Akteozid v kitajski naravni rastlini - Cistanche za izboljšanje ledvične bolezni--I. del

Kontakt: emily.li@wecistanche.com

Naravni produkt akteozida ublaži poškodbo ledvic pri miših s sladkorno boleznijo db/db in celicah HK-2 preko uravnavanja signalne poti NADPH/oksidaza-TGF-/Smad

Qinwen Wang|Xinxin Dai et.al

Ta študija je bila zasnovana za raziskovanje zaščitnih učinkov in mehanizmovakteozidna DKD pri samcih miši db/db s sladkorno boleznijo in celicah HK-2, povzročenih z visoko koncentracijo glukoze. Miši s sladkorno boleznijo db/db so bile naključno razdeljene v modelno skupino, skupino z metforminom, skupino z irbesartanom inakteozidskupina. Opazovali smo naravni produktakteozidki kaže pomemben učinek prizaščita ledvicz analizo biokemičnih indikatorjev in endogenih metabolitov, histopatološkimi opazovanji in western blotom. Celice HK-2, izpostavljene visoki glukozi, so bile uporabljene v poskusih in vitro. Molekularni mehanizmi so bili raziskani z RT-PCR in western blotom.Akteozidpreprečuje celice HK-2, ki jih povzroča visoka koncentracija glukoze, in miši s sladkorno boleznijo db/db z zaviranjem signalne poti NADPH/oksidaze-TGF-/Smad.Akteoziduravnavali moteno presnovno pot presnove lipidov, presnove glioksilatov in dikarboksilatov ter presnove arahidonske kisline. Odkrili smo naravni izdelekakteozidima pomemben učinek nazaščita ledvic.Ta študija je utrla pot nadaljnjemu raziskovanju patogeneze, zgodnji diagnozi in razvoju novega terapevtskega sredstva za DKD.

KLJUČNE BESEDE akteozid, diabetikbolezni ledvic, presnovno profiliranje, NADPH/oksidaza-TGF-/Smad signalna pot, ROS

del I

Acteoside zdravi ledvično bolezen

1|UVOD

Akteozidje reprezentativna sestavina feniletanoidnih glikozidov, široko razširjena v 79 rodovih rastlin, kot je Rehmannia glutinosa,Cistanche deserticola, in druge zdravilne rastline.Akteozidje značilna kofeinska kislina in hidroksitirozol, ki sta vezana na glukozni del preko estrskih oziroma glikozidnih vezi, z enoto ramnoze, povezano z molekulo glukoze (Zhao et al., 2015). Poroča se, daakteozidima široko farmakološko delovanje, kot nprledvicazaščita (Gan et al., 2018), antioksidacija (He et al., 2011), nevroprotekcija (Li, Zhou, Xu, Song in Lu, 2018), zaščita jeter (Lee et al., 2004), proti raku (Ohno , Inoue, Ogihara in Saracoglu, 2002) in tako naprej. Vendar pa zaščitni učinkiakteozidpri sladkorni boleznipoškodba ledvicso nejasni.

Sladkorna bolezen je ena najhitreje rastočih globalnih zdravstvenih težav 21. stoletja. Leta 2019 je ocenjeno, da ima sladkorno bolezen 463 milijonov ljudi, to število pa naj bi do leta 2030 doseglo 578 milijonov, do leta 2045 pa 700 milijonov. Svetovna razširjenost sladkorne bolezni hitro narašča, zlasti v državah v razvoju, in razširjenost sladkorne boleznibolezni ledvic(DKD) in končno stopnjoledvična bolezen(ESRD) še naprej narašča (Hu, 2011). DKD je eden od diabetičnih kroničnih mikrovaskularnih zapletov, ki se jih najbolj bojijo, in glavni vzrok za ESRD. Umrljivost zaradi vseh vzrokov pri posameznikih z DKD je približno 30-krat večja kot pri bolnikih s sladkorno boleznijo brez nefropatije. Nedavne študije to kažejoledvičnatubularni epitelijsko-mezenhimski prehod (EMT) in kopičenje ekstracitoplazemskega matriksa (ECM) vledvičnaintersticij igrajo ključne dejavnike v patogenezi DKD (He et al., 2015; Yao et al., 2014). Vse več študij je pokazalo, da napredovanjeledvičnafibrozo pri diabetični nefropatiji posredujejo številne signalne poti. TGF- je bil vpleten kot ključni patogeni dejavnik pri večini vrst KLB, povezanih s fibrozo, vključno z DKD (Lv & Zhang, 2019). Heteromerni signalni kompleks, ki izhaja iz vezave TGF- 1 na receptor tipa II in nato na receptor tipa I, transducira signale prek receptorsko reguliranih Smad (Smad2/3) in Smad skupnega partnerja (Smad4), kar vodi do transkripcijska regulacija ciljnih genov (Sierra et al., 2015). Kopičenje ROS lahko vodi do oksidativnega stresa v celici, kar povzroči poškodbe celičnih komponent, vključno z beljakovinami in DNK. Končno vodi oksidativni stres doledvičnafibrozo in upaddelovanje ledvic. NADPH oksidaze (NOX) veljajo za glavne vire nastajanja ROS pri diabetični nefropatiji in kroničnibolezni ledvic. Povečana regulacija in hiperaktivacija NOX prav tako verjetno prispevata k oksidativnemu stresu v patofizioloških fazah. Nadmorska višinaledvičnaRaven ROS prek aktivacije NOX, ki jo povzroča hiperglikemija, povzroči oksidativni stres, ki povzroči poškodbeledvična tkiva, ki povzroča DKD (Lee, An, Kim in Bae, 2020).

Metabolomika je nova in pomembna omična tehnologija za kvalitativno in kvantitativno analizo vseh majhnih molekularnih metabolitov v živih celicah, tkivih in telesnih tekočinah. Metabolomika kot nova disciplina za prepoznavanje splošnih presnovnih sprememb živih organizmov ponuja nov vpogled v preučevanje sladkorne bolezni in zapletov sladkorne bolezni (Lu, Xie, Jia in Jia, 2013).

Namen te študije je bil raziskati zaščitni učinek naravnega izdelkaakteozidna DKD diabetičnih samcev miši db/db in celic HK-2, inducirano z visoko glukozo in vitro, in njen mehanizem. Torej, v tej študiji so bile miši db/db sprejete za ocenoledvičnazaščitni učinkiakteozidin analizirali regulacijo različnih metabolitov v serumu, da bi osvetlili mehanizmeakteozid. Poleg tega in vitro model HK-2, povzročen z visoko koncentracijo glukoze, ocenjuje učinkovitostakteozidna miših db/db z določanjem ravni izražanja NADPH/oksidaze-TGF-/Smad signalne poti.

2|MATERIALI IN METODE

2.1|Kemikalije in instrumenti

Acetonitril stopnje UPLC je bil kupljen pri Mercku (Darmstadt, Nemčija); mravljinčno kislino smo kupili pri Sigma-Aldrich (Sigma, St. Louis, Missouri).Akteozid(Čistost večja ali enaka 98 odstotkom) je bilo kupljeno pri Nacionalnem inštitutu za nadzor hrane in zdravil (Peking, Kitajska). Strukturaakteozidje prikazano na sliki 1A. Komplet reagenta za dušik sečnine (BUN), komplet reagenta za aspartat aminotransferazo (GOT), komplet reagenta za alanin aminotransferazo (GPT), komplet reagenta za skupni holesterol (TCHO), komplet reagenta za trigliceride (TG), komplet reagenta za serumski kreatinin (Scr), urinski mikroalbumin (mALB) reagentni komplet in insulin (INS) reagentni komplet sta bila kupljena pri Nanjing Jiancheng Bioengineering Institute (Nanjing, Kitajska). Tablete metforminijevega klorida so bile kupljene pri Sino American Shanghai Squib Pharmaceutical Ltd; Irbesartan je bil kupljen pri Shenzhen Haibin Pharmaceutical Co., Ltd. DMEM in F12 sta bila kupljena pri GIBCO, Amerika; Prvo protitelo NOX1 (kataloška številka: ab121009), NOX2 (kataloška številka: ab129068), NOX4 (kataloška številka: ab154244) in Smad7 (kataloška številka: ab216428) je bilo kupljeno pri Abcam (Cambridge, Združeno kraljestvo). -SMA (kataloška številka: 19245), E-kadherin (kataloška številka: 3195), NF-κB p65 (kataloška številka: 8242), TGF- 1 (kataloška številka: 3711), Smad2 (kataloška številka: 5339) , prva protitelesa Smad3 (kataloška številka: 9523), Smad4 (kataloška številka: 46535) in PSmad2/3 (kataloška številka: 8828) so bila kupljena pri CST. Vse druge kemikalije in reagenti, uporabljeni v tej študiji, so bili analitske kakovosti in izdelani na Kitajskem.

Waters Acquity™ Ultra Performance LC sistem (Waters), opremljen s spektrometrom Quattro Micro MS in Waters Xevo TM G2 QTof MS (Waters MS Technologies, Manchester, New Hampshire). Deionizirano vodo smo prečistili na sistemu Milli-Q (Millipore, Bedford, Massachusetts). Za analizo podatkov je bila uporabljena delovna postaja Mass Lynx v4.1, uporabljena pa sta bila ultrahitra centrifuga pri nizki temperaturi (Thermo Scientific, Združeno kraljestvo) in mikroskop DMI3000M (Leica, Nemčija).

2.2|Pogoji poskusov na živalih

Vse eksperimentalne postopke in protokole, uporabljene v tej študiji, je pregledal in odobril Institucionalni odbor za etiko živali Univerze kitajske medicine Nanjing (Nanjing, Kitajska). Protokoli, opisani v tej študiji, so bili v skladu z institucionalnimi smernicami za nego in uporabo laboratorijskih živali. Miši so bile kupljene pri raziskovalnem centru za živalske modele Univerze v Nanjingu (potrdilo št. Su 2015–0001). Vsi poskusi so bili izvedeni z 8-teden starimi samci miši db/db in mišmi iz legla divjega tipa db/m ujemajoče se starosti z začetno telesno težo 30 40 g. Diabetični mišji model db/db je mednarodno priznan živalski model sladkorne bolezni. Študije so pokazale, da je mehanizem DKD pri db/db miših podoben kot pri ljudeh. Živali so bile nameščene v kletkah s konstantno vlažnostjo (približno 60 odstotkov ± 2 odstotka) in temperaturo (približno 23 ± 2 stopinji) ter s ciklom svetloba/tema 12 ur. Živali so bile v 3-tedenskem obdobju prilagajanja, med katerim so imele neomejen dostop do hrane in vode iz pipe. Po obdobju privajanja so miši db/db naključno razdelili v štiri skupine s šestimi v vsaki skupini: modelna skupina (normalna fiziološka raztopina, M), skupina z metforminom (250 mg kg^-1 d^-1, EJSG), skupina irbesartana (50 mg kg^-1 d^-1, EBST),akteozidskupina (70 mg kg^-1 d^-1, MRHTG), enkrat na dan (Gao, Peng, Huo, Liu in Yan, 2015). Poleg tega sta bila v tej študiji metformin in irbesartan izbrana kot zdravili za pozitivno kontrolo. Poročali so, da lahko irbesartan zniža krvni tlak, lipide v krvi inledvični lipid.Ne vpliva na glukozo v krvi in ​​jetrne lipide. Lahko izboljša delovanje in patološke spremembeledvicedb/db miši. Zaščitni učinek metformina naledvicase odraža v zmanjšanju proteinurije pri diabetičnih podganah in bolnikih s sladkorno boleznijo tipa 2. Odmerek metformina in irbesartana za živali je bil ekstrapoliran iz dnevnega odmerka za ljudi z uporabo metode normalizacije telesne površine. Nato so mišim dajali ustrezno zdravilo enkrat na dan z izpiranjem želodca 6 tednov, db/m miši pa so uporabili kot kontrolno skupino, ki so jim istočasno dajali enako količino fiziološke raztopine.

2,3|Zbiranje vzorcev

Med poskusnim obdobjem so telesno težo in ravni glukoze v krvi na tešče (FBG) beležili tedensko, ravni FBG so bile izmerjene s sistemom za spremljanje glukoze v krvi One Touch Ultra II (Life Scan, Milpitas, Kalifornija) v repni veni vsak ponedeljek (ob 8. uri zjutraj). ). Po 6 tednih dajanja so miši postili v presnovnih kletkah s prostim dostopom do vode za zbiranje 24-urnega urina. Vse vzorce urina smo po odvzemu takoj centrifugirali pri 3000 obratih na minuto 10 minut, supernatante pa ločili in shranili pri -80 stopinjah do analize. Na koncu študije so miši žrtvovali pod anestezijo z 10-odstotnim kloral hidratom (3 mg/kg) in zbrali kri za koncentracijo biokemičnih parametrov in študijo metabolomike. Nato smo vzorce krvi centrifugirali pri 3000 obratih na minuto 10 minut, vzorce seruma pa ločili in shranili pri -80 stopinjah do analize. Desna ledvica je bila odstranjena z enim delom, fiksiranim z 10-odstotnim nevtralnim puferskim formalinom za histološko preiskavo. Theledvičnakorteks je bil izoliran od drugega kosa in zamrznjen v tekočem dušiku za western blot.

Cistanche za zdravljenje odpovedi ledvic

2,4|Kultura in zdravljenje celic

Človeška linija RTEC HK{{0}} je bila pridobljena pri Nanjing Keygen Biotechnology Development Co., Ltd. Celoten medij je bil DMEM z nizko vsebnostjo glukoze z 10 odstotki FBS in 1 odstotkom raztopine penicilin-streptomicin. Celice HK-2 so gojili pri 37 stopinjah, 5 odstotkih CO2 in nasičeni vlagi. Celice so bile subkultivirane pri 80-odstotni konfluenci, ki so bile odstranjene iz inkubatorja, prvotni medij v posodi pa je bil zavržen. Celice smo sprali z 0,5 ml fiziološke raztopine fosfatnega pufra (PBS) in prebavili z obdelavo z 0,5 ml tripsina 1–2 minuti pri 37 stopinjah. Prebavo smo zaključili z uporabo 2 ml medija DMEM in celično suspenzijo nato centrifugirali pri 450 g 5 minut pri 4 °C. Supernatant smo zavrgli in celice resuspendirali v 2 ml ustreznega medija DMEM, da smo dobili enocelično suspenzijo. Celice smo zasejali v različne posode/mikroplošče z različnimi gostotami za nadaljnje eksperimentiranje, kot je opisano spodaj. Celice HK-2 smo nasadili na 96-plošče z vdolbinicami in posode, predhodno obdelane z DMEM z nizko vsebnostjo glukoze (5 mmol/L), inkubirane pri 37 °C in 5 odstotkih CO₂6 ur, nato pa so bili sinhronizirani. Eksperimentalne skupine so bile razdeljene na naslednji način: kontrolna skupina (C), brez intervencijskega faktorja; modelna skupina (M), v kateri so bile celice gojene v raztopini DMEM z visoko vsebnostjo glukoze (30 mmol/L); skupina za nadzor osmotskega tlaka (DMEM plus 24,5 mmol/L manitola, GLC); skupino irbesartana (25 mmol/L) inakteozid(MRHTG) pri petih odmerkih (5, 10, 25, 50 oziroma 100 μmol/L).

2,5|Celična morfologija

Celice HK-2 smo dvakrat sprali s PBS in jih pregledali pod invertnim mikroskopom (OLYMPUS IX51). Morfologijo celic smo opazovali pod 100 povečavami.

2,6|Meritve biokemičnih indikatorjev

Terapevtska učinkovitostakteozidna miših db/db ovrednotili ravni mALB v urinu ter FBG, INS, T-CHO, TG, Scr, GOT, GPT in BUN v serumu, ki so jih odkrili, čemur je sledil opis, ki ga je predložil proizvajalec kompleta.

2,7|Patološka analiza

Delledvičnakorteksa za barvanje s hematoksilin-eozinom (HE) in periodično kislino po Schiffu (PAS), da bi opazili patološke spremembe vledvičnega tkiva, stopnje fibrozne hiperplazije tkiva, strukture glomerulov in tubulov skozi elektronski mikroskop (400). Pri fotografiranju poskusite zapolniti celotno vidno polje zledvičnega tkivada zagotovite, da je svetloba ozadja vsake fotografije enaka. Programska oprema Image-Pro Plus 6.0 je bila uporabljena za izbiro iste rdeče-vijolične barve kot enotnega kriterija za ocenjevanje pozitiva vseh fotografij. Zbrano optično gostoto (IOD) pozitivne ekspresije bazalne membrane in površino slikovnih pik glomerularnega vaskularnega pleksusa (AREA) smo pridobili z analizo vsake fotografije in izračunali povprečno optično gostoto (IOD/AREA).

2,8|Western blotting

Tkivo ledvicin celice smo ekstrahirali z liznim pufrom; lizate smo centrifugirali. Po popolni pirolizi centrifugirajte 5 minut pri 12000 obratih na minuto in vzemite supernatant in supernatante smo zbrali. Za določanje koncentracije beljakovin je bil uporabljen komplet za koncentracijo beljakovin bicinhoninske kisline (BCA). Po kvantificiranju je bil protein ločen z 10 odstotki SDS-PAGE, prenesen na membrane PVDF, nato blokiran v 5 odstotkih BSA v TBST in inkubiran s primarnimi protitelesi, ki so jim sledila ustrezna sekundarna protitelesa. Reaktivnost protiteles je nato zaznal ECL in kvantificiral s programsko opremo ImageJ.Ledvična tkivavzorce smo analizirali z Western blotom za odkrivanje ravni izražanja -SMA, TGF- 1 (1:1300), Smad2 (1:3000), Smad3 (1:1000), P-Smad2/3 (1:500) ), beljakovine Smad4 (1:1000) in Smad7 (1:1000).

2,9|ELISA analiza

Izločanje monocitnega kemoatraktnega proteina -1 (MCP-1), interlevkina –1 (IL-1), faktorja tumorske nekroze- (TNF-) in interlevkina-6 (IL -6) v supernatantu vsake celice smo izmerili s kompletom ELISA.

2.10|PCR v realnem času

Poleg tega so bile te celice pripravljene za PCR v realnem času, da bi preučili nivoje izražanja NOX1, NOX2, NOX4, -SMA, E-kadherina, NF-κB p65, TGF- 1, Smad2, Smad3, Smad4 in Smad7 mRNA. Zbrane so bile celice v vsaki skupini (približno 1 107 celic). Totalno RNK smo ekstrahirali po Trizolovi enostopenjski metodi ter določili njeno čistost in koncentracijo. Z GAPDH kot interno referenco je bilo zaporedje primerjev naslednje. TGF- 1, smiselni primer: 5-ACACATCAGAGCTCCGAGAA-3, protismiselni primer: 5-GAGGTATC GCCAGGAATTGT-3;E-kadherin, smiselni primer: 5- ACGCATTGCCA CATACACTC-3, protismiselni primer: 5-GGTGAATTCGGGCTTGTTGT-3; NF-κB p65, smiselni primer: 5-CTTCCTGCCCTACAGAGGTC-3, protismiselni primer: 5-AGAGCAAGGAAGTCCCAGAC-3;NOX1, smiselni primer: 5-CCTAGAAGGGCTCCAAACCA{{33} }, protismiselni primer: 5-GGAAGGCATCCACAAACAGG-3; NOX2, zaznavna začetnica: 5-ACCCTTCGCATCCATTCTCA-3, protismiselna začetna priprava: 5-TCTGCAAACCACTCAAAGGC-3; NOX4, zaznavna začetnica: 5-CAAGCAGGAGAACCAGGAGA-3, protismiselna začetna snov: 5-AGTTGAGGGCATTCACCAGA-3; Smad2, začetni primer za čutenje: 5-TGAGCACGTGAGGTGAGATT-3, protismiselni začetni primer: 5-CTCCATCACAGTGCACCAAG-3; Smad3, začetni primer za čutenje: 5-CAGCCGGTTTGGATTACAGG-3, protismiselni začetni primer: 5-GAGTCAAAGTCCCTGCTCCT-3; Smad4, začetni primer za čutenje: 5-CACTGCCAACTTTCCCAACA-3, protismiselni začetni primer: 5-ATCCATTCTGCTGCTGTCCT-3; Smad7, začetni primer za čutenje: 5-AAGAGTCAGCTGGTGCAGAA-3, protismiselni začetni primer: 5-GCGGACTTGATGAAGATGGG-3; -SMA, začetni primer za čutenje: 5-GGTGCTGTCTCTCTATGCCT-3, protismiselni začetni primer: 5-CAGATCCAGACGCATGATGG-3; GAPDH, začetni primer za čutenje: 5-TGGTATCGTGGAAGGACTCA-3, protismiselni začetni primer: 5-CCAGTAGAGGCAGGGATGAT-3.

2.11|Statistična analiza

Podatki in statistična analiza so v skladu s priporočili o eksperimentalnem načrtovanju in analizi v farmakologiji. Vsi poskusi so bili randomizirani in zaslepljeni. Rezultati so izraženi kot M ± SD/SEM navedenega števila (n) neodvisnih poskusov. Podatki v trenutni študiji so predstavljeni kot M ± SD/SEM iz vsaj treh neodvisnih poskusov. Pomembnost razlik je bila analizirana z enosmerno ANOVA, ki ji je sledil Tukeyjev test (več kot dve skupini) ali Studentov t-test (dve skupini). Post hoc testi se izvedejo le, ko je F dosegel p <.05 in="" ni="" bilo="" pomembne="" nehomogenosti="" variance.="" vsi="" testi="" so="" bili="" dvostranski="" in="" p="">< 0,05="" je="" veljal="" za="" statistično="" značilen.="" statistična="" analiza="" je="" bila="" izvedena="" s="" programsko="" opremo="" graphpad="" prism="">

Cistanche acteoside za izboljšanje ledvic

2,12|UPLC-QTOF/MS pogoji in analiza podatkov

Vse vzorce seruma smo pred pripravo odmrznili pri sobni temperaturi. 300 ul acetonitrila smo dodali 100 ul vzorcem seruma k oborjeni beljakovini in močno mešali 60 s. Vse vzorce centrifugiramo pri 13000 obratih na minuto 10 minut pri 4 stopinjah. Na koncu smo supernatant vbrizgali v analizo UPLC-QTOF/MS. Ločevanje metabolitov je bilo izvedeno s sistemom Waters Acquity™ Ultra Performance LC (Waters), opremljenim z Waters Xevo™ G2 Q/TOF-MS (Waters MS Technologies). Alikvot 2 ul raztopine vzorca je bil vbrizgan na Acquity UPLC BEH C18 (100 mm 2,1 mm, 1,7 μm, Waters Corporation, Milford, Connecticut) pri 35 stopinjah in hitrost pretoka je bila 0,4 ml/min. Optimalno mobilno fazo sta sestavljala voda (A) (vsebuje 0,1 % mravljinčne kisline) in acetonitril (B). Optimizirani pogoji eluiranja UPLC za analizo seruma so bili 0 3 min, 95 odstotkov 55 odstotkov A; 4 13 min, 55 odstotkov 5 odstotkov A; 13 14 min, 5 odstotkov A. Samodejni vzorčevalnik je bil vzdrževan pri 4 stopinjah.

Masno spektrometrijo smo izvedli z uporabo Xevo™ G2 QTof (Waters MS Technologies), kvadrupola in tandemskega masnega trometra s pravokotnim pospeškom. Levcin-enkefalin je bil uporabljen kot zaporna masa, ki ustvarja [M plus H]^plusion (m/z 556,2771) in [MH]^-ion (m/z 554,2615) v pozitivnem oziroma negativnem načinu. Koncentracija levcin-enkefalina je bila 200 pg/ml in hitrost pretoka infuzije je bila 100 ul/min, da se zagotovi natančnost med analizo MS s črpalko na brizgo. Podatki so bili zbrani v centroidnem načinu od 100 do 1,000 m/z. Za pozitivne in negativne načine elektrospreja je bila kapilarna in stožčna napetost nastavljena na 3,0 kV oziroma 30 V. Desolvatacijski plin je bil nastavljen na 600 L/uro pri temperaturi 350 stopinj, stožčasti plin je bil nastavljen na 50 L/uro in temperatura vira je bila nastavljena na 120 stopinj. Hitrost zajemanja podatkov je bila nastavljena na 30 ms z zakasnitvijo med skeniranjem 0,02 s.

Poleg tega je bilo iz vsake skupine naključno izbranih 10 vzorcev seruma in zmešanih skupaj kot vzorci za kontrolo kakovosti (QC). Vzorec QC je bil uporabljen za optimizacijo stanja UPLCQTOF/MS, saj je vseboval večino informacij celotnega vzorca. Vzorci QC so bili vbrizgani šestkrat na začetku delovanja, da bi kondicionirali ali uravnotežili sistem, nato pa vsakih 10 vzorcev za nadaljnje spremljanje stabilnosti analize. Vsak dan, potem ko je bil instrument umerjen, je bil najprej analiziran vzorec QC, da se preizkusi stabilnost instrumenta, da se zagotovi dosledno delovanje sistema.

Vse zbiranje podatkov in analize podatkov je nadzorovala programska oprema Waters MassLynx v4.1. Multivariatno podatkovno matriko je analizirala programska oprema EZinfo 2.0 (Waters Corp.). Glavni parametri vključujejo časovni razpon zadrževanja 0 14 min; masno razmerje m/z 100 1,000, masno tolerančno območje 0.{{10}}1 Da, prag največje intenzivnosti 50, kakovostno okno 0,05 Da, zadrževanje časovna okna 0,20 min in samodejno zaznavanje 5-odstotne višine vrha in šuma. Intenzivnost vsakega iona je bila normalizirana glede na celotno število ionov, da se ustvari podatkovna matrika, ki je sestavljena iz retencijskega časa, vrednosti m/z in normalizirane površine vrha.

Dobljene podatkovne matrike so bile uvedene v programsko opremo EZinfo 2.0 za analizo glavnih komponent, delno diskriminantno analizo najmanjših kvadratov (PLS-DA) in analizo ortogonalne projekcije na latentne strukture (OPLS-DA). Iz OPLS-DA je bilo mogoče ugotoviti, da so različni metaboliti odgovorni za ločevanje med kontrolno skupino in modelno skupino in so bili zato obravnavani kot potencialni markerji. Potencialne zanimive označevalce smo ekstrahirali iz S-ploskev, izdelanih po analizi z OPLS-DA, spremenljivke, ki so pomembno prispevale k diskriminaciji med skupinami, pa smo podvrgli nadaljnji identifikaciji molekulske formule.

Pomembnost spremenljivke (VIP) v vrednosti projekcije je utežena vsota kvadratov uteži PLS, spremenljivke z VIP > 1 pa so veljale za vplivne za ločevanje vzorcev v grafih rezultatov, ustvarjenih z analizo OPLS-DA. V vseh poskusih je bila stopnja zaupanja nastavljena na 95 odstotkov, da se določi pomembnost razlike (p <.05). te="" spremenljivke="" so="" bile="" na="" koncu="" izbrane="" kot="" potencialni="" biomarkerji.="" grafi="" rezultatov="" pls-da="" so="" bili="" opisani="" s="" parametrom="" navzkrižne="" validacije="" r2y="" in="" q2,="" ki="" predstavlja="" skupno="" razloženo="" variacijo="" za="" matriko="" x="" oziroma="" predvidljivost="" modela.="" odlične="" modele="" dobimo,="" ko="" sta="" kumulativni="" vrednosti="" r2y="" in="" q2="" nad="" 0,8.="" relativne="" razdalje="" med="" skupinami="" za="" dajanje="" in="" kontrolno="" skupino="" iz="" grafa="" rezultatov="" pls-da="" so="" bile="" izračunane="" s="" povprečno="" vrednostjo="" (os="" x="" in="" y)="" vseh="" vzorcev="" kontrolne="" skupine="" kot="" referenčne="">

Izbrani potencialni presnovki so bili identificirani glede na natančno določitev m/z, retenzijskega časa in tipičnega MS/MS fragmenta ter vzorca potencialnih biomarkerjev zgoraj, ki so bili pridobljeni v načinu pozitivnih in negativnih ionov. Konstrukcija presnovne poti je bila izvedena z Metabo Analyst, ki je spletno orodje za vizualizacijo metabolomike (https://www. metaboanalyst.ca/), ki temelji na virih baz podatkov, vključno s KEGG (HTTP:// www.genome .jp/kegg/) in baze podatkov HMDB (http://www.hmdb.ca/) za iskanje. Retencijski čas in tipični MS/MS fragment ter vzorec so bili zelo koristni za zožitev obsega možnih molekul.

Acteoside v Cistanche lahko izboljša delovanje ledvic

3|REZULTATI

Kliknite tukaj za informacije o II. delu (rezultati) tega članka.

Povzeto iz: ' Naravni proizvodakteozidizboljšatipoškodba ledvicpri miših s sladkorno boleznijo db/db in celicah HK-2 prek regulacijske signalne poti NADPH/oksidaze-TGF-/Smad' -----avtor Qinwen Wang|Xinxin Dai et.al

----Raziskave fitoterapije. 2021; 35: 5227–5240. wileyonlinelibrary.com/journal/ptr © 2021 John Wiley & Sons Ltd. DOI: 10.1002/ptr.7196