Kakšna je razlika med divje rastočo cistančo in umetno gojeno cistančo glede aktivnosti krepitve imunosti

Kontakt: Audrey Huaudrey.hu@wecistanche.com

Zhao Bing; Yang Xiumei; Wu Daocheng; Ba Xueli; Li Quanxiao; Tan Yachao; Zhang Ailian

Povzetek:

Cilj:Za primerjavo učinkov krepitve imunskega sistema divje rastoče cistanche in umetno gojenih polisaharidov cistanche iz cistanche (v nadaljevanju: WCDPS oziroma CCDPS).

Metode:Različni odmerki (nizki, srednji in visoki) WCDPS in CCDPS ter ovalbumina (OVA) so bili subkutano imunizirani z mišmi ICR, OVA-specifičnim protitelesom IgG in podtipi protiteles IgGl in IgG2a so bili odkriti z ELISA in z metodo MTT. Aktivnost proliferacije limfocitov, specifična za OVA, pretočna citometrija za odkrivanje ravni izražanja CD4 plus T celic in CD8 plus T celic.

Rezultati:Tako WCDPS kot CCDPS lahko znatno povečata ravni izražanja protitelesa IgG, specifičnega za OVA, in IgG1 in IgG2a za tipiziranje protiteles (P<0.05), and="" there="" is="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" the="" same="" doses="" of="" wcdps="" and="" ccdps="" (f="">0. 05); WCDPS and CCDPS can significantly promote OVA-specific lymphocyte proliferation, and the difference between the same dose is not statistically significant (P>0.05); WCDPS in CCDPS lahko tudi znatno povečata odstotek podvsebine celic CD4 plus T in CD8 plus T (P<0.05), and="" the="" difference="" between="" the="" same="" dose="" was="" not="" statistically="" significant="" (p="">0.05), WCDPS in CCDPS nista vplivala na težo imuniziranih miši.

Zaključek:Oba, WCDSP in CCDPS, lahko znatno povečata humoralne in celične imunske odzive, specifične za OVA, in med njima ni statistično značilne razlike in imata dobro varnost.

Ključne besede: cistanche; polisaharidi iz cistanche; ovalbumin; adjuvans

Cistanche (C. deserticola. YC Ma),znan tudi kot Cunyun in Dayun, je že vrsto let parazitska zelnata rastlina iz družine Lydanaceae. Je redek in dragocen kitajski medicinski material. Njegove glavne sestavine vključujejo polisaharide iz cistanche, feniletanoidne glikozidne spojine Cistanche, organske kisline, alkaloide itd.⑷, imajo več funkcij, kot so negovalna esenca in kri, pomoč pri jangu in tonificiranje ledvic ter lajšanje staranja⑸. Zaradi izjemno visoke zdravilne vrednosti cistanke je prekomerno izkoriščanje divjih vrst tik pred izumrtjem, uspešna pa je bila umetno gojena cistanka. Raziskovalci doma in v tujini so opravili veliko raziskav o kemičnih sestavinah in učinkovinah divje rastočih cistanč in umetno gojenih cistanč, vendar je malo poročil o primerjavi polisaharidov divjih in gojenih cistanč iz adjuvansnega delovanja cistanč (WCDPS/CCDPS). . Veliko raziskav je pokazalo, da lahko rastlinski polisaharidi iz cistanke kot adjuvans uravnavajo imunski odziv telesa. Mnogi raziskovalci so uporabili kitajsko zeliščno medicino kot adjuvans za cepivo in dosegli dober napredek.

Ta študija temelji na prejšnji raziskavi (6) za primerjavokrepitev imunskega sistemadejavnosti Xinjiang WCDPS in CCDPS. V glavnem s poskusi imunizacije na miših so bili različni odmerki WCDPS in CCDPS subkutano imunizirani z OVA pri miših ICR in njihovi učinki na raven humoralneimunostin celično imunost, inducirano z OVA po imunizaciji. Primerjajdivje raste cistancheinumetno gojena cistančapolisaharidi Dejavnost polisaharidov v citrusih za krepitev imunskega sistema je lahko referenca za boljši razvoj in uporabo umetno gojenih cistanche v Xinjiangu.

Materiali in metode

Eksperimentalni materiali:

Divje rastoča cistanča in gojena cistanča (komercialno dostopna). Gojišče RPMI 1640 je bilo kupljeno pri GIBCO; Fetalni goveji serum je bil kupljen pri Israel Bioind; Protitelesa za pretočno citometrijo: PE podgana proti mišjim CD3, APC podgana proti mišjim CD4, FITC podgana proti mišjim CD8a so bila kupljena pri ameriškem podjetju BD, jajčni beljak Protein (Ovalbumin, OVA) Sigma izdelek, kozje protimišje označeno s hrenovim peroksidom IgG, IgGl in IgG2a so bili kupljeni pri Southbiotech, ZDA. Vsi drugi eksperimentalni kemični reagenti so domači analitski reagenti.

Poskusne živali:

Samice miši ICR čistega razreda (6-8 tednov, 18-22 g) so bile kupljene v Eksperimentalnem centru za živali Medicinske univerze Xinjiang. Živali smo hranili v sobi za živali v našem laboratoriju, poskus pa smo začeli 7 dni po aklimatizaciji živali.

Priprava WCDPS in CCDPS:

Referenca [17] uporablja metodo vodne ekstrakcije in alkoholne precipitacije. Kratki koraki so naslednji: Vzemite suh prašek gojene in divje cistanče Xinjiang, dodajte 10-kratno količino vazelina in absolutni etanol ultrazvoku 1 uro; po sesalni filtraciji zadržite ostanek zdravila in ga posušite, dodajte 10-kratni volumen destilirane vode 37T Ultrazvok dvakrat, centrifugirajte pri 4 000 vrt/min 10 minut, združite supernatante, rotacijsko uparite in koncentrirajte ter oborite čez noč z alkohol; po vakuumski filtraciji in sušenju dobimo prašek surovega ekstrakta; Metoda Savage ⑻ odstrani beljakovine iz WCDPS in CCDPS. Vsebnost polisaharidov iz cistanhe v WCDPS in CCDPS, določena z metodo čebula-žveplova kislina, je bila 76,82 odstotka oziroma 59,58 odstotka.

Imunizacija miši in zbiranje seruma:

Kot eksperimentalni živalski modeli so bile uporabljene {{0}} teden stare samice miši ICR. Poskus je bil razdeljen na 9 skupin, po 5 v vsaki skupini: 0.9 odstotkov NaCl, OVA 10 jig, OVA-Alum 200 |jLg, OVA-WCDPS 10 |xg, OVA -WCDPS 50 |xg, OVA- WCDPS 100 net, OVA-CCDPS 10 |jLg, OVA-CCDPS 50 |xg, OVA-CCDPS 100 net. Pred imunizacijo raztopite z 0,9 odstotka NaCl in miši dvakrat subkutano imunizirajte v presledku 2 tednov. Pred imunizacijo se odvzame kri, serum-80Y pa se pripravi in ​​shrani za kasnejšo uporabo.

Učinki WCDPS in CCDPS na rast miši:

Da bi opazovali učinke WCDPS in CCDPS na rast miši, smo težo miši v vsaki skupini stehtali pri 0 d pred prvo imunizacijo, 14 d in 21 d po imunizaciji.

Odkrivanje mišjega serumskega protitelesa IgG in tipizacija po imunizaciji WCDPS in CCDPS:

Za določanje protiteles v serumu smo uporabili indirektno metodo ELISA. Prevleko ELISA plošče z 2,5 jig/ml OVA, 4Y čez noč; 3-krat sprano s PBST in nato dodano 5-odstotno nemastno mleko v prahu 37L za blokiranje 1 uro; 3-krat sprano s PBST in dodano primarno protitelo mišem po imunizaciji v serumu vsake skupine, razmerje razredčitve primarnega protitelesa je 1:100, 100 tabletk na jamico, 37Tl h; po 3-kratnem izpiranju s PBST dodajte sekundarna protitelesa: kozja protimišja IgG, IgGl, IgG2a (l: 5 000), označena s HRP 37 Inkubirajte zmaja 1 uro; po 4-kratnem izpiranju s PBST dodajte raztopino substrata tetrametilbenzidina (TMB), da se 15 minut izognete svetlobi. V vsako jamico dodajte 50, da ustavite reakcijo z 2 mol/L H2SO4, in izmerite vrednost A45O/655. Primerjajte ravni protiteles v vsaki skupini.

Odkrivanje proliferacije mišjih vraničnih limfocitov po imunizaciji WCDPS in CCDPS:

Metoda MTT je bila uporabljena za odkrivanje proliferacije limfocitov v vranici miši, imuniziranih s CCDPS in WCDPS. Vranico miši smo izolirali v aseptičnih pogojih 21 dni po začetni imunizaciji in celice vranice razredčili z 10-odstotnim medijem RPMI 1640, ki je vseboval FBS, da smo naredili suspenzijo posameznih celic, prešteli in prilagodili celice (r celic/ml razporedite v 96-ploščo za kulturo celic vdolbinice, dodajte 20 OVA (končna koncentracija 10 |xg/ml) oziroma ConA (končna koncentracija 5 prašičev/ml) Stimulirajte, nastavite prazno celično kontrolo in prazen serum istočasno kontrolo, ga postavite v celični inkubator 37Y za 48 ur, dodajte 20 MTT v vsako vdolbinico, 37^ in nadaljujte z inkubacijo 4 ure, dodajte 100|±1 DMSO v vsako vdolbinico, da se raztopi in testira srce 0 /63 Vrednost, izračunajte indeks stimulacije (SI) vsake skupine miši.

Izražanje CD4 in CD8 na celicah CD3 plus T po imunizaciji WCDPS in CCDPS:

Pretočna citometrija je bila uporabljena za odkrivanje ekspresije celic CD4 plus T in CD8*T na površini celic CD3 plus T. Mišjo vranico smo izolirali v aseptičnih pogojih 21 dni po primarni imunizaciji in vranico obdelali z medijem RPMI 1640, ki je vseboval 10 odstotkov FBS. Pripravite suspenzijo posameznih celic, preštejte in prilagodite število celic na 1x106 celic/vzorec, obarvajte CD4 in CD8 na površini celic CD3 plus T, zaščitite pred svetlobo pri sobni temperaturi 25 minut in uporabite 10 ml raztopina s fosfatnim pufrom, ki vsebuje 0,5 odstotka FBS (raztopina s fosfatnim pufrom). fiziološka raztopina, PBS) 1 200 r/min 7 min enkratno izpiranje, dodajte 250 |jil PBS, prepustite bakreno mrežico 200 mesh, pretočno citometrijo za odkrivanje izražanja CD4 in CD8 na površini celic CD3*T.

Statistične metode:

Programska oprema Flowjo 7.6 obdeluje rezultate testov pretočne citometrije; GraphPad Prism 5.0 se uporablja za analizo podatkov in vsi podatki temeljijo na povprečju ± standardnem odklonu. Za primerjavo podatkov med eksperimentalnimi skupinami uporabite Student and test. p<0.05 means="" that="" there="" is="" a="" difference.="" statistical="">

Rezultat

1. The effect of WCDPS and CCDPS on the growth of mice: After co-immunization with WCDPS and CCDPS and OVA, weigh the weight of the mice (Table 1). There was no statistically significant difference in the bodyweight of mice in each group during the same growth period ( P>0.05).

2. Učinek WCDPS in CCDPS na OVA-specifična protitelesa IgG: WCDPS in CCDPS smo subkutano imunizirali z OVA, da bi odkrili izražanje OVA-specifičnih protiteles IgG v serumu po 14 dneh in 21 dneh imunizacije. Rezultati so prikazani na sliki 1, WCDPS in CCDPS sta spodbujala izražanje protiteles IgG v serumu na način, odvisen od odmerka; OVA plus WCDPS 50 p,g v primerjavi z OVA plus CCDPS 50 |xg lahko v primerjavi z OVA plus CCDPS 50 |xg znatno spodbuja protitelesa, specifična za OVA. Izražanje IgG (F<0.05), but="" the="" difference="" was="" not="" statistically="" significant="" compared="" with="" the="" aluminum="" adjuvant="" group="" (p="">0.05); the difference between WCDPS and CCDPS at the same dose was not statistically significant (P>0.05).

3. Učinek WCDPS in CCDPS na tipizacijo protiteles, specifičnih za OVA: 21 dni po imunizaciji so v serumu odkrili ekspresijo IgG1 in IgG2a za tipizacijo protiteles, specifičnih za OVA. Rezultati so prikazani na sliki 2. OVA-WCDPS 50 jig in OVA-WCDPS 100 |xg Mumu sta znatno pospešila izražanje protiteles IgG2a v serumu kot skupina OVA sama (P<0.05); both="" ova-wcdps="" 50="" and="" ova-ccdps="" 50="" pigs="" could="" significantly="" promote="" the="" expression="" of="" ova-specific="" antibody="" iggl=""><0. 001);="" compared="" with="" ova-wcdps="" 50="" p,g,="" and="" ova-wcdps="" 100="" jig,="" the="" aluminum="" adjuvant="" group="" can="" significantly="" promote="" the="" expression="" of="" antibody="" igg2a=""><0.05); the="" expression="" of="" antibody="" typing="" is="" different="" between="" wcdps="" and="" ccdps="" at="" the="" same="" dose="" no="" statistical="" significance="" (p="">0.05).

4. Učinek WCDPS in CCDPS na proliferacijo mišjih limfocitov, specifičnih za OVA: Da bi odkrili učinek WCDPS in CCDPS na vranične limfocite, smo polisaharide iz cistanche subkutano imunizirali z OVA in celice vranice ločili 21 dni po imunizaciji , za njihovo odkrivanje pa je bila uporabljena metoda MTT. Spodbujajte OVA-specifično proliferacijo limfocitov. Rezultati so prikazani na sliki 3. WCDPS in CCDPS sta povečala za OVA specifično proliferacijo limfocitov na način, ki je odvisen od odmerka. Kombinacija WCDPS in CCDPS s skupino OVA lahko znatno spodbuja proliferacijo limfocitov, specifičnih za OVA, v primerjavi s samo skupino OVA. Proliferacija limfocitov (P<0.05); ova-wcdps="" 50="" jig="" and="" ova-ccdps="" 50="" |xg="" compared="" with="" an="" aluminum="" adjuvant="" group="" can="" significantly="" promote="" ova-specific="" lymphocyte="" proliferation=""><0.05); the="" same="" dose="" of="" wcdps="" there="" was="" no="" statistically="" significant="" difference="" between="" ccdps="" and="" ccdps="" (p="">0.05).

5. Učinek WCDPS in CCDPS na celice CD3 plus CD4 plus T in CD3 plus CD8 plus T: 21 dni po subkutani imunizaciji WCDPS in CCDPS z OVA je bila ekspresija CD4 in CD8 v celicah CD3 plus T odkrita s pretočno citometrijo , kot je prikazano na sliki 4A. Dokazano je, da lahko OVA-WCDPS 50, OVA-CCDPS 50 jig in OVA-WCDPS 100 znatno spodbujajo proliferacijo CD3 plus CD4 plus T celic (P<0.05); as="" shown="" in="" figure="" 4b,="" ova-wcdps="" 10="" a,="" ova-wcdps="" 50="" zhao="" significantly="" promotes="" the="" proliferation="" of="" cd3+cd8+="" t="" cells=""><0.05), ova-wcdps="" 100="" |xg,="" ova-ccdps="" 100="" significantly="" promotes="" the="" proliferation="" of="" cd3+cd8+="" t="" cells=""><0.01); but="" the="" same="" dose="" there="" was="" no="" significant="" difference="" between="" wcdps="" and="" ccdps="" (p="">0.05); there was no significant difference between WCDPS and CCDPS and OVA compared with an aluminum adjuvant group (P>0.05).

Diskusija

Številne študije so pokazale, da ima kitajska zeliščna medicina imunomodulatorno funkcijo "Da], obstaja pa tudi veliko poročil, ki dokazujejo, da se polisaharidi kitajske zeliščne medicine iz cistanche lahko uporabljajo kot adjuvans za izboljšanje imunskega učinka cepiv"3] in puščavsko meso Xinjiang iz Congronga, izbrano v tej študiji, je edinstven zdravilni material v Xinjiangu, divje vrste pa so na robu izumrtja, v kombinaciji z njihovo večjo medicinsko vrednostjo pa je gojenje gojenih vrst še posebej pomembno za razvoj in uporabo virov zdravilnih rastlin . Nova cepiva na trenutnem trgu imajo dobro antigensko specifičnost, vendar slabo imunogenost. Rastlinski polisaharidi iz cistanche lahko nadomestijo to pomanjkanje. moja država ima veliko prednost pri raziskavah kitajske zeliščne medicine. Preverjamo adjuvanse cepiva iz naravnih kitajskih zeliščnih zdravil. Visoka izvedljivost. Študije so pokazale, da imajo kitajski zeliščni polisaharidi iz cistanche različne stopnje regulacije specifične imunosti in nespecifične imunosti, kot so polisaharidi Ganoderme iz cistanche, polisaharidi Radixisatidis iz cistanche, polisaharidi Poria cocos iz cistanche koji, polisaharidi inulina iz cistanche 27] itd. Lahko okrepi imunski učinek cepiva.

Zaradi hitrega povečanja povpraševanja po cistanči so bile njene divje vrste izumrle in so zdaj navedene kot ogrožene in zaščitene rastline v moji državi. Na podlagi uspeha umetne zasaditve puščave Caulis Carlsbad se pričakuje, da bodo gojene vrste nadomestile divje vrste. V tem poskusu smo uporabili divje gojene cistanche in gojene umetne kultivirane polisaharide cistanche kot adjuvanse OVA za izvedbo poskusov imunizacije miši in vivo. S testiranjem različnih indikatorjev je bil sprva ovrednoten imunski učinek divjih in gojenih cistanč, kar je dalo referenco za učinkovito uporabo gojenih cistanč v Xinjiangu.

Da bi razumeli varnost divje rastočih cistanč in gojenih umetno gojenihcistanche saharidiiz cistanche so poskusi imunizacije živali in vivo opazovali značilnosti videza miši in ugotovili, da miši po imunizaciji nimajo driske, pokončne dlake ali solz, njihove aktivnosti in dihanje pa so normalni in ni trzanja mišic. V vsaki skupini ni bilo pomembne razlike v telesni teži miši zaradi pojava motnje, kar kaže, da imunizacija WCDPS in CCDPS nista vplivala na rast miši in imata določeno stopnjo varnosti. Protitelesa IgG in rezultati testa tipizacije kažejo: WCDPS in CCDPS lahko znatno povečata izražanje OVA-specifičnih protiteles IgG po sočasni imunizaciji z OVA, učinek pa je enakovreden aluminijevemu adjuvansu; lahko znatno poveča izražanje OVA-specifičnih protiteles tipa IgG2a in IgGl. Kaže, da polisaharidi iz cistanhe hkrati okrepijo Th1 in Th2 imunski odziv in ni pomembne razlike med WCDPS in CCDPS. Rezultati tipizacije protiteles IgG2a so pokazali, da lahko soimunizacijska skupina WCDPS in CCDPS ter OVA znatno poveča izražanje IgG2a v primerjavi s skupino, ki je prejemala aluminijev adjuvans, aluminijev adjuvans je šibkejši pri spodbujanju izražanja celic T, kar dokazuje, da se uporabljata WCDPS in CCDPS kot adjuvansi Sposobnost spodbujanja celične imunosti je bistveno večja kot pri aluminijevih adjuvansih.

Rezultati detekcije proliferacije limfocitov z metodo MTT so pokazali, da so bile celice vranice miši v vsaki skupini stimulirane z OVA. Indeks stimulacije (SI) proliferacije limfocitov v WCDPS in CCDPS v kombinaciji z OVA je bil znatno višji kot v skupini za imunizacijo samo z OVA. OVA-Indeks stimulacije skupine WCDPS 50 Ah in OVA-CCDPS 50 jig je bil znatno višji kot pri skupini z aluminijevim adjuvansom; kaže, da lahko WCDPS in CCDPS v kombinaciji s skupino OVA znatno povečata proliferacijo limfocitov, specifičnih za OVA, v primerjavi s skupino OVA in skupino z aluminijevim adjuvansom.

Obstajajo različne podskupine limfocitov T. CD3 je površinska molekula vseh limfocitov T. Glede na različne fenotipe jih lahko razdelimo na CD8 plus T celice in CD4 T celice. Molekule CD4 plus lahko nastanejo pod delovanjem molekul MHC fl, ki se po aktivaciji uporabljajo predvsem kot celice pomočnice (Th). Molekule CD8 plus morajo nastati pod delovanjem molekul MHC I. Po aktivaciji postanejo celice ubijalke (TC ali CTL), ki igrajo pomembno vlogo pri imunosti proti virusnim okužbam in imunosti na tumorje. 3". Pretočna citometrija zazna ekspresijo celic CD3PD4 plus T in CD3 plus CD8 plus T, rezultati kažejo, da lahko WCDPS in CCDPS znatno spodbujata proliferacijo celic CD4 plus T in CD8 plus T v določenem razponu odmerkov in ni pomembnega razlika med WCDPS in CCDPS pri istem odmerku.Kombinacija CCDPS in OVA lahko stimulira izražanje celic CD3 plus CD4 plus T in CD3 plus CD8 plus T, oba učinka pa sta enakovredna.

Če povzamemo, sta WCDPS in CCDPS varna kot adjuvansa. Po imunizaciji z OVA lahko hkrati povečajo specifično humoralno imunost in celično imunost. V primerjavi z aluminijevimi adjuvansi imata WCDPS in CCDPS boljše učinke na izboljšanje celične imunosti in ni razlike v učinkih izboljšanja obeh polisaharidov iz cistanche. Ti rezultati raziskav zagotavljajo materialne reference za Xinjiang umetno gojene polisaharide cistanche iz cistanche kot adjuvanse in zagotavljajo materialno osnovo za presejanje varnih in učinkovitih imunskih adjuvansov iz puščave Xinjiangcistanche.

Reference

[1] Zhao X, Sun W, Zhang S et al. Imunski adjuvantni odziv polisaharidov iz Atractylodis macrocephalus Koidz pri piščancih, cepljenih proti atipični kokošji kugi (ND) [J]. Carbohydr Polym, 2016, 190-196. DOI: 10. 1016/j. ogljikovi hidrati pop. 2016. 01.033.

[2]Li J, Wang X, Wang W et al. Vodni izvleček Pleurotus ferulate izboljša zorenje in delovanje dendritičnih celic, pridobljenih iz mišjega kostnega mozga, prek signalne poti TLR4 [J]. Vaccine, 2015, 33(16): 1923-1933. DOI: 10.1016/j. cepivo.2015.02. 063.

[3] Zhao H, Luo Y, Lu C et al. Imunski odziv črevesne sluznice lahko sproži imunomodulacijsko aktivnost polisaharida Ganoderma pri miših [J]. Planta Med, 2010, 76(3): 223-227. DOI: 10. 1055/S-0029-1186055.