Strategija zaznavanja prirojenih patogenov, ki vključuje vseprisotnost bakterijskih površinskih proteinov 2. del

DISKUSIJA

Metazoji uporabljajo ubikvitinacijo kot vsestranski mehanizem za vzdrževanje citosolne homeostaze, preprečujejo kopičenje poškodovanih proteinov/organelov in se branijo pred invazijo patogenov (40, 41). Glede na raznolikost patogenov in različne nize poškodovanih proteinov, na katere naletimo, predstavlja identifikacija skupnih motivov za prepoznavanje substrata in poznejšo vseprisotnost pametno strategijo za optimizacijo virov. Proteini v evkariontskih celicah, ki so namenjeni proteolizi, so običajno identificirani s tripartitnim degronskim motivom (24).

Imunost je sposobnost telesa, da se ubrani bolezni, vključno z odzivi na bakterije, viruse in druge škodljive snovi. Če je imunski sistem telesa oslabljen, ne bo dovolj močan, da bi se spopadel z navalom bolezni. Študije so pokazale, da podhranjenost vpliva na delovanje imunskega sistema, zaradi česar je telo bolj dovzetno za okužbe in bolezni. Beljakovine so ena od pomembnih snovi za ohranjanje imunosti.

Beljakovine so sestavljene iz aminokislin, od katerih se nekatere imenujejo esencialne aminokisline, ker jih moramo zagotoviti s hrano in jih telo ne more sintetizirati. Te esencialne aminokisline vključujejo triptofan, levcin, fenilalanin, lizin, izolevcin, metionin, valin in histidin. Če telo ne dobi dovolj esencialnih aminokislin, lahko pride do motene presnove beljakovin, kar lahko vpliva na delovanje imunskega sistema.

Poleg tega visokokakovosten vnos beljakovin pomaga ohranjati normalen imunski sistem in telesne funkcije. Če telesu primanjkuje beljakovin, lahko pride do ogroženega imunskega sistema in telo je bolj dovzetno za bolezni. Če človeškemu telesu dlje časa primanjkuje beljakovin, lahko to povzroči dolgotrajne poškodbe imunskega sistema, zaradi česar so ljudje dovzetni za različne bolezni.

Zato sta uravnotežena prehrana in ustrezna vadba ključnega pomena za vzdrževanje vnosa beljakovin. Ljudje lahko zadovoljijo svoje telesne potrebe po beljakovinah z uživanjem več hrane, bogate z beljakovinami, kot so meso, perutnina, ribe, fižol, jajca, mlečni izdelki, žita, oreščki in semena. Poleg tega lahko zmerna vadba poveča telesno povpraševanje po beljakovinah in učinkovitost absorpcije. Uravnotežena in raznolika prehrana ter zdrav življenjski slog sta ključ do ohranjanja imunosti, ohranjanja zdravja in stabilnosti telesa ter odpornosti proti vdoru bolezni. S tega vidika moramo izboljšati našo imuniteto. Cistanche lahko znatno izboljša imunost, saj lahko polisaharidi v mesu uravnavajo imunski odziv človeškega imunskega sistema, izboljšajo stresno sposobnost imunskih celic in povečajo odpornost imunskih celic. Baktericidni učinek.

Kliknite dodatek cistanche deserticola

To nas je spodbudilo, da raziščemo, ali je mogoče podobne motive najti na površinah patogenov, kjer bi lahko delovali kot posrednik za prepoznavanje substrata. Tukaj dokazujemo, da gostiteljske ubikvitinske ligaze uporabljajo podobne molekularne podpise za zaznavanje filogenetsko različnih patogenov. Prepoznavanje patogenov prek skupnih molekularnih vzorcev/motivov (PAMP) je dobro opredeljena lastnost prirojene imunosti (42). Naši rezultati kažejo, da degronu podobna zaporedja znotraj bakterijskih površinskih proteinov delujejo na enak način kot PAMP, da omogočijo nadzor znotrajceličnega patogena. Ta modus operand bi gostitelj lahko nadalje izkoristil za predstavitev antigenov mikrobnih proteinov na glavnem histokompatibilnem kompleksu I, da bi induciral močan odziv CD8, usmerjen proti znotrajceličnih patogenom.

Potencialni pomen odkrivanja patogenov, posredovanega z ubikvitinom, za obrambo gostitelja je dodatno poudarjen s precejšnjo rezidualno vseprisotnostjo, odkrito v mutantnem SPN, ki nima BgaA in PspA. To kaže, da obstajajo dodatni, neidentificirani substrati ubikvitinskega stroja, pri čemer posledična redundanca zagotavlja močno prestrezanje patogenov. Predvsem nekatera takojšnja vprašanja o motivu degrona in njegovem pomenu za bakterije (razen tega, da je prepoznavna enota) ponujajo zanimiv evolucijski kot.

Motiv degrona je nepotreben in vivo, in če sploh kaj, je mutacija ali izbris motiva izboljšala znotrajcelično obstojnost, kar je povzročilo povečano virulentnost. To potrjujejo naši rezultati, da bi lahko patogeni uporabili mutacijo v motivu degrona, da bi se izognili prepoznavanju, ki ga posreduje ubikvitin, kot je razvidno iz serotipa 19F SPN. Vendar bi lahko ohranjena narava motiva degrona v BgaA v večini serotipov SPN nakazovala nasprotno strategijo, ki so jo sprejele bakterije, da bi bila manj smrtonosna za gostitelja.

To bi lahko dalo priložnost za patogena, da poveča svoje naseljene habitate. Hkrati bi lahko vseprisotnost bakterijske površine ali izločenih proteinov na motivu degrona funkcionalno modulirala, da bi dušila ali ponovno povezala odziv gostitelja za morebitno korist (43). Zato je lahko prisotnost ali odsotnost evkariontskih podobnih funkcionalnih domen ali motivov (kot so degroni) odvisna od patogene niše in prilagojena za izogibanje ali moduliranje imunskih odzivov gostitelja.

Podoben mehanizem zaznavanja patogenov, ki vključuje proteine, ki vežejo gvanilat, je bil vpleten tudi v očistek bakterij; vendar naj bi bila za razliko od ubikvitinacije njihova vloga omejena na gramnegativne patogene (44–47). Vseprisotnost cilja na patogen ne glede na izvor po Gramu, dokumentirano je bilo na primer, da RNF213 cilja na Listeria spp. ne glede na odsotnost LPS (48). Zato ne izključujemo možnosti njegovega protimikrobnega delovanja tudi proti SPN.

Patogena površina je lahko ubikvitinirana z več vrstami verig z različnimi ligazami E3 z medverižnimi interakcijami (41). Zlasti v primeru Mtb je bilo dokazano, da Smurf1 in Parkin tvorijo vrste verig K48 in K63, ki delujejo sinergistično za razgradnjo patogena (12). Razumevanje mehanične vloge vseprisotnosti K48 in ligaz E3, vključenih med scenarije okužbe, je še vedno premalo raziskano. V primeru STm je prikazana ena sama ligaza E3 ARIH1, ki cilja na citosolni STm z ubikvitinskimi verigami K48, kar vodi do njihove eliminacije iz sistema (15). Na podlagi naših in drugih ugotovitev se K48-Ub-označeni patogeni nazadnje razgradijo, medtem ko so povezani s proteasomalnimi stroji.

Vendar pa ta študija kaže K48-Ub dekoracijo specifičnih bakterijskih površinskih proteinov. Znano je, da nekateri patogeni aktivno spreminjajo svoje površinske beljakovine, jih ščitijo pred vseprisotnostjo in kasnejšim ubijanjem, s čimer se poudarja pomen površinske lokalizacije substrata ubikvitina (10). Poleg tega je več obveznih intracelularnih patogenov razvilo strategije za de-ubikvitinacijo ali gostiteljske regulativne komponente, da bi se izognili očistku, ki ga posreduje ubikvitin (5). Te ugotovitve skupaj poudarjajo pomen alarmnega vzburjenja, ki ga posreduje ubikvitin, kot temeljnega znotrajceličnega mehanizma zaznavanja patogenov, ki je osrednjega pomena za obrambo gostitelja.

Naša študija je nadalje pokazala osrednjo vlogo ligaze SCF E3, zlasti s FBXW7, pri bakterijski vseprisotnosti, ki povečuje razgradnjo patogena. Heterozigotne mutacije v FBXW7, zlasti različica R505C (kritični ostanek v žepu za prepoznavanje substrata), sprožijo več karcinomov in limfocitno levkemijo pri ljudeh (49, 50). Nedavna kohortna študija je pokazala, da skoraj 43 odstotkov bolnikov s kronično limfocitno levkemijo (KLL) podleže bakterijski pljučnici in sepsi, ki ji sledijo glivične okužbe (51).

To potrjuje naše opazovanje razveljavljene sposobnosti gostiteljskih celic, ki nosijo mutacijo FBXW7, da zaznajo in odstranijo patogene. Naše ugotovitve torej zagotavljajo nepričakovano molekularno razlago povečanega tveganja za okužbe pri bolnikih s KLL. Povezavo med genetskim polimorfizmom v genih za ligazo E3 in dovzetnostjo za bakterijske okužbe potrjujejo tudi bolniki s Parkinsonovo boleznijo, ki so občutljivi na tifus ali gobavost (14), kar kaže na omembe vreden prispevek ligaz E3 k imunosti gostitelja proti bakterijskim okužbam in vzdrževanju celičnega stabilnega stanja.

Na koncu smo dešifrirali univerzalni jezik zaznavanja patogenov, ki prebivajo v citosolu, ki bi ga lahko gostitelj učinkovito uporabil za prepoznavanje mikroorganizmov za kasnejšo odstranitev. Skupaj te ugotovitve osvetljujejo razumevanje rudimentarnih celičnih imunskih procesov, ki bi jih lahko izkoristili za krepitev antibakterijske imunosti.

MATERIALI IN METODE

Kultura celic

Obe celični liniji A549 človeškega pljučnega alveolarnega karcinoma (pnevmocit tipa II) [Ameriška zbirka tipskih kultur (ATCC) št. CCL185)] in celično linijo adenokarcinoma materničnega vratu HeLa (ATCC št. CRM-CCL-2) smo gojili v Dulbeccovem modificiranem Eagleovem mediju (DMEM; HiMedia), dopolnjenem z 10 odstotki fetalnega govejega seruma (Gibco) pri 37 stopinjah in 5 stopinjah. odstotkov CO2.

Bakterijski sevi in ​​pogoji rasti

SPN (R6, serotip 2, darilo Tima J. Mitchella, Univerza v Birminghamu, Združeno kraljestvo) so gojili v juhi Todd-Hewitt, dopolnjeni z 1,5-odstotnim ekstraktom kvasa pri 37 stopinjah v 5-odstotnem CO2. Za gojenje kultur SPN so bili po potrebi uporabljeni naslednji antibiotiki: kanamicin (200 ug/ml), spektinomicin (100 ug/ml) in kloramfenikol (4,5 ug/ml). Devetsto mikrolitrov 0,4 OD600 (optična gostota pri 600 nm) gojene SPN kulture smo zmešali s 600 ul 80-odstotnega sterilnega glicerola (32-odstotna končna koncentracija glicerola) in shranili v zamrzovalniku pri -80 stopinjah. Te zaloge glicerola so bile uporabljene kot začetni inokulum za vse poskuse.

Kulturi Escherichia coli DH5 in STm (ATCC 14028) smo gojili v bujonu Luria-Bertani (LB) pri 37 stopinjah pod stresanjem (200 vrt./min), po potrebi pa smo uporabili naslednje antibiotike: kanamicin (50 ug/ml), spektinomicin (100 ug/ml), kloramfenikol (20 ug/ml) in ampicilin (100 ug/ml). Za vse teste okužbe so bile bakterije gojene do OD600 ~0,4, čemur je sledila resuspendiranje v fiziološki raztopini s fosfatnim pufrom (PBS) do podobne gostote pred okužbo gostiteljskih celic.

Preverjanje domnevnih ciljnih proteinov ubikvitina

Vsi površinski proteini, prisotni v proteomu STm in SPN, so bili najprej identificirani iz objavljene literature. Celotne beljakovinske sekvence površinskih beljakovin so bile pridobljene iz UniProt, ki so bile nato uporabljene za identifikacijo prisotnosti degronskih motivov. Nabor 29 domnevnih degronskih motivov je bil kuriran iz objavljene literature (24, 52, 53) in podatkovne baze Eukaryotic Linear Motif. Pythonov modul regex je bil uporabljen za identifikacijo lokacije vseh takih kuriranih motivov v zaporedjih površinskih beljakovin. Nadalje je bilo izvedeno linearno iskanje za identifikacijo prisotnosti lizinskega ostanka v bližini (8 do 14 aminokislinskih ostankov) vsakega identificiranega motiva degrona. Domneva se, da ta lizinski ostanek deluje kot pritrdilno mesto za ubikvitinski del. Nazadnje so bila proteinska zaporedja v ožjem izboru vnesena v IUPred (54), orodje za napovedovanje proteinske strukture, da bi ugotovili prisotnost neurejene regije med motivom degrona in proksimalnim lizinom. Nastali proteini (BgaA in PspA za SPN in RlpA za STm) so bili izbrani za vrednotenje kot tarče za vseprisotnost in dekodiranje njihove vloge pri očistku patogena.

Konstrukcija bakterijskega seva

Alelna izmenjava s homologno rekombinacijo je bila izvedena z uporabo obrobnih regij genov, ki so nosile vstavljeno antibiotično kaseto za generiranje mutantnih sevov tako v SPN kot v STm (tabela S2).

Za SPN so bile 500-bp zgornje in spodnje regije bgaA, pspA in njegovih genov pomnožene iz genoma z ustreznimi primerji (tabela S3) in sestavljene v vektor pBKS. Po kloniranju teh fragmentov je bila v ta konstrukt vstavljena kaseta z odpornostjo na antibiotike (spektinomicin za vrečko ter pspA in kloramfenikol za hysA). Linearizirane rekombinantne plazmide smo nato transformirali v WT SPN z uporabo kompetentno stimulirajočega peptida 1 (GenPro Biotech), rekombinante smo izbrali z ustreznimi antibiotiki in zamenjavo gena potrdili z verižno reakcijo s polimerazo (PCR) in sekvenciranjem ustreznih genskih lokusov. Za STm je bila uporabljena metoda λ-rdeče rekombinaze za generiranje genskih delecijskih mutantov (55).

Na kratko, zaporedja, ki so homologna koncem gena za vrv, so bila dodana v sekvence primerjev, ki se uporabljajo za pomnoževanje kasete za odpornost na kanamicin. Kaseta je bila nato elektroporirana v sev WT STm in izločki, ustvarjeni s homologno rekombinacijo, so bili izbrani na podlagi odpornosti na kanamicin. Izbris gena smo potrdili s PCR in sekvenciranjem genskega lokusa. PspA, hysA polne dolžine in okrnjeni bgaA-T (1 do 3168 bp) smo klonirali pod promotorjem P23 v shuttle vektorju pIB166 (56) in uporabili za komplementacijo.

These recombinant plasmids were also used for site-directed mutagenesis to generate different variants of bgaA-T (bgaA-TK96R, bgaA-TK97R, bgaA-TK96R, K97R, and bgaATΔDegron), pspA (pspAK314R, pspAK315R, pspAK314R, K315R, and pspAΔDegron ), in njegov (hysADegron-BgaA in hysADegron-PspA) z uporabo ustreznih kompletov primerjev (tabela S3) in transformiran v mutanta ΔbgaA in ΔpspA. Vsi kloni so bili preverjeni s sekvenciranjem DNK. Izražanje različnih variant BgaA, PspA in HysA je bilo potrjeno z Western blotom z uporabo ustreznih protiteles.

Protitelesa in reagenti

Anti-Enolase in anti-PspA serum (S. Hammerschmidt, Univerza v Greifswaldu, Nemčija); anti-BgaA serum (S. King, The Ohio State University, ZDA); in protitelesa, specifična za His6 (Invitrogen, MA1-21315), povezavo K48-Ub (Millipore, 05-1307), povezavo K63-Ub (Millipore, 14-6077-80 ), Ply (Santa Cruz Biotechnology, sc-80500), FBXW7 (Bethyl Laboratories, A301-721A), SKP1 (Invitrogen, MA5-15928), Cullin1 (Invitrogen, {{15} }), gliceraldehid fosfat dehidrogenaza (Millipore, MAB374), GSK3 [tehnologija celične signalizacije (CST), D5C5Z], fosfotreonin (CST, 9381S), IgA, kapa iz mišjega mieloma, klon TEPC-15 (Sigma-Aldrich, M1421) in PSMB7 (Invitrogen, PA5-111404). Uporabljena so bila naslednja sekundarna protitelesa: anti-kunčje (BioLegend, 406401), označeno s hrenovo peroksidazo (HRP), anti-mišje, označeno s HRP (BioLegend 405306), anti-kunčje Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A27206), anti-kunčje Alexa Fluor 555 (Invitrogen, A31572), z biotinom konjugiran anti-mišji imunoglobulin A (Life Technologies, M31115), anti-mišji Alexa Fluor (Invitrogen, A31570), anti-mišji Alexa Fluor 488 (Invitrogen, A21202), anti-kozji Alexa Fluor 633 (Invitrogen, A21082) in FM4-64 (Thermo Fisher Scientific, T13320).

Ekspresija in čiščenje beljakovin

BgaA-T in njegove različice so bile klonirane v pET28 z uporabo Xba I/Not I restrikcijskih mest. Rekombinantne plazmide, ki kodirajo BgaA-T z N-terminalno oznako His, smo transformirali v celice E. coli BL21 (DE3) za izražanje proteina. Sveže transformirane kolonije smo gojili v LB, ki je vseboval kanamicin (50 ug/ml) pri 37 stopinjah na stresalnem inkubatorju 12 ur. En odstotek primarne kulture smo dodali 1 litru LB brozge in inkubirali pri 37 stopinjah na stresalnem inkubatorju, dokler OD600nm ni dosegel med 0,6 in 0,8. Ekspresijo beljakovin smo inducirali z dodatkom 100 μM izopropil- -D-tiogalaktopiranozida (IPTG) in nadaljnjim gojenjem kulture pri 37 stopinjah 5 do 6 ur z mešanjem pri 150 obratih na minuto.

Celice smo pobrali s centrifugiranjem pri 6000 obratih na minuto 10 minut pri 4 stopinjah. Celični pelet smo resuspendirali v pufru A [25 mM tris (pH 8,0) in 300 mM NaCl] in lizirali z ultrazvočno sonikacijo. Celične ostanke smo ločili s centrifugiranjem (14,000 rpm, 50 min, 4 stopinje) in supernatant nanesli na kolono Ni-NTA, uravnoteženo s pufrom A. Kolono smo sprali z 10 volumni kolone pufra A in His-označene proteine ​​smo eluirali z imidazolom (250 mM) v pufru A. Vse različice BgaA-T smo eksprimirali in očistili z istim postopkom. FBXW7 je bil subkloniran v vektorju pGEX-4 T-1 z oznako N-terminalne glutation S-transferaze (GST) iz vektorja pCMV6-Entry-FBXW7 z uporabo restrikcijskega encima Eco RI.

GST-označen FBXW7 je bil izražen v celicah E. coli BL21 (DE3) po indukciji izražanja proteina z 0.1 mM IPTG in rasti pri 30 stopinjah 4 ure. GST-FBXW7 iz surovega ekstrakta E. coli smo očistili s kolonsko kromatografijo z glutation-sefarozo (GE HealthCare). Frakcije, ki so vsebovale prečiščene proteine, so bile združene in koncentrirane do 0,5 mg/ml z uporabo 10-kDa filtra za izrezovanje molekulske mase (Amicon) s centrifugiranjem pri 4700 obratih na minuto pri 4 stopinjah. Čistost beljakovin smo preverili z elektroforezo v SDS-poliakrilamidnem gelu (SDS-PAGE), ki ji je sledilo barvanje s Coomassie blue.

Transfekcije gostiteljskih celic

BgaA-T je bil kloniran v vektorju pAK_Tol2_TRE_Blast (Addgene št. 130261), inducibilnem z doksiciklinom, z uporabo kompleta za kloniranje z infuzijo (Takara). Pozitivni klon je bil potrjen s Sangerjevim sekvenciranjem. Mutacija FBXW7R505C je bila izvedena z na mesto usmerjeno mutagenezo z uporabo pMRX-GFP-FBXW7 kot predloge in potrjena s Sangerjevim sekvenciranjem. Vse transfekcije so bile izvedene z uporabo reagenta Lipofectamine 3000 (Thermo Fisher Scientific), selekcije pa so bile izvedene v prisotnosti blasticidin hidroklorida (2 ug/ml; HiMedia).

siRNA usmerjen gen knockdown

Za knockdown specifičnih genov, posredovan z interferenco RNA, so bile uporabljene naslednje siRNA: siFBW7 (Dharmacon ON-TARGET SMARTpool L-004246-00-0005), siCullin1 (Qiagen, 1027423), siSKP1 (Qiagen, SI00301819) in siGSK3 (Dharmacon ONTARGET SMARTpool L-003010-00-0005). Na kratko, celice A549, gojene v 24-plošči z jamicami, so bile začasno transficirane z gensko specifičnimi siRNA ali scramble (siControl) (150 pmol) z uporabo Lipofectamine 3000 po navodilih proizvajalca. Šestintrideset ur po transfekciji so bile celice obdelane za Western blotting in imunofluorescenčne teste ali zaščitne teste penicilin-gentamicin.

Napovedovanje in modeliranje strukture

Vse strukture je predvidel AlphaFold (Protein Homology/analogy Recognition Engine V 2.0) (57) in vizualiziral z uporabo PyMOL (The PyMOL Molecular Graphics System, različica 2.0 Schrödinger, LLC). Strukture so bile barvno kodirane v PyMol na podlagi rezultatov IUPred (54), ki so segali od urejenih (modrih) do neurejenih (rdečih) do belih.

Western blotting

SPN kulture, gojene na {{0}}.4 OD600nm, so bile lizirane z ultrazvočno obdelavo in surovi ekstrakti so bili zbrani po centrifugiranju (15,000 vrt./min, 30 min, 4 stopinje). Za A549s smo enosloje večkrat sprali s PBS in lizirali v pufru za preskus radioimunoprecipitacije (RIPA) z ledeno mrzlim [50 mM tris-Cl (pH 7,89), 150 mM NaCl, 1 odstotek Tritona X-100, 0,5 odstotka natrija deoksiholat in 1 odstotek SDS], ki vsebuje mešanico zaviralcev proteaz (Promega), natrijev fluorid (10 mM) in EDTA (5 mM). Suspenzijo celic smo na kratko obdelali z ultrazvokom in centrifugirali, da smo zbrali celične lizate. Proteine, prisotne v bakterijskih ali celičnih lizatih A549 (10 ali 20 ug), smo ločili na 12-odstotnem SDS-PAGE gelu in prenesli na aktivirano poliviniliden difluoridno membrano. Po blokiranju v 5-odstotnem posnetem mleku so bile membrane testirane z ustreznimi primarnimi in sekundarnimi protitelesi, označenimi s HRP. Bloti so bili nazadnje razviti z uporabo izboljšanega kemiluminiscenčnega substrata (Bio-Rad).
Test zaščite penicilin-gentamicin

Sevi SPN, gojeni do OD600nm 0.4 v Todd-Hewitt brozgi, dopolnjeni z 0.2-odstotnim ekstraktom kvasa (THY), so bili peletirani, resuspendirani v PBS ( pH 7,4) in razredčili v preskusnem mediju za okužbo monoslojev A549 z množico okužb (MOI) 10. Po 1 uri po okužbi smo monosloje sprali z DMEM in inkubirali s testnim medijem, ki je vseboval penicilin (10 ug/ml). ) in gentamicin (400 ug/ml) 2 uri, da ubijemo zunajcelični SPN. Celice smo nato lizirali z 0,025-odstotnim Tritonom X-100 in lizat nanesli na plošče z agarjem Brain Heart Infusion, da bi našteli žive SPN. Odstotek invazije je bil izračunan kot [enote, ki tvorijo kolonije (CFU) v lizatu/CFU, uporabljeni za okužbo] × 100. Za oceno znotrajceličnega preživetja so bili 9 ur po okužbi (od začetka zdravljenja s penicilinom in gentamicinom) celični lizati pripravljeni kot omenjeno zgoraj, in naštete so bile razširjene in preživele bakterije. Učinkovitost preživetja (v odstotkih) je bila predstavljena kot kratna sprememba v odstotku preživetja glede na kontrolo na navedeni časovni točki (normalizirano na 0 ur).

Imunofluorescenca

Za imunofluorescenčni test so bile celice A549 ali HeLa gojene na steklenih pokrovnih stekelcih in okužene s sevi SPN ali STm pri MOI ~25 za 1 uro, čemur je sledilo zdravljenje z antibiotiki za 2 uri. Ob želenih časovnih točkah po okužbi (9 ur za okužbo s SPN v A549s in 3 ure za okužbo s STm v HeLa) smo celice sprali z DMEM in fiksirali z ledeno ohlajenim metanolom pri -20 stopinjah 10 minut. Nadalje so bila pokrovna stekelca blokirana s 3 odstotki govejega serumskega albumina (BSA) v PBS 2 uri pri sobni temperaturi (RT). Celice smo nato obdelali z ustreznim primarnim protitelesom v 1 odstotku BSA v PBS čez noč pri 4 stopinjah, sprali s PBS in inkubirali z ustreznim sekundarnim protitelesom v 1 odstotku BSA v PBS 1 uro pri sobni temperaturi. Nazadnje so bila pokrovna stekelca oprana s PBS in nameščena na objektna stekelca skupaj z VECTASHIELD z ali brez 4',6-diamidino-2-fenilindola (Vector Laboratories) za vizualizacijo z uporabo laserskega skenirnega konfokalnega mikroskopa (LSM 780, Carl Zeiss). ) pod 40× ali 63× oljnimi objektivi. Slike so bile pridobljene po optičnem rezanju in nato obdelane s programsko opremo ZEN lite (različica 5.0). Mikroskopija v super ločljivosti je bila izvedena podobno z uporabo Elyra 7 (Carl Zeiss) v načinu SIM. Za analizo kolokalizacije so bile bakterije ocenjene z vizualnim štetjem n > 100 bakterij na ponovitev.

Transmisijska elektronska mikroskopija

Po okužbi s SPN in STm smo celice sprali z {{0}}.1 M natrijevim kakodilatnim pufrom, fiksiranim z 2,5-odstotnim glutaraldehidom (Sigma-Aldrich) v 0.1 M natrijevem kakodilatnem pufru ( Sigma-Aldrich) 3 ure pri 4 stopinjah. Po fiksaciji smo celice zbrali skozi strgalo za celice in 10 minut peletirali pri 2000 rpm. Celice smo nato sprali z 0,1 M natrijevim kakodilatnim pufrom in naknadno fiksirali z 1 odstotkom osmijevega tetroksida v 0,1 M natrijevem kakodilatnem pufru 20 minut pri 4 stopinjah. Po naslednjih izpiranjih s kakodilatnim pufrom in destilirano vodo smo celice nato 30 minut dehidrirali v naraščajočih koncentracijah etanola (50, 70, 95 in 100 odstotkov) in propilen oksida ter jih nazadnje vdelali v epoksi smolo (Electron Microscopy Sciences, 14300). polimerizacija pri 75 stopinjah 45 minut. Nato smo kapsule za 45 minut prenesli v pečico pri 95 stopinjah. Ultratanke rezine (70 nm) smo izrezali z diamantnim nožem na ultramikrotomu Leica EM UC7 in jih obarvali z 2 odstotkom uranil acetata in 1 odstotkom svinčevega citrata ter jih pregledali s transmisijskim elektronskim mikroskopom (Talos L120 C, Thermo Fisher Scientific) pri 120 KV.

Vseprisotnost ex vivo

A{0}}, ki izraža BgaA-T, in njegove različice so bile obdelane z MG132 (5 μM), ekspresija proteina pa je bila inducirana z doksiciklinom (100 ug/ml) 24 ur. Celice smo nato lizirali v pufru RIPA in vzorce elektroforizirali s SDS-PAGE (8 odstotkov). Potrditev ekspresije beljakovin in vseprisotnosti BgaA-T in njegovih različic je bila dokazana z Western blotom po sondiranju s protitelesi anti-BgaA oziroma anti-K48-Ub.

Vseprisotnost in vitro

Za teste vseprisotnosti in vitro smo rekombinantne proteine ​​očistili, kot je opisano prej (58). Kompleks ligaze SCFFBW7 E3 je bil inkubiran z rekombinantnim 0.1 mM E1 (UBE1; Boston Biochem), 0.25 mM E2 (cdc34; Boston Biochem) in ubikvitinom (2,5 ug/ml; Boston Biochem) v prisotnosti prečiščenega BgaA-T in njegovih različic. Reakcije ubikvitilacije so bile izvedene v testnem pufru [50 mM tris (pH 8), 5 mM MgCl2, 5 mM adenozin trifosfata (ATP), 1 mM -merkaptoetanola in 0,1 odstotka Tween 20] 2 uri pri 25 stopinjah. . Reakcije smo zaustavili s 5 × Laemmli pufrom, raztopili na SDS-PAGE gelih in analizirali z imunoblotingom z uporabo protitelesa proti BgaA.

In vitro test kinaze

Za izvedbo in vitro testa kinaze je bil uporabljen encimski sistem GSK3 kinaze (Promega) v skladu s protokolom proizvajalca z naslednjimi modifikacijami. Na kratko, 3 ug rekombinantnega BgaA-T smo dodali k 0.5 ug aktivnega GSK3 s 400 μM ATP v reakcijskem pufru, sestavljenem iz 40 mM tris (pH 7,5), 20 mM MgCl2 , BSA (0,1 mg/ml) in 50 μM ditiotreitola. Reakcijo smo inkubirali 2 uri pri 30 stopinjah in zaustavili z dodatkom 1 × Laemmli pufra. Vzorci so bili nato kuhani in podvrženi elektroforezi za Western blot, kot je bilo omenjeno prej. Fosforilirani BgaA-T smo odkrili s protitelesom proti fosfotreoninu.

In vivo model

All animal experiments were performed at the University of Liverpool in strict accordance with U.K. Home Office guidelines, under project license PP2072053, following approval from local animal welfare and ethics committees. For infection studies, 7- to 8-week female CD1 mice were purchased from Charles River Laboratories, United Kingdom, and allowed to acclimatize for 7 days before use. Briefly, mice were placed into a restraint tube, and S. pneumoniae was administered by intravenous injection into the tail vein (1 × 106 CFU in 100 μl of PBS). Mice were periodically scored for clinical signs of disease and culled when they showed signs of advanced pneumococcal disease or else at predetermined times after infection. Severity endpoints were defined as one or more of the following: substantially elevated or reduced respiratory rate, substantial reduction in natural behavior or moderate reduction in provoked behavior, loss of >20 odstotkov začetne telesne teže in izrazit izcedek iz nosu ali oči. Vzorci krvi so bili pridobljeni s srčno punkcijo pod terminalno anestezijo, vranice pa so bile postmortem izrezane za štetje bakterij. Vzorce tkiv smo obdelali z ročnim homogenizatorjem tkiv in homogenate serijsko razredčili v PBS, preden smo jih nanesli na plošče s krvnim agarjem. Plošče smo inkubirali čez noč pri 37 stopinjah, 5 odstotkih CO2 in naslednji dan ocenili število bakterijskih kolonij.

Statistična analiza

Za statistično analizo je bil uporabljen GraphPad Prism različice 5. Statistični testi, opravljeni za posamezne poskuse, so omenjeni v legendah posameznih slik. P < 0.05 je veljalo za statistično pomembno. Podatki so bili testirani na normalnost in za opredelitev variance vsake testirane skupine. Vse večparametrske analize so vključevale popravke za večkratne primerjave, podatki pa so predstavljeni kot srednje vrednosti ± SD, razen če je navedeno drugače.

LITERATURA IN OPOMBE

ME Bianchi, DAMPs, PAMPs in alarmins: Vse, kar moramo vedeti o nevarnosti. J. Leukoc. Biol. 81, 1–5 (2007).

2. TH Mogensen, Prepoznavanje patogenov in vnetna signalizacija pri prirojeni imunski obrambi. Clin. Microbiol. Rev. 22, 240–273 (2009).

3. K. Ray, B. Marteyn, PJ Sansonetti, CM Tang, Življenje znotraj: Znotrajcelični življenjski slog citosolnih bakterij. Nat. Rev. Microbiol. 7, 333–340 (2009).

4. X. Jiang, ZJ Chen, Vloga vseprisotnosti pri imunski obrambi in izogibanju patogenom. Nat. Rev. Immunol. 12, 35–48 (2011).

5. V. Vozandychova, P. Stojkova, K. Hercik, P. Rehulka, J. Stulik, Sistem vseprisotnosti znotraj bakterijskih interakcij med gostiteljem in patogenom. Mikroorganizmi 9, 638 (2021).

6. E. Fiskin, T. Bionda, I. Dikić, C. Behrends, Globalna analiza gostiteljskega in bakterijskega ubikvitinoma kot odziv na okužbo s salmonelo tifimurium. Mol. Celica 62, 967–981 (2016).

7. Q. Chai, X. Wang, L. Qiang, Y. Zhang, P. Ge, Z. Lu, Y. Zhong, B. Li, J. Wang, L. Zhang, D. Zhou, W. Li, W. Dong, Y. Pang, GF Gao, CH Liu, Površinski protein mikobakterije tuberkuloze rekrutira ubikvitin, da sproži gostiteljsko ksenofagijo. Nat. Komun. 10, 1973 (2019).

8. EG Otten, E. Werner, A. Crespillo-Casado, KB Boyle, V. Dharamdasani, C. Pathe, B. Santhanam, F. Randow, Vseprisotnost lipopolisaharida z RNF213 med bakterijsko okužbo. Narava 594, 111–116 (2021).

9. A. Yamada, M. Hikichi, T. Nozawa, I. Nakagawa, FBXO2/SCF ubikvitin ligazni kompleks usmerja ksenofagijo s prepoznavanjem bakterijskega površinskega glikana. EMBO Rep. 22, e52584 (2021).

10. P. Engstrom, TP Burke, CJ Tran, AT Iavarone, MD Welch, Metilacija lizina ščiti intracelularni patogen pred vseprisotnostjo in avtofagijo. Sci. Adv. 7, eabg2517 (2021).

11. J. Celli, LRSAM1, ubikvitin ligaza E3 z občutkom za bakterije. Cell Host Microbe 12, 735–736 (2012).

12. LH Franco, VR Nair, CR Scharn, RJ Xavier, JR Torrealba, MU Shiloh, B. Levine, Ubikvitin ligaza Smurf1 deluje pri selektivni avtofagiji mikobakterije tuberkuloze in obrambi gostitelja proti tuberkulozi. Cell Host Microbe 21, 59–72 (2017).

13. J. Noad, A. von der Malsburg, C. Pathe, MA Michel, D. Komander, F. Randow, LUBAC sintetizirane linearne ubikvitinske verige omejujejo bakterije, ki napadajo citosol, z aktiviranjem avtofagije in NF-κB. Nat. Microbiol. 2, 17063 (2017).

14. PS Manzanillo, JS Ayres, RO Watson, AC Collins, G. Souza, CS Rae, DS Schneider, K. Nakamura, MU Shiloh, JS Cox, Ubiquitin ligase parkin posreduje odpornost na intracelularne patogene. Narava 501, 512–516 (2013).

15. M. Polajnar, MS Dietz, M. Heilemann, C. Behrends, Expanding the host cell ubiquitylation machinery targeting cytosolic Salmonella. EMBO Rep. 18, 1572–1585 (2017).

For more information:1950477648nn@gmail.com