2. del: Kalpastatin preprečuje poškodbe podocitov, ki jih povzroča angiotenzin II, z vzdrževanjem avtofagije

Kontakt:joanna.jia@wecistanche.com/ WhatsApp: 008618081934791

Kliknite tukaj za 1. del

Kliknite tukaj za 3. del

Angel plus HSD aktivira aktivnost kalpaina v podocitih, ki prispeva k blokadi avtofagije

Ker je bilo ugotovljeno, da (i) aktivnost kalpaina aktivira Angel v več vrstah celic in (ii) da cepi več proteinov, povezanih z avtofagijo, smo se spraševali, ali je mogoče blokado avtofagije, ki jo posreduje AngII in HSD, pripisati povečani aktivnosti kalpaina, ki jo povzroči Angl. Najprej smo ugotovili, da primarni podociti izražajo 3 vseprisotne oblike kalpainov (slika 3a). Nato smo pokazali, da je AngII stimuliral aktivnost kalpaina v primarnih podocitih. To povečanje aktivnosti kalpaina je blokiral selektivni zaviralec kalpaina (slika 3b). Za oceno vloge kalpainov pri AngII in HSD, ki jih posreduje, smo uporabili miško knock-in z dodatno ekspresijo transgena kalpastatina (kar vodi do zmanjšane aktivnosti kalpaina).ledvicapoškodbain blokada avtofagije. Primarni podociti iz miši CST'g so pokazali zmanjšano aktivnost kalpaina kot odziv na AngII v primerjavi s podociti iz kontrolnih miši (slika 3c). Tako je čezmerna ekspresija kalpastatina v podocitih zmanjšala aktivacijo kalpaina, posredovano z AngII.

Cistanchetubulozaima mnogoučinki, kliknite tukaj, če želite izvedeti več

Nato smo ocenili ravni avtofagije v podocitih miši CSTTg. Ustvarili smo miši CST s transgenom GFP-LC3. LC3-GFP reporter je omogočil štetje avtofagosomov kot GFP plus /P62 plus pike. P62 se bo kopičil v agregatih v celicah, ko je avtofagični tok blokiran. V bazalnem stanju smo prešteli manj GFP plus P62 plus pike (slika 4a, b in e) in manj kopičenja P62 (slika 4c, d in f) v podocitih miši CST1g GFP-LC3 kot v normalnih podocitih

Slika 4|Vrednotenje avtofagičnega toka v podocitih transgenih miši s kalpastatinom (CST9). (a,b) Reprezentativne imunofluorescenčne slike izražanja zelenega fluorescenčnega proteina (GFP) (zeleno) in P62 (rdeče) v glomerulih 12-teden starih miši GFP-LC3 in CST'GFP-LC3. Konice puščic označujejo GFP plus P62 plus avtofagosome. (c, d) Reprezentativne imunofluorescenčne slike izražanja P62 (zeleno) in podokaliksina (PODXL; rdeče) v glomerulih 12-teden starih miši GFP-LC3 in CST'9 GFP-LC3. Poddeli slike s črko označujejo večjo povečavo. Jedra so bila obarvana s Hoechstom （modro）. Palice=50 μm. （e） Kvantifikacija števila LC3 plus P62 plus pik na podocit. Mann-Whitneyjev test:**P=0.0065. (f) Kvantifikacija P62 plus površine na glomerularni odsek. Mann-Whitneyjev test:*P= 0.0420.In(e,f), n =5 miši GFP-LC3 in n =8 miši CST'9 GFP-LC3. Predstavljene so vrednosti kot posamezne ploskve in povprečje ± SEM. Za optimizacijo gledanja te slike si oglejte spletno različico tega članka pri miših GFP-LC3, kar kaže na povečan avtofagični tok v podocitih miši z visoko vsebnostjo kalpastatina.

Avtofagični tok je mogoče spremljati z merjenjem pretvorbe citoplazemske oblike LC3, LC3-I, v avtofagosomsko razcepljeno in s fosfatidiletanolaminom sklopljeno obliko LC3, LC3-II, na Western blotu . Podociti miši CST so pokazali povečano pretvorbo LC3-I v LC3-II in zmanjšano izražanje P62, tako v prisotnosti kot tudi v odsotnosti bafilomicina A (slika 5a in b), kar kaže na povečan avtofagni tok v podocitih s prekomerno ekspresijo kalpastatina. Končno je bilo kopičenje GFP plus P62 plus pik v podocitih po dajanju klorokina pomembnejše pri miših CST'g GFP-LC3 kot pri miših GFP-LC3, kar potrjuje, da prekomerna ekspresija kalpastatina povzroči avtofagični tok v podocitih in vivo (slika 5c). -e). Naši podatki skupaj kažejo, da AngII stimulira aktivnost kalpaina v podocitih, da avtofagijo zavira kalpain v podocitih in da zaviranje endogene aktivnosti kalpaina s prekomerno ekspresijo kalpastatina zadostuje za stimulacijo avtofagnega toka v podocitih.

Miši CSTT9 so zaščitene pred poškodbo podocitov, ki jo povzroči Angel plus HSD

CSTT: miši niso pokazale nobenegaledvicaspremembo vsaj do 12. meseca starosti (dodatna slika S5). Analizirali smo poškodbo podocitov pri miših CST'号 med zdravljenjem z AngII plus HSD. Čeprav se je pri miših WT po 4 tednih hipertenzije pojavila blaga glomeruloskleroza in poškodba podocitov, kar je razvidno iz nenormalne ekspresije podokaliksina in nefrina, so miši CSTTg pokazale manj sklerotičnih glomerulnih lezij (slika 6a).

Slika 5|Blokiranje avtofagosomske razgradnje je potrdilo povečan avtofagni tok podocitov pri transgenih (CSTT) miših s kalpastatinom. (a) Western blot analiza izražanja LC3. Sekvestosom 1(SOSTM1)/P62 in ATG5 v primarnih podocitih iz miši divjega tipa (W ali CST'9. Ekspresija tubulina služi kot normalizacija. Podociti so bili 4 ure pred gojenjem obdelani z bafilomicinom A1 (BafA1; 100 nM) ali ne. (b) Kvantifikacija razmerij LC3-ll/'tubulin in P62/tubulin.n=10 WT miši in n =8 CST'9 miši. Vrednosti so predstavljene kot posamezne ploskve in povprečje ± SEM Dvosmerna analiza variance v paru za zdravljenje: za LC3-ll/tubulin: genotip, P= 0.0008;zdravljenje, P<0.0001; for="" p62/tubulin:="" genotype,="" p="0.0884;" treatment,="">< 0.0001.sidak's="" multiple="" comparison="" test:="" for=""><0.0001 for="" wt-bafa1="" versus="" wt+=""><0.0001 for="" cst'9-bafa1="" versus="" cst'9+bafa1,"*p="0.0028" for="" wt+bafa1="" versus="" cstt9="" +bafa1:for=""><0.0001 for="" wt-bafa1="" versus=""><0.0001 for="" cst'9-bafa1="" versus="" cst'9+="" bafa1.(c,d)representative="" immunofluorescence="" images="" of="" the="" expression="" of="" green="" fluorescent="" protein="" (gfp;="" green)="" and="" p62="" (red)="" in="" glomeruli="" from="" 12-week-old="" gfp-lc3="" and="" cst'9="" gfp-lc3="" mice.="" figure="" subparts="" with="" prime="" indicate="" higher="" magnification.="" nuclei="" were="" stained="" with="" hoechst="" （blue）.="" bars="50" μm.="" mice="" were="" treated="" with="" chloroquine（cq;="" 80="" mg/kg）="" 4="" hours="" before="" killing.="" the="" arrowheads="" indicate="" gfp+="" p62+autophagosomes.="" (e)="" quantification="" of="" the="" number="" of="" lc3+="" p62+="" dots="" per="" podocyte.="" n="5" mice="" per="" genotype.="" values="" are="" presented="" as="" individual="" plots="" and="" mean="" ±="" sem.="" unpaired="" t-test="" with="" equal="" sd:*p="0.0302." to="" optimize="" viewing="" of="" this="" image,="" please="" see="" the="" online="" version="" of="" this="" article="" at="">ledvica-international.org.

Slika 6| Prekomerna ekspresija kalpastatina preprečuje poškodbe podocitov, ki jih povzroča angiotenzin Il (Angel) in dieta z visoko vsebnostjo soli (HSD). (a,b)

Cistanchelahko razbremenibolezni ledvic

Reprezentativne slike Massonovih s trikromom obarvanih odsekov glomerulov iz miši divjega tipa (WT in transgenih (CST'9) kalpastatina) po 6 tednih Angll plus HSD. Bars=50 um. (c, d, f, g) Reprezentativne imunofluorescenčne slike izražanja (c,d) podokaliksina (PODXL) in (f,g)nefrina (NPHS1) pri miših WT in CST'9 po 6 tednih Angel plus HSD in (e,h) povezanih kvantifikacij. Vrstice { {8}} um. (ii)

cistanchelahko zdraviakutna odpoved ledvic

Reprezentativne imunofluorescenčne slike izražanja Wilmovega tumorja 1 (WT1; zeleno) in PODXL (rdeče) v glomerulih miši WT in CST' po 6 tednih Angel plus HSD in (k) povezana kvantifikacija števila WT1 plus celic na glomerular razdelek. Jedra so bila obarvana s Hoechstom (modro). Palice =50 um. V (e,h,k) so vrednosti predstavljene kot posamezne ploskve in srednje vrednosti ± SEM,n =9 WT miši in n=7 CSTTg miši. Neparni t-test z enakim SD:**P =0.0095 in (e),*P=0.0249 in (h), P=0.7891 in (k).

in b) ter ohranjeno izražanje podokaliksina in nefrina (slika 6c-h). Takšne razlike v fenotipu podocitov so opazili na stopnji, kjer se gostota jeder podocitov ni razlikovala med WT in hipertenzivnimi mišmi CST'g (slika 6i-k).

Podobno je po 6 tednih hipertenzije pri miših GFP-LC3 in CST'1 GFP-LC3 prišlo do poškodbe podocitov, lezije pa so bile bolj izrazite pri miših GFP-LC3 (slika 7). Razmerje med albuminom in kreatininom v urinu je bilo višje pri miših GFP-LC3 po 4 tednih AnglI plus HSD (slika 7a). Število podocitov se med obema genotipoma ni razlikovalo, vendar je bila ekspresija nefrina bistveno bolj zmanjšana pri miših GFP-LC3 (kontrola) (slika 7b-e). V korelaciji z zaščito, ki jo posreduje kalpastatin, je ultrastrukturna analiza pokazala blago in žariščno izbris nožnega procesa podocitov pri miših GFP-LC3, zdravljenih z Angl plus HSD, z boljšo ohranitvijo izbris nožnega procesa pri miših CST'g, čeprav je globalna kvantifikacija števila stopalni procesi na dolžino glomerularne bazalne membrane (GBM) niso bili statistično različni, najverjetneje zato, ker je poškodba podocitov žariščna in segmentna v našem modelu (slika 7f-h). Opozoriti je treba na infiltracijo makrofagov in T-limfocitov vledvicese med skupinami niso razlikovale (dodatna slika S6). Ti rezultati skupaj so pokazali, da je kalpastatin preprečil poškodbo podocitov, ki jo povzroči AngII in HSD.

Prekomerna ekspresija kalpastatina obnovi avtofagni tok v podocitih miši po zdravljenju z Angel plus HSD

Nazadnje smo se spraševali, ali je glomerularna zaščita, posredovana s kalpastatinom, v modelu AngII plus HSD implicirala vzdrževanje avtofagije v podocitih. Zanimivo je, da je bilo kopičenje P62 v podocitih, ki ga povzroča AnglI plus HSD, preprečeno pri miših CSTTg in GFP-LC3 CST'g (slika 8a-d), kar kaže, da je kalpastatin preprečil blokado avtofagije podocitov. Opozoriti je treba, da je bilo število GFP plus P62 plus označevanje s pikami avtofagosomov podobno v podocitih hipertenzivnih miši GFP-LC3 in GFP-LC3 CST, kar nakazuje, da AnglI plus HSD povzroči upočasnitev avtofagnega toka podocitov in ne popolno zaustavitev (Slika 8e-g).

In silico napoved mesta cepitve kalpaina v proteinih podocitov

Uporabili smo več orodij in silico za napovedovanje potencialnih tarč kalpaina v podocitih (dodatni tabeli S1 in S2). Primerjane so bile tri spletne zbirke podatkov: GPS-CCD, 4CaMPDB, 5 in DeepCalpain. stopnja In silico analiza je identificirala več proteinov podocitov, med njimi nefrin in podocin, ki bi jih lahko razcepili kalpaini. Tako bi lahko s kalpastatinom posredovano glomerularno zaščito povezali z zmanjšanjem encimske aktivnosti kalpaina, kar vodi do zmanjšane razgradnje nekaterih proteinov podocitov.

Poleg tega so vsaj 3 proteini, povezani z avtofagijo, neposredne tarče kalpainov. ATG5 cepijo kalpaini, kar vodi do motenj v tvorbi kompleksa ATG12-ATG5.57 Dajanje inhibitorjev kalpaina in vivo je preprečilo tudi cepitev avtofagnega proteina Beclin-1.5"In silico analiza domnevno mesto cepitve na proteinih, povezanih z avtofagijo, podpira hipotezo, da bi kalpain lahko reguliral avtofagijo z encimsko cepitvijo proteinov avtofagije.

Ekspresija mRNA endoplazmatskega retikuluma (ER) in markerjev oksidativnega stresa v glomerulih miši, zdravljenih z Angll plus HSD

Ocenili smo stres endoplazmatskega retikuluma (ER) in oksidativni stres s kvantitativno PCR v glomerulih med zdravljenjem z AngII in HSD (tabela 1). Na začetku nismo opazili nobene spremembe v izražanju mRNA analiziranih genov pri miših glomeruli5loxlox (dodatno iz WT in Nphs2.cre Atg5 Slika S7). Po 6 tednih hipertenzije glomeruli iz Nphs2. miši cre Atg5loxlox so pokazale različne profile mRNA genov poti stresa ER in oksidativnega stresa s povečano ekspresijo Sod1, Prdxl, Atf4, Gpxl in Hsp90b1 v primerjavi z glomeruli WT, kar nakazuje, da je zmanjšanje avtofagije v podocitih dalo prednost AngII in HSD ER stres in oksidativni stres. Nasprotno pa so glomeruli iz miši CST predstavili znižano regulacijo več genov poti ER stresa in oksidativnega stresa ter zmanjšano izražanje nekaterih pro-apoptotičnih genov (slika 9).

Ti rezultati skupaj kažejo, da bi prekomerna ekspresija kalpastatina lahko preprečila poškodbo glomerulov z zmanjšanjem ER in oksidativnega stresa, ki ga povzroča AngII in HSD.

DISKUSIJA

V tej študiji smo dokazali, da je pri hipertenziji, ki jo povzroča AngII plus HSD, avtofagija podocitov izrazito zmanjšana. Poleg tega so bile miši z delecijo Atg5, specifično za podocite, bolj nagnjene k glomerulosklerozi, ki jo povzroča Angl plus HSD, in izgubi podocitov, kar kaže, da avtofagija v podocitih preprečuje razvoj hipertenzivne nefropatije, kar poudarja kritično vlogo avtofagije pri podocitih, ki jih povzroča Angl plus HSD poškodba. Malo je znanega o zunajceličnih dražljajih, ki uravnavajo celično avtofagijo, ti rezultati pa osvetljujejo patofiziološko regulacijo avtofagije podocitov z AngII.

Pri večini človeških glomerulopatij je izbris nožnega odrastka podocitov znak glomerularne poškodbe, ki vodi do proteinurije. Avtofagija bo verjetno igrala bistveno vlogo pri ohranjanju funkcije podocitov, ker te končno diferencirane celice kažejo visoke stopnje avtofagije tudi v odsotnosti stresa. Prejšnja študija je pokazala, da Angi spodbuja avtofagijo z ustvarjanjem reaktivnih kisikovih vrst v pogojno ovekovečeni celični liniji mišjih podocitov.5 Proizvodnja reaktivnih kisikovih vrst je dejansko splošen induktor avtofagije v številnih tipih celic in razlogi za takšno neskladje z našimi ugotovitve so nejasne. Za razliko od te zadnje študije smo uporabili mišje primarno kultivirane podocite, ki so ohranili ekspresijo podocina in nefrina ter pristope in vivo in ne mišjih celičnih linij. Potrjujemo prejšnja poročila, da postmitotični podociti kažejo nenavadno visoko stopnjo konstitutivne avtofagije. Za določitev

ali je avtofagični tok povečan ali blokiran. Prejšnje študije so ta pojav zanemarile.

Tu smo uporabili hipertenzivni model, ki temelji na perfuziji AnglI in HSD. Podociti imajo receptorje ATI in so izpostavljeni prostim filtriranim peptidom, kot je AngII1,6,26,61-6 Domneva se, da so opaženi renoprotektivni učinki zaviranja RAAS lahko — vsaj delno — posledica blokade tega podocita -specifični RAAS. Podobno tudi študije in vivo

Cistanchelahko razbremenibolezni ledvic