Usklajeno uravnavanje sistemskega in ledvičnega metabolizma triptofana s prenašalcema zdravil OAT1 in OAT3

Jeffry C. Granados¹, Anne Richelle², Jahir M. Gutierrez¹, Patrick Zhang³, Xinlian Zhang⁴, Vibha Bhatnagar⁵, Nathan E. Lewis^1,2,6in Sanjay K. Nigam^2,7,*

^{Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com}

cistanche izkušnje

Ključno vprašanje je, kako organi zaznavajo presnovke v obtoku. Tukaj prikazujemo, da imajo multispecifični organski anionski transporterji zdravil, OAT1 (SLC22A6 ali NKT) in OAT3 (SLC22A8), vlogo pri občutku organov. Metabolomske analize seruma izločenih miši Oat1 in Oat3 so pokazale spremembe v derivatih triptofana, ki sodelujejo pri presnovi in ​​signalizaciji. Več teh metabolitov izhaja iz črevesnega mikrobioma in so vpleteni kot uremični toksini vkroničnoledvicabolezen. Neposredna interakcija s prenašalci je bila podprta s testi transporta na osnovi celic. Da bi ocenili vpliv izgube funkcije OAT1 ali OAT3 na ledvice, organ, kjer so ti privzemni prenašalci močno izraženi, so bili izločeni transkriptomski podatki preslikani na računalniški model, ki temelji na "metabolični nalogi", ki ocenjuje več kot 150 celičnih funkcij. Kljub spremembam metabolitov triptofana pri obeh izločitvah se je le pri izločitvi Oat1 povečalo več celičnih funkcij, povezanih s triptofanom. Tako se ledvice, prikrajšane za sposobnost jemanja kinurenina, kinurenata, antranilata in N-za-milantranilata prek OAT1, odzovejo z aktiviranjem lastnih biosintetskih poti, povezanih s triptofanom. Rezultati podpirajo teorijo daljinskega zaznavanja in signaliziranja, ki opisuje, kako prenašalci "zdravil" pomagajo optimizirati ravni metabolitov in signalnih molekul tako, da olajšajo navzkrižno poslušanje organov. Ker OAT1 in OAT3 zavirajo številna zdravila, podatki kažejo na možnost interakcij med zdravilom in presnovkom. Dejansko je zdravljenje ljudi s probenecidom, zaviralcem OAT, ki se uporablja za zdravljenje protina, povečalo presnovke triptofana v obtoku. Poleg tega, glede na to, da so regulativne agencije priporočile, da se zdravila testirajo na vezavo ali transport OAT1 in OAT3, sledi, da se ti presnovki lahko uporabljajo kot endogeni biomarkerji za ugotavljanje, ali kandidati za zdravila medsebojno delujejo z OAT1 in/ali OAT3.

Prenosnika organskih anionov OAT1 (SLC22A6, prvotno NKT (1)) in OAT3 (SLC22A8, prvotno ROCT (2)) najdemo v proksimalnem tubululedvicain horoidni pleksus možganov ter nadzorujejo fiziološko porazdelitev in izločanje številnih zdravil in okoljskih toksinov ter endogenih metabolitov, kot so -ketoglutarat, prostaglandini in urati (3, 4). Poleg tega OAT pomagajo uravnavati ravni zaužitih naravnih proizvodov in spojin, pridobljenih iz črevesnega mikrobioma (npr. epikatehin, 3-indoksil sulfat, p-krezol sulfat) (5, 6).

OAT1 in OAT3, člana družine SLC22, sta med najbolj znanimi multispecifičnimi prenašalci zdravil. Ta skupina prenašalcev zdravil vključuje druge člane superdružin SLC (nosilec raztopine) in ABC (ATP-binding cassette) (7, 8). Obstaja obsežna literatura o farmacevtskih in toksikoloških vlogah teh prenašalcev, vendar se endogene funkcije teh evolucijsko ohranjenih proteinov, kot tudi regulativna mreža, v kateri sodelujejo, šele začenjajo opisovati (9). Ti multispecifični transporterji vplivajo na številne vidike fiziologije in patofiziologije, verjetno tako, da delujejo v kombinaciji z mono- ali oligospecifičnimi transporterji. Trije dobro opredeljeni patofiziološki primeri so vloge OAT1, OAT3, URAT1 in ABCG2 pri protinu (10), vloga OAT1 in OAT3 pri kopičenju uremičnih toksinov, povezanih s kroničnimledvica(CKD) (11, 12) in družino SLC22 pri akutnemledvicapoškodba (13).

Zaradi velikega nabora majhnih organskih anionskih spojin, ki jih prenašata OAT1 in OAT3, lahko širok nabor ksenobiotikov in endogenih molekul tekmuje za dostop do teh prenašalcev OAT in njihov ledvični očistek (14, 15). To ima pomembne posledice, saj številni metaboliti, vključno s tistimi, ki izhajajo iz črevesnega mikrobioma in jih prenašata OAT1 in OAT3, uravnavajo endogeno fiziologijo in so povezani z razvojem kliničnih motenj, kot so kronična ledvična bolezen, presnovni sindrom in sladkorna bolezen (14, 16, 17). Na primer, količina CMPF (3-karboksi-4-metil-5-propil-2- furan propanojske kisline), substrata OAT3, v obtoku je bila povezana s sladkorno boleznijo. CMPF je metabolit furanove maščobne kisline, ki ga najdemo v ribjih oljih, rastlinskih oljih, maslu in drugih živilih ter moti delovanje celic trebušne slinavke, kar vodi v intoleranco za glukozo (18, 19). Potencialne posledice tekmovanja na ravni transporterja med zdravilom in transportiranim endogenim metabolitom vključujejo (a) spremenjene znotrajcelične koncentracije metabolitov, ker transportirano zdravilo blokira vstop metabolita v celico; (b) spremenjene serumske koncentracije zdravila, presnovka ali obojega, kar vodi do podaljšanih razpolovnih časov in/ali ravni metabolitov; in (c) spremenjen sistemski metabolizem, ki izhaja iz distalnih kaskadnih učinkov na več presnovnih poti, ki so odvisne od OAT1 ali OAT3 ali obeh.

Uporabili smo pristop sistemske biologije, ki je uporabil metabolomske in transkriptomske podatke miši Oat1 in Oat3knockout (KO), da bi analizirali glavne presnovne funkcije, na katere vplivata OAT1 in OAT3. Podatki o metabolomu seruma miši Oat1 in Oat3 KO so predstavljali vpliv, ki ga imajo ti transporterji na endogeni sistemski metabolizem. Uporabili smo transkriptomske podatke izledvica, ki je mesto izražanja kodirnih transportnih genov, za ovrednotenje aktivnosti na stotine presnovnih funkcij z uporabo analize presnovnih nalog. Pri tem smo lahko dopolnili razumevanje sprememb zunajceličnih presnovkov zaradi izgube prenašalca OAT1 ali OAT3 z analizo prizadetih znotrajceličnih presnovnih poti.

Pristop z več omikami in analiza sistemske biologije, uporabljena tukaj, skupaj zagotavljata portret lokalnih in sistemskih presnovnih in signalnih poti, ki jih ločeno in skupaj modulirata OAT1 in OAT3. Pokazali smo, da OAT1 ne le sistemsko uravnava presnovo triptofana, ampak ima tudi ključno vlogo v presnovnih poteh triptofana znotraj tkiva, kjer se nahaja. Tako naši rezultati kažejo, da študije novih zdravilnih entitet ne bi smele upoštevati le učinkov interakcije med zdravilom in presnovkom (DMI) v serumu, temveč tudi oceniti morebitne premike v celičnem metabolizmu zaradi izgube dotoka presnovkov zaradi konkurence na ravni transporterja. V podporo pomembnosti našega dela za ljudi smo pokazali, da so številne spremembe serumskih ravni presnovkov triptofana, opažene pri izločenih miših, opažene tudi pri ljudeh po dajanju probenecida, zdravila za zdravljenje protina, ki zavira OAT1 in OAT3.

\

cistanche moške koristi

Rezultati

Povzetek splošnega pristopa

Družina genov SLC22 (OAT, OCT, OCTN) kodira prenašalce, ki sodelujejo pri vnosu številnih edinstvenih spojin v več tkivih, čeprav se je velik del raziskav osredotočil na peščico članov (SLC22A1, SLC22A2, SLC22A6, SLC22A8), ki upravljajo veliko običajnih zdravil (20, 21). Vendar so ti geni zelo ohranjeni, z ortologi v muhi, črvu, ribah in morskem ježku (22); to pomeni, da imajo pomembne fiziološke vloge poleg ravnanja z zdravili. Da bi določili endogene vloge OAT1 in OAT3 pri nadzoru metabolizma na ravni tkiva in organizma, neodvisno od njune dobro znane vloge prenašalcev zdravil in toksinov, smo analizirali tkivno specifične transkriptomske podatke in podatke o serumski metabolomiki (slika 1). Primerjali smo podatke iz miši z gensko pomanjkljivostjo Oat1 ali Oat3 in njihovih kontrol divjega tipa. Ti nizi podatkov so bili predhodno preučeni s kemoinformatičnega vidika (23) in za zagotovitev širokega pregleda prizadetih poti (24), vendar tukaj poudarjamo njihovo specifično vlogo pri razporeditvi metabolitov triptofana. Ker se ta dva transporterja nahajata vledvica, smo analiziraliledvicatranskriptomske podatke z uporabo analize presnovnih nalog, sistemske biološke metode, ki združuje gene glede na njihove usklajene vloge v biosintezi omejenega nabora ključnih presnovnih intermediatov iz različnih presnovnih vnosov (za več podrobnosti glejte razdelek Metode). Te študije smo podprli v okviru preskusov transporta vitro; klinično pomembnost naših ugotovitev podpiramo tudi s podatki o človeški presnovi.

Znane značilnosti miši Oat1 KO in Oat3 KO Skoraj vse značilnosti miši s pomanjkanjem Oat1 ali Oat3 so podobne tistim miši divjega tipa (25–27) (tabela 1). Izločene miši so sposobne preživeti s preživetjem, primerljivim s preživetjem miši divjega tipa. Poleg tega ne kažejo nobenih očitnih razvojnih ali rastnih nepravilnosti, histološki in fiziološki pregled teh različnih izločenih (starih ~ 2–8 mesecev) pa je razkril malo ali nič razlik od divjega tipa, razen miši Oat3 KO, ki imajo nekoliko nižji krvni tlak ( 28). Opazili so tudi trend odlaganja lipidov v jetrih pri Oat1 KO, vendar le pri zelo starih miših (29).

Te miši z izločenim prenašalcem so bile opredeljene tudi s farmakološkega in toksikološkega vidika (tabela 2). OAT1 in OAT3 imata pomembno vlogo pri ravnanju z različnimi zdravili in toksini, tako okoljskimi kot endogeno proizvedenimi (30–38). Obe izločeni miši imata spremenjen odziv na diuretike zanke in tiazidne diuretike zaradi nezmožnosti teh zdravil za dostop do lumna nefrona – proces, ki je odvisen od privzema, ki ga posreduje OAT1-ali OAT3-, v celico proksimalnih tubulov . Živali Oat1 KO so zaradi pomanjkanja zaščitene pred nefrotoksičnostjo, ki jo povzroča živo srebroledvicaprivzem konjugatov živega srebra. Obe miši sta kopičili uremične toksine v serumu in pokazali zmanjšano izločanje sečne kisline. Ex vivo analiza tkiv miši Oat1 KO ali Oat3 KO kaže zmanjšan vnos več protivirusnih zdravil.

Poročali smo, da imajo lahko živali s pomanjkanjem ovsa zmanjšano izražanje OAT3 (39). Vendar pa so številne študije pokazale, da je funkcionalni učinek tega skromen v najboljšem primeru v bazalnem stanju. Na primer, knockout Oat1ledviceimajo izrazito zmanjšan transport PAH, vendar brez očitne izgube transporta substrata OAT3, estron sulfata (26). Kemoinformatska analiza je identificirala sklope molekularnih lastnosti, ki razlikujejo metabolite, spremenjene v Oat1, v primerjavi z mišmi s pomanjkanjem Oat3 (23). Poleg tega embrionalniledvicaorganske kulture obeh linij miši so prenašale različne skupine protivirusnih zdravil (36–38). Obstajajo tudi razlike v vrstah uremičnih toksinov, ki jih najdemo v Oat1 v primerjavi z Oat3 KO (34).

Presnova triptofana je sistemsko spremenjena pri miših Oat1 in Oat3 KO

Objavljene metabolomične analize miši Oat1 KO in Oat3 KO kažejo na fiziološko pomembne spremembe pri ravnanju z endogenimi metaboliti in produkti črevesnega mikrobioma, vključno z nekaterimi uremičnimi toksini (34, 35). Tukaj smo analizirali 731 metabolitov znane identitete v serumu, zbranem pri kontrolnih in Oat1 KO miši. Podobno je bilo v serumu kontrolnih in Oat3 KO miši odkritih 611 metabolitov znane identitete.

Pri miših Oat1 KO smo ugotovili, da je bilo 63 metabolitov v superpoti aminokislin (dodatna tabela S1) znatno povečanih (p Manj kot ali enako 0.05, 54 metabolitov, med katerimi je 12 metabolitov so imele spremembe gub, večje od 3) ali pa so se močno povečale (0,05 manj kot ali enako p manj kot ali enako 0,10, devet presnovkov), kar kaže na to, da so substrati OAT1 ali da so njihove serumske koncentracije odvisne od na OAT1. Za miši Oat3 KO smo ugotovili, da se je deset metabolitov v superpoti aminokislin znatno povečalo, medtem ko se je 11 nagibalo k znatnemu povečanju (dodatna tabela S2). Kot dopolnilo p-vrednostim smo izračunali tudi Cohenov d, ki je pokazal velike velikosti učinka (v razponu od 1,76 do 4,17) za metabolite triptofana. V skladu z drugimi farmakološkimi in fiziološkimi podatki, pridobljenimi iz izločenih miši OAT1 in OAT3 ali njihovih tkiv, ki kažejo na pomembne funkcionalne razlike (23, 36, 38), primerjava sprememb v serumskih presnovkih na način Amino Acid Superpath med Oat1 KO (63 presnovkov) in Miši Oat3 KO (21 metabolitov) so v teh podskupinah pokazale le deset prekrivajočih se metabolitov (dodatna tabela S3).

Vsak presnovek je bil s programsko opremo Metabolon razvrščen v eno od osmih superpoti (aminokisline, ogljikovi hidrati, kofaktorji in vitamini, energija, lipidi, nukleotidi, peptidi, ksenobiotiki) in eno od 90 podpoti. Od 17 metabolitov, ki so se znatno kopičili v serumu živali Oat1 KO in Oat3 KO, so štirje pripadali podpoti presnove triptofana, kar kaže, da imata ta dva prenašalca pomembno skupno vlogo pri uravnavanju sistemskega metabolizma triptofana (slika 2). . Neodvisno je bil metabolizem triptofana med najbolj obogatenimi podpotemi za oba modela izločitve (slika 3). Šestnajst Slika 3. Presnova triptofana je ena izmed najbolj spremenjenih poti pri obeh izločenih miših. Graf vulkana za Oat1 KO (n=5) ​​prikazuje metabolite triptofana v primerjavi z vsemi drugimi izmerjenimi metaboliti. B, presnova triptofana je druga najbolj obogatena pot za znatno povišane metabolite. C, graf vulkana za Oat3 KO (n=3), ki prikazuje metabolite triptofana v primerjavi z vsemi drugimi izmerjenimi metaboliti. D, metabolizem triptofana je najbolj obogatena pot za znatno povišane metabolite na podlagi analize podpoti presnove. Vloga OAT1 in OAT3 pri presnovi triptofana 4 J. Biol. Chem. (2021) 296 100575presnovke triptofana so izmerili v serumu obeh miši in 12 jih je bilo bistveno spremenjenih v vsaj eni skupini. Miši Oat1 KO so imele povišanih 11 metabolitov, vključno z enim (N-formilant hranilat), ki ni bil izmerjen v serumu Oat3 KO (tabela 3). Analiza Oat3 KO je razkrila, da je bilo šest od 16 metabolitov znatno spremenjenih ali pa so se močno spremenili. Znano je, da imajo nekateri od teh metabolitov, vključno s tistimi, ki izhajajo iz bakterij v črevesni mikroflori, distalne učinke na številne druge organe. Na primer, 3-indoksil sulfat je povezan z napredovanjemledvicabolezni in uremičnega sindroma (12, 40). Podatki kažejo, da OAT1 in OAT3 delujeta skupaj pri uravnavanju sistemske presnove triptofana, kljub temu pa imata tudi posebne funkcije v presnovi triptofana, tako da obravnavata različne nize metabolitov, ki vplivajo na različne biokemične reakcije.

Vrednotenje interakcij med zdravilom in metabolitom pri ljudeh, ki vključujejo zdravilo, ki zavira OAT, in presnovke triptofana

Probenecid, zdravilo za zdravljenje protina, so dajali ljudem, da bi ugotovili kratkoročni vpliv zdravila z visoko afiniteto, ki veže OAT, na ravni presnovkov v obtoku. Probenecid ima tri dobro uveljavljene tarče: SLC22A12 (URAT1, Rst), OAT1 in OAT3, ki so vsi tesno povezani geni v skupini prenašalcev organskih anionov družine nosilcev raztopin SLC22. URAT1 je prenašalec sečne kisline, ki se nahaja na apikalni membrani (stran proti urinu) proksimalnega tubula, zato se pričakuje, da bosta OAT1 in OAT3, ki sta večspecifična in se izražata na strani proksimalnega tubula, obrnjeni proti krvi, izvajala močnejši učinek na serumski metabolom. Primerjave presnovnih meritev v krvi pred odmerkom in 5 ur po njem kažejo velike spremembe v podpoti presnove triptofana (tabela 4). Zaradi različnih platform je bilo v tej podpoti 22 metabolitov, od katerih jih je bilo 16 bistveno spremenjenih. Štirinajst presnovkov je bilo izmerjenih na vseh treh platformah in razkrilo je več skupnih značilnosti med izločenimi mišmi in ljudmi, zdravljenimi s probenecidom (slika 4). Na primer, povečanja 3-indoksil sulfata, kinurenina, N-acetilkinurenina in indol laktata so opazili pri obeh skupinah izločenih miši in pri ljudeh. Vendar je bilo več prekrivanja med mišjo Oat1 KO in ljudmi, zdravljenimi s probenecidom. Vseh osem metabolitov, ki so bili znatno povišani v Oat1 KO, so bili tudi znatno povišani pri ljudeh, zdravljenih z zdravili. Le serotonin, ki je bil povišan pri miših Oat3 KO, pri ljudeh ni bil spremenjen.

Miši, zdravljene z zdravilom, ki zavira OAT, kažejo spremembe v presnovi triptofana

Kot posrednik med našimi izločenimi mišjimi modeli in ljudmi smo miši divjega tipa zdravili s probenecidom, dobro uveljavljenim zdravilom za zaviranje OAT. To zdravljenje z zdravili je povzročilo zvišanje šestih metabolitov triptofana, vključno s kinureninom, kinurenatom in indolelaktatom (slika 5). Ti presnovki so bili povišani v enem ali obeh poskusih izločitve in pri ljudeh, zdravljenih s probenecidom.

Tako skupni rezultati pri ljudeh in miših, zdravljenih s probenecidom, kot tudi pri miših z izločenimi celicami podpirajo vlogo OAT1 in OAT3 pri uravnavanju ravni presnovkov triptofana v obtoku.

Presnovki triptofana medsebojno delujejo s humanimi testi transporta OAT1 in OAT3 in vitro. Za potrditev naših ugotovitev smo izvedli teste transporta in vitro z uporabo celic, ki prekomerno izražajo humani OAT1 in OAT3. Številni metaboliti v tej podpoti so bili testirani glede na te prenašalce (tabela 3), drugi metaboliti pa ostajajo neraziskani. Preskusi transporta za indolocetno kislino (ILA) so pokazali, da ILA medsebojno deluje z OAT1 in OAT3 (IC50=229.1 ± 74,56 μM oziroma 74,49 ± 23,29 μM) (slika 6). Poleg tega je serotonin, ki je bil edinstveno povišan v Oat3 KO, deloval samo z OAT3 in vitro (IC50=288.2 ± 167.0 μM) (podatki niso prikazani). Vrednosti IC50 smo nato integrirali z znanimi vrednostmi Km za izračun inhibitornih konstant. Inhibicijska konstanta (Ki) za ILA z OAT1 je bila 119,3 μM.

Analiza presnovne naloge izločene ledvice kaže na ključno vlogo OAT1 pri zaznavanju metabolitov triptofana v proksimalnem tubulu

Uporabili smo podatke mikromrež izledviceOat1 KO, Oat3 KO in njihovih kontrol divjega tipa, da bi ugotovili, kako spremembe transporterja vplivajo naledvicapresnovne funkcije. V ta namen smo uporabili metodo sistemske biologije (analiza presnovnih nalog (41) iz orodja CellFie), ki napoveduje, kako spremembe v izražanju genov vplivajo na vnaprej določen seznam 175 presnovnih nalog (dodatna tabela S4), ki zajema splošne presnovne sisteme celice (energija, nukleotidi, ogljikovi hidrati, aminokisline, lipidi, vitamini in kofaktorji ter presnova glikanov). Kot je opisano v Metodah, izračun "rezultata presnovne naloge" zajema transkriptomske podatke in pripisuje rezultat genske aktivnosti za vsak gen. Model metabolizma na ravni genoma se uporablja za sestavljanje seznama reakcij, potrebnih za izvedbo vsake od 175 presnovnih nalog. Tako lahko transkriptomsko analizo neposredno uporabimo za kvantitativno primerjavo relativne aktivnosti vsake presnovne funkcije pod različnimi pogoji (npr. divji tip v primerjavi z Oat1 KO, divji tip v primerjavi z Oat3 KO).

Ugotovili smo, da so presnovne naloge, povezane s triptofanom, pogoste pri tistih z veliko razliko med Oat KO in mišmi divjega tipa. Nepričakovano pa je bilo, da jeledvicapresnovne naloge, povezane s triptofanom, so bile odvisne od OAT1, ne pa tudi od OAT3. Pri miših Oat1 KO je sinteza kinurenina, kinurenata, antranilata in N-za-milantranilata iz triptofana povečala rezultate presnovnih nalog, medtem ko je imela vsaka od teh nalog zmanjšan rezultat presnovnih nalog pri Oat3 KO. To je skladno z analizami serumske metabolomike, ki kažejo znatno zvišanje ravni kinurenina, kinurenata, antranilata in N-za-milantranilata v Oat1 KO.

Diskusija

OAT1 in OAT3 sta priznana po svoji vlogi pri izločanju več sto zdravil (42). Vendar pa so in vivo in in vitro študije OAT1 in OAT3 pokazale, da so ti proteini vključeni v transport številnih endogenih in iz črevesnih mikrobov pridobljenih presnovkov, uremičnih toksinov, signalnih molekul, zaužitih hranil, industrijskih toksinov in naravnih proizvodov (9, 24, 26, 34, 35, 43). Zdi se, da to velja tudi za druge multispecifične prenašalce zdravil, kar kaže na to, da je njihov prispevek k endogenemu metabolizmu zelo premalo cenjen (44).

Ti multispecifični prenašalci zdravil so močno izraženi v skoraj vseh tkivih in igrajo posebej kritično vlogo na sliki 4. Presnovki triptofana so bili povišani pri miših z izločenim ovsom in ljudeh, zdravljenih s probenecidom. Vennov diagram bistveno spremenjenih metabolitov triptofana pri izločenih miših in ljudeh, zdravljenih s probenecidom. Od 14 metabolitov, ki so skupni vsem trem platformam, jih je bilo 12 znatno povišanih v vsaj enem od poskusov. V vsakem poskusu so bili štirje metaboliti znatno povišani. B, kemijske strukture presnovkov, povišane v vsakem poskusu: 3-indoksil sulfat, indolelaktat, kinurenin in N-acetilkinurenin. C, škatlaste ploskve za vsak metabolit pri ljudeh, zdravljenih s probenecidom (n=20), miših Oat1 KO (n=5) in miših Oat3 KO (n=3). Črte v okvirjih označujejo mediano. Vloga OAT1 in OAT3 pri presnovi triptofana. Biol. Chem. (2021) 296 100575 7epitelne in endotelne pregrade med krvjo in drugimi telesnimi tekočinami/kompartmenti (npr. krvno-možganska pregrada, krvno-retinalna pregrada, krvno-možganska pregrada, pregrada med nosom in možgani, pregrada krv-urin). Kot regulatorji sistemskega metabolizma, pa tudi lokalnega metabolizma v njihovem tkivu izražanja, lahko vrsta študij in analiz, ki smo jih tukaj opisali, če se izvedejo za vse prenašalce "zdravil", radikalno spremeni naše fiziološke poglede na te evolucijsko ohranjene proteine.

Klinični farmacevtski pomen teh prenašalcev je ogromen in regulativne agencije so priporočile pregled novih entitet zdravil proti vsaj sedmim multispecifičnim prenašalcem zdravil (OAT1, OAT3, OATP1B1, OATP1B3, OCT2, P-GP, BCRP), da bi omejili možnost interakcije z zdravili (DDI) – primeri, ko dve ali več zdravil tekmujeta za dostop do istega prenašalca. DDI, posredovani s prenašalci, lahko spremenijo koncentracijo zdravil v krvi, kar lahko vodi do neželenih kliničnih učinkov (45). Glede na število substratov za OAT1 in OAT3 se lahko podoben pojav pojavi med zdravili in metaboliti v obtoku. Ti DMI lahko tudi vplivajo na delovanje tkiva, saj presnovki in signalne molekule morda ne morejo vstopiti v celico in izvajati svojih učinkov na normalno celično fiziologijo. Ta študija podpira to možnost.

V naših metabolomičnih analizah seruma izločenih miši Oat1 in Oat3 je prišlo do izrazitih sprememb presnovkov, povezanih s triptofanom. Povečanje sistemskih ravni presnovkov zaradi odsotnosti teh prenašalcev na meji krvi s krvjoledvica, je povečala možnost zmanjšane znotrajcelične koncentracije vledvicacelice proksimalnih tubulov. Kako se lahko te celice odzovejo? Za rešitev tega vprašanja smo uporabili analizo presnovnih nalog, ki temelji na transkriptomiki. Identificirali smo več lokalnih (ledvic) presnovnih nalog, povezanih s triptofanom, na katere vpliva odsotnost prenašalcev. Te spremembe v rezultatih presnovnih nalog so posledica kompenzacijskega povečanja izražanja genov, povezanih s presnovnimi nalogami, v kontekstu pomanjkanja OAT1. Medtem ko so bile številne presnovne poti raziskane z analizo presnovnih nalog, ki temelji na metabolomiki in na transkriptomiki, nam je uporaba obeh pristopov zagotovila edinstven vpogled v to, kako določeni prenašalci zdravil sodelujejo pri komunikaciji med tkivom in zunajceličnim okoljem. Medtem ko sta presnovke triptofana uravnavala oba prenašalca na sistemski ravni, so bile s triptofanom povezane presnovne naloge v ledvicah v prvi vrsti odvisne od OAT1.

Rezultati kažejo, da je proksimalni tubul vledvica, kjer najdemo OAT, ni le kanal za ledvično izločanje metabolitov triptofana; zazna presnovke triptofana in se odziva na spremembe v njihovi intracelularni številčnosti. Skupaj so podatki podprli stališče, da ima OAT1 ključno vlogo ne le pri čiščenju presnovkov, povezanih s triptofanom, iz obtoka s spodbujanjem njihovega vnosa vledvicaampak tudi, da ta prenašalec uravnava znotrajcelično presnovo, predvsem presnovo triptofana.

To podpira stališče, da je OAT1-posredovani transport kinurenina, kinurenata, antranilata in N-za-milantranilata pomemben zaledvicafunkcijo (slika 8). Ti štirje metaboliti pripadajo kinureninski podpoti razgradnje triptofana in razen kinurenata so vključeni v proizvodnjo celične energije s sintezo NAD plus (46). Tako je možno, da pomanjkanje OAT1 povzroči moteno celično presnovo, ki jo je mogoče vsaj delno obnoviti s proizvodnjo teh metabolitov.

Skoraj ves zaužiti triptofan se presnovi v tri glavne podpoti: kinurenin, serotonin in indol (47, 48). Poleg svoje vloge pri nastajanju NAD plus kinureninska podpot proizvaja metabolite, ki imajo različne funkcije tako v zdravem kot bolnem stanju (46, 49). Serotoninska pot proizvaja nevrotransmiter, serotonin, ki ima vlogo v številnih fizioloških procesih, predvsem kot regulator delovanja CNS (50). Indolna podpot, ki jo posreduje črevesni mikrobiom, proizvaja signalne molekule, ki sodelujejo pri komunikaciji gostitelj-mikrob (51). Sistemsko OAT1 in OAT3 modulirata biološko uporabnost presnovkov triptofana iz vsake od treh podpoti, čeprav večina presnovkov prihaja iz podpoti kinurenina in indola.

Glede na nešteto signalnih vlog, ki jih imajo povišani metaboliti, obstaja možnost, da OAT1 in OAT3 vplivata na številne vidike fiziologije. Na primer, kinurenat aktivira GPR35, tarčo zdravila, in GPCR, ki sodeluje pri vnetnih odzivih in srčno-žilnih boleznih (52). Številni bistveno spremenjeni presnovki triptofana so tudi uveljavljeni ali domnevni ligandi arilnega ogljikovodikovega receptorja (AhR) (tabela 3), transkripcijskega regulatorja, izraženega v skoraj vseh tkivih, ki se odzivajo na ksenobiotike (53).

Študije metabolomike dveh izločenih miši so pokazale, da je ključna endogena funkcija OAT1 in OAT3 uravnavanje sistemskih ravni metabolitov triptofana. Tako bi pričakovali, da bo zdravilo, ki cilja na OAT1 in OAT3, imelo podoben vpliv na metabolome. Kot je bilo predvideno, je bil prevodni potencial naših izločenih miši kot modelov DMI močno podprt z rezultati pri ljudeh, zdravljenih s probenecidom, zdravilom za zaviranje OAT, ki se po vsem svetu uporablja za zdravljenje protina. Več metabolitov triptofana je bilo povišanih v serumu ljudi in izločenih miši.

Tako obstaja možnost, da se spojine, povišane v študijah na ljudeh in glodalcih, uporabijo kot biomarkerji za nove entitete zdravil, ki lahko zavirajo OAT1 in OAT3. Medtem ko so bili izločeni mišji modeli (ki imajo normalno pričakovano življenjsko dobo) in ljudje, zdravljeni s probenecidom, zdravi, so nekateri povišani presnovki znani uremični toksini, ki so povečani v serumu ljudi s kronično odpovedjo ledvic in so povezani z negativnimi izidi (54 , 55). Prekrivanje presnovkov, ki so vpleteni v vidike kronične ledvične bolezni, in naše študije kažejo, da imajo lahko OAT ključno vlogo pri manifestacijah kronične ledvične bolezni ali njenem napredovanju, čeprav je možno tudi, da se koncentracije metabolitov povečajo zaradi izgube izločanja zaradi tkiva škoda (56, 57). CKD lahko vodi tudi do odpovedi več organov, deloma zaradi kopičenja uremičnih toksinov, deloma pa je to lahko posledica privzema v druga tkiva preko prenašalcev zdravil SLC in ABC (12, 58).

Pot presnove triptofana zahteva usklajeno delovanje več organov. Triptofan absorbira črevesje, spremenijo ga jetra ali drugi organi, presnovke pa na koncu prenašaledvica, delno prek funkcije OAT1 in OAT3. Običajno se na to gleda preprosto kot na pot izločanja. Naši rezultati, ki kažejo, da celice vledvicaodzovejo na odsotnost teh presnovkov in signalnih molekul tako, da se pripravijo na njihovo proizvodnjo, predlagajo drugače. Čeprav je njihova posebna vloga vledvicaproksimalni tubul slabo definiran, je jasno, da so številni proizvedeni intermediati nevrotransmiterji in imajo pomembno vlogo pri delovanju CNS (46, 49, 59, 60). Poleg medorganske komunikacije presnova triptofana odraža tudi medorganizmsko komunikacijo med gostiteljem in črevesnim mikrobiomom. Dejansko ima serum miši brez mikrobov znižane ravni 3-indoksil sulfata, indolepropionata in serotonina (61). Poleg tega so prejšnje študije pokazale, da v ledvičnih OAT1-pozitivnih celicah 3-indoksil sulfat deluje pri celični signalizaciji z aktiviranjem AhR in uravnavanjem lastnega izločanja prek OAT1 (62). Naše ugotovitve, da so bili presnovki, pridobljeni iz črevesja, povečani v serumu miši Oat1 KO in Oat3 KO – skupaj z našim dokazom, da so nekateri ligandi in vitro, zagotavljajo dodatno podporo za pomen teh prenašalcev pri uravnavanju komunikacije med gostiteljem in komenzalom. organizmi. Naši rezultati se skupaj ujemajo s teorijo daljinskega zaznavanja in signalizacije, ki predlaga, da prenašalci zdravil in encimi, ki presnavljajo zdravila, sodelujejo pri medorganski in medorganizmski komunikaciji s transportom in spreminjanjem majhnih molekul za vzdrževanje homeostaze (63, 64). Zato je ključnega pomena razumeti razpon endogenih fizioloških funkcij prenašalcev zdravil sistemsko in lokalno.

Z izboljšanimi metabolomičnimi podatki smo identificirali metabolite, na katere vpliva odsotnost OAT1 in OAT3 v modelih glodalcev, in metabolite, na katere vpliva inhibicija OAT1 in OAT3 pri ljudeh, zdravljenih z zdravili, ki zavirajo OAT. Naša skupina je že uporabljala mreže za rekonstrukcijo presnove za napovedovanje presnovne funkcije in poročala o več skupnih in edinstvenih poteh, ki jih urejata OAT1 in OAT3 (43, 65). Vendar so bile te študije omejene z zgodnjimi različicami orodij za rekonstrukcijo in zelo malo podatkov o metabolomiki. Tukaj je z uporabo drugačnega pristopa Metabolic Task Analysis dala veliko večji poudarek vlogi OAT1 v intracelularni presnovi triptofanaledvica. Naš pristop je mogoče uporabiti za raziskovanje endogenih funkcij drugih članov družine SLC in ABC in za izgradnjo ločenih, a prekrivajočih se mrež za vse te prenašalce zdravil, ki jih najdemo ne samo pri miših, temveč tudi pri polnih in črvih (20, 66). Takšne predstavitve bodo tudi olajšale razumevanje celotnega obsega DMI za zdravila, ki medsebojno delujejo z OAT1, OAT3 ali obema, kar verjetno presega preprosto konkurenco na ravni transporterja.

Eksperimentalni postopki

Živali

Vse eksperimentalne protokole, ki vključujejo uporabo živali, je odobril Odbor za institucionalno oskrbo in uporabo živali UCSD (IACUC). Z vsemi živalmi so ravnali v skladu z institucionalnimi smernicami o uporabi živih živali za raziskave. Odrasli samci WT, Oat1 KO in Oat3 KO so bili nameščeni ločeno v 12-h ciklu svetlo-temno in imeli so ad libitum dostop do hrane in vode. Te živali so bile opisane v prejšnjih publikacijah (26, 27). Miši, zdravljene s probenecidom, so 3 dni pred žrtvovanjem dnevno dobivale intraperitonealno injekcijo 200 mg/kg probenecida ali PBS. Končno injekcijo so dali 2 uri pred žrtvovanjem. Delno so opisani tudi nizi podatkov, uporabljeni za to analizo (23, 24). Nabor podatkov Oat1 KO je bil delno raziskan s kemoinformatičnega vidika, vendar podrobna analiza poti ni bila izvedena (23). Nabor podatkov Oat3 KO je bil ponovno analiziran in primerjani sta bili le dve skupini (24).

Študije na ljudeh s probenecidom

Vse eksperimentalne protokole je pregledal in odobril Institucionalni revizijski odbor in so v skladu s Helsinško deklaracijo etičnih načel. Vzorci polne krvi so bili zbrani pri 20 posameznikih (14 samic, 6 samcev). Povprečna starost je bila 30,85 ± 10,98, povprečni BMI pa 24,18 ± 3,52. Udeleženci, ki niso jemali nobenih zdravil in so bili v času študije na vegetarijanski dieti. Uporabili smo peroralni odmerek 1 grama probenecida in po 5 urah ponovno zbrali polno kri. Vsak vzorec je bil do metabolomične analize shranjen pri –80 stopinjah.

Metabolomika Vzorci človeškega seruma so bili takoj shranjeni pri –80 stopinjah in poslani na suhem ledu Metabolon Inc. Vzorci mišjega seruma so bili zbrani in analizirani, kot je opisano prej (23, 24). Če na kratko povzamem, je Metabolon Inc. za vsak vzorec izvedel ciljno metabolomično profiliranje. Za pripravo vsakega vzorca je bil uporabljen sistem MicroLab STAR podjetja Hamilton Company, za nadzor kakovosti pa je bilo dodanih več standardov izkoristka. Serum smo oborili z metanolom in mešali z Glen Mills GenoGrinder 2000, da smo odstranili proteine ​​iz seruma in sprostili molekule, vezane na te proteine. Nastalo raztopino smo razdelili na štiri manjše vzorce. Dva sta bila analizirana z masno spektrometrijo (MS) ultrazmogljive tekočinske kromatografije (UPLC) z reverzno fazo (RP) z ionizacijo v elektrospreju (ESI) s pozitivnim ionskim načinom. En vzorec je bil analiziran z RP/UPLC-MS/MS z negativnim ionskim načinom ESI. En vzorec je bil analiziran s HILIC/UPLC-MS/MS. Organsko topilo smo odstranili tako, da smo vsak vzorec postavili na TurboVap (Zymark).

Statistika

Pri človeških in mišjih vzorcih so bile neobdelane vrednosti normalizirane na volumen, logaritmično transformirane in manjkajoče vrednosti so bile nadomeščene z najnižjo opaženo vrednostjo za vsako spojino. V vzorcih človeškega seruma je bila statistična značilnost določena z uporabo kontrastov ANCOVA, ki vključujejo BMI in starost. Za vzorce mišjega seruma je bila pomembnost določena z uporabo Welchovega t-testa z dvema vzorcema z metaboliti, ki so dosegli statistično značilnost (p Manjši ali enak 0.05), kot tudi s tistimi, ki se približujejo pomembnosti ( 0.05 Manjše ali enako p Manjše ali enako 0,10), vključeno v nadaljnje analize. Obogatitev je bila določena z enačbo 1, kjer je k število bistveno spremenjenih metabolitov v podpoti, m število metabolitov v podpoti, n število bistveno spremenjenih metabolitov v skupnem nizu podatkov in N je število izmerjenih metabolitov v celotnem nizu podatkov.

Analiza presnovne naloge

Za kvantificiranjeledvičnapresnovne funkcije in vpliv sprememb transporterja OAT iz podatkov o izražanju genov (41) (tj. podatkov mikromrež iz ledvic Oat1 KO, Oat3 KO in njihovih kontrol divjega tipa). Ta analiza predvideva aktivnost kurirane zbirke na stotine nalog, ki pokrivajo sedem glavnih presnovnih dejavnosti celice (proizvodnja energije, nukleotidi, ogljikovi hidrati, aminokisline, lipidi, vitamini in kofaktorji ter metabolizem glikanov) neposredno iz transkriptomskih podatkov z uporabo genoma. pomanjšani modeli človeškega metabolizma. Natančneje, izračun relativne aktivnosti presnovne naloge (tj. rezultat presnovne naloge) temelji najprej na predhodni obdelavi razpoložljivih transkriptomskih podatkov in dodelitvi ocene aktivnosti gena za vsak gen (67). Model človeškega metabolizma na ravni genoma se nadalje uporablja za identifikacijo seznama reakcij, potrebnih za izvedbo vsake presnovne naloge, in s tem za identifikacijo seznama genov, ki lahko prispevajo k pridobitvi presnovne funkcije na podlagi pravil GPR (tj. , Pravila genske proteinske reakcije). Zato se ocena presnovne naloge izračuna kot povprečna ocena aktivnosti vseh genov, ki prispevajo k presnovni funkciji. Pri tem se lahko transkriptomski podatki neposredno uporabijo za kvantificiranje relativne aktivnosti vsake presnovne funkcije v določenem stanju.

In vitro transportni testi

Človeški zarodekledvica(HEK){0}} celice, ki stabilno prekomerno izražajo človeški OAT1 in OAT3 (Solvo Biotechnology), so bile gojene do sotočja v Dulbeccovem modificiranem Eagle's Medium (Invitrogen), dopolnjenem z 10 odstotki fetalnega govejega seruma in 1 odstotkom penicilina/streptomicina ter vzdrževane v 5 % CO2 pri 37 C. Celice, ki izražajo OAT1-, so bile izbrane v prisotnosti blasticidina, celice, ki izražajo OAT3-, pa so bile izbrane v prisotnosti puromicina. Obe celični liniji sta bili negativni na kontaminacijo z mikoplazmo. Pred funkcionalnimi testi so bile celice nanesene na 96-plošče z vdolbinicami, inkubirane 24 ur in dopolnjene z gojišči. Poskusi konkurenčnega privzema so bili izvedeni z inkubacijo celic v puferski raztopini s fiksno koncentracijo 10 μM6-karboksifluoresceina in serijsko razredčeno koncentracijo predlaganega substrata, ki se začne pri 2 mM. Pufer smo odstranili po 10--minutni inkubaciji pri sobni temperaturi in celice trikrat splaknili z DPBS. Fluorescenco FL smo nato ocenili z bralnikom fluorescenčnih plošč FL. Vrednosti IC50 so bile določene z GraphPad Prism 8.

Vrednosti fluorescenčne intenzivnosti so bile normalizirane, tako da je bila najnižja vrednost nastavljena na 0 odstotkov, najvišja vrednost pa na 100 odstotkov. Po normalizaciji so bili podatki prilagojeni nelinearnemu modelu in IC50 je bil določen z enačbo 2.

Ki je bil nato izračunan za vsak metabolit z uporabo Cheng–Prusoffove enačbe (enačba 3), pri čemer je bil Km za celice hOAT1 HEK293 izpeljan iz prejšnjih poskusov (68).

Razpoložljivost podatkov

Vsi pomembni podatki o metabolomiki so vsebovani v članku in dodatnem gradivu. Transkriptomski podatki so na voljo na zahtevo pri snigam@health.ucsd.edu. hipotezo, nadzoroval projekt, zasnoval eksperimente ter napisal in uredil članek.

Financiranje in dodatne informacije— To delo je podprlo štipendijo Nacionalnega inštituta za zdravje (NIH) za SKN iz Nacionalnega inštituta za splošne medicinske vede (NIGMS) (R01GM132938). Podpora za JCG izhaja iz štipendije za usposabljanje, ki jo podeljuje Nacionalni inštitut za biomedicinsko slikanje in bioinženiring (NIBIB) (T32EB009380) in dodatka k R01GM132938. To delo je bilo delno financirano z velikodušnim financiranjem NIGMS za NEL (R35GM119850), Nacionalnega inštituta za alergije in nalezljive bolezni (NIAID) za NEL (UH2AI153029), štipendijo LIFA za AR in štipendijo za JMG od mehiške vlade ( CONACYT) in Inštitut Kalifornijske univerze za Mehiko in ZDA (UC-MEXUS). Vsebina je izključno odgovornost avtorjev in ne predstavlja nujno uradnih stališč NIH. Nekatere številke so bile ustvarjene s pomočjo Biorenderja. Ta članek je posvečen spominu na Vibho Bhatnagar, MD, MPH.

Nasprotja interesov—Avtorji izjavljajo, da niso v nasprotju interesov z vsebino tega članka.

Okrajšave—Uporabljene okrajšave so: AhR, arilni ogljikovodikov receptor; CKD, kroničnaledvicabolezen; DMI, interakcija med zdravilom in presnovkom; ESI, elektrosprejna ionizacija; HEK, človeški zarodekledvica; ILA, indol ocetna kislina; KO, knockout; RP/UPLC/MS, reverzno-fazna tekočinska kromatografija – masna spektrometrija.

Cistanche tubulosa preprečuje bolezni ledvic, kliknite tukaj za vzorec

Od 1Oddelka za bioinženiring, 2Oddelka za pediatrijo, 3Oddelka za biologijo, 4Oddelka za biostatistiko in bioinformatiko, Oddelka za družinsko medicino in javno zdravje, 5Oddelka za družinsko in preventivno medicino, 6Center za biotrajnost Fundacije NovoNordisk pri UC San Diego in 7Oddelka za medicino, Kalifornijska univerza SanDiego, La Jolla, Kalifornija, ZDA Uredilo

avtorja Mike Shipston

Reference

1. LopezNieto, CE, You, GF, Bush, KT, Barros, EJG, Beier, DR, in Nigam, SK (1997) Molekularno kloniranje in karakterizacija NKT, genskega produkta, povezanega z družino prenašalcev organskih kationov, ki je skoraj izključno izraženo vledvica. J. Biol. Chem. 272, 6471–6478

2. Brady, KP, Dushkin, H., Fornzler, D., Koike, T., Magner, F., Her, H., Gullans, S., Segre, GV, Green, RM, in Beier, DR (1999) ) Nov domnevni transporter se preslika na mutacijo osteoskleroze (oc) in ni izražen v mutirani mišji OC. Genomika 56, 254–261

3. Riedmaier, AE, Nies, AT, Schaeffeler, E. in Schwab, M. (2012) Organski transporterji anionov in njihove implikacije v farmakoterapiji. Pharmacol. Rev. 64, 421–449

4. Ahn, SY in Bhatnagar, V. (2008) Posodobitev molekularne fiziologije transporterjev organskih anionov. Curr. Opin. Nefrol. hipertenzije. 17, 499–505

5. Nigam, SK (2018) Družina prenašalcev SLC22: paradigma za vpliv prenašalcev zdravil na presnovne poti, signalizacijo in bolezen. Annu. Rev. Pharmacol. 58, 663–687

6. Lowenstein, J., in Grantham, JJ (2016) Ponovno rojstvo zanimanja za delovanje ledvičnih tubulov. Am. J. Physiol. Renal 310, F1351–F1355

7. Govindarajan, R., in Sparreboom, A. (2016) Prenašalci drog: napredek in priložnosti. Clin. Pharmacol. Ther. 100, 398–403

8. Vi, GF, in Morris, ME (2014) Predgovor. V Molekularna karakterizacija prenašalcev zdravil in vloga pri odstranjevanju zdravil, 2. izdaja. Wiley Ser Drug Disc, Hoboken, NJ. Xix

9. Nigam, SK, Wu, W., Bush, KT, Hoenig, MP, Blantz, RC, in Bhatnagar, V. (2015) Ravnanje z zdravili, metaboliti in uremičnimi toksiniledvicaprenašalci zdravil v proksimalnih tubulih. Clin. J. Am. Soc. Nefrol. 10, 2039–2049

10. Bhatnagar, V., Richard, EL, Wu, W., Nievergelt, CM, Lipkowitz, MS, Jeff, J., Maihofer, AX, in Nigam, SK (2016) Analiza ABCG2 in drugih prenašalcev urata v sečni kislini homeostazo pri kroničnemledvicabolezen: potencialna vloga daljinskega zaznavanja in signalizacije. Clin.LedvicaJ. 9, 444–453 Vloga OAT1 in OAT3 pri presnovi triptofana

12 J. Biol. Chem. (2021) 296 100575

11. Nigam, SK in Bhatnagar, V. (2018) Sistemska biologija transporterjev sečne kisline: Vloga daljinskega zaznavanja in signalizacije. Curr. Opin. Nefrol. hipertenzije. 27, 305–313

12. Nigam, SK in Bush, KT (2019) Uremični sindrom kroničneledvicabolezen: Spremenjeno daljinsko zaznavanje in signalizacija. Nat. Rev. Nephrol. 15, 301–316

13. Saito, H. (2010) Patofiziološka regulacija transporterjev ledvične organizacije SLC22A pri akutnemledvicapoškodbe: farmakološke in toksikološke posledice. Pharmacol. Terapevt. 125, 79–91

14. Lepist, EI in Ray, AS (2017) Poleg interakcij med zdravili: Učinki inhibicije transporterja na antibiotike, hranila in toksine. Strokovno mnenje. Zdravilo Metab. Toxicol. 13, 1075–1087

15. Duan, P., Li, SS, Ai, N., Hu, LQ, Welsh, WJ in You, GF (2012) Močni zaviralci človeških organskih anionskih transporterjev 1 in 3 iz kliničnih knjižnic zdravil: Odkritje in molekularna karakterizacija . Mol. Farmacevt. 9, 3340–3346

16. Evers, R., Piquette-Miller, M., Polli, JW, Russel, FGM, Sprowl, JA, Tohyama, K., Ware, JA, de Wildt, SN, Xie, W., Brouwer, KLR in Consortium, IT (2018) Z boleznijo povezane spremembe v prenašalcih zdravil lahko vplivajo na farmakokinetiko in/ali toksičnost zdravil: Bela knjiga Mednarodnega konzorcija transporterjev. Clin. Pharmacol. Ther.104, 900–915

17. Masereeuw, R., Mutsaers, HA, Toyohara, T., Abe, T., Jhawar, S., Sweet, DH, in Lowenstein, J. (2014)ledvicain odstranjevanje uremičnega toksina: glomerul ali tubul? Semin. Nefrol. 34, 191–208

18. Liu, Y., Prentice, KJ, Eversley, JA, Hu, C., Batchuluun, B., Leavey, K., Hansen, JB, Wei, DW, Cox, B., Dai, FHF, Jia, WP , in Wheeler, MB (2016) Hitro zvišanje CMPF je lahko prelomna točka pri razvoju sladkorne bolezni. Cell Rep. 14, 2889–2900

19. Prentice, KJ, Luu, L., Allister, EM, Liu, Y., Jun, LS, Sloop, KW, Hardy, AB, Wei, L., Jia, WP, Fantus, IG, Sweet, DH, Sweeney , G., Retnakaran, R., Dai, FF, in Wheeler, MB (2014) Presnovek furanove maščobne kisline CMPF je pri sladkorni bolezni povišan in povzroča disfunkcijo beta celic. Cell Metab. 19, 653–666

20. Engelhart, DC, Granados, JC, Shi, D., Saier, MH, Jr., Baker, ME, Jr., Abagyan, R., in Nigam, SK (2020) Sistemska biološka analiza razkriva osem podskupin prenašalcev SLC22, vključno z OAT, OCT in OCTN.Int. J. Mol. Sci. 21, 1791