Transgenski model razkriva vlogo Klotha pri razvoju raka trebušne slinavke in utira pot novi terapiji, ki temelji na Klothu

Kliknite prosimoscar.xiao@wecistanche.comza več informacij

Preprost povzetek:Naš cilj je bil preučiti vlogo proteina klotho proti staranju in njegove izločene izoforme, UK, pri raku trebušne slinavke. Trije modeli in vivo, vključno z novim genetskim mišjim modelom in bioinformatičnimi analizami, so pokazali, da je kloto zaviralec tumorja pri duktalnem adenokarcinomu trebušne slinavke in razkrili edinstven vzorec hipermetilacije kloto DNA pri tumorjih trebušne slinavke. Ti rezultati imajo pomembno prognostično vrednost in nadalje kažejo, da lahko služi kot terapevtsko sredstvo za duktalni adenokarcinom trebušne slinavke.

Za več informacij kliknite tukaj

Povzetek: Klotho je transmembranski protein proti staranju, ki se lahko izloči in lahko deluje kot hormon. Podatki, ki se kopičijo, kažejo, da je klotho tumorski supresor v številnih malignih obolenjih, in označujejo poddomeno KL1 kot aktivno regijo proteina za to aktivnost. Naš cilj je bil preučiti vlogo klotha kot tumorskega supresorja pri duktalnem adenokarcinomu trebušne slinavke (PDAC). Bioinformatične analize naborov podatkov The Cancer Genome Atlas (TCGA) so pokazale korelacijo med preživetjem bolnikov s PDAC, stopnjami izražanja klotho in metilacijo DNK ter pokazale edinstven vzorec hipermetilacije klotho v tumorjih trebušne slinavke. Učinke klotho in KL1 in vivo so pregledali s tremi mišjimi modeli. Z uporabo novega genetskega modela, ki združuje uničenje pankreasa klotho z mutacijo v Krasu, je pomanjkanje klotho prispevalo k nastanku PDAC in zmanjšalo preživetje miši. V modelu ksenografta je dajanje virusnih delcev, ki nosijo sky, spojeno izoformo klotho, ki vsebuje domeno KL1, zaviralo tumorje trebušne slinavke.kupi cistancheNazadnje je zdravljenje s topnim skyom podaljšalo preživetje Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus ; Trp53R172H/ plus (KPC) miši, model, za katerega je znano, da povzame človeški PDAC.bioflavonoidi,Skratka, ta študija zagotavlja dokaze, da je klotho zaviralec tumorja pri PDAC. Poleg tega ti podatki kažejo, da bi lahko imele ravni izražanja klotho in metilacije DNA prognostično vrednost pri bolnikih s PDAC in da lahko uporaba eksogenega sKL služi kot nova terapevtska strategija za zdravljenje PDAC.

Ključne besede:kloto; KL1; sKL; tumorski supresor; rak trebušne slinavke; PDAC

1. Uvod

Rak trebušne slinavke je med najbolj agresivnimi oblikami raka z 5-letno stopnjo preživetja 9 odstotkov. Incidenca in umrljivost naraščata, saj se samo v ZDA leta 2021 pričakuje 60.430 novih primerov in 48.220 smrti[1]. Duktalni adenokarcinom trebušne slinavke (PDAC) predstavlja 85-90 odstotkov vseh malignih neoplazem trebušne slinavke. Trenutni modeli kažejo na njegov razvoj od benigne intraepitelijske neoplazije trebušne slinavke (PanlN)1-3 do invazivnega karcinoma, skupaj s pridobitvijo genetskih mutacij. Aktivacija Krasa velja za prvi korak k malignosti [2] in na mišjih modelih vodi do razvoja PanIN do 9 mesecev [3]. Čeprav je očiten PDAC pri teh miših redek, se v modelu KPC, ki združuje mutacijo Kras z izgubo tumorskega supresorja p53 [4], PDAC običajno razvije pri starosti 3-6 mesecev [5].

Cistanche lahko upočasni staranje

Klotho (tukaj uporabljen kot klotho) je transmembranski protein tipa I, ki sodeluje pri uravnavanju staranja [6]. Pri miših pomanjkanje kloto vodi do sindroma, ki spominja na pospešeno staranje, medtem ko čezmerna ekspresija kloto podaljša življenjsko dobo [7,8]. Zunajcelično območje kloto je sestavljeno iz dveh homolognih domen, KL1 in KL2, ki se lahko odcepita od membrane in delujeta kot krožeči hormoni [9-11]. Izloča se druga, diferencialno spojena izoforma kloto (UK). Nebo je identično KL1, plus 15 dodatnih aminokislin na C-koncu. Opisane so bile različne dejavnosti klotha, vključno z aktivacijo signalizacije fibroblastnega rastnega faktorja (FGF)23 [12,13], regulacijo prehodnega potencialnega receptorskega potenciala kationskega kanala poddružine V (TRPV)5 kalcijevega kanala [14,15] in inhibicijo poti insulina in insulinu podobnega rastnega faktorja (IGF)-1 [8,16,17].

Klotho se izraža predvsem v ledvicah in možganih, pa tudi v različnih tkivih, vključno z eksokrino in endokrino trebušno slinavko [7,17-20]. Njegove fiziološke aktivnosti v trebušni slinavki je treba še določiti; vendar pa obstajajo dokazi o njegovi vpletenosti v uravnavanje homeostaze glukoze. Klotho inducira nastajanje in izločanje inzulina in vitro in in vivo, zmanjša občutljivost za inzulin pri miših in se zmanjša v otočkih trebušne slinavke bolnikov s sladkorno boleznijo tipa 2 (T2DM) [8,19-22]. Klotho je močan tumorski supresor pri številnih malignih boleznih, vključno z rakom prebavil [16,17,23-30]. Pri raku je epigenetsko utišan, tako klotho kot Karl zmanjšata rast rakavih celic in vitro in in vivo [16,17,23,25,26,28,31-33]. Pri raku trebušne slinavke je znižanje regulacije klotha povezano s preživetjem bolnikov. In vitro klotho zmanjša rast rakavih celic trebušne slinavke in zavira poti IGF-I in bFGF [17,34].

V tej študiji smo želeli razvozlati vlogo klotha kot tumorskega supresorja v PDAC z uporabo treh in vivo modelov. Z uporabo novega genetskega modela smo pokazali, da je knockdown trebušne slinavke klotho prispeval k razvoju PDAC in zmanjšal preživetje Kras mutiranih miši. V drugem modelu smo pokazali, da je dajanje virusnih delcev, ki prenašajo sKL, zaviralo tumorje trebušne slinavke v modelu ksenografta. Nazadnje je zdravljenje s topnim rekombinantnim nebom podaljšalo preživetje miši KPC. Ti rezultati kažejo vlogo kota kot pomembnega akterja pri razvoju PDAC in predlagajo klotho kot terapevtsko strategijo za zdravljenje bolnikov s PDAC.

2. Materiali in metode

2.1. Analiza TCGA z uporabo brskalnika UCSC Xena

Podatkovne nize genske ekspresije RNAseg (IlluminaHiSeq) in metilacije DNA (Methylation450k) za kohorto The Cancer Genome Atlas (TCGA)Raka trebušne slinavke (PAAD) so proučevali z uporabo brskalnika Xena Univerze v Kaliforniji Santa Cruz(UCSC) (http://xena.ucscenu/, dostopno 19. julija 2020)[35].cistanchZ uporabo brskalnika Xena so celotno preživetje in interval brez napredovanja bolezni pri bolnikih z rakom trebušne slinavke analizirali glede na izraze klotho ali metilacijo DNA KLOTHO in ustvarili so Kaplan-Meierjeve ploskve. Podvojeni posamezni podatki so bili odstranjeni s filtriranjem samo za primarne tumorje. Podatki o izražanju genov, podani v enotah log2(x plus 1), so bili razdeljeni v dve skupini glede na mediano; Podatki o metilaciji DNA so bili razdeljeni v dve skupini glede na spodnji in zgornji kvartil.

Za metilacijo KLOTHO DNA, specifično za mesto, so bili nadalje analizirani vzorci z nizkimi ali visokimi stopnjami izražanja klotho, kot je opredeljeno z spodnjim oziroma zgornjim kvartilom. Izračunane so bile vrednosti 36] za vsako metilacijsko mesto in korelacija z izražanjem kloto v ustreznem vzorcu je bila preučena s Pearsonovim korelacijskim koeficientom (r).

2.2. Kemikalije, protitelesa in konstrukti

Kemikalije, uporabljene v tej študiji, so vključevale topno človeško spojeno varianto klotho, ki vsebuje aminokisline34-549(ski domena; pristopna številka BAA24941.1), z 15-edinstvenim zaporedjem aminokislin na C-koncu({ {6}}; PeproTech Inc, Rocky Hill, NJ, ZDA); glukoza （Floris, Misgav, Izrael）, humani insulin （Actrapid; Novo Nordisk A/S, Bagsværd, Danska) in luciferin (122799; PerkinElmer, Waltham, MA, ZDA).

Protitelesa, uporabljena v tej študiji, so vključevala kontrolo izotipa IgG2a podgan (02-9688; Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, ZDA) in anti- -aktin (A5441; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, ZDA) . Protitelesa proti klotho, usmerjena proti domeni KL1 (KM2076), so bila prijazno darilo podjetja Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd., Tokio, Japonska.

2.3. Proizvodnja in čiščenje vektorja AAV

Vektorji AAV9, ničelni prazni vektor in sky (ki vsebujejo izločeno izoformo variante klotho spoja, pristopna številka BAA24941.1) so bili proizvedeni in prečiščeni v obratih stopnje 2 biološke varnosti United Mixta UAB-VHIR in Vector Production Unit (VPU) Na kratko , so bili vektorji ustvarjeni z uporabo sistema trojne transfekcije v celicah HEK293. Po 48 urah smo vektorje AAV pobrali, obdelali z benzonazo, očistili v gradientu jodiksanola in titrirali z uporabo PicoGreen [37]. Ekspresijo transgena je poganjal promotor CMV, kot je opisano prej [37].

2.4. Vzdrževanje živali

Vzdrževanje miši in poskusi so bili izvedeni v medicinskem centru Sourasky (Tel Aviv, Izrael) in v skladu s predpisi in standardi odbora za nego in uporabo živali medicinskega centra Sourasky.

Sevi miši, uporabljeni za transgenske modele, so bili vsi na mešanem ozadju C57BL/6 in JVB/NJ. Pdx1-Cre, LSL-KrasG12D/ plus in LSL-Trp53R172H/ plus t miši so bile prijazna darila dr. Ziva Gila (Technion-Izraelski inštitut za tehnologijo v Rambamu, Haifa, Izrael).

2.5. Modeli miši KLOTHO Knockdowm, specifični za trebušno slinavko

Da bi ciljali na knockdown KLOTHO na mišjo trebušno slinavko, so bile ustvarjene miši, ki so nosile floksirane alele KLOTHO (KLlox), kot je opisano prej [38].cistanche AvstralijaKeflex/flox miši so križali z mišmi Pdx1-Cre, pri čemer so izražali rekombinazo Cre, ki jo nadzira promotor Pdxl, in tako dobili Pdx1-Cre; KL-/-miši. Knockdown KLOTHO trebušne slinavke je bil potrjen z imunohistokemijo in nivoji mRNA, kot je opisano v nadaljevanju.

Da bi ustvarili miši, ki nosijo s promotorjem nadzorovan Pdxl knockdown KLOTHO in mutant Kras ekspresijo, so bile miši LSL-KrasG12D/ plus [3], ki so nosile zaporedje Lox-Stop-Lox, ki mu sledi mutirani alel Kras, križane z mišmi KLflox/flox. Te miši so nadalje križali z mišmi Pdx1-Cre, pri čemer so dobili Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus miši. LSL-KrasG12D/ plus so prav tako križali z mišmi Pdx1-Cre ločeno in ta Pdx1-Cre; Kot kontrolo smo uporabili miši KrasG12D/ plus. Miši so dnevno pregledovali glede znakov trpljenja, vključno s trdim dihanjem, velikimi spremembami teže in velikimi tumorji (več kot 1 cm), tiste, ki so izpolnjevale merila, ki jih je določil etični odbor, pa so žrtvovali. Miši so spremljali glede preživetja, pri čemer je bila smrt določena spontano ali po znakih, ki zahtevajo žrtvovanje. Zaradi hitre prebave tkiva trebušne slinavke s tekočinami trebušne slinavke smo lahko pregledali le trebušno slinavko miši, ki so bile žrtvovane. Tkiva smo pobrali in hranili v formaldehidu 24 ur, ki smo ga nato nadomestili s 70-odstotnim etanolom.

2.6. Študije ksenotransplantatov tumorjev pri miših

Samice atimičnih golih miši (ozadje BALB/c), stare {{0}} tednov, so bile kupljene pri Envigo RMS (Jeruzalem, Izrael). Miši so bile nameščene in vzdrževane v omarah z laminarnim tokom pod specifičnimi pogoji brez patogenov. Prvi dan poskusa so bile celice MIA PaCa-2, ki stabilno izražajo m-Cherry/luciferazo, subkutano (sc) inokulirane v njihove boke （n=21, celice 1 × 10 stopinj v 100 μL 5 % FCS DMEM medium）. Deset dni po inokulaciji tumorja so ji intramuskularno injicirali visok odmerek (5 × 1011 GC/mL, n=7) ali nizek odmerek (5 × 1010 GC/mL, n=6) človeškega AAV. (im).AAV-null je služil kot kontrola (5×1010 GC/mL, n=8). Tumorje smo merili z digitalnim merilnikom trikrat na teden, volumen pa izračunali po formuli za izračun volumna elipsoida (0,5 × dolžina × širina2). Na 20. dan poskusa so bili tumorji ovrednoteni in vivo s spremljanjem aktivnosti luciferaze celic MIA PaCa-2 z intraperitonealnim injiciranjem 150 ug/ml luciferina, intenziteta luciferaze pa je bila izmerjena z Biospase.

Istega dne se je poskus končal in miši so bile evtanazirane. Tumorje smo odstranili, stehtali in izmerili z digitalnim kalibrom. Kri je bila zbrana pred evtanazijo in ravni človeškega klotha so bile izmerjene v serumu z uporabo ELISA (IBL, Minneapolis, MN, ZDA). Za ELISA smo uporabili 50 mikrolitrov seruma na vzorec (v dvojnikih), test pa smo izvedli po navodilih proizvajalca. Korelacijo med težo tumorjev in človeškimi koncentracijami klotho v krvi smo preučili s Pearsonovim korelacijskim koeficientom.

2.7. Modeli miške KPC

Generacija miši KPC je bila opravljena s križanjem miši LSL-Trp53R172H/ plus [5], ki so nosile zaporedje Lox-Stop-Lox, čemur je sledil točkovno mutirani alel p53, ki deluje kot ničelna mutacija, z mišmi LSL-KrasG12D/ plus t. Te so bile nadalje križane z mišmi Pdx1-Cre, kar je povzročilo Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus ; Trp53R172H/ plus miši. Miši so bile ujemane glede na spol, starost in težo ter so bile naključno dodeljene za zdravljenje z intraperitonealnimi (ip) injekcijami topne človeške kože (15 mg/kg, dvakrat na teden) ali kontrolo nosilca (n =6 za skupina, zdravljena z nebom; n =7 za kontrolno skupino). Zdravljenje je trajalo do 30 tednov. Miši so dnevno pregledovali glede znakov trpljenja, vključno s trdim dihanjem, velikimi spremembami teže in velikimi tumorji (več kot 1 cm), tiste, ki so izpolnjevale merila, ki jih je določil etični odbor, pa so žrtvovali. Miši so spremljali glede preživetja, pri čemer je bila smrt določena spontano ali po znakih, ki zahtevajo žrtvovanje.

2.8. Genotipizacija

Mišji repi so bili vzeti pri starosti 3 tednov za genotipizacijo. DNK smo ekstrahirali z inkubacijo repa v raztopini za alkalno lizo, sestavljeno iz 250 μM NaOH in 2 μM dinatrijevega EDTA (pH 12.0), 30-60 min pri 95 stopinjah , čemur je sledila nevtralizacija z 0.4 mM Tris HCL (pH 5,0). DNK je bila nato podvržena PCR pomnoževanju za različne genotipe z uporabo REDTaq ReadyMix PCR Reaction Mix (Sigma-Aldrich, Rehovot, Izrael). Primerji so bili pri končni koncentraciji 1000 nM. Cikli PCR in primerji so podrobno opisani v tabeli S1. Izdelke smo podvrgli elektroforezi na 1,5-odstotnem agaroznem gelu in obarvali z etidijevim bromidom.

2.9. Imunohistokemijska (IHC) analiza

Tkiva so bila fiksirana v 4-odstotnem paraformaldehidu in vdelana tkiva so bila serijsko razrezana. Odseke smo bodisi obarvali s hematoksilinom in eozinom (H&E) in jih mikroskopsko pregledal izkušen patolog ali pa jih obarvali z IHC, kot je opisano. Za klotho IHC so bili s formalinom fiksirani in v parafin vdelani odseki, debeline 4 um, razvoskani v ksilenu in rehidrirani. Pridobivanje antigena smo izvedli z uporabo vroče kopeli (95 stopinj) 20 min v citratnem pufru pH6,0. Po 30-minutnem ohlajanju smo stekelca splaknili v TBS-tritonskem (TBS-T) pufru.koristi cistancheNato je bila izvedena blokada endogene peroksidaze 10 minut v 3 odstotkih H, O/metanola. Po izpiranju v TBS-T smo odseke blokirali 30 minut z uporabo 5 odstotkov BSA v TBS-T in jih kasneje čez noč inkubirali s primarnim protitelesom klotho pri 4 stopinjah. Detekcija je bila izvedena z ZytoChem Plus (HRP) enostopenjskim polimerom proti miši/zajcem/podganam (ZUC053; Zytomed Systems, Berlin, Nemčija). Podganji IgG2a je služil kot kontrola izotipa.

2.10. Verižna reakcija s polimerazo reverzne transkripcije (RT-PCR)

Pankreata iz žrtvovanega Pdxl-Cre; Kontrolne miši KL-/- in KLflox/flox so bile izrezane, zamrznjene v tekočem dušiku in shranjene pri -80 stopinjah. Po homogenizaciji trebušne slinavke smo celotno RNA pripravili z uporabo kompleta za izolacijo RNA (Sigma) in obratno prepisali z uporabo JScript cDNA SuperMix (Quanta BioSciences, Gaithersburg, MD, ZDA). cDNA smo pomnožili za kloto in -aktin (kot kontrolo nalaganja) z uporabo REDTaq ReadyMix PCR Reaction Mix (Sigma). PCR je bil optimiziran pri 94 stopinjah za 5 minut, čemur so sledili cikli po 30 s pri 94 stopinjah, 90 sekund pri 52,5 stopinjah in 20 s pri 72 stopinjah (45 ciklov za klotho, 25 ciklov za -aktin) in 10 minut pri 72 stopinj za podaljšanje z uporabo 12,5 pmol klotho primerjev (F,5-ACGTTCAAGTGGACACTACTCT-3'in R,5'-TTCTTIGGCTACAACCCCGTC-3') in 5 pmol -aktinskih primerjev (F,5' -TGTTACCAACTGGGACGACA-3'in R,5'-GGGGTGTTGA AGGTTCCAAA-3). Izdelke smo podvrgli elektroforezi na 1,5-odstotnem agaroznem gelu, obarvanem z etidijevim bromidom. Kvantifikacija je bila opravljena s programsko opremo ImageJ, National Institutes of Health, Bethesda, MD, ZDA.

2.11. Statistična analiza

Rezultati so predstavljeni kot povprečje ± SD ali SEM, kot je navedeno. Zvezne spremenljivke smo primerjali s t-testom, razen če je navedeno drugače. Vsi testi pomembnosti so bili dvostranski in p-vrednost manj kot ali enaka 0,05 je veljala za statistično pomembno. Korelacijo smo ocenili s Pearsonovim korelacijskim koeficientom (r). Analiza preživetja je bila narejena z uporabo log-rank testa.

3. Rezultati

3.1. Ravni ekspresije Klotho in metilacije DNA v tumorjih trebušne slinavke so v korelaciji s preživetjem bolnikov z rakom

Kohorto Cancer Genome Browser (TCGA) Pancreatic Cancer (PAAD) so pregledali z uporabo brskalnika Xena Univerze v Kaliforniji Santa Cruz (UCSC)[35]. Analize izražanja genov so pokazale zmanjšano celotno preživetje (OS) in interval brez napredovanja bolezni (PFI) za bolnike z rakom trebušne slinavke z nizkim izražanjem klotho tumorjev v primerjavi z visokim (n=89 za vsako skupino; slika 1A, B). Pregled podatkov o metilaciji je pokazal združljiv trend ovirane OS in PFI pri bolnikih, ki so imeli tumorje z visokimi ravnmi metilacije DNA KLOTHO, v primerjavi z nizkimi (n=45 oziroma n=46; slika 2A, B) .

Further analyses of gene expression and methylation data (Table S2) revealed three specific sites, evaluated by probes cg23282559, cg02441765, and cg25650964, which were hypermethylated(IDelta βI>0.15)and negatively correlated to klotho expression(Irl>0.3)pri človeškem raku trebušne slinavke (slika 2C-E).

3.2. Generacija trebušne slinavke KLOTHO knockdown miši

Brezpogojne izločene miši KLOTHO poginejo pri starosti približno 8-9 tednov [7], zato ne morejo služiti kot modeli za razvoj raka. Zato smo želeli usmeriti knockdown KLOTHO na pankreato miši. Za ta namen smo miši Pdx1-Cre križali z mišmi, ki so nosile floksirane alele KLOTHO, KLlox/lox [38], s čimer smo dobili Pdx1-Cre; KL-/- miši (slika 3A, B). Ravni RNA in beljakovin so potrdile uničenje pankreasa klotho (slika 3C-E). Pdx1-Cre; KL-77miši so sčasoma pokazale rahlo povečanje teže v primerjavi s kontrolo (slika 3F), vendar ni bilo razlik v serumski glukozi ali insulinu in toleranci za glukozo (slika S1).

Slika 3. Generacija trebušne slinavke KLOTHO knockdown miši. (A) Shematski diagram alela KLflox: mesta LoxP obkrožajo ekson 2 KLOTHO, kar vodi do njegovega ciljnega izpada v trebušni slinavki Pdx1-Cre; KL-/-miši. Zgornja plošča prikazuje floksirani alel, spodnja plošča prikazuje pričakovane rezultate rekombinacije Cre. (B) Reprezentativni gel, ki prikazuje produkte PCR genotipizacije miši KLOTHO: KL plus / plus (WT; 370 bp), KLl / plus (470 in 370 bp) in KLflox / flox (470 bp). (C,D) Pankreasna RNA je bila ekstrahirana iz Pdx1-Cre; KL-/-(n=7) in kontrolne miši (n=4). Ravni Klotho mRNA so bile določene s polkvantitativno RT-PCR in kvantificirane. Prikazan je reprezentativni gel (izvirni neobrezani madeži so na voljo na sliki S2). (E) Reprezentativno imunohistokemično kloto barvanje trebušne slinavke, izrezane iz Pdx1-Cre; KL-/- in kontrolne miši. Povečava: X20. Brez, brez. (F) Teža miši v obeh skupinah (n=5na skupino). Analizirano s ponavljajočimi se meritvami ANOVA.p=0.01. Podatki so predstavljeni kot povprečje ± SEM. Kontrola, miši KLflox/flox. Miši, ki so nosile trebušno slinavko knockdown KLOTHO in izražanje mutiranega Krasa, so nastale s križanjem Pdx1-Cre z LSL-KrasG12D/ plus [3] mišmi (Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus miši) in njihovim nadaljnjim križanjem z KLflox/lox miši (Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus miši). Analize so bile izvedene z uporabo mišjih samcev. Samice miši so bile izključene zaradi visoke stopnje analnih lezij v obeh Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus in Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus miših, kar je skladno s prejšnjimi poročili o mukokutanih papilomih pri takih miših [3].

3.3. Izguba trebušne slinavke Klotho prispeva k zmanjšanemu preživetju pri miših

V preživetju Pdx1-Cre ni bilo razlike; KL-/- miši v primerjavi s kontrolo). S spremljanjem miši 65 tednov smo nadaljevali s proučevanjem učinka kombiniranega knockdowna trebušne slinavke KLOTHO in mutacije Kras na preživetje. Smrt je nastopila spontano ali z evtanazijo, ko so se pojavili znaki hudega trpljenja ali tumorske obremenitve, ki je zahtevala žrtvovanje. Preživetje Pdx1-Cre; KL-/-;KrasG12D/ plus miši (n =21) ​​je bil zmanjšan v primerjavi s kontrolnim Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus miši (n=18; p= 0.02; slika 4A). Tako je do starosti 22 tednov 100 odstotkov (18/18) Pdx1-Cre; KrasGi2D/ plus miši so bile žive v primerjavi z 71 odstotki (15/21) Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus miši. Med skupinama niso opazili pomembnih sprememb v teži (slika 4B).

Slika 4. Knockdown KLOTHO trebušne slinavke prispeva k zmanjšanemu preživetju in inducira PDAC in vivo. (A) Kaplan-Meierjeve krivulje za Pdx1-Cre; KL-/-;KrasGi2D/ plus (n=21) v primerjavi s kontrolnimi Pdx1-Cre;KrasGi2D/ plus (n=18)miši.p=0.02.( B) Teža miši v obeh skupinah (n=19 na skupino). (CE) Pankreata je bila izrezana iz Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus (n=7, povprečna starost 36 tednov)in kontrolni Pdx1-Cre; KrasGi2D/ plus (n=8, povprečna starost 49 tednov) miši ob žrtvovanju. (C) Primerjava med patološko oceno trebušne slinavke, obarvane s H&E, obeh skupin. (D) Reprezentativno H&E barvanje trebušne slinavke, pridobljene iz 24-teden starih miši.Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus (desno): popolna izguba celične polarnosti, pomembna jedrska atipija in brstenje celičnih skupkov v duktalni lumen, skupaj s profuzno fibrozo in keratinom. Control Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus (levo): brez lezij. Povečava: ×10. (E) Reprezentativne lezije PanIN obeh skupin. Povečava: ×10.

3.4. Klotho sodeluje pri razvoju PDAC v Vioo

Na podlagi prejšnjih študij, ki so pokazale razvoj PDAC pri miših z mutacijo Kras in izgubo tumor supresorske aktivnosti [4], smo pregledali Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus mišja pankreata za lezije. Zaradi hitre prebave tkiva trebušne slinavke s tekočinami trebušne slinavke smo lahko uporabili samo trebušno slinavko miši, ki je bila žrtvovana. Vzorci Pdx1-Cre; KL-7-; KrasGi2D/ plus (n =7) ​​in nadzor Pdx1-Cre; Miši KrasGi2D/ plus (n =8) so bile podvržene patološki oceni (povprečna starost smrti: 36 oziroma 49 tednov). PDAC je bil identificiran v dveh Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus miši, vendar v nobeni od Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus miši, medtem ko je bil PanN2 opažen v dveh od Pdx1-Cre; KL-/-; KrasG12D/ plus miši in v štirih od Pdx1-Cre; KrasG12D/ plus miši (slika 4C). Prikazane so reprezentativne slike (slika 4D-E).

3.5. Zdravljenje s sKL zavira tumorje trebušne slinavke in podaljša preživetje in vivo

The potential of SQL treatment as a therapeutic strategy for PDAC was studied using two mouse models, a xenograft model treated with a viral skin vector, and the transgenic KPCmodel treated with soluble, recombinant sKL. For the xenograft model, m-Cherry/luciferase-labeled MIA PaCa-2 cells were s.c.inoculated into nude mice. Ten days later, mice were injected with adeno-associated viruses(AAV)encoding sKL(AAV-L) at two doses. Tumor load in mice inoculated with AAV skin was significantly lower compared to the control, reflected by smaller size, weight, and luciferase signals (Figure 5A-E). Importantly, tumor weights negatively correlated with human klotho blood levels in mice (Ir| >0.729; Slika 5F-G).

Drugi model, uporabljen za ta namen, je bil model KPC. Miši so ujemali glede na spol, starost in težo ter jih do 30 tednov zdravili z injekcijami topnega humanega sKL ali vehikla. Smrt je nastopila spontano ali z evtanazijo, ko so se pojavili znaki hudega trpljenja ali tumorske obremenitve, ki je zahtevala žrtvovanje. Preživetje miši, zdravljenih s sKL, se je povečalo v primerjavi s kontrolo (p=0.005; Slika 5H).

Slika 5. Zdravljenje s sKL zmanjša lokalno rast tumorja in podaljša preživetje in vivo. (AG) Atimične gole miši BALB/c so bile sc cepljene s celicami MIA PaCa-2, ki so stabilno izražale m-Cherry/luciferazo (1 × celice 10 stopinj na miš). Deset dni pozneje so miši injicirali visok odmerek AAV-sKL (5 × 1011 GC/mL, n=7), nizek odmerek AAV-sKL (5 × 1010 GC/mL, n{{13} }) ali kontrolni AAV-null (5 × 1010 GC/mL, n=8). (A) Volumen tumorja je bil izmerjen in vivo z digitalnim merilnikom. (B) Reprezentativne slike bioslikovanja aktivnosti luciferaze lokalnih tumorjev. (C) Aktivnost tumorske luciferaze je bila izmerjena s številom na minuto. (D) Reprezentativne slike tumorjev, pobranih na dan žrtvovanja. (E) Teža pobranih tumorjev. (F) Človeške ravni klotho v krvi. *str<0.05, was="" calculated="" using="" the="" kruskal-wallis="" test.="" (g)="" correlation="" between="" tumor="" weights="" and="" human="" klotho="" blood=""><0.05.r, pearson's="" correlation="" coefficient.="" (h)kpc="" mice="" were="" matched="" according="" to="" sex,="" age,="" and="" weight,="" and="" randomly="" assigned="" to="" receive="" treatment="" with="" i.p.injections="" of="" soluble="" human="" skin="" (15="" mg/kg,="" twice="" weekly)or="" vehicle="" control(n="6" for="" the="" sky-treated="" group;n="7" for="" the="" control="" group)for="" up="" to="" 30="" weeks.="" kaplan-meier="" curves="" of="" skin-treated="" and="" control="" mice="" are="" presented.p=""><0.05;*><0.005;*** p=""><0.0005 compared="" to="" control.="" error="" bars,="" mean="" ±="">

4. Razprava

Ta študija ugotavlja vlogo klotha kot tumorskega supresorja pri PDAC. Bioinformatične analize so pokazale korelacijo med preživetjem bolnikov s PDAC in stopnjami ekspresije klotho in metilacije DNK ter pokazale edinstven vzorec hipermetilacije KLOTHO v tumorjih trebušne slinavke. Z uporabo novega mišjega modela smo pokazali, da knockdown pankreasa klotho sodeluje z mutacijo Kras za zmanjšanje preživetja in ustvarjanje PDACin Vivo. Poleg tega je L zaviral rast tumorjev, ki izvirajo iz celic trebušne slinavke v modelu ksenotransplantata, in podaljšal preživetje miši KPC.

Klotho je epigenetsko utišan s hipermetilacijo promotorja v širokem naboru malignomov [16,23,25,26,28-31,33,39,40]. O tem so poročali tudi v majhnih kohortah pri PDAC, kot tudi v korelaciji med preživetjem bolnikov s PDAC ter stopnjami izražanja klotho in metilacije DNK [17, 34]. V skladu s tem je naša ocena OS, kot tudi PFI z uporabo podatkov, ki obsegajo 178 vzorcev PDAC, pokazala pozitivno povezavo z izražanjem klotho in ustrezno negativno povezavo z metilacijo DNA KLOTHO. Ti podatki nadalje kažejo, da lahko ekspresijo klotho uravnava metilacija DNA, in krepijo idejo, da bi ti parametri lahko služili za oceno prognoze bolnikov s PDAC.

Prejšnje študije metilacije DNK KLOTHO v PDAC [17,34] so temeljile na omejeni podskupini bolnikov in poskusih in vitro ter niso analizirale vzorca metilacije specifičnih mest znotraj celotnega gena KLOTHO. Trenutna analiza, ki temelji na zgoraj omenjenem obsežnem naboru podatkov, je pokazala, da tri specifična mesta, od katerih se dve nahajata znotraj CpGislanda v zadnjem eksonu KLOTHO, delujejo kot negativni regulatorji izražanja klotho s hipermetilacijo. Prej smo ugotovili, da je eno od teh mest, cg23282559, tudi hipermetilirano pri kolorektalnem raku [25]. Še vedno je treba ugotoviti, ali imajo ta mesta vlogo pri regulaciji klotha tudi pri drugih malignih boleznih.

Znano je, da se Klotho izraža v trebušni slinavki; vendar njegova vloga pri normalnem razvoju in delovanju trebušne slinavke še vedno ni znana. Medtem ko miši s pomanjkanjem klotho kažejo zmanjšano proizvodnjo inzulina, skupaj z dramatičnim povečanjem občutljivosti za inzulin [22], čezmerna ekspresija klotho pri miših povzroči povečan inzulin v krvi na tešče, ki ga spremlja inzulinska rezistenca [8]. Presenetljivo je, da mišji model, predstavljen v tej študiji, ki je nosil pankreasni klotho knockdown, ni pokazal očitnega fenotipa sladkorne bolezni ali spremenjene občutljivosti na insulin. Poleg tega ni bilo učinka na morfologijo trebušne slinavke, nastanek tumorja ali preživetje. Ti rezultati kažejo, da se lahko izguba pankreasnega klotha kompenzira s perifernimi učinki sistemskega klotha ali z drugimi mehanizmi. Poleg tega je razvoj sladkorne bolezni kompleksen proces, ki ni odvisen samo od trebušne slinavke, ampak tudi od jeter, mišic in maščobnega tkiva. Kot v našem modelu je bil klotho uničen predvsem v trebušni slinavki, lahko pojasni pomanjkanje sladkorne bolezni v tem mišjem modelu.

V skladu s predstavljenimi kliničnimi rezultati je Pdx1-Cre; KL-/-; Miši KrasG12D/ plus so imele krajšo življenjsko dobo v primerjavi s kontrolnimi Pdx1-Cre; KrasGi2D/ plus miši (48 proti 60 tednom). Čeprav nismo mogli patološko pregledati vse mišje trebušne slinavke, smo opazili večjo stopnjo očitnega PDAC pri Pdx1-Cre; KL-7-; KrasG12D/ plus miši v primerjavi s kontrolnimi Pdx1-Cre; KrasG2D/ plus miši. Ti rezultati dokazujejo pomen klotha pri razvoju malignih obolenj trebušne slinavke in preživetju in vivo. Fenotip Pdx1-Cre; KL-/-: KrasGl2D/ plus miši je manj izrazit v primerjavi z modeli, ki združujejo izgubo drugih tumorskih supresorjev z mutacijami Kras. Na primer, miši KPC imajo mediano preživetje le 5 mesecev [5]. Možno je, da je to posledica delne kompenzacije izgube lokalnega klota s krožečim klotom. Druga možnost je, da je preostalo izražanje klotho v trebušni slinavki lahko vplivalo na fenotip. Doseganje popolnega ciljnega utišanja klotha v prihodnjih študijah bi omogočilo boljše razumevanje njegove vloge v različnih tkivih, pa tudi protiutež med lokalnimi in sistemskimi učinki klotha.

Predstavili smo dva modela, ki prikazujeta terapevtski potencial klotha. V modelu miši s ksenotransplantatom so bile injekcije raka trebušne slinavke virusnega kožnega vektorja zelo učinkovite, ne le pri zaviranju rasti tumorja, ampak tudi pri zmanjševanju velikosti tumorjev. Zdravljenje se je začelo, ko so bili tumorji že vidni in vzpostavljeni, kar je pri večini bolnikov podobno času začetka zdravljenja. Rezultati kažejo, da bi jo lahko uporabili za gensko terapijo, s čimer bi zaobšli glavne ovire za stabilnost in učinkovito dostavo zdravil na osnovi beljakovin in peptidov. Poleg tega je bila ugotovljena negativna korelacija med težo tumorja in koncentracijo človeškega klotoha v krvi. Nadaljnje raziskave ravni klotha v krvi glede na njegov učinek lahko pomagajo pri napovedovanju, komu bi koristilo zdravljenje s klothom ali SQL, kot tudi pri ohranjanju ravni znotraj terapevtskega okna.

Razvoj terapij na osnovi klotha je cilj, ki si ga prizadevajo številne raziskovalne skupine, pa tudi farmacevtska podjetja. V zvezi z zdravljenjem raka je raziskanih več poti. Endogene ravni klotha lahko povečamo tako, da izkoristimo epigenetske mehanizme, za katere je dokazano, da vplivajo na izražanje klotha. Poročali so, da je promotor klotho močno metiliran pri mnogih oblikah raka in je tudi funkcija starosti. Tako lahko spojine, ki zavirajo DNA metil transferaze, postanejo terapevtska tarča za povečanje ekspresije klotho. Po drugi strani pa lahko raven povečamo z dodajanjem klotho eksogeno, na primer z uporabo genske terapije ali dostave rekombinantnega proteina klotho. Tukaj smo poročali o uvedbi aktivne regije klotho (L) z uporabo sistema AAVexpression, kar je povzročilo terapevtski učinek v modelu raka trebušne slinavke.

Nato smo pokazali, da je zdravljenje s topnim nebom podaljšalo preživetje miši KPC, model, za katerega je znano, da rekapitulira človeški PDAC. To je pokazalo učinek neba v imunsko kompetentnem gostitelju in izvornem tumorskem okolju, kar dodatno podpira možno uporabo SSL v kliničnih okoljih.

5. Sklepi

Skratka, ta študija je opredelila klotho kot močan tumorski supresor pri PDAC. Trenutni režimi zdravljenja PDAC ne zadostujejo in uporaba eksogenega sKL lahko služi kot nova strategija za zdravljenje PDAC.

Ta članek je izvleček iz Cancers 2021, 13, 6297. https://doi.org/10.3390/cancers13246297 https://www.mdpi.com/journal/cancers