Sposobnost preživetja in antioksidativni učinki tradicionalnega hladilnega riževega prahu (bedak Sejuk), izdelanega iz Oryza Sativa Ssp. Indica in Oryza Sativa Ssp. Japonica na celicah melanoma B164A5, ki jih povzroči UVB

Kontakt: ali.ma@wecistanche.com

Ahmad Rohi Ghazali1*, Raveena Vaidheswary Muralitharan1, Chan Kam Soon1, Tharsini Salyam1, Nurul Najihah Ahmad Maulana1, Ummul Aqeela Balqees Mohamed Thaha1, Rasyidah Mohamad Halim1, Sajidah Suhaifi1, Muhamad Haziq Md Khalid1, Adibah Hanis Tan Koflisham2 Ahmad1, Noorhimad1

Povzetek

Ozadje:Tradicionalni hladilni rižev prah (bedak sejuk) je na osnovi fermentiranega rižakozmetičniki se nanese lokalno na kožo kot maska ​​za obraz čez noč. Po pričevanjih uporabnikov,bedak sejukpolepša in pobeli kožo, pri čemer bi te prednosti lahko uporabili kot potencialno kemopreventivno sredstvo proti melanomu.

Cilj:Zato je bila ta študija namenjena ugotavljanju učinkovbedak sejuknarejeno iz Oryza sativa ssp. indica (Indica) in Oryza sativassp. japonica (Japonica) na celicah melanoma B164A5, ki jih povzroči UVB, in tudi identificiraantioksidantzmogljivosti obeh vrst bedak sejuk.

Metode:Optimalni odmerek Indica in Japonica bedak sejuk za zdravljenje celic je bil določen s testom MTT. Potem,antioksidantzmogljivosti obeh vrstbedak sejukso bile določene s testom FRAP.

Rezultati:S testom MTT je bilo ugotovljeno, da Indica in Japonica bedak sejuk nista pokazali citotoksičnih učinkov na celice. Zato ni mogoče doseči IC50 in za zdravljenje sta bila izbrana dva od višjih odmerkov, 50 in 100 g/L. V testu FRAP je Indica bedak sejuk pri 50 in 100 g/L pokazal vrednosti FRAP 0,003 ± 0,001 ug AA (askorbinske kisline)/g bedak sejuka in 0,004 ± 0,0003 ug AA/gbedak sejuk. Medtem ko je japonski bedak sejuk pri 50 g/l imel enako vrednost FRAP kot indica bedak sejuk pri 100 g/l. Japonica bedak sejuk s 100 g/L je pokazala najvišjoantioksidantkapaciteto z vrednostjo FRAP {{0}}.01 ± 0,0007 ug AA/g bedak sejuka, kar je bilo statistično značilno (p < 0,05) v primerjavi z drugimi testiranimi koncentracijami.

Zaključek:Za zaključek Japonicabedak sejukima višjoantioksidantzmogljivost v primerjavi z Indico bedak sejuk, čeprav oba nista citotoksična za celice. Ne glede na to je treba opraviti nadaljnje preiskave, preden bi bedak sejuk lahko razvili kot potencialno sredstvo za kemopreprečevanje melanoma.

Ključne besede:Bedak sejuk- fermentiran riž - fermentirankozmetika- Oryza sativa indica - Oryza sativa Japonica

Kliknite zaekstrakt cistanche in cistanche deserticola ma za antioksidant

Uvod

Največji organ človeškega telesa je koža, ki predstavlja 16 odstotkov človeške telesne teže. Povrhnjica kože deluje kot zaščitna plast, ki ločuje organizme od zunanjega okolja. To je ključnega pomena pri preprečevanju okoljskih dejavnikov, kot je ultravijolična (UV) svetloba. Ko UV svetloba prodre skozi povrhnjico, melaninski pigmenti v keratinocitih tvorijo zaščitni ovoj nad jedri keratinocitov. To zagotavlja zaščito kože pred prodiranjem UV-svetlobe in nevtralizacijo reaktivnih kisikovih vrst (ROS), ki so bile proizvedene (D'Orazio et al., 2013; Aluwi et al., 2016; Woolridge Cooper, 2018).

Vendar pa je povečana izpostavljenost UV svetlobi glavni vzrok za hiperpigmentacijo in poškodbe kože (Chan et al., 2014; American Cancer Society, 2020). UV-svetloba sonca, ki prodre skozi kožo, je UVA (90 - 95 odstotkov) in UVB žarek (5 – 10 odstotkov), pri čemer je obseg poškodbe kože odvisen od valovne dolžine posameznega žarka. UVA žarki imajo daljše valovne dolžine (320 – 400 nm), ki prodrejo globoko v dermis in povzročijo nastanek prostih radikalov, zlasti ROS. Kar zadeva UVB žarke, s krajšimi valovnimi dolžinami (280 – 320 nm), ki prodrejo samo do epidermalne plasti, žarki poškodujejo DNK, kar posledično povzroči mutacije. Ta kombinacija tvorb in mutacij ROS končno prispeva k razvoju kožnega raka (Sander et al., 2003; Pfeifer in Besaratinia, 2012; D'Orazio et al., 2013; Kamarulzaman et al., 2017; Pavel et al., 2017; Nagapan et al., 2018).

Vrsta kožnega raka, ki nastane zaradi prekomerne izpostavljenosti UV-svetlobi, je melanom. Melanom se pojavi, ko melanociti nenadzorovano rastejo zaradi mutacij v DNK. Čeprav melanom predstavlja le manj kot 10 odstotkov vseh kožnih rakov, prispeva k večini smrti, povezanih s kožnim rakom. To je mogoče pripisati visokemu metastatskemu potencialu melanoma in odpornosti proti terapiji (Pfeifer in Besaratinia, 2012; American Cancer Society, 2020). Zato so strategije za kemoprevencijo melanoma primernejše pri reševanju te bolezni (Chhabra et al., 2017).

V skladu s strategijami za kemopreprečevanje melanoma je ideja o uporabi lokalnegakozmetičnipojavil izdelek, ki lahko zmanjša nastajanje ROS in mutacije na človeški koži. Ta izdelek, tradicionalni hladilni rižev prah, bolj znan kotbedak sejukv Maleziji, je tradicionalni kozmetični izdelek na osnovi fermentiranega riža. Riževa zrna, ki so bila v prejšnjih študijah fermentirana za proizvodnjo bedak sejuk, so Oryza sativa ssp. indica (Indica) in Oryza sativa ssp. japonika (Japonica) (Dzulfakar in sod., 2015a). Zrna riža indica so dolga, ploščata, vitka, se zlahka drobijo in imajo visoko vsebnost amiloze, medtem ko so zrna riža japonica kratka, okrogla, se ne drobijo zlahka in imajo nizko vsebnost amiloze (Ricepedia, nd). Bedak sejuk kot produkt fermentacije riževih zrn je v obliki vodnih kapljic ali stožčastih pastil. Ko te pastile zmešate z vodo in nanesete na kožo kot masko za obraz čez noč, dajejo hladilni učinek. Pričevanja uporabnikov iz generacije v generacijo so potrdila, da je bedak sejuk sposoben polepšati in tudi pobeliti kožo (Dzulfakar et al., 2015b; Dzulfakar et al., 2016c; Johar et al., 2018). Vendar ta pričevanja niso bila nikoli preizkušena v laboratoriju, zlasti glede njegovih učinkov na kožne celice, tako normalne kot maligne.

Zato je bila naša raziskava namenjena ugotavljanju učinkovbedak sejuknarejen iz podvrst riža indica in japonica z uporabo celic melanoma B164A5, ki jih povzroči UVB, ter identificiraantioksidantzmogljivosti obeh vrst bedak sejuk.

Materiali in metode

Priprava Indica in Japonica bedak sejuk

Thebedak sejuknarejen iz podvrst riža Indica in Japonica, je prijazno zagotovila Fakulteta za inženirstvo in grajeno okolje, Universiti Kebangsaan Malezija, 43600 Bangi, Selangor. Za pripravo bedak sejuka so bila riževa zrna indica in japonica namočena v vodi iz pipe v razmerju 1:1 (m/v) v ločenih zaprtih posodah, ki niso bile sterilizirane. Riževa zrna so bila nato 14 dni podvržena naravni fermentaciji pri sobni temperaturi. 14. dan smo riževa zrna filtrirali z muslinsko krpo in jih ponovno namočili v novo količino vode (w/v). Namakanje riževih zrn je bilo ponovljeno šestkrat vsakih 14 dni, tako da je skupni postopek namakanja znašal 84 dni. Po 84 dneh je bila nastala riževa pasta iz vsake podvrste riža zbrana in posušena v pečici, da je nastala praškasta oblika bedak sejuk (Dzulfakar et al., 2016a). Bedak sejuk smo nato do nadaljnje uporabe hranili v hladilniku pri 4oC. Pred poskusi je bil bedak sejuk raztopljen v destilirani vodi in filtriran skozi 0,22 µm Millipore filter za brizgo za sterilizacijo.

Kultura celic

Celična linija mišjega melanoma B164A5 je bila kupljena pri Evropski zbirki avtenticiranih celičnih kultur (ECACC). Celice smo gojili v Dulbeccovem modificiranem mediju Eagle (DMEM), obogatenem z 10 odstotki fetalnega govejega seruma (FBS), 1 odstotkom mešanice penicilina in streptomicina (Pen/Strep, 10,000 ie/ml), glukoze in L- glutamin. Celice smo nato inkubirali v navlaženem ozračju pri 37oC v 5 odstotnem CO2. Ko celična konfluentnost doseže 80 odstotkov, so bile celice subkultivirane (Public Health England, nd). Preden so bili izvedeni testi, je bila narisana krivulja rasti celic B164A5. Iz krivulje rasti je bil pridobljen čas podvojitve 24 ur, pri čemer je bila ta ugotovitev podprta s študijo Danciu et al., (2013).

MTT test

Citotoksičnost obeh vrstbedak sejukproti celicam B164A5 so ovrednotili s testom viabilnosti celic 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazolijev bromid (MTT) v skladu z metoda Mosmanna (1983) z manjšimi spremembami. 200 µL 5 x 104 celic smo zasejali v 96-ploščo z ravnim dnom in inkubirali 24 ur v vlažni atmosferi pri 37oC v 5 odstotkov CO2. Po 24 urah inkubacije smo gojišče zavrgli in nadomestili z 200 µL PBS. Nato so bile celice izpostavljene UVB sevanju pri 30 mJ/cm2 za 36,4 sekunde (Lin et al., 2002). Takoj po izpostavitvi UVB smo PBS zavrgli in celice obdelali z obema vrstama bedak sejuka v serijsko razredčenih koncentracijah 6,25, 12,5, 25, 50 in 100 g/L. Kar zadeva pozitivno kontrolo, so bile celice obdelane z menadionom v serijsko razredčenih koncentracijah 0,0625, 0,125, 0,25, 0,5 in 1 mM po Basriju et al. (2015), medtem ko so bile negativna kontrola neobdelane celice. Po obdelavi smo celice inkubirali še 24 ur. Po inkubacijskem obdobju smo v vsako vdolbinico dodali 20 µL 5 mg/mL raztopine MTT in inkubirali 4 ure. Nato smo iz vsake vdolbinice zavrgli 190 µL zmesi in dodali 200 µL DMSO ter inkubirali 15 minut. Nazadnje smo ploščo stresali 5 minut in odčitali absorbanco pri 570 nm z uporabo bralnika mikroplošč. Odstotek viabilnosti celic je bil izračunan z naslednjo formulo: Viabilnost celic (odstotki)= (povprečna OD tretiranih celic)/(srednja OD negativne kontrole) ×100

Test zmanjševanja antioksidativne moči železa (FRAP).

Theantioksidantzmogljivosti obeh vrstbedak sejukso bili določeni s testom FRAP, kot sta opisala Benzie in Strain (1996). To je metoda za ocenjevanje antioksidativne moči z redukcijo železovega (Fe3 plus) v železove ione (Fe2 plus) pri nizkem pH, kar ima za posledico tvorbo obarvanega železovega-tripiridiltriazinskega kompleksa. Najprej smo sveže pripravili delovni reagent FRAP z mešanjem acetatnega pufra (30 mM, pH 3,6), raztopine železovega (III) klorida (FeCl3) (20 mM) in raztopine TPTZ (10 mM) v razmerju 10:1:1. . Pripravljen delovni reagent FRAP smo nato hranili v vodni kopeli pri 37oC in zaščitili pred svetlobo. Temu sledi priprava umeritvene krivulje železovega (II) sulfata (FeSO4) z uporabo serijsko razredčenih koncentracij v razponu od 100 – 1,000 µM. Askorbinska kislina je bila uporabljena kot pozitivna kontrola in je bila pripravljena z uporabo serijsko razredčenih koncentracij v razponu od 3,125 do 50 µg/mL v temi (Hasiah et al., 2011). Kar zadeva eksperimentalne korake, smo dodali 50 µL FeSO4, askorbinsko kislino in obe vrsti bedak sejuka v dodeljene jamice v 96-plošči z jamicami. Po tem smo v vsako vdolbinico naknadno dodali 175 µL segretega delovnega reagenta FRAP. Nato smo ploščo inkubirali pri 37 °C 5 minut. Nazadnje so bili odčitki absorbance vzeti pri 595 nm z uporabo čitalnika mikroplošč in vrednosti FRAP so bile izražene kot antioksidativna kapaciteta ekvivalenta askorbinske kisline (AEAC) (Gashahun in Solomon, 2019).

cistanche v prahu

Statistična analiza

Za predstavitev podatkov je bila uporabljena programska oprema SPSS v25. Vsak preskusni podatki iz treh neodvisnih poskusov (n=3) so bili izraženi kot povprečje ± SEM. Za primerjavo med povprečji je bil uporabljen enosmerni test ANOVA. Uporabljena alfa je bila 0.05 in p-vrednost < 0,05="" je="" veljala="" za="" statistično="">

Rezultati

Citotoksičnost Indica in Japonica bedak sejuk

Citotoksičnost obeh vrstbedak sejukje bil ovrednoten proti celicam melanoma B164A5, ki jih povzroča UVB, s testom MTT. Menadion, ki je bil uporabljen kot pozitivna kontrola, je pokazal citotoksičnost z IC50 0.04 ± 0.02 mM (slika 1). Vsaka koncentracija menadiona je bila statistično značilna (p < 0,05)="" v="" primerjavi="" z="" negativno="" kontrolo.="" medtem="" ko="" indica="" in="" japonicabedak="" sejuk="" nista="" pokazali="" citotoksičnosti,="" zato="" vrednosti="" ic50="" niso="" bile="" pridobljene.="" obe="" vrsti="" bedak="" sejuk="" sta="" imeli="" na="" začetku="" zmanjšanje="" viabilnosti="" celic,="" vendar="" se="" je="" postopoma="" povečevala,="" ko="" se="" je="" koncentracija="" povečevala="" (sliki="" 2="" in="" 3).="" poleg="" tega="" vse="" koncentracije="" obeh="" vrst="" bedak="" sejuka="" niso="" bile="" statistično="" značilne="" (p=""> 0,05) v primerjavi z negativno kontrolo. Rezultati so pokazali, da obe vrsti bedak sejuka nista bili citotoksični za celice melanoma B164A5, ki jih povzroči UVB.

Antioksidativne zmogljivosti Indica in Japonica bedak sejuk

Zmanjševalne zmogljivosti obeh vrst bedak sejuk kotantioksidantiso bile določene s testom FRAP. Vrednosti FRAP so bile izražene kot antioksidativna kapaciteta ekvivalenta askorbinske kisline (AEAC) v enoti µg AA (askorbinska kislina)/g bedak sejuka. Vrednosti FRAP za 50 in 100 g/L Indica bedak sejuk so bile 0.003 ± {{ 17}}.001 oziroma 0,004 ± 0,0003 µg AA/g bedak sejuka (slika 4). Kar zadeva Japonica bedak sejuk, sta bili vrednosti FRAP za 50 in 100 g/l 0,004 ± 0,0003 in 0,01 ± 0,0007 µg AA/gbedak sejukkar kaže na način, ki je odvisen od odmerka (slika 4).

Ko so primerjali vrednosti FRAP Indica bedak sejuk za 50 in 100 g/L, ni bilo statistično značilno (p=0,803). Vendar so bile vrednosti FRAP Japonica bedak sejuk za 50 in 100 g/L statistično pomembne (p=0.006) v primerjavi. Poleg tega je bila vrednost FRAP Japonica bedak sejuk za 100 g/L, ki kaže najvišjo antioksidativno zmogljivost, statistično pomembna v primerjavi z vrednostmi FRAP Indicabedak sejukza 50 (p=0.001) in 100 g/L (p=0.003).

Diskusija

V zadnjem času je uporaba naravnih izdelkov v negi kože v porastu. Dokazano je, da ima večina teh naravnih izdelkovantioksidantlastnosti poleg zagotavljanja zaščite kože pred UV svetlobo (Abdul Wahab et al., 2014). Primer takega izdelka je bedak sejuk, kozmetični izdelek na osnovi fermentiranega riža. Za generacije,bedak sejukpastile pomešamo z vodo in nanesemo lokalno na kožo kot masko za obraz čez noč (Dzulfakar et al., 2016c; Johar et al., 2018).

Pri fermentaciji riževih zrn za proizvodnjo bedak sejuk so poleg plesni in kvasovk običajno vključene mlečnokislinske bakterije (LAB) (Dzulfakar et al., 2015a; Dzulfakar et al., 2016b). Uporabakozmetičniizdelki, ki vsebujejo to sestavino fermentiranega riža LAB, povzročijo ekspanzijo in gladkost izdelka ter moker občutek po nanosu na kožo (Sawaki et al., 2010). O podobni izkušnji poroča tudibedak sejukuporabnikom, pri čemer nanos bedak sejuka povzroči hladen občutek (Dzulfakar et al., 2015a). Zanimiva je tudi povezava med kožo in fermentacijo z LAB, pri čemer voda za namakanje LAB, ki se uporablja med fermentacijo riževih zrn, vsebuje mlečno kislino in druge aminokisline, ki prispevajo k hidraciji kože. Zaradi teh prednosti je voda za namakanje LAB uporabna kot vir kozmetičnih izdelkov. Zato lahko kombinacija substrata ali medija, kot so riževa zrna in sevi LAB, povzroči kozmetične učinke, kot so antioksidativni učinki, nadzor pH in preprečevanje celičnega stresa (Izawa in Sone, 2014). Te koristi so v skladu s strategijami kemoprevencije melanoma. Vendar je treba učinek bedak sejuka na maligne kožne celice še raziskati v laboratoriju. Kot predhodna študija za morebitno sredstvo za kemoprevencijo melanoma so celice mišjega melanoma B164A5, ki so bile inducirane z UVB, primeren model raka.

Prvič, v testu MTT je bilo ugotovljeno, da Indica in Japonicabedak sejukniso bili citotoksični za celice melanoma B164A5, ki jih povzroča UVB. Vendar pa je bilo ugotovljeno, da je prišlo do zmanjšanja viabilnosti celic pri nižjih koncentracijah bedak sejuka, čemur je sledilo povečanje viabilnosti celic pri višjih koncentracijah bedak sejuka. To zmanjšanje viabilnosti celic lahko pripišemo dejstvu, da so UVB žarki citotoksični za celice, v tem primeru za celice B164A5 (Pavel et al., 2017). Hkrati nižje koncentracije bedak sejuka niso bile dovolj za povečanje števila celic, ki so bile inducirane z UVB. Ne glede na to pa zmanjšanje sposobnosti preživetja celic ni padlo pod 50-odstotno oznako, zato za obe vrsti bedak sejuka ni bilo mogoče doseči IC50. Posledično sta bila dva od višjih odmerkov, 50 g/L in 100 g/L, izbrana kot odmerka za zdravljenje za naslednji test.

V testu FRAP je bilo ugotovljeno, da ima Japonica bedak sejuk višjoantioksidantzmogljivost v primerjavi z Indicobedak sejuk. Razlike bi lahko pojasnili z dejstvom, da se riževa zrna Japonica gojijo v zmernih in hladnejših regijah Azije, medtem ko se riževa zrna Indica gojijo po vsej tropski Aziji (Garris et al., 2005). Temperatura okolja igra bistveno vlogo pri antioksidativnih aktivnostih rastlin in rastline, gojene v hladnejšem vremenu, imajo bolj izrazito antioksidativno aktivnost v primerjavi z rastlinami, ki so bile gojene v toplejšem vremenu. To povečanje antioksidativne aktivnosti lahko pripišemo proizvodnji več fitokemikalij, saj so rastline podvržene stresu v hladnejšem vremenu (Kumar et al., 2017).

Obstajajo tudi drugi izdelki iz fermentiranega riža, ki so pokazali obetavne rezultate. Prvič, tu je fermentirani filtrat Galactomyces (GFF), ki je stranski produkt fermentacije riža s kvasovkami Galactomyces. Izvleček GFF vsebuje edinstveno mešanico vitaminov, mineralov, majhnih peptidov in oligosaharidov, ki se uporabljajo kotkozmetičnisestavine izdelkov za nego kože. Izvleček je pokazalantioksidantznačilnosti z zaščito normalnih človeških epidermalnih melanocitov (NHEM) pred oksidativnim stresom (Woolridge Cooper, 2018). Te ugotovitve GFF so bile podobne ugotovitvambedak sejukv tej študiji.

Riževi otrobi imajo tudi močno antioksidativno delovanje do te mere, da povzročajo citotoksičnost za melanocite. Ko so riževi otrobi fermentirani, je bila citotoksičnost izvlečka riževih otrobov proti celicam B16F1 odpravljena. To kaže, da je fermentacija riževih možganov proizvedla nove koristne spojine z biološkimi funkcijami, čeprav je treba natančne spojine še pojasniti (Chung et al., 2009).

Nazadnje, voda za namakanje riža iz prahubedak sejukdejansko vsebuje aminokisline, ki bi lahko bile koristne za kozmetične namene. V Indica bedak sejuku in vodi za namakanje je odkritih 16 od 17 aminokislin. Glutaminska kislina je bila najvišja koncentracija aminokislin, najdena tako v Indica bedak sejuku kot v njegovi vodi za namakanje (Johar et al., 2018). Glutamin (derivat glutaminske kisline) je poleg arginina, tirozina in lizina, ki jih najdemo v bedak sejuku in njegovi vodi za namakanje, med glavnimi aminokislinami, ki se uporabljajo v kozmetični industriji (Ha et al., 2018). Poleg tega aminokisline vkozmetičniizdelki delujejo kotantioksidanti(Ivanov et al., 2013) in vsebnost aminokislin v Indica bedak sejuku je bila veliko višja v primerjavi z vodo za namakanje. Zato je bila uporaba bedak sejuka bolj učinkovita glede vsebnosti aminokislin v primerjavi z vodo za namakanje (Johar et al., 2018).

Če povzamemo, Indica in Japonicabedak sejukjih je treba dodatno raziskati, preden lahko trdimo, da imajo potencial kot sredstvo za kemoprevencijo melanoma, ki lahko (1) prepreči melanom, (2) prepreči razvoj malignega melanoma iz predmalignih lezij ali (3) prepreči ponoven pojav melanoma po uspešnem zdravljenju melanoma (Chhabra et al., 2017).