aktivacijo inflamasoma [355–357]. Proces privzema Ad destabilizira kapsido in omogoči sproščanje virusnega proteina VI [103,106]. Sproščeni protein VI nato prodre skozi membrano iz endolizosomskega predela, da omogoči virusu dostop do citosola. Primerjava vrst C in B kaže, da sta oba virusa enako učinkovita pri vstopu v citosol in dostavi genoma, vendar se razlikujeta v kinetiki pobega [111]. Dejstvo, da lahko preprosta zamenjava vlaken prenese vstop in imunogene lastnosti z virusa vrste B na virus vrste C, je izjemno. Zagotavlja dokaz koncepta, da je mogoče oblikovati hibridne vektorje s specifičnimi lastnostmi. Zdi se, da je osnovna razlika v tem, da je sproščanje proteina VI zakasnjeno pri virusih vrste B (ali hibridnem virusu) in lahko zahteva zakisanje ali drug neznan sprožilec razstavljanja.

Ker je sproščanje proteina VI v tem primeru zakasnjeno, bi to lahko odražalo povečano stabilnost kapside. Pokazalo se je, da virusi Ad5 vrste C sproščajo molekulo vlaken po vezavi na celico, za kar se domneva, da oslabi kapsido in začne postopek razstavljanja za sproščanje proteina VI. V tem kontekstu se je pokazalo, da je Ad5 brez vlaken manj stabilen kot naravni delci [358]. Nasprotno pa nezreli, hiperstabilni Ts1 Ad2/5 ne sproščajo vlaken ali proteina VI in so slabi induktorji vnetja, saj niti ne sprožijo TLR9 niti ne povzročajo poškodbe membrane [114,138,359,360].

Ni raziskano, ali zamenjava vlaken z vrsto B prepreči začetno sproščanje vlaken in naredi kapsido vrste C bolj stabilno, vendar je verjetno. Stabilnost kapside je lahko bistvena determinanta usode kapside po vstopu in posledično značilnost, ki bi jo lahko izkoristili za načrtovanje vektorjev. Virusi vrste B so lahko bolj stabilni zaradi uporabe drugačnega receptorja ali zaradi edinstvene interakcije vlaken-penton. V nasprotju s tem pa virusi vrste F Ad40/41 okužijo prebavila in imajo povečano stabilnost kapside zaradi njihovega tropizma in prilagoditve na surovo črevesno okolje [24,361]. Črevesje ima intrinzično temperaturo, ki je nekaj stopinj višja od zgornjih dihalnih poti, ki so tarča virusov vrste C (37 ◦C v primerjavi s 33 ◦C) [362]. Tako so Ad40/41 intrinzično bolj termostabilni, podpirajo proces okužbe [24], zaradi česar jih je tudi težko razmnoževati [24,361,363].

Poleg tega nimajo motiva RGD v molekuli pentona, kar ima za posledico dodatno zmanjšan vstop v celico [92]. Ni znano, ali se te edinstvene lastnosti kapside prevedejo v pobeg iz lizosomskega predela ali v delno razstavljanje/defekte sproščanja proteina VI ob vstopu. Nasprotno pa lahko te lastnosti zagotovijo kontekst za razvoj aplikacij peroralnih cepiv. Za razliko od vlaken vrste B imajo vektorji, ki vsebujejo vlakna vrste F, zmanjšano imunsko aktivacijo [364], če se uporabljajo v standardnih okoljskih pogojih. Če je določena človeška vrsta Ad zdaj vzeta iz konteksta in uporabljena kot vektor cepiva, bi bilo morda vredno pogledati naravni tropizem tega vektorja, da bi poiskali namige za napovedovanje njegovega vedenja. Trenutno uporabljeni vektor cepiva na osnovi Ad26 je virus vrste D, njegov naravni tropizem pa so oči in prebavila [365]. Virusi vrste D, vključno z Ad26, so manj imunogeni kot Ad5 [366] in dokazano je, da prenašajo v pozni endosomski predel, kar verjetno vključuje zapoznelo sproščanje proteina VI.

Posledično je blokiranje zakisanosti poznega endosomskega predela dodatno zmanjšalo njegovo imunogenost [113]. V nasprotju s človeškimi oglasi je znanje o nečloveških oglasih, ki se uporabljajo tudi pri cepljenju in vektorizaciji, zelo omejeno. Oglasi, pridobljeni iz šimpanzov, vključno s ChAd3, so tesno povezani z virusi vrste D [367,368]. Zanimivo je, da so vektorji Ad5 bolj imunogeni kot vektorji Ad, pridobljeni iz šimpanzov, in imajo večji transdukcijski potencial. Ta ugotovitev ni bila povezana z razlikami v pentonskem RGD motivu ali vlaknu in njen mehanični razlog ostaja neznan [369]. Morebitne razlike v stabilnosti kapside niso bile raziskane. Drug nečloveški Ad, ki se izkorišča kot prenašalec, je pasji Ad tipa 2 (CAV-2). Ta vektor ima izjemno lastnost, da selektivno transducira nevrone, vendar ne obkroža glialnih celic, za razliko od kontrolnega vektorja Ad5, kljub temu, da oba vektorja uporabljata isti receptor [370–372]. Ta sposobnost je lahko povezana s povečano stabilnostjo kapside, ki omogoča odstranjevanje prevleke le v nevronskih celicah. Psi imajo telesno temperaturo, ki je za ~2 ◦C višja od človeka, kar potencialno povzroči povečano stabilnost kapside CAV-2 [373], podobno kot pri virusih vrste F. CAV-2 slabo izzove prirojeni imunski odziv, skladno s pomanjkanjem učinkovitega razstavljanja v ciljnih celicah [372]. Tako so lahko vektorji CAV2 še en primer, kjer ima biofizična lastnost, povezana z njenim naravnim tropizmom ali gostiteljem, potencial za zagotavljanje novih vektorskih lastnosti.

4.2. Natančna nastavitev strukture kapside, primer proteina VI v vrsti C Ad2/5

Če stabilnost kapside in sproščanje proteina VI določata usodo virusne kapside navzdol, se postavlja vprašanje, ali je to mogoče spremeniti v vektorjih Ad, tj. pripisati nove lastnosti virusnim vektorjem (slika 3). Večina našega razumevanja o tem, kako Ads prodrejo v endolizosomski predel, izhaja iz virusov vrste C Ad2/5. Odkritje proteina VI kot membranskega litičnega faktorja je bilo bistveno za razumevanje tega procesa [103,106]. Protein VI kodira N-terminalno amfipatsko vijačnico, ki je dejanski membranski litični del proteina. Med proizvodnjo virusa se protein VI izraža kot prekurzorski protein, ki se povezuje s heksonskimi trimeri preko amfipatske vijačnice [42,374]. Kompleks se uvozi v jedro preko transportnih signalov, kodiranih na N- in C-koncu proteina VI, ki jih med sestavljanjem in zorenjem virusa odstrani virusna proteaza. Peptid aminokisline C-terminal 11 prav tako aktivira proteazo, kar zagotavlja pameten način za povezovanje sestavljanja virusa z zaščito amfipatske vijačnice. Mutirani virus Ts1 Ad2/5 ima napako pri pakiranju proteaze in noben od kapsidnih proteinov, vključno s proteinom VI, ni obdelan. Nastali delci so hiperstabilni, zadržujejo vlakna in ne uporabljajo proteina VI.

Posledično se delci Ts1 razvrstijo v lizosome po receptorsko posredovani endocitozi. Natančna lokacija proteina VI v zrelem virusu ni jasna, vendar se odcepljeni N-terminus nahaja na notranji površini heksona peripersonalnih eksonov [37,104,375]. Pokazalo se je, da dve točkovni mutaciji v proteinu VI, G33A in S28C, povečata stabilnost kapside Ad5 (slika 3A) [376,377]. Prvi mutant je pred mestom cepitve N-terminalne proteaze v proteinu VI in ovira procesiranje. Nastali delci so delno nezreli in zanje je značilen defekt endosomske lize, kar nakazuje, da N-konec proteina VI stabilizira interakcije protein-protein znotraj viriona [376]. Drugi mutant je bil izbran zaradi njegove sposobnosti tvorbe intra-molekularnih disulfidnih mostov [377].

Virus je vseboval delno nepredelane proteine, potencialno vključno s proteinom VII, vendar presenetljivo ni pokazal nobenih napak pri kužnosti, kljub povečani stabilnosti. Ni znano, ali ima kateri od virusov spremenjen profil imunske aktivacije. Druga točkovna mutacija v proteinu VI, ki vpliva na usodo virusa, je mutacija proteina VI L40Q, ki se nahaja neposredno v amfipatski vijačnici (slika 3A) [378,379]. Virusi s to mutacijo normalno dozorijo, vendar so delno okvarjeni za korak endosomske lize. V nasprotju z zgoraj omenjenimi mutanti so virioni L40Q manj stabilni kot njihovi primerki divjega tipa. Namesto zakasnitve se protein VI in penton predčasno sprostita iz kapside L40Q. Virioni L40Q so manj nalezljivi in ​​podvrženi delnemu lizosomskemu razvrščanju. Vendar pa mutacija L40Q ne odpravi popolnoma lize membrane in nekateri virusi uidejo v citosol, kar ima za posledico splošno približno štirikratno zmanjšano infektivnost vektorja L40Q [379,380]. Opazovanja kažejo, da amfipatska vijačnica s svojo interakcijo prispeva k stabilnosti delcev. Ni znano, ali in kako mutacija L40Q spremeni imunogene lastnosti vektorjev Ad5. Nedavna opažanja kažejo, da sproščanje proteina VI iz kapside sproži notranja konkurenca s proteinom VII za ista ali prekrivajoča se vezavna mesta v eksonih [375].

Dosledno mutirani virus brez proteina VII ne uspe pobegniti iz endosoma in ima napako v endosomski lizi [58]. Nadaljnje razumevanje strukturne in dinamične organizacije notranje kapside (tj. proteina VI) in jedrnih proteinov (tj. proteina V in VII) v delcu in med vstopom v celico bo močno pomagalo razumeti, kaj določa (reverzibilno) stabilnost kapside.

Nadzor učinkovitosti imunske aktivacije vektorjev Ad je velik interes za razvoj cepiv in razširitev MHC predstavitve antigenov bi izboljšala razvoj cepiva [381]. Kot smo že omenili, avtofagija uravnava imunsko aktivacijo in hrani MHC s peptidi. Avtofagija je eden najstarejših celičnih obrambnih mehanizmov pred okužbo, vendar Ads kot prilagojeni človeški patogeni niso razvili mehanizmov, ki bi se izognili avtofagiji ob vstopu. Namesto tega se zdi, da sprejemajo aktivacijo avtofagije in preusmerjajo odgovornost k spodbujanju okužbe. Protein VI ima osrednjo vlogo pri nadzoru avtofagnega odziva celice. Liza adenovirusne membrane s proteinom VI vodi do rekrutiranja galektina 3 in galektina 8, ki ju celica prepozna kot signale nevarnosti (slika 3B) [108,109,382]. Zaznavanje mest prodiranja Ad z galektini aktivira selektivno avtofagijo v okuženi celici, kot je prikazano z rekrutiranjem receptorjev za avtofagijo (npr. NDP52 in p62) in tvorbo točk LC3 [108].

Zanimivo je, da vektorski delci Ad5 uspejo pobegniti iz razpokanega endosoma in lahko potujejo do jedra. Zaviranje avtofagije ne vpliva na virusno infektivnost, ampak zadrži dostavo njihovega genoma v jedro, kar kaže, da oglasi ugrabijo celični stroj za svoj dobiček [108]. Pobeg iz endosoma torej omogoča virusu, da se izogne ​​razgradnji z avtofagijo prek aktivnega procesa. Ta proces je odkril še en mutant proteina VI, mutant M1. Vsi človeški oglasi (in več nečloveških oglasov) kodirajo visoko ohranjen peptidni motiv PPxY v proteinu VI. Pri mutantu M1 je bil ta motiv spremenjen v PGAA (slika 3) [104]. Tako divji tip kot mutant M1 učinkovito sproščata protein VI ob vstopu in sprožita avtofagijo po pretrganju endosomske membrane. Vendar mutirani virus M1 ne more učinkovito pobegniti v citosol in slike EM so pokazale, da so mutirani virusi M1 ujeti v počene endosome, tarča avtofagije.

Posledično se je izkazalo, da ima mutirani virus M1 močno napako na kužnosti, ki se obnovi po farmakološki in genetski inhibiciji avtofagije. Študija je pokazala, da virusi divjega tipa uporabljajo svoj motiv PPxY, da pridobijo ubikvitin ligazo NEDD4.2 in omejijo zorenje avtofagosomov dovolj dolgo, da pobegnejo v citosol. Poleg tega ta lastnost omogoča virusu, da omeji svojo antigensko predstavitev [108]. Pomembno je, da je mutantni vektor M1, vbrizgan v miši, povzročil veliko močnejšo protivektorsko imunost in zmanjšan odziv CD8 plus na kodirani transgen, kar kaže, da lahko preprosta sprememba kapside močno vpliva na imunogenost kapside Ad5. Ni znano, ali katera od drugih mutacij proteina VI vpliva na imunogenost. Vendar lahko prisotnost motiva PPxY v virusu L40Q pojasni, zakaj vektor ohrani relativno visoko infektivnost kljub okvari lize membrane [379,380]. Ker je endosomska liza manj učinkovita in vektorji L40Q delno končajo v lizosomskem predelu, je možno, da je izzvani imunski odziv vendarle drugačen od divjega tipa, Ts1 ali M1 Ad5 kapsid.