Izrazita porazdelitev faktorja, ki ga povzroča hipoksija-1, v kultiviranih ledvičnih tubularnih celicah s hipoperfuzijo, simulirano z namestitvijo pokrovnega stekla

Kontakt: Audrey Hu Whatsapp/hp: 0086 13880143964 E-pošta:audrey.hu@wecistanche.com

Tomoko Honda¹| Yosuke Hirakawa¹ | Kiichi Mizukami²| Tošitada Jošihara²| Tetsuhiro Tanaka¹| Seiji Tobita²| Masaomi Nangaku

Povzetek

Kronična hipoksija v ledvičnem tubulointersticiju ima ključno vlogo pri napredovanju kroničneledvicabolezen(CKD). Zato je pomembno raziskati tubularno hipoksijo in aktivnost hipoksijsko inducibilnega faktorja (HIF) -1 kot odziv na hipoksijo. Razredčenje peritubularne kapilare povzroči hipoperfuzijo pri kronični ledvični bolezni; vendar je bil učinek hipoperfuzije na HIF redko raziskan. Inducirali smo hipoperfuzijo, ki jo je povzročila namestitev pokrovnega stekelca pri človekuledvica-2 celic in opazovali kisikov gradient pod pokrovnim stekelcem. Imunocitokemija HIF-1 je pokazala tvorbo v obliki krofa na robu na pimonidazol pozitivnega področja, ki smo ga poimenovali "HIF-obroč". Napetost kisika v obroču HIF je bila ocenjena med približno 4 mmHg in 20 mmHg. Ta rezultat ni bil združljiv s tistimi iz preteklih raziskav, ki so pokazale kopičenje HIF-1 v anoksičnem območju s homogeno napetostjo kisika. Nadalje smo opazili prisotnost gradienta pH pod pokrovnim stekelcem, pa tudi premik obroča HIF zaradi sprememb v pH gojišča, kar kaže, da je obroč HIF nastal s supresijo HIF-1 povezanega do nizkega pH. Ta raziskava je pokazala, da aktivacija HIF-1 posnema fiziološko stanje v kultiviranih celicah s hipoperfuzijo.

KLJUČNE BESEDEhipoperfuzija, hipoksija, dejavnik, ki ga povzroča hipoksija, kisikov gradient, pH

Cistanche herbapreprečuje bolezni ledvic, kliknite tukaj za vzorec

1|UVOD

Pojavnost kroničnegaledvicabolezen(CKD) narašča po vsem svetu, ko se družbe starajo (Tonelli & Riella, 2014). Napredovanje kronične ledvične bolezni je ireverzibilno, ko ledvična okvara doseže določeno stopnjo in končno povzroči končno ledvično odpoved (ESRD), ne glede na osnovno bolezen. Ta rezultat kaže na obstoj "končne skupne poti." Glede na pretekle patološke analize je upad ledvične funkcije močneje povezan s tubulointersticijsko poškodbo kot z glomerularno poškodbo. Obstaja več poročil, ki dokazujejo, da ledvična fibroza povzroči kronično hipoksijo v tubulointersticiju, ta tubulointersticijska hipoksija pa poslabša kronično ledvično ledvično bolezen in povzroči končno odpoved ledvic. Ti dokazi kažejo, da ima tubulointersticijska hipoksija vlogo pri končni skupni poti kronične ledvične bolezni (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Theledvicaje zelo dovzeten za hipoksijo zaradi velikega povpraševanja po kisiku in obstoja kisikovega šanta med intrarenalnimi arterijami in venami (Nangaku, 2006; Welch et al., 2001; Zhang et al., 2014). Zato menimo, da je nujno raziskati hipoksijo in odziv na hipoksijo v ledvičnem tubulointersticiju.

Primarni biološki odziv na hipoksijo v živih organizmih poteka preko poti hipoksije inducibilnega faktorja (HIF) (Hypoxia, 2011; Semenza & Wang, 1992; Zhou et al., 2003). HIF je sestavljen iz - in -podenot. Čeprav je -podenota konstitutivno aktivna, se -podenota razgradi v prisotnosti kisika. V normoksičnih pogojih je HIF- hidroksiliran z domeno prolil hidroksilaze (Ph.D.), zaradi česar je prepoznaven po von Hippel–Lindau tumor supresorju (VHL). To prepoznavanje povzroči vseprisotnost in razgradnjo hidroksiliranega HIF- v proteasomu. V hipoksičnih pogojih se HIF- kopiči v citosolu, ker se nehidroksiliran HIF- izogne ​​razgradnji. Akumulirani HIF- se prenese iz citosola v jedro, kjer se dimerizira s HIF- in deluje kot transkripcijski faktor, ki spodbuja izražanje genov navzdol. Od treh identificiranih izooblik HIF-podenot – HIF-1, HIF-2 in HIF-3 – je znano, da epitelne celice ledvičnih tubulov izražajo HIF-1 (Tanaka et al. ., 2016). Prejšnje študije so pokazale prehodno ali regionalno kopičenje HIF vledvicas CKD (Goldfarb et al., 2006; Yu et al., 2012) in ta HIF se aktivira pri zmanjšani napetosti kisika v okolju CKD. Nepravilno prilagajanje na hipoksijo pri kronični ledvični bolezni je lahko posledica prisotnosti dejavnikov, ki zavirajo poti HIF (Asai et al., 2016; Tanaka et al., 2013; Thangarajah et al., 2009). Zaščitni učinki aktivacije HIF so bili opisani pri več živalskih modelih, vključno s podganami s sladkorno boleznijo, povzročenimi s streptozotocinom, in podganami z nefrektomijo 5/6 (Deng et al., 2010; Nordquist et al., 2015). dr. Zaviralci so nedavno pritegnili pozornost kot novi terapevtski pristopi k ledvični anemiji pri bolnikih s kronično ledvično boleznijo (Akizawa et al., 2019; Chen et al., 2017, 2019; Coyne et al., 2017; Miyata et al., 2011; Pergola et al. ., 2016; Provenzano et al., 2016). Vendar podrobnosti o napredovanju ledvične hipoksije in način, kako pride do kopičenja HIF vledvicas kronično ledvično boleznijo, ostajajo nejasni. Od kisika odvisna hidroksilacija HIF- se pojavi v citosolu, zato je pomembno izmeriti znotrajcelično in zunajcelično napetost kisika. Obstaja več metod, ki se uporabljajo za merjenje napetosti kisika, vključno z uporabo mikroelektrod ali slikanjem z magnetno resonanco, odvisno od ravni kisika v krvi (BOLD-MRI). Uporabili smo fosforescenčno življenjsko slikovno mikroskopijo (PLIM) za kvantitativno merjenje znotrajceličnega statusa kisika (Hirakawa et al., 2017; Yoshihara et al., 2015). BTPDM1 je fosforescentno barvilo na osnovi iridijevega (III) kompleksa BTP, (bp)2Ir(acc) (bp=benzoat-piridin, aac=acetilaceton) s kationsko dimetilamino skupino, ki je pasivno porazdeljeni v intracelularnih lizosomih. Sintetiziran je bil kot fosfo-novejša sonda za merjenje intracelularnega tlaka kisika (Yoshihara et al., 2015). PLIM z BTPDM1 je omogočil pridobitev visokoločljivih slik parcialnega tlaka kisika v ledvičnih tubularnih celicah na površini ledvic normalnih miši, kar je zagotovilo podatke, ki kažejo na prisotnost kisikovega gradienta, tudi pri normalnih ledvicah (Hirakawa et al., 2018). ).

V živih organih obstajajo gradienti kisika, vključno zledvice, tudi v normalnih pogojih (Hirakawa et al., 2018; Kietzmann, 2017; Zhdanov et al., 2015), zato lahko takšne gradiente pričakujemo tudi pri kronični ledvični bolezni. Hipoperfuzijo povzroči redčenje mikrovaskulature pri kronični ledvični bolezni, pri kateri progresivna poškodba glomerulov povzroči zmanjšanje peritubularnega kapilarnega pretoka krvi, kar poslabša intersticijsko fibrozo. Intersticijska fibroza poslabša difuzijo in oskrbo tubularnih celic s kisikom ter povzroči redčenje mikrovaskulature, kar dodatno poslabša tubulointersticijsko hipoksijo (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Biološki učinki hipoperfuzije pa ostajajo nejasni, ker je večina študij raziskovala učinke hipoksije in HIF-1 na gojene celice v pogojih homogene perfuzije in napetosti kisika (Rexius-Hall et al., 2017). Prejšnje študije so pokazale, da enoslojne kultivirane celice, pokrite s pokrovnim stekelcem, zagotavljajo dober model hipoperfuzije, ki jo povzroča ovira za difuzijo v gojišču. Modelirana hipoperfuzija je povezana z gradientom kisika, ker pokrovno stekelec preprečuje difuzijo kisika z vrha medija v celice (Pitts & Toombs, 2004; Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015). V enosloju gojenih celic, prekritih s pokrovnim stekelcem, napetost znotrajceličnega kisika pada z razdaljo od roba pokrovnega stekeca zaradi omejene difuzije kisika v gojene celice. Posledično nastane kisikov gradient od roba do središča pokrovnega stekelca, intracelularna napetost kisika pa lahko pade na anoksično območje v središču pokrovnega stekelca (Takahashi & Sato, 2010; Yoshihara et al., 2015). . V trenutni študiji smo se osredotočili na aktivacijo HIF in raziskali, ali obstaja od kisika neodvisna sprememba izražanja HIF v prisotnosti hipoperfuzije z gradientom kisika. Ker v ledvičnih tubulih in vivo obstaja hipoperfuzija z gradientom kisika, lahko opazovanje od kisika neodvisnih učinkov na ekspresijo HIF v modelu pokrovnega stekla zagotovi vpogled v mehanizem, na katerem temelji nezadostno kopičenje HIF pri KLB.

ekstrakt cistancheza ledvice

2|MATERIALI IN METODE

2.1|Kultura celic

Gojene celice smo inkubirali v navlaženem inkubatorju s 5 odstotki CO2. Hipoksična inkubacija je bila izvedena v osebnem CO2/večplinskem inkubatorju APM-30D (Astec). Anoksija je bila inducirana z vrečko za anoksijo, AnaeroPack in kompleti za anaerobno gojenje #A-13 (Mitsubishi Gas Chemical).

Celice HK-2 (Homo sapiens, človekledvica, samec, CRL- 2190, ATCC, RRID: CVCL_0302), ovekovečena celična linija epitela proksimalnih tubulov iz normalne ledvice odraslega človeka, so bili gojeni v Dulbeccovi modificirani Eaglovi mešanici medija/hranil F{{2} } Šunka (DMEM/F12) (D8062, Sigma Aldrich), ki vsebuje 10 odstotkov fetalnega govejega seruma (FBS) (F7524, Sigma Aldrich) in raztopino penicilin-streptomicin (15070063, Thermo Fisher Scientific) v 10 cm veliki posodi za kulture. Za prehod smo celice HK-2 disociirali s tripsinom (204-16935, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) in centrifugirali pri 300 g 5 minut.

Celice raka materničnega vratu HeLa in človeškega zarodkaledvicacelice 293 (HEK293) gojimo v DMEM z nizko (1000 mg/L) glukozo (D6046, Sigma Aldrich), ki vsebuje 5 odstotkov FBS v 10 cm veliki posodi za kulture. Te celice so bile pasirane kot celice HK-2.

Epitelijske celice proksimalnih tubulov ledvic (RPTEC) (CC- 2553, Cambrex) so vzdrževali s kompleti RenaLifeTM Comp (LRC-LL0025, Lonza Ltd.). Za prehod so bili RPTEC disociirani z uporabo tripsina, nevtralizirani z raztopino za nevtralizacijo tripsina (CC-5002, Lonza Ltd.) in centrifugirani pri 200 g 5 minut.

2.2|Vzpostavitev hipoperfuzijskega modela z namestitvijo pokrovnega stekelca

Pokrovnice okrogle oblike s premerom 15 mm (C015001, Matsunami) so bile očiščene z ultrazvokom in pred uporabo shranjene v 99,5-odstotnem etanolu. Uporabljeni sta bili dve metodi, ki temeljita na opazovanju celic zunaj pokrovnega stekelca.

Enoslojne kultivirane celice so bile stisnjene med pokrovno stekelko in dno posode (slika S1a,b) ali alternativna metoda (slika S1c), kot je opisano spodaj. Bodisi tradicionalna ali alternativna metoda je bila izbrana za vzpostavitev našega modela pokrovnega stekla za slikanje v živo, bodisi slikanje s kisikom ali slikanje PH. Za imunocitokemijo (ICC) je bila izbrana alternativna metoda, ker se je pri uporabi tradicionalne metode večina celic pogosto ločila od dna posode med odstranjevanjem pokrovnega stekla za fiksacijo celic (slika S2a).

2.2.1|Tradicionalna metoda

Prvi dan so bile celice postavljene na dno 27 mm steklene posode (3910-035, Iwaki) pri sotočju 100 odstotkov * (približno 5,0 × 105/posodo). Čez noč so jih gojili v DMEM/F12, ki je vseboval 10 odstotkov FBS brez raztopine antibiotikov. 2. dan je bilo na gojene celice za navedeno obdobje postavljeno pokrovno stekelec (slika S1b).

2.2.2|Alternativna metoda

Celice smo zasejali na pokrovno stekelko v 35 mm posodo s kulturo pri 100 odstotni konfluenci (približno 5,0 × 105/posodo) na dan.

1. Čez noč so jih gojili v DMEM/F12, ki je vseboval 10 odstotkov FBS brez raztopine antibiotikov. 2. dan je bilo pokrovno stekelce obrnjeno, da se je površina njegovih celic pritrdila na dno nove 27 mm steklene posode za določen čas (slika S1c).

Ustvarili smo tudi model pokrovnega stekelca z okroglimi pokrovnimi stekelci s premerom 10 mm (CS01005, Matsunami) (slika S2b).

2,3|Slikanje s kisikom v živo z BTPDM1

Gojene celice smo pripravili 1. dan, kot je opisano zgoraj. Drugi dan so bile celice dvakrat sprane s Hanksovo uravnoteženo raztopino soli (HBSS) (H8264, Sigma Aldrich) in inkubirane s 500 nM BTPDM1, kationskim lipofilnim barvilom na osnovi iridija, uporabljenim kot znotrajcelična fosforescentna sonda (Yoshihara et al., 2015), v DMEM/F12 brez fenol rdečega (21041-025, Thermo Fisher Scientific) 30 minut. Potem ko so bile celice dvakrat sprane s HBSS, so bile stisnjene med pokrovno stekelko in dno posode, kot je opisano zgoraj. Intenzivnost fosforescence iz BTPDM1 v kultiviranih celicah, pokritih s pokrovom, je bila opazovana z vzbujevalnim in emisijskim filtrom, fosforescenca BTPDM1 (Hirakawa et al., 2015) pa je bila zaznana s fluorescenčnim mikroskopom BZ-X710 (Keyence Corporation). Slike, pridobljene iz invertnega fluorescentnega mikroskopa, so bile prilagojene za svetlost in kontrast z uporabo programske opreme za analizo BZ-X.

2,4|Imunocitokemija

Celice na pokrovnem stekecu smo 1 uro gojili z 200 µM pimonidazol HCl (HP3-100, Hypoxyprobe, Inc.) v DMEM/F12 brez fenol rdečega, nakar smo pokrovno stekec obrnili in pritrdili na pokrovno stekleno posodo, kot opisano prej. Celice smo nato gojili v DMEM/F12 brez fenol rdečega za določeno obdobje. Ko kontrastno barvanje s pimonidazolom ni bilo uporabljeno, je bila predobdelava s pimonidazolom izpuščena.

Po zaključku obdobja kulture smo zbrali vsako pokrovno stekelce in celice takoj fiksirali z metanolom/acetonom (1:1) na ledu, kjer so ostale 30 minut. Po dvakratnem izpiranju z Dulbeccovo fiziološko raztopino s fosfatnim pufrom (PBS) (D5652, Sigma Aldrich) je bila celična membrana permeabilizirana 30 minut, inkubirana s 5-odstotnim govejim serumskim albuminom (BSA) (A3059, Sigma Aldrich) 30 minut in nato z blokom beljakovin brez seruma (X0909, DAKO) 10 min. Celice smo obarvali s prvim protitelesom in nato z drugim, fluorescenčnim protitelesom. Seznam prvih protiteles je podan v tabeli S1. FITC-prašičji poliklonski antikunčji imunoglobulin (F0205, razredčitev 1:20, DAKO) smo uporabili kot prvo protitelo, če je bil gostitelj kunec. Fluorescentno protitelo Alexa Fluor 594 streptavidin (S11227, razredčitev 1:500, Thermo Fisher Scientific) je bilo uporabljeno kot prvo protitelo, če je bila gostiteljica miš, ki mu je sledil biotinilirani protimišji IgG (H plus L) (BA{{23} }, razredčitev 1:1000, Vector Laboratories), kot drugo protitelo. Jedrsko barvanje smo izvedli z bisbenzimid H 33342 trihidrokloridom (B2261, Sigma Aldrich) za vsak vzorec.

Fluorescenčne signale smo opazovali z invertnim fluorescenčnim mikroskopom BZ-X710 (Keyence Corporation) z naslednjimi filtri: Texas Red z vzbujevalno valovno dolžino (Ex) 560/40 nm, emisijsko valovno dolžino (Em) 630/75 nm, GFP ( Npr.: 470/40 nm, Em: 525/50 nm) in DAPI (Npr.: 360/40 nm, Em: 460/50 nm). Slike so bile prilagojene za svetlost in kontrast s programsko opremo za analizo BZ-X.

2,5|ICC HIF celic HK-2, obdelanih s kobaltovim kloridom

Alternativna metoda je bila spremenjena za izdelavo modela krovnega stekelca celic HK-2, obdelanih s kobaltovim kloridom. HK-2 celice so bile posejane pri polovični konfluentni gostoti (2,5 × 105/posodico) na pokrovno stekelko 1. dan in obdelane s 300 µM kobaltovega klorida heksahidrata (C 8661, Sigma Aldrich) 16 ur na dan. 2. dan. 3. dan je bil pokrov obrnjen, da se celične površine pritrdijo na dno nove 27 mm steklene posode za 3 ure, in izvedena je bila ICC HIF.

2,6|Western blotting

Za raziskovanje kopičenja HIF{{0}} pod različnimi napetostmi kisika in pri različnih ravneh pH, ​​1.0 × 106 HK-2 celic na 10 cm posodo s kulturo smo 5 ur inkubirali pod normoksijo, 2 odstotkom kisika, 1 odstotkom kisika ali anoksijo ali v DMEM/F12 pri pH 7,4, pH 6,0 ali pH 5,0 5 ur.

Te celice so bile lizirane v pufru RIPA, ki je vseboval 50 mM Tris-pufra (pH 8.0), 150 mM NaCl, 0,5 m/v % natrija deoksiholata, 0,1 m/v odstotka SDS in 1,0 m/v odstotka NP40.

Za western blot pufer za vzorec SDS, ki vsebuje {{0}}.35 M Tris-HCl (pH 6,8), 10 odstotkov SDS, 36 odstotkov glicerola, 0,012 odstotka bromofenol modrega in 0,1 M ditiotreitola (DTT) smo dodali proteinom. Beljakovine, ki vsebujejo SDS vzorčni pufer, smo eluirali z vrenjem pri 95 stopinjah 5 minut.

Proteine ​​smo ločili z elektroforezo na 10 odstotnih SDS poliakrilamidnih gelih. Proteine ​​smo nato prenesli na AmershamTM HybondTM PVDF membrano (10600023, GE Healthcare) v prenosnem pufru (48 mM Tris-bazni pufer, 39 mM glicin, 0,04 % SDS in 20 v/v % metanola) z uporabo Trans-Blot®. TurboTM Transfer System (Bio-Rad). Membrane smo inkubirali pri sobni temperaturi s primarnimi protitelesi, protitelesom proti HIF1 (NB100-134, razredčitev 1:500, Novus Biologicals, RRID: AB_350071) in protitelesom proti aktinu (A2066 , razredčitev 1:2000, Sigma Aldrich, RRID: AB_476693) in nato v sekundarnem protitelesu, poliklonski kozji antikunčji imunoglobulin/HRP (P0448, razredčitev 1:10000, DAKO, RRID: AB{{26) }}). Za detekcijo je bil uporabljen substrat PierceTM ECL Plus Western Blotting (32132, ThermoFisher Scientific). Kemiluminiscenco smo opazovali z Luminoimage Analyzer ImageQuantLAS4000mini (GE Healthcare). Ponovljivost je bila potrjena z izvedbo vsaj treh neodvisnih poskusov. Intenzivnost pasov je bila kvantificirana s programsko opremo National Institutes of Health ImageJ (Schneider et al., 2012).

2,7|Luciferazni reporterski test

Izveden je bil reporterski test luciferaze za merjenje kopičenja HIF1 v homogeni hipoksični inkubaciji kulture. Prej smo izdelali označeni gen za luciferazo, ki ga poganja element, odziven na hipoksijo (HRE), in razvili vektor, ki se odziva na hipoksijo (transgenska konstrukcija). To je bilo zgrajeno iz tandemskih kopij HRE iz gena podganjega vaskularnega endotelnega rastnega faktorja, subkloniranega v 5' regijo am CMV-promotorja-luciferazne transkripcijske enote (pre-Luc) (Chiang et al., 2011; Tanaka et al. al., 2004).

Celice HK{{0}} pri koncentraciji 1,0 × 105 na vdolbinico smo pripravili v 12-ploščih za kulturo vdolbinic (150628, Thermo Fisher Scientific). Celice smo sočasno transfektirali s 500 ng vektorjev pGL3-Basic HRE-luciferaze in 30 ng kontrolnih vektorjev luciferaze pRL-SV40 Renilla (Promega) z uporabo 2 µl FuGENE® HD transfekcijskega reagenta (E2311, Promega) na dobro. Celice HK-2, sotransficirane s 500 ng pGL3-osnovnih vektorjev luciferaze kresničke in 30 ng kontrolnih vektorjev luciferaze pRL-SV40 Renilla (Promega), so bile uporabljene kot negativna kontrola.

Transfektirane celice smo 5 ur inkubirali pod normoksijo, 2-odstotno hipoksijo, 1-odstotno hipoksijo ali vrečko za anoksijo. Celice smo nato pobrali z uporabo 100 µl pufra za pasivno proteinsko lizo za dvojni luciferazni test. Za meritve smo uporabili luminometer LB9507 (EG in Berthold). Za popravek učinkovitosti transfekcije je bila relativna vrednost svetlobne enote luciferaze kresničke deljena z vrednostjo luciferaze Renilla.

cistanche za izd

2,8|Analiza apoptoze

Gojene celice so bile prekrite s pokrovom za 0 min, 15 min, 30 min, 1 h, 3 h, 6 h in 24 h ter nato zbrane s tripsinom. Celice, obdelane s 3 odstotki vodikovega peroksida (081- 04215, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) 30 minut, so bile pripravljene kot apoptotična kontrola. Kvantitativno analizo apoptoze smo izvedli z Muse Annexin V in Dead Cell Kits (MCH100105, Millipore) v Muse™ Cell Analyzer (Millipore) v skladu z navodili proizvajalca.

2,9|Kvantitativni PCR v realnem času (qRT-PCR)

Celotna ekstrakcija RNA in sinteza cDNA sta bili izvedeni v skladu z navodili proizvajalca za RNAiso Plus (9109, Takara) oziroma PrimeScript™ RT Master Mix (RR036B, Perfect Real Time) (Takara). PCR v realnem času je bil izveden z uporabo THUNDERBIRD SYBR qPCR Mix (QPS- 201, Toyobo) v sistemu CFX Connect za odkrivanje PCR v realnem času (Bio-Rad). Ravni transkriptov so bile normalizirane na raven ekspresije mRNA -aktina. qRT-PCR smo izvedli v treh izvodih z uporabo gensko specifičnih primerjev. HIF-1 je bil pomnožen z uporabo prednjih, 5'-CCATTAGAAAGCAGTTCCGC-3' in obratnih, 5'-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3' primerjev. -aktin je bil pomnožen z uporabo predhodnega, 5'-TCCCCAACTTGA GATGTATGAAG-3' in povratnega 5'-AACTGGTTCCAAG TCAGTGTACAGG-3' primerja.

2.10|Transfekcija s siRNA

Da bi raziskali zrušitev HIF-1, ki jo povzroči RNAi, v celicah HK-2, smo pripravili 5.0 × 104 celic HK-2 na vdolbino v ploščah s šestimi vdolbinicami. Z Lipofectamine RNAiMAX sta bili uporabljeni dve vrsti RNAi – HIF-1 siRNA (siHIF-1 #1 [HSS104774, Thermo Fisher Scientific] in siHIF-1 #2 [HSS104775, ThermoFisher Scientific]) Transfekcijski reagent (Thermo Fisher Scientific). Kot negativno kontrolo smo uporabili Stealth RNAi™ siRNA Negative Control Med GC Duplex #3 (12935-113); Zmešali smo 1,5 µl vsake siRNA in 5 µl RNAiMAX. Celice, transficirane s siRNA, so bile 48 ur inkubirane v normoksičnih ali hipoksičnih (1 odstotek O2) pogojih in ekstrahirana je bila RNA. Učinkovitost knockdown-HIF-1 je bila raziskana s qRT-PCR.

2.11|Živo slikanje učinkov gradienta PH

Vizualizirali smo znotrajcelični pH gradient živih celic pod pokrovom. Celice smo obdelali s pHrodo Green AM intracelularnim indikatorjem pH (p35373, ThermoFisher Scientific) v skladu z navodili proizvajalca pred uporabo modela pokrovnega stekla. Za opazovanje časovnega prehoda gradienta intenzitete fluorescence pod pokrovnim stekelcem smo uporabili invertni fluorescenčni mikroskop BZ-X710 (Keyence Corporation) s filtrom GFP.

2,12|Kvantitativna analiza obroča HIF

2.12.1|Mesto obroča HIF

Izmerili smo razdaljo obročev HIF in območij, pozitivnih na pimonidazol, od robov pokrovnega stekelca z uporabo ImageJ, kot sledi. Določene so bile površine zunanjega in notranjega kroga obroča HIF in kroga, pozitivnega na pimonidazol, ter izračunan polmer vsakega kroga. Vsaka vrednost je bila odšteta od 7,5 mm, kar je polmer 15 mm pokrovnega stekelca, da se izračuna njegova razdalja od roba pokrovnega stekelca. Izvedeni so bili trije neodvisni poskusi ICC HIF v vsakem stanju.

2.12.2|Opredelitev obroča HIF

Uporabili smo fluorescentne slike, pridobljene iz modela pokrovnega stekelca, inkubiranega pod normoksijo in nevtralnim pH. Mesto obroča HIF ter njegovo zunanjost in notranjost smo opredelili kot lestvico 2,5–3.0 (0.22–0.45 mm), 0.5 Merilo –1.0 (1,12–1,35 mm) in merilo 5.0–5,5 (2,24–2,47 mm) od roba pokrovnega stekelca z uporabo ImageJ. Izmerili smo pet mest signalov HIF-1 na vzorec in izračunali povprečje. Izvedeni so bili trije neodvisni poskusi ICC HIF.

izvleček cistanke v prahu

2,13|Merjenje tlaka kisika s sliko PLIM

2.13.1|Izgradnja kalibracijske linije za merjenje tlaka kisika

Izdelana je bila umeritvena krivulja celic HK-2 na podlagi metode, opisane v našem prejšnjem poročilu (Yoshihara et al., 2015). HK-2 celice, napolnjene s 500 nM BTPDM1 za 30 minut, so bile kultivirane v večplinskem inkubatorju s spremenljivo koncentracijo kisika, opremljenem z invertnim fluorescentnim mikroskopom, ki je bil povezan s sistemom za merjenje življenjske dobe. Umeritvena črta na podlagi Stern-Volmerjeve analize je bila zgrajena z uporabo življenjske dobe fosforescence (PL) celic HK-2 pod več različnimi napetostmi kisika z uporabo

Enačba (1)

kjer τp predstavlja PL v pO2, τ0 predstavlja PL pri deoksigenaciji, kq predstavlja konstanto hitrosti gašenja in pO2 predstavlja parcialni tlak kisika. Z uporabo te kalibracijske črte je mogoče tlak kisika izračunati iz PL.

2.13.2|PLIM slika modela pokrovnega stekelca

Pripravljene so bile celice HK-2, napolnjene s 500 nM BTPDM1 za 30 minut. Model pokrovnega stekeca je bil izdelan in gojen v večplinskem inkubatorju s spremenljivo koncentracijo O2, opremljenem z invertnim fluorescenčnim mikroskopom, povezanim s sistemom za merjenje življenjske dobe.

Slike fosforescenčne življenjske slikovne mikroskopije (PLIM) so bile posnete z invertnim fluorescenčnim mikroskopom, opremljenim s sistemom konfokalnega skeniranja (Hirakawa et al., 2018). Slike PLIM so bile pridobljene po 30 minutah inkubacije v 21 odstotkih O2 ali 4 odstotkih O2. Posneli so štiri slike PLIM na vzorec, z zgornje, spodnje, leve in desne regije blizu roba pokrovnega stekelca, da bi določili povprečno PL ob upoštevanju variacije v PL v pokrovnem stekelcu.

2.13.3|Identifikacija obroča HIF na sliki PLIM

Pimonidazol je bil pozitiven pod 10 mmHg kisikovega tlaka. PL ekvivalent 10 mmHg kisikovega tlaka je bil 4034,6 ns glede na umeritveno linijo, tako da je bilo mogoče prepoznati zunanjo linijo kroga pimonidazola na sliki PLIM. Kasneje je bilo mogoče najti mesta zunanjih in notranjih obročev HIF na sliki PLIM z uporabo kvantitativne analize razdalje. Izmerili smo razpon povprečnih PL, ki ustrezajo obroču HIF v 21 odstotkih O2 in 4 odstotkih O2.

2.13.4|Merjenje tlaka kisika obroča HIF

Izračunali smo razpon tlakov kisika obroča HIF iz PL z uporabo kalibracijske črte. Slike PLIM so bile analizirane s programom SPCImage 5.0 (Becker & Hickl GmbH).

2,14|Statistična analiza

Dunnettov test je bil uporabljen za primerjavo eksperimentalnih in kontrolnih skupin, vrednosti < 0,05="" pa="" so="" veljale="" za="" statistično="" pomembne="" razlike.="" za="" primerjavo="" treh="" ali="" več="" skupin="" so="" uporabili="" studentove="" t-teste="" in="" uporabili="" bonferronijevo="" prilagojeno="" p-vrednost.="" vse="" statistične="" analize="" so="" bile="" izvedene="" z="" uporabo="" jmp="" pro="" ver13.2.1="" (sas).="" predpostavlja="" se,="" da="" so="" vrednosti="" izpeljane="" iz="" normalno="" porazdeljene="" populacije="" in="" so="" prikazane="" kot="" povprečje="" ±="" standardni="" odklon="">

kaj je cistanche

3|REZULTATI

3.1|Tvorba kisikovega gradienta v modelu hipoperfuzije

Potrdili smo obstoj kisikovega gradienta v modelu hipoperfuzije, induciranega z namestitvijo pokrovnega stekla, z neposredno oceno napetosti kisika z uporabo fosforescence. Merjenje intenzivnosti fosforescence lahko napove približen trend tlaka kisika (Hirakawa et al., 2015; Yoshihara et al., 2015). Opazovali smo intenzivnost fosforescence modela pokrovnega stekelca celic HK-2, obdelanih z BTPDM1. Slike intenzivnosti fosforescence so pokazale hipoksijo na večini območja znotraj pokrovnega stekelca, vendar brez hipoksije blizu roba, opazovanje, ki je nakazovalo obstoj kisikovega gradienta okoli roba pokrovnega stekeca v celicah HK-2, pokritih s pokrovno stekelec (slika 1a). Ker je intenzivnost fosforescence odvisna od koncentracije sonde in od časa vzbujanja, je meritev življenjske dobe fosforescence (PL) uporabna za kvantitativno analizo tlaka kisika (Yoshihara et al., 2015). Tako smo za kvantitativno merjenje napetosti kisika gojenih celic okoli roba pokrovnega stekeca dobili PLIM slike celic HK-2, pokritih s pokrovnim stekelcem za 30 minut (slika 1b). PL se je razširil, ko se je razdalja od roba pokrovnega stekelca povečala. Potrdili smo, da se je napetost kisika, izračunana z uporabo kalibracijske črte (slika S3), zmanjšala, ko se je razdalja od roba pokrovnega stekelca povečala, kar dokazuje obstoj kisikovega gradienta okoli roba pokrovnega stekelca (slika 1c). Preiskava časovnega profila intenzivnosti fosforescence je pokazala, da se je gradient kisika začel oblikovati 10 minut po namestitvi pokrovnega stekelca

(Slika 1d).

3.2|Edinstvena porazdelitev HIF-1 v modelu hipoperfuzije, "HIF obroč"

Pregledali smo porazdelitev HIF-1 v hipoperfuzijskem modelu z gradientom kisika. ICC HIF-1 v celicah HK-2 je pokazala izboljšavo v obliki krofa na robu na pimonidazol pozitivnega območja, ki smo ga poimenovali "HIF obroč" (slika 2a). Intenzivnost signala HIF-1 je bila bistveno večja na obroču HIF kot v njegovem notranjem ali zunanjem območju (slika 2b). Ta pojav je bil potrjen z uporabo ICC z drugim HIF-1 protitelesom (slika S4a) ali drugimi tubularnimi celičnimi linijami (slika S4b,c). Izvedli smo tudi ICC analizo HIF-1 v drugih vrstah gojenih celic, kot so celice raka materničnega vratu HeLa. Čeprav je šibka adhezija teh celic na stekelec otežila podrobno oceno porazdelitve HIF-1, smo opazili izboljšanje HIF-1 v obliki krofa v celicah HeLa (slika S4d).

Obroč HIF in območje, pozitivno na pimonidazol, sta se začela oblikovati nekaj ur po namestitvi pokrovnega stekelca in obroč HIF je bil 3 ure videti statičen (slika 2c). Knockdown HIF-1 je povzročil izginotje signala HIF-1, vključno z obročem HIF (slika 2d, slika S4e), kar kaže, da je bil obroč HIF odvisen od HIF-1.

Da bi raziskali možnost, da je tvorba obroča HIF odvisna od kisika, smo raziskali porazdelitev HIF-1 v modelu pokrovnega stekelca med inkubacijo z različnimi napetostmi kisika. Posodo smo takoj po izdelavi modela pokrovnega stekelca postavili v hipoksične komore z različnimi napetostmi kisika. Med hipoksično inkubacijo smo opazili, da sta se tako obroč HIF kot območje, pozitivno na pimonidazol, razširila navzven (slika 3a). Izmerili smo razdaljo vsakega obroča HIF in področja, pozitivnega na pimonidazol, od roba pokrovnega stekelca pod normoksijo, 4 odstotki O2 in 1 odstotkom O2 inkubacije. Tako obroč HIF kot območje, pozitivno na pimonidazol, sta se razširila navzven, ko se je okoliška napetost kisika zmanjšala (slika 3b). Ti rezultati so pokazali, da je bil obroč HIF odvisen od HIF-1 in napetosti kisika.

Da bi potrdili, da je kopičenje v obliki krofa specifičen pojav HIF, smo izvedli ICC z gospodinjskimi geni v modelu pokrovnega stekla. Signali GAPDH in aktina so se ohranili na celotnem območju pokrovnega stekeca in so bili primerljivi med območjem obroča HIF in drugimi regijami (slika S5a, b).

3.3|Merjenje razpona kisikovega tlaka HIF obroča

Potrdili smo obročasto povečanje kopičenja HIF-1 v gojenih celicah, pokritih s pokrovom, kar je pojav, odvisen od napetosti kisika. Za določitev obsega vpletene napetosti kisika smo analizirali tlak kisika v obroču HIF s tehniko življenjske dobe fosforescence. Dobili smo PLIM slike modela pokrovnega stekelca po 30 min inkubacije v 21 odstotkih O2 ali 4 odstotkih O2 (slika 4a). Obroč HIF je nastal na robu kroga pimonidazola v ICC HIF (slika 3b). Identificirali smo mesto na sliki PLIM, ki je bilo enakovredno območju, pozitivnemu na pimonidazol, v ICC HIF in nato identificirali mesto, ki ustreza obroču HIF (slika 4b), z uporabo kvantitativne analize podatkov o razdalji od obroča HIF in pimonidazol-pozitivno območje (slika 3b). Izmerili smo tudi obseg PL obroča HIF in nato uporabili umeritveno črto (slika S3) za izračun tlaka kisika obroča HIF v 21 odstotkih O2 (4,20 [3,46–4,97] ~35,9 [28,5–44,9] mmHg) in 4 odstotki O2 (2,19 [0,21–4,32] ~20,4 [17,1–24,1] mmHg) (slika 4c).

3,4|HIF-1 kopičenje pod homogeno napetostjo kisika

Medtem ko lahko šibke signale HIF-1 zunaj obroča HIF v modelu pokrovnega stekelca pripišemo nezadostni hipoksiji, morajo biti tisti znotraj obroča, kjer bi moral biti HIF-1 močneje aktiviran zaradi nižje napetosti kisika. nadzirati od kisika neodvisen pojav. Da bi preučili pojave, ki povzročajo pomanjkanje največjega kopičenja HIF-1 v anoksičnem območju, ki se pojavlja samo v modelu hipoperfuzije, smo preverili, ali obstaja obratno razmerje med napetostjo kisika in kopičenjem HIF-1 med inkubacijo s homogeno napetostjo kisika. Western blot analiza celičnih lizatov pri različnih homogenih napetostih kisika je pokazala povečanje kopičenja HIF-1 med anoksično inkubacijo (slika 5a). Reporterski test HRE-luciferaze je tudi pokazal, da se je kopičenje HIF-1 povečalo z nižjo napetostjo kisika v pogojih homogene napetosti kisika (slika 5b). Ti rezultati so pokazali, da je kopičenje HIF-1 odvisno od napetosti kisika, pri čemer je največje kopičenje opaženo v anoksičnem območju. Značilnosti HIF-1 se morajo razlikovati med modelom hipoperfuzije in modelom s homogeno napetostjo kisika. Špekulirali smo, da bi lahko edinstveni pojav kopičenja HIF-1 v tem modelu hipoperfuzije določil dejavnik, ki ni napetost kisika.

3,5|Oblikovanje obroča HIF je bilo neodvisno od doktorata

Preučili smo, ali je bila razgradnja HIF-1, možen mehanizem tvorbe obroča HIF, regulirana navzgor znotraj obroča HIF. Ta zamisel se je zdela neveljavna, ker hidroksilacija z doktoratom, proces razgradnje HIF, ki omejuje hitrost, zahteva kisik kot substrat. Kobaltov klorid se pogosto uporablja kot kemični stabilizator HIF. Konstruirali smo model pokrovnega stekla celic HK-2, obdelanih s kobaltovim kloridom, in izvedli ICC analizo HIF. Signal HIF-1 se ni povečal znotraj obroča HIF, kar je postalo nejasno zaradi povečanega signala HIF-1 zunaj obroča (slika 6c). ICC celic HK-2 z uničenjem PHD2, za katerega se domneva, da je primarna HIF prolil hidroksilaza v poskusih celične kulture (Strowitzki et al., 2019), je dal podobne rezultate (slika S6). Ti rezultati so pokazali, da os PHD-VHL razgradnje HIF ni bila povezana s tvorbo obroča HIF.

3,6|Vpliv pH na kopičenje HIF-1

Prejšnje poročilo je opisalo uporabo modela pokrovnega stekelca srčnih miocitov, ki so imeli padec pH znotraj pokrovnega stekelca (Pitts & Toombs, 2004). Raziskali smo pH pod pokrovnim stekelcem in njegov vpliv na tvorbo obroča HIF. Celice HK-2 smo obdelali z intracelularnim pH indikatorjem, katerega intenziteta fluorescence omogoča oceno pH v celicah. Slikanje v živo je pokazalo, da se je pH zmanjšal na večini notranjega območja, vendar ne blizu roba pokrovnega stekelca, kar kaže na obstoj pH gradienta okoli roba v modelu pokrovnega stekelca (slika 6a). Kvantitativna analiza korelacije med intenzivnostjo fluorescence in razdaljo od roba pokrovnega stekelca je pokazala, da je bila prva povišana, ko se je razdalja povečevala, opažanje, ki je podprlo obstoj gradientov pH in kisika okoli roba pokrovnega stekelca (slika 6b). Western blot analiza celičnih lizatov pri homogenih koncentracijah kisika je pokazala, da je inkubacija z medijem pH 5,0 zavirala kopičenje HIF-1 v hipoksičnih pogojih (slika S7a–d). Potrdili smo tudi, da se je kopičenje HIF-1 pod hipoksijo pod različnimi pogoji pH zmanjšalo pod pH 6,0 (slika S8a–c).

Eno poročilo je poudarilo pomen rahlo kislih pogojev pri pH okoli 6.0. Glede na to študijo je reoksigenacija po hipoksiji zakisala medij, kar je povzročilo nukleolarno sekvestracijo VHL. Po drugi strani je bila razgradnja HIF preprečena v miocevkah C2C12, nevronih PC12 in 786-0 rakavih celicah ledvic (Mekhail et al., 2004). V naši študiji ni bilo sprememb v porazdelitvi VHL v tubularnih celicah med območji z akumulacijo HIF-1 in tistimi, v katerih je bil potlačen, v modelu pokrovnega stekla z vrednostmi pH od 5.0 do 7,4 (Slika S9a–c). Tubularne celice so izpostavljene širokemu spektru pogojev pH (Burke et al., 1999; Pavuluri et al., 2019; Raghunand et al., 2003), zato smo raziskali variacijo obroča HIF v medijih z različnimi pH. vrednosti med 5,0 in 8,5. Obroč HIF je bil jasno viden v medijih s pH 8,5 in 7,4 (slika 6c). Obroč HIF je obstajal tudi pri pH 6,5, vendar je bil zakrit (slika 6c). Signal HIF-1 je bil oslabljen na celotnem območju pokrovnega stekelca pri pH 5,0. (Slika 6c). Izvedli smo nadaljnjo kvantitativno analizo razmerja položaja med obročem HIF in robom pimonidazol-pozitivnega območja (slika 7a) in odkrili, da se položaj obroča spreminja glede na pH. Notranji krog se je nagibal k razširitvi navzven pri pH 6,5 v primerjavi s pH 7,4, medtem ko se je zunanji krog znatno skrčil navznoter pri pH 8,5 glede na rob območja, pozitivnega na pimonidazol (slika 7b,c). Potrdili smo tudi, da so se dejavnosti gospodinjskih genov ohranile v modelu pokrovnega stekla pri kisli inkubaciji (slika S10). Zato se zdi, da ima pH pomembno vlogo v mehanizmu, na katerem temelji tvorba obroča HIF.

4|DISKUSIJA

V tej študiji smo identificirali edinstveno porazdelitev HIF-1 v ledvičnih tubularnih celicah z uporabo modela hipoperfuzije, povzročene z namestitvijo pokrovnega stekla. Ugotovili smo, da sta nastanek in vzdrževanje obroča HIF regulirana s tlakom kisika in pH, ki sta obstajala v gradientu na robu pokrovnega stekelca modela pokrovnega stekelca. Na podlagi teh rezultatov predlagamo možen mehanizem za nastanek obroča HIF, ki vključuje kopičenje HIF-1 z zmanjševanjem napetosti kisika, kopičenje pa je potlačeno zaradi nizkega pH znotraj določene razdalje od roba pokrovnega stekelca (slika 8). ).

Hipoperfuzijo povzroči redčenje mikrovaskulature pri kronični ledvični bolezni (Mimura & Nangaku, 2{{20}}10; Nangaku, 2006). V našem prejšnjem delu smo uporabili slikanje in vivo, da bi dokazali prisotnost kisikovega gradienta v ledvičnih tubularnih celicah normalnih mišjih ledvic (Hirakawa et al., 2018). Pričakuje se tudi, da bo napetost kisika heterogena v tubularnih celicah pri CKD. Vendar pa ostaja nejasno, ali obstoj hipoperfuzije z gradientom kisika vpliva na obrambni sistem pred hipoksijo, HIF. V tej študiji smo raziskali porazdelitev HIF v gojenih celicah proksimalnih tubulov pod hipoperfuzijskim modelom in odkrili, da je bil kisikov gradient v kultiviranih ledvičnih tubulnih celicah uspešno modeliran z okroglim steklenim pokrovom. Dokazi iz poskusov z uporabo homogene napetosti kisika so pokazali, da se je kopičil HIF-1, katerega hidroksilacija in kasnejša razgradnja sta v glavnem odvisni od kisika. To pomeni, da se količina HIF-1 poveča, ko se napetost kisika zmanjša. V našem modelu pokrovnega stekeca pa je bil HIF-1 potlačen v anoksičnem območju in je imel največje kopičenje na določeni razdalji od roba pokrovnega stekelca. To kopičenje HIF v obliki krofa še nikoli ni bilo prikazano. Pokazali smo, da je mogoče opaziti oblikovanje obroča HIF ne glede na napetost kisika v inkubacijski atmosferi, vendar je bila njegova lokacija odvisna od napetosti kisika. Razpon napetosti kisika na obroču HIF je bil izmerjen pri približno 4–20 mmHg z uporabo PLIM z BTPDM1. Večina prejšnjih študij, ki so bile osredotočene na kultivirane celice v atmosferi s homogeno napetostjo kisika, je ugotovila, da se je količina proteina HIF-1 povečala v hipoksičnem ali anoksičnem območju (Ameri et al., 2002; Carrera et al. , 2014). Tako je moral v našem modelu na nastanek obroča HIF vplivati ​​dejavnik, ki ni napetost kisika; bil je neodvisen od doktorata, procesa razgradnje HIF, ki omejuje hitrost. Preboj pri razjasnitvi mehanizma tvorbe obroča HIF je bilo naše odkritje vloge gradienta pH in kisikovega gradienta v modelu pokrovne ustnice, ki je omejil dotok medija, podobno kot hipoperfuzija in vivo model. V tem hipoperfuzijskem modelu se je znotrajcelični pH zmanjšal, ko se je razdalja od roba pokrovnega stekelca povečala, okoli roba pokrovnega stekelca pa so opazili gradient pH. Pokazali smo, da je bilo kopičenje HIF-1 zavrto pri nizkem pH, okoli pH 5,0, v primerjavi z inkubacijo pri približno nevtralnem pH pod homogeno napetostjo kisika. Zunanji rob obroča HIF se je razširil navzven pri pH 6,5, notranji rob obroča HIF pa se je skrčil navznoter pri pH 8,5 glede na rob območja, pozitivnega na pimonidazol. Obroč HIF je bil zakrit v kislih pogojih in signal HIF-1 je izginil pri pH 5,0. Tako smo razjasnili pomen pH za tvorbo obroča HIF v modelu pokrovnega stekla. Pokazali smo možnost, da je obroč HIF nastal z zaviranjem kopičenja HIF-1 z nizkim pH znotraj obroča.

Več prejšnjih študij z metodo pokrovnega stekla je uporabljalo rakave celice. Po enem poročilu z uporabo celične linije človeškega hepatoma Hep3B, ki izraža od kisika odvisen rdeči premik zelenega fluorescenčnega proteina (AcGFP1), je živo slikanje celic, pokritih s pravokotnim pokrovčkom, pokazalo rdeči premik, ko se je razdalja od roba pokrovčka povečala (Takahashi & Sato, 2010). Emisijski spekter celic hepatoma se je premaknil od valovne dolžine fluorescence zelenega fluorescenčnega proteina (GFP) do rdeče, ko se je napetost kisika zmanjšala. V drugi študiji je bila napetost kisika celic SCC-7 z okroglim 15- mm krovnim stekelcem izmerjena s tehniko življenjske dobe fosforescence. Napetost kisika je bila 6,9 mmHg in 166 mmHg, izračunana iz PL, ki je bil 3,89 µs in 893 µs, 0–2 mm znotraj oziroma 0–1 mm zunaj roba pokrovnega stekelca (Yoshihara et al., 2015). Metoda pokrovnega stekla je bila uporabljena tudi s srčnimi miociti, sistemom, ki je pritegnil pozornost kot obetaven model ishemije in reperfuzije in vivo. Kelly in drugi so pokazali, da so miociti, prekriti s pokrovom, sčasoma podvrženi izrazitim morfološkim spremembam, ki so jih spremljale spremembe potenciala mitohondrijske membrane in dinamike plazemske membrane, kar je na koncu povzročilo smrt miocitov. Dokazali so tudi, da znotrajcelični pH miocitov, pokritih s pokrovnim stekelcem, hitro pade na približno pH 4 v središču pokrovnega stekelca (Pitts & Toombs, 2004). Model pokrovnega stekelca, ki zavira difuzijo kisika ali hranil v gojene celice pod pokrovnim stekelcem, lahko posnema in vivo model ishemičnih, normalnih in obrobnih območij v sredini, zunaj in na robu pokrovnega stekelca. Več študij je ta model uporabilo kot model ishemije in reperfuzije miocitov in vitro (Chun et al., 2015; Pitts et al., 2008; Solhjoo & O'Rourke, 2015; Wang et al., 2012). Kolikor nam je znano, je naša študija prva, ki uporablja metodo pokrovnega stekla za cevaste celice. V našem sistemu je bila razdalja od roba pokrovnega stekelca do območja, ki ustreza 10 mmHg napetosti kisika, kjer bi moral pimonidazol postati pozitiven, 1,22 mm, napetost kisika pa se je zmanjšala na nič na razdalji 2 mm od roba pokrovnega stekelca. . Ta rezultat je lahko združljiv s prejšnjimi poročili z uporabo približno 15 mm pokrovnega stekelca, ki dokazuje obstoj kisikovega gradienta vsaj znotraj 2 mm od roba (Akiyama et al., 2018; Yoshihara et al., 2015). Preučili smo stopnjo apoptoze celic pod pokrovnimi stekelci (slika S11) in odkrili, da sta se GAPDH in aktin ohranila tudi znotraj obroča HIF, kar kaže, da obroča HIF ni povzročila samo celična apoptoza ali smrt znotraj obroča HIF.

Več študij je merilo napetost kisika v ledvicah z uporabo različnih metod. Nekaj ​​primerov merjenja napetosti kisika normalnih ledvic je bilo naslednjih: 50 mmHg in 30 mmHg v skorji in meduli z uporabo mikroelektrod; in 49 mmHg in 41 mmHg v segmentih S1 in S2 tubularnih celic korteksa z uporabo PLIM (Hirakawa et al., 2017, 2018; Zhang et al., 2014). Napetost kisika bolnih ledvic bi bila manjša. Glede na prejšnje poročilo z uporabo kisikovih mikroelektrod so diabetične podgane imele nižjo napetost kisika v ledvičnem parenhimu: 36 mmHg oziroma 11 mmHg v skorji in meduli (Heyman et al., 2013; Palm et al., 2003). Ker kisikove mikroelektrode merijo povprečno parenhimsko napetost kisika, pričakujemo širši razpon pri bolnih ledvicah. Intracelularna napetost kisika se je zmanjšala na nič mmHg v modelu ishemične ledvice, katere lateralna ledvična arterija in vena sta bili vpeti (Hirakawa et al., 2015). Ob upoštevanju teh ugotovitev se je zdelo, da je obseg napetosti kisika na obroču HIF, približno 4–20 mmHg, verjeten in vivo.

Nadalje smo odkrili, da pH vpliva na tvorbo obroča HIF kot tudi na napetost kisika. Ker so tubularne epitelne celice v ledvicah nenehno izpostavljene urinarni tekočini, mora pH tubularnih celic vplivati ​​na pH urina. Glede na širok razpon pH v urinu smo se odločili preučiti celice, inkubirane pri pH 5.0–8,5. Obstajajo študije o območju pH v normalnih ledvicah. Ena študija je pokazala, da je bil pH skorje 7,39 ± 0.{{10}}8, medule pa 7,20 ± {{2{{39} }}}.09, kot je bilo izmerjeno z uporabo mikroelektrod (Burke et al., 1999). Druga študija z uporabo slikanja pH na podlagi MRI je pokazala vrednosti pH 7,3 ± 0.13 oziroma 7.0 ± 0,29 (Raghunand et al., 2003). Poročali so, da se je ledvični pH zmanjšal s 6,5 na 6,32 in na celo 5,83 v hudem primeru pri mišjem modelu KLB z acidozo (Pavuluri et al., 2019). Ta opažanja so zagotovila dokaze o padcu pH in variacijah KLB. Vendar pa vpliv pH na HIF-1, ki ga povzroči kronična hipoksija pri KLB, ni bil dovolj dobro raziskan. V tej študiji so opazili premik obroča HIF med pH 6,5 in pH 7,4, območje pH, ki je verjetno pri KLB. Ta rezultat je podprl hipotezo, da blago znižanje pH vpliva na kopičenje HIF-1 pri KLB. Na podlagi dokazov o padcu pH pod 6,0 ​​v hudih primerih KLB je treba oceniti tudi fiziološko stanje HIF-1 pri nižjem pH. Čeprav obstajajo poročila, da kislo okolje, tudi pri normoksiji, stabilizira HIF-1, je večina teh poročil preučevala pogoje zmerne kislosti nad pH 6,0 (Filatova et al., 2016; Mekhail et al., 2004). . V tem delu smo pokazali zatiranje kopičenja HIF-1 v tubularnih celicah pri pH 5,0 in oslabitev signalov HIF-1 v modelu pokrovnega stekelca, inkubiranem pri pH 5,0. Zato je lahko znižanje ledvičnega pH pri CKD in vivo povezano z nezadostno aktivacijo HIF, pa tudi z uremičnimi toksini v hipoksičnih ledvicah, kar poslabša napredovanje CKD (Tanaka et al., 2013).

Naša študija ima več omejitev. Prvič, na področju hipoperfuzije mora biti v gojiščih poleg pomanjkanja kisika in znižanega pH pomanjkanje hranil. Vendar pa je težko razmejiti učinke pH, napetosti kisika in drugih dejavnikov, ki jih povzroča hipoperfuzija. V telesu se v organih in celicah pojavi ishemija, patološka hipoperfuzija krvi, ki jo povzroči kombinacija pomanjkanja kisika in pomanjkanja hranil. Pomembno je razumeti razlike med zaznavanjem hipoksije in zaznavanjem ishemije. Kljub težavam pri razjasnitvi biološkega učinka vsakega dejavnika je naš model hipoperfuzije fiziološko verjeten in posnema patološko stanje in vivo. Drugič, izdelava modela pokrovnega stekeca zahteva spretnost in prakso, saj se je večina celic med odstranjevanjem pokrovnega stekeca občasno ločila, zlasti pri uporabi tradicionalne metode (slika S2a). Ta težava je bila odvisna od uporabljene celične linije. Na primer, težko smo nanesli model pokrovnega stekeca na celice HEK 293, ker je bil njihov oprijem na pokrovno stekelko relativno šibek. Tretjič, zaželeno je bilo zmanjšati poškodbe kultiviranih celic pod pokrovom. Število poškodovanih celic se je povečevalo s podaljševanjem časa, v katerem so bile pokrite, kar je pokazala analiza apoptoze. Ugotovili smo, da so bile 3 ure primerne za ocenjevanje obroča HIF, ko se je zdelo, da je statičen, in približno le 10 odstotkov celic je postalo apoptotičnih (slika S11). Četrta omejitev je bila težava pri pritrditvi gojenih celic na pokrovček na enoten način v vsakem vzorcu (slika S2b, c). Na študijo bi lahko vplivala tudi razlika v pritrditvi med tradicionalno in alternativno metodo izdelave modela pokrovnih ustnic. Izmerili smo razpon napetosti kisika, ki je enakovreden obroču HIF, s tehniko življenjske dobe fosforescence, pri kateri smo ustvarili model pokrovnega stekelca s tradicionalno metodo. Ker je bil obroč HIF med imunocitokemijo vizualiziran z alternativno metodo, je lahko resnična napetost kisika drugačna. Te napake smo zmanjšali na minimum z uporabo dokazov, da je bil pimonidazol pozitiven pri 10 mmHg ali manj napetosti kisika. Peta omejitev je, da znotrajcelični pH ni nujno enak pH-ju gojišča. Več preteklih poročil je pokazalo, da je intracelularni pH skladen s pH medija do določene mere v gojenih celicah (Michl et al., 2019), s spremembo pH medija bi lahko ocenili samo trend znotrajceličnega pH. In vivo je razmerje med pH intracelularnih in zunajceličnih regij, kot je urin ali telesna tekočina, bolj zapleteno kot v gojenih celicah. Zato bodo v prihodnosti potrebne nadaljnje študije o tem, kako premik pH uravnava kopičenje proteina HIF-1 in vivo.

Korist Cistanche: izboljšati ledvicafunkcijo

Druga omejitev je, da mora pH vplivati ​​na marker hipoksije, pimonidazol. V našem modelu pokrovnega stekelca smo primerjali razdaljo roba na pimonidazol pozitivnega območja od središča pokrovnega stekelca pri različnih pH pogojih. Rob območja, pozitivnega na pimonidazol, je bil primerljiv med pH 6,5, 7,4 in 8,5 (slika S12a,b). Prejšnja študija je tudi pokazala vzdrževanje vezave pimonidazola pri različnih vrednostih pH (Kleiter et al., 2006). Na podlagi teh dokazov smo ugotovili, da je pimonidazol ustrezen marker hipoksije za naše poskuse s pokrovnimi stekelci. Končna omejitev je, da glede na razpon napetosti kisika med približno 4 mmHg in 20 mmHg (0,52 odstotka O2 do 2,6 odstotka O2) obroča HIF, Pt(II)- in Pd(II)-porfirini, ki se pogosto uporabljajo kot biološki kisikove sonde imajo prednosti pri merjenju zelo nizkih koncentracij kisika zaradi bistveno daljše življenjske dobe fosforescence v primerjavi s tistimi, ki uporabljajo komplekse Ir(III) (Yoshihara et al., 2017). Vendar ima na splošno kvantitativna meritev kisika na podlagi fosforescence, izračunana z uporabo Stern–Volmerjeve enačbe, boljšo učinkovitost pri nizkih vrednostih O2 (Papkovsky & Zhdanov, 2016). Več predhodnih študij je pokazalo merjenje napetosti kisika na osnovi kompleksa Ir(III) do približno 10 mmHg (Akiyama et al., 2018; Yoshihara et al., 2015). Zato verjamemo, da mora biti razpon napetosti kisika v obroču HIF natančen rezultat.

5|SKLEPI

Če povzamemo, ugotovili smo, da je razumevanje vloge kisika in pH bistvenega pomena za razumevanje fiziološkega stanja HIF-1 pri kronični ledvični bolezni in ga je mogoče pridobiti s preiskovanjem tubularnih celic s hipoperfuzijo. Model pokrovnega stekla je bil s svojimi omejitvami dotoka medija dober model hipoperfuzije in vivo, zlasti v tubulih pri kronični ledvični bolezni, saj je redčenje peritubularnih kapilar glavni znak kronične ledvične bolezni (Mimura & Nangaku, 2010; Nangaku, 2006). Ta hipoperfuzijski model lahko posnema tudi gradiente kisika in pH in vivo, kot so tumorji in ishemične lezije. Model zagotavlja obetaven pristop k razjasnitvi teh bioloških mehanizmov.

NASPROTJE INTERESOV

Vsi avtorji nimajo navzkrižja interesov, ki bi ga morali prijaviti.

AVTORSKI PRISPEVKI

Vsi avtorji so prispevali k oblikovanju celotnega koncepta. TH je izvedel celotne poskuse. TH in YH sta analizirala rezultate in naredila številke. TH je napisal izvirni rokopis. KM, TY in ST so izvedli poskus s tehniko življenjske dobe fosforescence in uredili del rokopisa. YH, TT in MN so uredili celoten rokopis. Vsi avtorji so prebrali in potrdili končni rokopis.

REFERENCA

Akiyama, H., Takahashi, I., Shimoda, Y., Mukai, R., Yoshihara, T., & Tobita, S. (2018). Ir(iii) kompleksno slikanje s kisikom živih celic in očesnega fundusa z zaprto kamero ICCD. Fotokemijske in fotobiološke znanosti, 17(6), 846–853.

Akizawa, T., Nangaku, M., Yamaguchi, T., Arai, M., Koretomo, R., Maeda, K., Miyazawa, Y., & Hirakata, H. (2019). Enarodustat, konverzijsko in vzdrževalno zdravljenje anemije pri bolnikih na hemodializi: randomizirano, s placebom nadzorovano preskušanje faze 2b, ki mu sledi dolgoročno preskušanje. Nephron, 143 (2), 77–85.

Ameri, K., Burke, B., Lewis, CE, in Harris, AL (2002). Regulacija podganjega elementa VL30 v celicah raka dojke pri hipoksiji in anoksiji: vloga HIF-1. British Journal of Cancer, 87(10), 1173–1181.

Asai, H., Hirata, J., Hirano, A., Hirai, K., Seki, S., & Watanabe-Akanuma, M. (2016). Aktivacija arilnega ogljikovodikovega receptorja posreduje pri zatiranju ekspresije eritropoetina, odvisnega od hipoksije, z indoksil sulfatom. American Journal of Physiology. Celična fiziologija, 310 (2), C142–C150.

Burke, TJ, Malhotra, D. in Shapiro, JI (1999). Dejavniki, ki vzdržujejo gradient pH v ledvicah: vloga vaskulaturne arhitekture. Kidney International, 56 (5), 1826–1837.

Carrera, S., Senra, J., Acosta, MI, Althubiti, M., Hammond, EM, de Verdier, PJ, & Macip, S. (2014). Vloga transkripcijskega faktorja HIF-1alfa pri povečani delitvi celic pri fizioloških napetostih kisika. PLoS One, 9(5), e97938.

Chen, N., Hao, C., Peng, X., Lin, H., Yin, A., Hao, L., Tao, Y., Liang, X., Liu, Z., Xing, C., Chen, J., Luo, L., Zuo, L., Liao, Y., Liu, BC, Leong, R., Wang, C., Liu, C., Neff, T., … Yu, KHP (2019) ).

Roxadustat za anemijo pri bolnikih z boleznijo ledvic, ki niso na dializi. New England Journal of Medicine, 381(11), 1001–1010.

Chen, N., Qian, J., Chen, J., Yu, X., Mei, C., Hao, C., Jiang, G., Lin, H., Zhang, X., Zuo, L., He, Q., Fu, P., Li, X., Ni, D., Hemmerich, S., Liu, C., Szczech, L., Besarab, A., Neff, TB, … Valone, F.

H. (2017). Študije 2. faze oralnega zaviralca prolil hidroksilaze faktorja FG-4592, ki ga povzroči hipoksija, za zdravljenje anemije na Kitajskem. Nefrologija, dializa, transplantacija, 32(8), 1373–1386.

Chiang, CK, Tanaka, T., Inagi, R., Fujita, T., & Nangaku, M. (2011). Indoksil sulfat, predstavnik uremičnega toksina, zavira proizvodnjo eritropoetina na način, ki je odvisen od HIF. Laboratorijska preiskava, 91 (11), 1564–1571.

Chun, WJ, Nah, DY, Bae, JH, Chung, JW, Lee, H., in Moon, IS (2015). Raztopina glukoze, insulina in kalija ščiti ventrikularne miocite neonatalnih podgan v in vitro modelu ishemije/reperfuzije pokrovnega stekla. Korean Circulation Journal, 45(3), 234–241.

Coyne, DW, Goldsmith, D. in Macdougall, IC (2017). Nove možnosti za anemijo kronične ledvične bolezni. Kidney International Supplement, 7(3), 157–163. poljub.2017.09.002

Deng, A., Arndt, MA, Satriano, J., Singh, P., Rieg, T., Thomson, S. et al (2010). Ledvična zaščita pri kronični ledvični bolezni: hipoksija inducibilna aktivacija faktorja v primerjavi z blokado angiotenzina II. American Journal of Physiology. Ledvična fiziologija, 299 (6), F1365–F1373.

Filatova, A., Seidel, S., Bogurcu, N., Graf, S., Garvalov, BK, & Acker, T. (2016). Acidoza deluje prek HSP90 na način, neodvisen od doktorata/VHL, za spodbujanje delovanja HIF in vzdrževanje izvornih celic v gliomu. Raziskave raka, 76 (19), 5845–5856. LAHKO-15-2630

Goldfarb, M., Rosenberger, C., Abassi, Z., Shina, A., Zilbersat, F., Eckardt, KU, Rosen, S., & Heyman, SN (2006). Akutna in kronična ledvična odpoved pri podganah: funkcionalna kompenzacija in toleranca na hipoksijo. American Journal of Nephrology, 26(1), 22–33.

Heyman, SN, Rosenberger, C., Rosen, S. in Khamaisi, M. (2013). Zakaj je diabetes mellitus dejavnik tveganja za nefropatijo, ki jo povzroči kontrast? BioMed Research International, 2013, 123589.

Hirakawa, Y., Mizukami, K., Yoshihara, T., Takahashi, I., Khulan, P., Honda, T., Mimura, I., Tanaka, T., Tobita, S., in Nangaku, M. (2018). Intravitalno fosforescenčno slikanje ledvične skorje v celotnem življenju natančno meri ledvično hipoksijo. Kidney International, 93(6), 1483–1489.

Hirakawa, Y., Tanaka, T., & Nangaku, M. (2017). Ledvična hipoksija pri CKD; Patofiziologija in metode odkrivanja. Meje v fiziologiji, 8, 99.