Učinkovitost beljenja ginsenozida F1 z zaviranjem prenosa melanina v sokultiviranih človeških melanocitih sekeratinocitih in tridimenzionalnem ekvivalentu človeške kože

Ginsenozidi so glavne aktivne sestavine ginsenga. V fiziologiji kože ginsenozidi vplivajo na uravnavanje pigmenta in izkazujejo aktivnost proti staranju. Po zadnjih poročilih ginsenoside Rg1 poveča melanogenezo in aktivnost tirozinaze v človeških melanocitih [1]. Nasprotno pa poročajo, da ginsenoside F1 (GF1) (sl. 1), metabolit, ki nastane s hidrolizo Rg1, zavira vidno pigmentacijo. Klinična študija Hana in drugih je pokazala učinek beljenja kože GF1 na umetno strojeno človeško kožo, ki ga povzroča proizvodnja interlevkina 13 iz človeških epidermalnih gd T celic [2]. Kim in drugi so pokazali, da GF1 zmanjša izločanje melanina z retrakcijo dendrita brez učinkov na znotrajcelično vsebnost melanina in izražanje tirozinaze v celicah mišjega melanoma B16F10, ki jih stimulira melanocite stimulirajoči hormon (MSH) [3]. Vendar do danes ni bilo pridobljenih nobenih neposrednih ugotovitev o belilnih učinkih GF1 v človeškem epidermalnem okolju, sestavljenem iz melanocitov in keratinocitov v in vitro eksperimentalnem sistemu.

Interpolacija, hkrati smo ugotovili, da obstaja tudi tirozinaza v Cistanche deserticola, in metoda oksidacije hitrosti tirozinaza-dopa je izvedla regulacijske raziskave aktivnosti tirozinaze na ekstraktu feniletanoidnega glikozida v Cistanche deserticola, rezultati kažejo, da: skupni feniletanoid glikozidi Cistanche deserticola. Izvleček lahko znatno zmanjša aktivnost tirozinaze. Feniletanoidni glikozid v Cistanche deserticola lahko tudi učinkovito absorbira ultravijolično sevanje na sončni svetlobi. Molekularna struktura feniletanoidnega glikozida ima več konjugiranih sistemov. Po ultravijoličnem skeniranju je bilo ugotovljeno, da ima močno absorpcijo med 280 nm in 380 nm, največja absorpcijska valovna dolžina pa je 281 nm in 333 nm. , kar kaže, da ima feniletanoidni glikozid Cistanche deserticola dober učinek absorpcije ultravijoličnih žarkov in lahko bolje prepreči in ublaži poškodbe kože zaradi ultravijoličnega sevanja.

Click jing herbs cistanche ekstrakt v prahu izdelek

Slika 1. Učinek GF1 na vsebnost melanina in izražanje tirozinaze v človeških melanocitih. GF1 (10 mM, 50 mM, 100 mM) smo 24 h, 48 h in 72 h obdelovali s celicami MNT-1. (A) Nato smo analizirali vsebnost melanina. (B) Analizirana je bila raven izražanja tirozinaze. Poleg tega je bil GF1 (10, 50, 100 uM) obdelan z a-MSH (500 nM) stimuliranimi MNT-1 celicami 48 ur in 72 ur. (C) Nato smo analizirali vsebnost melanina. (D) Analizirana je bila raven izražanja tirozinaze. Zdravili smo primarne normalne človeške epidermalne melanocite (NHEM) z GF1 (50 mM in 100 mM) v prisotnosti ali odsotnosti a-MSH stimulacije 48 ur. (E) Nato smo analizirali vsebnost melanina. (F) Analizirana je bila raven izražanja tirozinaze. Celice MNT-1 smo 48 ur obdelali z GF1 (50 mM in 100 mM) v gojišču, ki je vsebovalo 100 mM ali 500 mM L-tirozina. (G) Nato smo analizirali vsebnost melanina. GADPH, gliceraldehid 3-fosfat dehidrogenaza; GF1, ginsenozid F1.

Tukaj smo raziskali antimelanogene učinke GF1 na kokulturne celice MNT-1/HaCaT in tridimenzionalni (3-D) ekvivalent človeške kože. Poleg tega smo se osredotočili na nastanek dendritov v melanocitih in prenos melanosomov v keratinocite po zdravljenju z GF1. Naše ugotovitve skupaj prvič kažejo, da je GF1 pokazal učinke beljenja v človeški povrhnjici, ki je obstajala skupaj z melanociti in keratinociti.

Za to študijo so celice MNT-1 gojili v minimalnem esencialnem mediju (MEM), ki je vseboval 20 odstotkov fetalnega govejega seruma (FBS), 1 odstotek gentamicina in 20 mM hidroksietil piperazinetansulfonske kisline (HEPES). Celice HaCaT smo gojili v dulbeccovem modificiranem orlovem mediju (DMEM), ki je vseboval 10 odstotkov FBS, 1 odstotek gentamicina in 20 mM HEPES. Normalni človeški epidermalni melanociti (NHEM) so bili kupljeni pri (Lonza, Basel, Švica) in gojeni v mediju za rast melanocitov-4 (MGM-4). Celice smo inkubirali pri 37 °C v atmosferi s 5 odstotki CO2.

Za merjenje vsebnosti melanina smo celice (2 105) gojili v 6-plošči z vdolbinicami 24 ur. Celice smo obdelali z navedenimi koncentracijami GF1. Nato celice dvakrat speremo s fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom (PBS) in nato odstranimo s tripsinom/EDTA. Celice smo lizirali z inkubacijo v 200 mL 1 N NaOH pri 80 °C 2 uri. Celične lizate smo prenesli na 96-ploščo z vdolbinicami in izmerili absorbanco pri 405 nm.

Za izvedbo Western blottinga smo celice dvakrat sprali s hladnim PBS in nato lizirali v ledeno mrzlem pufru za modificiran radioimunoprecipitacijski test (RIPA) (50 mM Tris-HCl, pH 7,4, 1 odstotek Nonidet P-40 , 0.5 odstotkov natrijevega deoksiholata, 150 mM NaCl), ki vsebuje inhibitorje proteaze in koktajl zaviralca fosfataze (Calbiochem, San Diego, CA, ZDA). Proteine ​​smo ločili z elektroforezo v natrijevem dodecil sulfatu in poliakrilamidnem gelu (SDS-PAGE) in prenesli na nitrocelulozne membrane. Membrane smo 24 ur inkubirali s primarnimi protitelesi pri 4 °C, nato sprali s tris-pufrano fiziološko raztopino, vključno z 0,1-odstotnim Tween-20, izpostavili sekundarnim protitelesom, konjugiranim s peroksidazo, 1 uro pri sobni temperaturi, sprali in nato vizualizirali z uporabo slikovnega sistema Odyssey.

Za analizo prenosa melanosoma smo celice MNT{{0}}/HaCaT gojili v 12-plošči z vdolbinicami v razmerju 1 proti 10 24 ur, nato pa GF1 je bil zdravljen z navedeno koncentracijo. Celice smo dvakrat sprali s hladnim PBS in fiksirali s 3, 5-odstotnim paraformaldehidom 10 minut. Celice smo sprali in 10 minut obdelali z 0,1-odstotnim Triton X-100 in nato 1 uro z 0,5-odstotnim govejim serumskim albuminom (BSA). Protitelesa proti tirozinazi sorodnemu proteinu 1 (1:200, rdeče) in citokeratinu-18 (1:200, zeleno) so bila uporabljena za detekcijo melanocitov in keratinocitov.

Model kožnega tkiva MelanoDerm (TM) je rekonstituiran {{0}}D ekvivalent človeške kože, ki vsebuje normalne melanocite in keratinocite (MatTek Corp., Ashland, MA). Uporabili smo MelanoDerm TM (MEL-300-A), ki izhaja iz azijskih darovalcev. Vzdrževali so jih v novem vzdrževalnem mediju-113, kot je priporočil proizvajalec. GF1 smo nanesli na MelanoDerm TM na dneve 0, 4, 6, 8, 11, 13 in 15. Pred obdelavo z GF1 smo tkiva sprali z 1 ml PBS, da smo odstranili vse ostanke spojine. Tkiva so bila fiksirana 18. dan za histološko analizo. Histološko vrednotenje je bilo izvedeno pod svetlobnim mikroskopom (Bx-41; Olympus, Tokio, Japonska), fotomikrografije pa so bile posnete z digitalnim fotoaparatom (DP72; Olympus). Melanoderm je bil za barvanje fiksiran v 4-odstotni pufrirani raztopini formaldehida. Vzorci so bili vstavljeni v parafinski vosek, razrezani na debelino 3 mm in obarvani s hematoksilinom in eozinom ter raztopino za barvanje Fontana in Mason. Vsi podatki so izraženi kot srednje vrednosti SD (standardni odklon), za statistične primerjave pa je bil uporabljen Studentov t-test. P-vrednost < 0,05 je veljala za statistično pomembno (posamezne p-vrednosti so podane v legendah slik).

Da bi ugotovili učinek GF1 na človeške melanocite, smo visoko pigmentirane celice človeškega melanoma (MNT-1) zdravili z GF1 24, 48 in 72 ur, čemur je sledila analiza znotrajcelične vsebnosti melanina in izražanja proteina tirozinaze . Kot je prikazano na sliki 1A, GF1 ni imel inhibitornega učinka na vsebnost melanina v območju koncentracije 10-100 mM. Poleg tega GF1 ni zmanjšal izražanja tirozinaze v celicah MNT-1 (sl. 1B, ssl. 2A). Zdravljenje celic MNT-1, stimuliranih z a-MSH, z GF1 48 in 72 ur ni povzročilo supresije vsebnosti melanina (slika 1C) ali ekspresije tirozinaze (slika 1D, sslika 2B). Za nadaljnjo potrditev učinka GF1 na človeške melanocite smo primarni NHEM zdravili z GF1 v prisotnosti ali odsotnosti stimulacije a-MSH 48 ur. Podobno kot podatki, pridobljeni s celicami MNT-1, GF1 ni vplival na vsebnost melanina (slika 1E) ali izražanje tirozinaze (slika 1F, sslika 2C) v NHEM. Končno smo ocenili, ali raven L-tirozina v gojišču vpliva na aktivnost GF1, ker je L-tirozin substrat tirozinaze za sintezo melanina. V skladu s tem so bile celice MNT-1 obdelane z GF1 48 ur v gojišču, ki je vsebovalo 100 mM ali 500 mM L-tirozina. Kot je prikazano na sliki 1G, GF1 ni zaviral vsebnosti melanina v celicah MNT-1, ne glede na koncentracijo L-tirozina.

Slika 2. Učinek GF1 na tvorbo dendritov in prenos melanosoma v MNT-1/HaCaTcokulturiranih celicah in 3-D ekvivalent človeške kože. Sokultivirane celice MNT-1/HaCaT so bile obdelane z 100 mM GF1 v prisotnosti ali odsotnosti stimulacije z a-MSH (500 nM) 48 ur. (A) Po fiksaciji smo opazovali tvorbo dendritov v melanocitih z optično mikroskopijo (lestvica; 50 mm). (B) Za imunsko barvanje smo melanosome obarvali s protitelesom TRP-1 (rdeča barva) in keratinocite s citokeratinom-18 (zelena barva). Bele puščice označujejo preneseni melanosom v HaCaT iz celic MNT-1 (lestvica; 20 mm). Ekvivalent človeške kože (MelanoDerm; n=3) je bil 18 dni obdelan z 1-odstotno kojično kislino kot referenčno belilno spojino in GF1 (10 in 50 ug/ml). (C) Po zdravljenju so bili fotografirani ekvivalenti kože. (D) Za vsak preskusni vzorec je bila izračunana vrednost 6 L (stopnja svetlobe v primerjavi s kontrolo, tretirano z nosilcem). (E) Barvanje delov tkiva s hematoksilinom in eozinom (H&E). (F) Fontana-Mason (F&M) barvanje delov tkiva. Predmetna stekelca smo fiksirali v raztopini formaldehida in vdelali v parafinski vosek za barvanje (lestvica; 50 mm). Črne puščice označujejo preneseni melanosom iz melanocitov v bazalni plasti v keratinocite v zgornji plasti. Modre puščice označujejo melanocite, ki tvorijo razširjene dendrite. (*p < 0,05, **p < 0,01, *p < 0,001). CON, nadzor; GF1, ginsenozid F1; KA, Kojična kislina.

Po ugotovitvi, da GF1 nima antimelanogenega učinka v monokulturnih človeških melanocitih, smo nadalje analizirali, ali GF1 vpliva na sintezo melanina v melanocitih v eksperimentalnem sistemu, ki vsebuje tako keratinocite kot melanocite z možnostjo celične komunikacije. Celice MNT-1 in HaCaT (ovekovečene normalne celične linije keratinocitov) so bile sokultivirane s 100 mM GF1 v prisotnosti ali odsotnosti UV-B obsevanja. Po 48 urah (sl. 3A) ali 72 urah (sl. 3B) smo ocenili vsebnost melanina iz izoliranega MNT-1 in sokultiviranih celic. Naši podatki so pokazali, da GF1 ne zavira sinteze melanina v izoliranih MNT-1 in sokultiviranih celičnih skupinah.

Poleg sinteze melanina smo se osredotočili na zaviralno učinkovitost GF1 na prenos melanosoma iz melanocitov v keratinocite. Natančneje, kokultivirane celice MNT-1/HaCaT smo obdelali s 100 mM GF1 v prisotnosti ali odsotnosti stimulacije a-MSH (slika 2A), čemur je sledil pregled tvorbe dendritov v melanocitih, ki je potreben za prenos melanosoma . Zanimivo je, da so bili raztegnjeni dendriti, ki jih povzroči aMSH, umaknjeni po zdravljenju z GF1. Nato smo obarvali TRP-1-pozitivne melanosome (rdeče) za celice MNT1 in citokeratin-18 (zeleno) za celice HaCaT v kokulturah. Kot je prikazano na sliki 2B, so bili TRP-1-pozitivni melanosomi v celicah MNT-1 preneseni v celice HaCaT po stimulaciji z a-MSH, ki jo je bistveno inhibiral GF1. Ti rezultati kažejo, da GF1 zavira prenos melanosoma, kar povzroča retrakcijo dendrita melanocitov.

Da bi to raziskavo razširili na bolj fiziološki sistem, smo preučili belilno sposobnost GF1 v 3-D ekvivalentu človeške kože, ki je epidermalna plast, sestavljena iz melanocitov in keratinocitov. Na sliki 2C je bilo tkivo, obdelano z GF1-, videti svetlejše od kontrolnega tkiva in vrednost L (indeks svetlobe/temnosti) je bila spremenjena po zdravljenju z GF1 (slika 2D). Poleg tega obarvanje delov tkiva s hematoksilinom in eozinom ni razkrilo kolapsa ali toksičnosti tkiva (slika 2E). Poskusi obarvanja po Fontani in Masonu so pokazali, da GF1 zavira tvorbo dendritov melanocitov v bazalni plasti in hkrati zavira prenos melanosoma iz melanocitov bazalne plasti v keratinocite diferencirane zgornje plasti (slika 2F). Te ugotovitve skupaj podpirajo zaviralno učinkovitost GF1 pri prenosu melanosoma, kar vodi do spodbujanja beljenja v modelu tkiva človeške kože.

V tej študiji GF1 ni zaviral sinteze melanina in izražanja tirozinaze; namesto tega je GF1 nekoliko povečal znotrajcelično vsebnost melanina in izražanje tirozinaze v celicah MNT-1 in sokultiviranih celicah (sl. 1A in 1B ter ssl. 3A). Vendar pa smo hkrati ugotovili, da GF1 zavira prenos melanosoma z zmanjšano tvorbo dendritov melanocitov. Sumimo, da bi povečano vsebnost znotrajceličnega melanina z GF1 lahko povzročilo kopičenje melanosoma zaradi blokade prenosa melanosoma in indukcije izražanja tirozinaze. Vidna pigmentacija kože je določena s količino disperzije melanosomov iz različnih območij razširjenih dendritov melanocitov v okoliške keratinocite [4]. Več spojin, kot sta centaureidin in metilofiopogonanon B, je pokazalo učinkovitost beljenja, kar je povzročilo umik dendrita melanocitov brez vpliva na ekspresijo melanogenih encimov ali sintezo melanina [5]. Zato se blokada prenosa melanosoma v keratinocite iz melanocitov šteje za učinkovit pristop za indukcijo učinka beljenja, čeprav biosinteza melanina ni zavirana. Zato smo menili, da povečana vsebnost melanina z GF1 malo vpliva na učinkovitost beljenja GF1. Poleg tega bi se nakopičeni melanosomi razgradili z avtofagijo za homeostazo kože, čeprav usoda melanosomov ni jasna [6].

Prvič smo dokazali, da GF1 zavira tvorbo dendritov, ki jo povzroči a-MSH, kar ima za posledico inhibicijo prenosa melanosoma v keratinocite v kokulturah človeških celic. Poleg tega je GF1 motil prenos melanina iz melanocitov v bazalni plasti v keratinocite v zgornji plasti, kar je povzročilo belilni učinek v ekvivalentu človeške kože. Nedavni poskusi kokulture kažejo, da melanociti prenašajo pigment v keratinocite s spremembami morfologije dendritov, kot je dezorganizacija mikrofilamentov b-tubulina v znotrajceličnem citoskeletu [7,8]. Ciklični adenozin monofosfat, induktor melanogeneze, posreduje nastajanje dendritov s povečano regulacijo Rac in znižano regulacijo aktivnosti Rho [9, 10]. Zato se bodo prihodnje študije naše skupine osredotočile na celovito oceno ciljnih proteinov GF1, kot so molekule, vključene v signalno pot cikličnega adenozin monofosfata.

Skupaj naši rezultati zagotavljajo predhodne dokaze, da ima GF1 potencial za razvoj kot učinkovitega belilnega reagenta za zdravljenje pigmentnih motenj in posvetlitev temne barve kože kot kozmetične sestavine.

Nasprotja interesov

Vsi sodelujoči avtorji izjavljajo, da ni navzkrižja interesov.

Zahvala

To raziskavo je podprl in financiral Center za raziskave in razvoj Amorepacific.

Reference

[1] Lin M, Zhang BX, Zhang C, Shen N, Zhang YY, Wang AX, Tu CX. Ginsenozida Rb1 in Rg1 stimulirata melanogenezo v človeških epidermalnih melanocitih preko PKA/CREB/MITF signalizacije. Evid. Temelji. Dopolnjujejo. Alternat Med 2014; 2014: 892073

[2] Han J, Lee E, Kim E, Yeom MH, Kwon O, Yoon TH, Lee TR, Kim K. Vloga interlevkina 13, pridobljenega iz celic epidermalnega gd T, pri učinku beljenja kože ginsenozida F1. Exp Dermatol 2014;23:860e2.

[3] Kim JH, Baek EJ, Lee EJ, Yeom MH, Park JS, Lee KW, Kang NJ. Ginsenoside F1 oslabi hiperpigmentacijo v celicah melanoma B16F10 z induciranjem retrakcije dendrita in aktiviranjem Rho signalizacije. Exp Dermatol 2015; 24: 150e2.

[4] Ando H, Niki Y, Ito M, Akiyama K, Matsui MS, Yarosh DB, Ichihashi MJ. Melanosomi se prenesejo iz melanocitov v keratinocite s procesi pakiranja, sproščanja, privzema in disperzije. Invest Dermatol 2012; 132: 1222e9.

[5] Ebanks JP, Wickett RR, Boissy RE. Mehanizmi, ki uravnavajo pigmentacijo kože: povečanje in zmanjšanje obarvanosti polti. Int J Mol Sci 2009;10:4066e87.

[6] Katsuyama Y, Taira N, Yoshioka M, Okano Y, Masaki H. Motnje transporta melanosomov v melanocitih, zdravljenih s teofilinom, povzročijo njihovo razgradnjo z avtofagijo. Biochem Biophys Res Commun 2017; 485: 126e30.

[7] Ni J, Wang N, Gao L, Li L, Zheng S, Liu Y, Ozukum M, Nikiforova A, Zhao G, Song Z. Učinek od receptorja NMDA odvisne signalne poti na celično morfologijo in prenos melanosoma v melanociti. J Dermatol Sci 2016; 84: 296e304.

[8] Scott G. Rac in rho: zgodba o nastanku melanocitnega dendrita. Pigment Cell Res 2002; 15: 322e30

[9] Scott G, Leopardi S. Signalna pot cAMP ima nasprotne učinke na Rac in Rho v celicah B16F10: posledice za tvorbo dendritov v melanocitnih celicah. Pigment Cell Res 2003; 16: 139e48.

[10] Ma HJ, Ma HY, Yang Y, Li PC, Zi SX, Jia CY, Chen R. a-Melanocite stimulirajoči hormon (MSH) in prostaglandin E2 (PGE2) poganjata prenos melanosoma s spodbujanjem dostave filopodij in izločanja sferoidnih zrnc: dokazi iz opazovanja z mikroskopom na atomsko silo. J Dermatol Sci 2014; 76: 222e30.

Chang-Seok Lee 1,3, Gibaeg Nam 1, Il-Hong Bae 1, Junseong Park 1,2,*

1 Center za raziskave in razvoj Amorepacific CO, Yongin-si, Republika Koreja

2 Oddelek za inženirsko kemijo, Narodna univerza Chungbuk, Cheongju-si, Chungbuk, Republika Koreja

3 Oddelek za lepoto in kozmetične znanosti, Fakulteta za zdravstvene vede, Univerza Eulji, Seongnam-si, Republika Koreja

For more information:1950477648nn@gmail.com