Primerjalna študija lastnosti in mehanizma proti staranju: resveratrol in kalorična restrikcija

POVZETEK

Resveratrol in omejevanje kalorij (CR) sta močni terapevtski možnosti zaproti staranju. Tukaj je njihov primerjalni učinek naz dolgoživostjo povezan genregulator utišanja informacij (SIRT1) je bil ocenjen in vitro in in vivo. Celice IMR-90, obdelane z 2,2'-azobis (2-amidinopropan) dihidrokloridom (AAPH), so bile uporabljene za vzpostavitev modela celičnega staranja, podgane pa so bile zdravljene z D-galaktozo (D-gal). kotstarajoči se živalski model. Resveratrol in CR sta bila podobnadejavnosti proti staranju, kar dokazujezaviranje staranja in apoptoze ter obnavljanje kognitivnih motenj in oksidativnih poškodb. Poleg tega bi lahkouravnavanje telomeraze(TE) dejavnost,poveča izražanje SIRT1, forkhead box 3a (Foxo3a), aktivni regulator SIRT1 (AROS) in Hu antigena R (HuR), vendar zmanjša p53 in se izbriše pri raku dojke 1 (DBC1). Vendar pa sta 10 μM resveratrola in vitro in skupina z velikimi odmerki in vivo pokazalarelativno močnejše aktivnosti proti staranju in spodbujanje ravni SIRT1 kot CR. V zaključku, resveratrol in CR sta pokazala podobnodejavnosti proti staranjupri signalizaciji SIRT1,implicira potencial resveratrola kot mimetika CR.

Kliknite tukaj, če želite izvedeti zeliščno zdravljenje Cistanche za preprečevanje staranja

UVOD

Izboljšave zdravstvene oskrbe so v zadnjih desetletjih pripomogle k podaljšanju pričakovane življenjske dobe ljudi, zato se starostna populacija močno povečuje. Na žalost to še vedno pomeni podaljševanje obdobij slabega zdravja ali invalidnosti. Trenutno se različne bolezni, povezane s staranjem, pojavljajo kot največja grožnja zdravju v večini razvitih držav. Čeprav še ni mogoče spremeniti našega genetskega ozadja, se trenutno pojavljajo različne strategije proti staranju kot zdravi življenjski slogi in terapevtski posegi, katerih cilj je zmanjšati pojavnost dejavnikov tveganja za slabo zdravje [1].

CR, zmanjšan vnos kalorij brez podhranjenosti, je eden najmočnejših posegov, ki podaljša življenjsko dobo v modelnih organizmih od kvasovk do primatov [2]. Lahko bi zaščitil pred poslabšanjem bioloških funkcij, zmanjšal pojavnost in odložil pojav več bolezni, povezanih s staranjem. Mehanizem, s katerim CR podaljša življenjsko dobo, vključuje upočasnitev rasti, zmanjšanje telesne maščobe, upočasnitev nevroendokrinih ali imunoloških sprememb, povečanje zmogljivosti popravljanja DNA, spremenjeno izražanje genov, povečano apoptozo, znižanje telesne temperature in depresijo metabolizma ter izboljšanje oksidativne stres [3]. Učinek CR proti staranju je bil močno povezan s povečano ravnjo in aktivacijo članov družine sirtuinov, povezan pa je tudi z drugimi molekularnimi signalnimi potmi, vključno s koaktivatorjem receptorja G, ki ga aktivira peroksisomski proliferator- 1 (PGC{{ 6}}), z adenozin monofosfatom aktivirano proteinsko kinazo (AMPK), inzulin/inzulinski rastni faktor-1 in tarča rapamicina [1, 4]. Vendar se večina ljudi ne bi držala tako rigoroznega prehranskega programa, zlasti dolgoročno. Zato so nedavne raziskave vedno bolj usmerjene v ugotavljanje izvedljivosti in učinkovitosti naravnih in/ali farmakoloških CR mimetičnih molekul/zdravljenj brez zmanjšanja porabe hrane [5].

Resveratrol je rastlinski polifenol, ki ga običajno najdemo v različnih rastlinah, vključno z lupino grozdja, jagodičja in arašidov. Zanimivo je, da je vključitev resveratrola v prehranska dopolnila ali živila lahko močna terapevtska možnost za preprečevanje staranja in več poročil kaže, da ima zdravljenje z resveratrolom ugodne učinke, podobne tistim pri CR [6], kar kaže na potencial resveratrola kot mimetika CR. [4]. Nedavno je bilo dokazano, da resveratrol podaljša življenjsko dobo z znatno povečano aktivnostjo SIRT1, kar ima za posledico povečanje afinitete SIRT1 za NAD plus in acetilirani substrat [7, 8], ki je tudi odgovoren za dolgoživost, ki jo povzroča CR. Čeprav sta bila resveratrol in CR obsežno raziskana glede njunih potencialnih koristi za zdravje, je malo znanega o njunih primerjalnih učinkih. V tej študiji smo primerjali učinek resveratrola in CR proti staranju in vivo in in vitro z odkrivanjem poti SIRT1.

REZULTATI

Resveratrol in CR sta zmanjšala s staranjem povezano obarvanje -galaktozidaze (SA-gal) v celicah IMR-90, zdravljenih z AAPH

Z izkoriščanjem modela staranja celic IMR-90, ki ga povzroča AAPH, smo testirali možen učinek na obarvanje SA- -gal. Kot je prikazano na sliki 1, so celice, obdelane z AAPH, pokazale širše in močno pozitivno obarvanje kot v kontrolnih celicah, pozitivno obarvanje v kontrolnih celicah pa je bilo razmeroma malo. Ugotovljeno je bilo, da zdravljenje z resveratrolom (5 μM, 10 μM in 20 μM) ali CR zagotavlja izrazito zaščito pri staranju, ki ga povzroča AAPH. Poleg tega so pri primerjavi učinka resveratrola s CR celice, obdelane z 10 μM resveratrola, pokazale razmeroma manj pogosto pozitivno obarvanje SA- -Gal kot zdravljenje s CR. Tako ti rezultati kažejo, da 10 μM resveratrola učinkoviteje zavira staranje, ki ga povzroča AAPH, kot CR.

Analiza celic IMR- 90 z vrstično elektronsko mikroskopijo

Preiskava z vrstično elektronsko mikroskopijo je zagotovila nekaj novih podrobnosti o strukturi celic, obdelanih z AAPH (slika 2). Normalni IMR-90 je bil videti kot popolnoma razširjene celice s tipično fuziformno obliko. Večina celic je vsebovala dva zožena procesa in nekaj mehurčkov. Celice, obdelane z AAPH, so pokazale povečano in sploščeno morfologijo s številnimi mehurčki. Nasprotno pa je opazovanje vzorcev IMR-90 z vrstično elektronsko mikroskopijo, obdelanih z resveratrolom ali CR po dajanju AAPH, jasno pokazalo, da je bila, čeprav je bilo mogoče zaznati nekaj mehurčkov, normalna fusiformna oblika na splošno ohranjena skupaj s popolnoma razširjenimi.

Resveratrol in CR sta zmanjšala apoptozo v celicah IMR-90, zdravljenih z AAPH

Fosfatidilserin na površini celic, ki velja za znak apoptoze v zgodnji fazi, je bil določen s testom obarvanja PI/Aneksina V (slika 3). Apoptotične celice so sestavljene iz zgodnjih apoptotičnih celic, obarvanih z aneksinom-V-FITC, in poznih apoptotičnih ali nekrotičnih celic, obarvanih z aneksinom-V-FITC in PI. Populacija apoptotičnih celic se je znatno povečala v skupini AAPH (34,54 odstotka) v primerjavi z negativno skupino (7,32 odstotka). Medtem ko je bilo ugotovljeno, da resveratrol (5 μM, 10 μM in 20 μM) ali zdravljenje s CR zmanjša apoptozo v celicah IMR-90, ki jih povzroči AAPH. Poleg tega je zdravljenje z 10 μM resveratrola (11,58 odstotka) učinkoviteje zmanjšalo apoptozo, ki jo povzroči AAPH, kot zdravljenje s CR (16,78 odstotka).

Sprememba splošnega videza in telesne teže

Med celotnim postopkom poskusa so starajoče se modelne podgane prejemale D-gal v odmerku 200 mg/kg vsak dan in opazovali so splošni videz. V primerjavi z normalnimi kontrolnimi podganami so podgane v modelni skupini D-gal postopoma postale apatične, dolgočasne in počasne v odzivu; lasje modelske skupine so postopoma izgubili elastičnost in postali krhki; koža je postala tanka, neelastična in postopoma povešena. Vendar pa je sočasno zdravljenje z resveratrolom ali CR z D-gal pri podganah pokazalo preobrat zgoraj navedenih sprememb v primerjavi s skupino z D-gal. V obdobju zdravljenja med poskusnimi skupinami ni bilo razlik v telesni teži, razen pri skupini CR, kjer se med poskusom teža skoraj ni povečala (slika 4).

Resveratrol in CR sta izboljšala prostorsko učenje in spomin SD podgan

Zmožnosti prostorskega učenja in spomina podgan smo ocenili z izvedbo Morrisovega testa vodnega labirinta. Kot je prikazano na sliki 5, se je vseh pet skupin uspešno naučilo naloge, kar dokazujeta postopno zmanjšana zakasnitev pobega in povečana hitrost plavanja v 4-dnevni fazi navigacije po kraju. Pri analizi z dvosmerno metodo ANOVA so se pokazale pomembne razlike tako v srednji zakasnitvi pobega kot v hitrosti plavanja med dnevi treninga (F(3,138)=41.660, P < 0. 01; F(3,138)=10.013, P < 0.01, oziroma med obravnavanji (F(4,46) )=36.762, P < {{40}}.01; F(4,46)=20.102, P < 0,01, v tem zaporedju), vendar ni interakcije med faktorjema dan in zdravljenjem (F(12.138)=0.846, P > 0,05; F(12.138)=1.084, P > 0.05, v tem zaporedju). Zakasnitev pobega v skupini z D-gal je bila opazno daljša od tiste v kontrolni skupini (P <0,01) (Post-hoc analiza, slika 5A). Medtem so podgane v skupini z resveratrolom in D-gal ali skupino CR in D-gal pokazale preobrat prej omenjenih sprememb v latenci pobega v primerjavi s skupino z D-gal (P <0,01) (slika 5A) in opazno skrajšale pobeg zakasnitev na podobne ravni kot pri kontrolni skupini. Podobni rezultati so bili pridobljeni za hitrost plavanja podgan (slika 5B) in podgane v skupini z resveratrolom in D-gal ter skupini CR in D-gal so pokazale izjemno povečanje hitrosti plavanja v primerjavi s skupino z D-gal (P <0,01 ). Vendar so podgane v skupini z visokim odmerkom resveratrola in D-gal pokazale relativno daljšo latenco pobega in nižjo hitrost plavanja v primerjavi s skupino s CR in D-gal.

Slika 1: Resveratrol in kalorična omejitev zmanjšata obarvanje SA- -gal v celicah IMR-90, zdravljenih z AAPH. Celice IMR- 90, ki jih povzroča AAPH, smo 2 dni zdravili z omejitvijo kalorij (CR) ali resveratrolom (RES) pri navedeni koncentraciji. Povečava je bila 20×.

Slika 2: Analiza celic IMR-90 z vrstično elektronsko mikroskopijo. Celice IMR-90, ki jih povzroča AAPH, so bile 2 dni obdelane s kalorično omejitvijo (CR) ali resveratrolom (RES) pri navedeni koncentraciji. Povečava je bila 6000×.

Slika 3: Resveratrol (RES) in kalorična restrikcija (CR) sta zmanjšala apoptozo v celicah IMR-90, zdravljenih z AAPH. Celice smo obarvali z aneksinom V-FITC/PI in analizirali s pretočno citometrijo. Kanal FL1 je bil uporabljen za odkrivanje obarvanja z aneksinom-V-FITC, kanal FL2 pa za obarvanje s PI

V fazi prostorske sonde (sliki 5C in 5D) je bilo mogoče videti, da je prišlo do izjemnega zmanjšanja prehodov peronov v skupini D-gal v primerjavi s tisto v kontrolni skupini (P < 0.{{6} }1). Zanimivo je, da se je povprečno število, kolikokrat so podgane prečkale platformo, znatno izboljšalo po dajanju resveratrola ali CR v primerjavi s skupino, ki je prejemala D-gal (P <0,01). Vendar so podgane, ki so prejemale visoke odmerke resveratrola in skupine D-gal, pogosteje prečkale platformo kot tiste v skupini, ki je prejemala CR in D-gal.

Ti rezultati so pokazali, da so imele starajoče se modelne podgane motnje pri prostorskem učenju in spominu, medtem ko bi zdravljenje z resveratrolom ali CR lahko obnovilo s starostjo povezano kognitivno okvaro, ki jo je povzročilo dajanje D-gal. Poleg tega so se starajoče modelne podgane, zdravljene z visokim odmerkom resveratrola, izkazale za razmeroma bolj učinkovite pri obnašanju kot tiste, zdravljene s CR.

Vpliv resveratrola in CR na ravni SOD, T-AOC, MDA in lipofuscina pri starajočih se podganah

Vrednosti SOD, T-AOC, MDA in lipofuscina pri podganah so bile ovrednotene, da bi potrdili, ali so učinki resveratrola in CR proti staranju posredovani z ublažitvijo oksidativnega stresa, ki ga povzroča dajanje D-gal. Tabela 1 prikazuje ravni SOD, T-AOC in MDA v serumu, jetrih in možganih pri normalnih in starajočih se podganah. Izpostavljenost D-gal je bistveno znižala ravni SOD in T-AOC, vendar je povečala raven MDA v serumu, jetrih in možganih v primerjavi s kontrolno skupino (P < 0.05). Sočasno zdravljenje z resveratrolom ali CR z D-gal pri podganah je povzročilo zmanjšanje aktivnosti ravni MDA, vendar je povečalo ravni SOD in T-AOC v primerjavi s skupino D-gal. Vendar pa so rezultati v primerjavi z zdravljenjem s CR pokazali, da je dajanje visokih odmerkov resveratrola relativno boljše.

Slika 4: Učinek resveratrola in kalorične restrikcije na telesno težo podgan, zdravljenih z D-gal med poskusom. Vse vrednosti so bile izražene kot srednje vrednosti ± SD. NG, negativna kontrolna skupina; MG, skupina za nadzor modela; RESL, skupina nizkih odmerkov resveratrola; RESH, skupina visokih odmerkov resveratrola; CR, kalorična restrikcijska skupina.

Slika 5: Vpliv resveratrola in kalorične restrikcije na vedenje podgan, zdravljenih z D-gal, z Morrisovim vodnim labirintom. (A) Primerjava zakasnitev do platforme med 4 dnevi usposabljanja. Vsaka miška je bila izpostavljena 4 poskusom na dan. (B) Primerjava hitrosti plavanja v 4 dneh treninga. (C) Primerjava števila prehodnih ploščadi, kjer je bila ploščad odstranjena za sondiranje. (D) Tipična plavalna steza v poskusu s sondo. Vse vrednosti so bile izražene kot srednje vrednosti ± SD. * P < 0.05, **P < {{10}}.01 v primerjavi z negativno kontrolno skupino; # P < 0,05, ## P < 0,01 v primerjavi s kontrolno skupino modela. NG, negativna kontrolna skupina; MG, skupina za nadzor modela; RESL, skupina nizkih odmerkov resveratrola; RESH, skupina visokih odmerkov resveratrola; CR, kalorična restrikcijska skupina.

Tabela 1: Stanje antioksidantov v tkivih in krvi podgan v vsaki skupini

Opomba: Vrednosti so bile povprečje ± SD. * P < {{0}}.05, **P < 0.01 v primerjavi s kontrolno skupino (vse skupine); # P < 0.05, ##P < 0,01 v primerjavi z modelno skupino (skupina CR in skupina RES); ∆P < 0,05, ∆∆P < 0,01 v primerjavi s skupino CR (skupina RES). NG, negativna kontrolna skupina; MG, skupina za nadzor modela; RESL, skupina nizkih odmerkov resveratrola; RESH, skupina visokih odmerkov resveratrola; CR, kalorična restrikcijska skupina.

je relativno boljši. Kopičenje lipofuscina je ena najbolj doslednih značilnosti staranja možganov. Kot je prikazano na sliki 6, so podgane, zdravljene z D-gal, pokazale znatno povečanje ravni lipofuscina v primerjavi s kontrolno skupino (P < 0.01). Vendar sta zdravljenje z resveratrolom in CR zmanjšala kopičenje lipofuscina v možganski skorji starajočih se podgan v primerjavi s podganami, zdravljenimi z D-gal (P < 0,01). Poleg tega ni bilo razlik med skupino resveratrol plus D-gal in skupino CR plus D-gal (P > 0,05).

Resveratrol in CR sta povečali aktivnost telomeraze pri starajočih se podganah

Ocenili smo učinek resveratrola in CR na aktivnost telomeraze v jetrih in možganskih tkivih (slika 7). Naši rezultati so pokazali, da zdravljenje ni pomembno vplivalo na aktivnost telomeraze v jetrnih tkivih (P > 0.05). Vendar je bila aktivnost telomeraze zmanjšana v skupini, ki je prejemala D-gal, v primerjavi s kontrolo (P < 0,05). Medtem bi lahko resveratrol ali CR dvignil aktivnost telomeraze v skupini, ki je prejemala D-gal in resveratrol ali CR. Poleg tega ni bilo razlik med skupino z resveratrolom in skupino CR (P > 0,05).

Slika 6: Vpliv resveratrola in kalorične restrikcije na raven lipofuscina pri starajočih se podganah. Vse vrednosti so bile izražene kot srednje vrednosti ± SD. * P < 0.05 v primerjavi z negativno kontrolno skupino; # P <0,05 v primerjavi s kontrolno skupino modela. NG, negativna kontrolna skupina; MG, skupina za nadzor modela; RESL, skupina nizkih odmerkov resveratrola; RESH, skupina visokih odmerkov resveratrola; CR, kalorična restrikcijska skupina.

Resveratrol in CR sta povečala ekspresijo mRNA SIRT1, ki jo povzroča AAPH. Da bi raziskali vlogo SIRT1 pri učinkih zdravljenja z resveratrolom in CR, so ravni ekspresije mRNA SIRT1 v celicah in tkivih IMR-90 pregledali s kvantitativnim RT- PCR. Rezultati so pokazali, da je AAPH znatno zmanjšal izražanje mRNA SIRT1 v celicah IMR-90. Resveratrol in CR bi lahko učinkovito obnovila nivoje izražanja mRNA SIRT1 v celicah, obdelanih z AAPH, in 10 μM resveratrola je bila optimalna koncentracija za spodbujanje izražanja mRNA SIRT1 v celicah IMR-90 (P <0,01; slika 8)