Funkcionalni dejavniki proti staranju in mehanizem Cistanche Deserticola

[Povzetek] Cilj: Za raziskovanjefunkcionalni dejavniki proti staranjuin mehanizem užitne in zdravilne snoviCistanche deserticolaki temelji na mrežni farmakologiji inin vivoposkusi modelnega organizmaCaenorhabditis elegans. Metode: Potencialne tarče glavnih komponent vC. deserticola so napovedali sistemi tradicionalne kitajske medicine Pharmacology Database and Analysis Platform (TCMSP), SwissTargetPrediction, GeneCards, Online Mendelian Inheritance in Man (OMIM) in druge zbirke podatkov. Predvideni cilji so bili vneseni v platformo za analizo omrežja STRING, da bi pridobili mrežo interakcij protein-protein (PPI) aktivnih komponent in ciljev bolezni, da bi izločili glavne cilje. Analiza obogatitve poti Kjotske enciklopedije genov in genomov (KEGG) je bila uporabljena za napovedovanje in analizo poti delovanja, omrežje zdravilno-aktivne komponente-tarčne poti pa je zgradil Cytoscape.C. elegansje bil razdeljen v prazno skupino inC. deserticolaskupine z različnimi koncentracijami. Življenjska doba, sposobnost razmnoževanja in telesna sposobnostC. elegansopazovali neposredno. Aktivnosti superoksid dismutaze (SOD), katalaze (CAT), glutation peroksidaze (GSH-Px) ter vsebnosti malondialdehida (MDA) in reaktivnih kisikovih spojin (ROS) vC. elegansso bile določene s testom kompleta. S kvantitativno verižno reakcijo s polimerazo (qRT PCR) v realnem času so določili izražanje genov, povezanih z življenjsko dobo in spremembo sposobnosti stresa priC. elegans. Rezultati: Možni funkcionalni dejavniki lahko delujejo75cilje, povezane s staranjem, in8core target proteins, vključno s proteinom toplotnega šoka HSP90- (HSP90AA1), estrogenski receptor (ESR1), GTPaza HRas (HRAS), protrombin (F2), matrične metaloproteinaze-2 (MMP2), heksokinaza-2 (HK2), saharazo-izomaltazo (SI) in maltazo-glukoamilazo (MGAM), smo izločili s topološko analizo. Analiza KEGG je pokazala, da lahko Cistanche deserticola moti27poti, vključno s signalno potjo estrogena, signalno potjo raka, signalno potjo GnRH in signalno potjo insulina za upočasnitev staranja.Cistanche deserticolalahko bistveno podaljša povprečni čas preživetja in izboljša sposobnost oksidativnega stresaC. eleganspovečajo aktivnosti SOD, CAT in GSH-Px ter zmanjšajo kopičenje ROS in MDA ter izražanjedaf-2instarost-1so se zmanjšale, medtem ko je izražanjedaf-16in njegovi spodnji ciljni geni (drevo-3, mtl-1, gst-4,ctl-1inctl-2) so se povečale, prav takoskn-1in geni, povezani s toplotnim šokom (hsf-1, hsp-16.1inhsp-16.2). Zaključek: Mrežna farmakologija se uporablja za razlago možnega mehanizmaC. deserticolav boju proti staranju in to je dokazalC. deserticolalahko podaljša življenjsko doboC. elegansin povečati protistresno sposobnost. Mehanizem je lahko povezan z inhibicijo insulinske signalne poti in aktivacijo spodnjih transkripcijskih faktorjevdaf-16in geni, povezani s toplotnim šokom, s čimer se poveča sposobnost oksidativnega stresaC. elegans.

Ključne besede:Cistanche deserticola YC Ma; proti staranju; funkcionalni dejavniki; mehanizem; oksidativni stres

IZVLEČEK CISTANCHE S 75% GLIKOZIDOM

Cistanche deserticola YC Maje dragoceno tradicionalno kitajsko zdravilo v moji državi. Znan je kot "puščavski ginseng". Prvič je bil zabeležen v "Shen Nong's Materia Medica" in je naveden kot najvišji razred. Po naravi je sladek, slan, topel in se vrača v meridiane ledvic in debelega črevesa. Tradicionalna kitajska medicina verjame, da ima učinke hranjenja ledvičnega janga, dopolnjevanje esence in krvi ter vlaženje črevesja in odvajalo [1]

. Leta 2018 je bila Cistanche deserticola (puščava) vključena v »Katalog substanc, ki so tradicionalno hrana in kitajski zdravilni materiali« [2], in priznana je bila njena vrednost pri razvoju v zdravstvene izdelke. Po statističnih podatkih je Cistanche deserticola v receptih proti staranju in podaljševanju življenja na drugem mestu za ginsengom [3]. Sodobne farmakološke raziskave kažejo, da ima Cistanche deserticola pomembne antioksidativne učinke, učinke proti staranju, proti utrujenosti, izboljšanje spomina in druge učinke [4], vendar njeni funkcionalni dejavniki in mehanizem delovanja proti staranju še vedno niso jasni. Caenorhabditis elegans (v nadaljevanju ogorčica) je večcelični organizem z jasnim genetskim ozadjem, relativno kratko življenjsko dobo, hitrim razmnoževanjem in enostavnim gojenjem. Ko se njegova življenjska doba podaljšuje, kaže fenotip staranja, podoben fenotipu pri ljudeh. Geni, proteini in signalne poti C. elegans so pri ljudeh zelo ohranjeni.

Ima 60- do 80-odstotno homologijo s človeškimi geni. V zadnjih letih so se nematode pogosto uporabljale v raziskavah proti staranju v tradicionalni kitajski medicini in naravni medicini [5]. Ta študija uporablja mrežne farmakološke metode za napovedovanje aktivnih sestavin, tarč in signalnih poti Cistanche deserticola pri odložitvi staranja; z uporabo ogorčic kot modelnih organizmov se z opazovanjem njihove življenjske dobe, razmnoževanja in drugih splošnih kazalcev merijo spremembe v oksidativnem stresu, telesni zmogljivosti in njihov odnos z življenjsko dobo Izražanje sorodnih genov, raziskovanje mehanizma Cistanche deserticola pri zakasnitvi staranja in zagotavljanje informacije za povezano zdravje

Zagotovite referenco za razvoj in uporabo zdravstvenih izdelkov.

1 Material

1. 1 Instrumenti

SMZ-168 stereo mikroskop (podjetje Motic); CKX41 fluorescenčni mikroskop z invertnim faznim kontrastom (podjetje Olympus); Čitalec mikroplošč Multiskan FC (znanstveno podjetje Thermo Fisher); Genski ojačevalec verižne reakcije s polimerazo (PCR) Mycycler, instrument za kvantitativno PCR s fluorescenco MJ Mini™ (Bio-Rad Company).

1. 2 Testno zdravilo

Cistanche deserticola je bila zbrana v bazi dobre kmetijske prakse (GAP) Cistanche deserticola v okrožju Yutian v Xinjiangu. Raziskovalec Zhang Tiejun iz Tianjin Institute of Pharmaceutical Research Co., Ltd. ga je identificiral kot Cistanche deserticola YC Ma; 2',7'-diklorodihidrofluorescein dietil ester kisline (DCFH DA), 2 % NaN3 (Sigma Company); Trizol reagent, komplet za sintezo cDNA, SYBR Green Kit (Takara Bioengineering Co., Ltd.); komplet za superoksid dismutazo (SOD), komplet za katalazo (CAT), komplet za glutation peroksidazo (GSH Px), komplet za malondialdehid (MDA) (Nanjing Jiancheng Biotechnology Co., Ltd.); fluorescenčna kvantitativna verižna reakcija s polimerazo (qRT PCR) Zahtevane primerje je sintetiziral Shanghai Sangon Bioengineering Co., Ltd., zaporedja primerjev pa so prikazana v tabeli 1.

1.3 Nematode

Vseh 10 različnih genetskih vrst ogorčic, uporabljenih v poskusu, je bilo iz genetičnega centra Caenorhabditis. Podrobne informacije so prikazane v tabeli 2.

2 metoda

2.1 Pregled funkcionalnih dejavnikov in tarč Cistanche deserticola

S pregledom literature in združevanjem prejšnje karakterizacije te raziskovalne skupine skupine snovi Cistanche deserticola so bile izločene glavne kemične sestavine in komponente krvi [{{0}}]. Narišite strukturo spojine v programski opremi ChemDraw 19.0, jo vnesite v bazo podatkov SwissTargetPrediction (http://new.swisstargetprediction.ch/) in uporabite metodo povratnega farmakofornega ujemanja, da dobite rezultate virtualnega presejanja. Istočasno je bila uporabljena baza podatkov in analitična platforma sistema tradicionalne kitajske medicine (TCMSP, https://tcmsp-e.com/tcmsp.php). Uporabite funkcijo iskanja UniProtKB v bazi podatkov UniProt (http://www.uniprot.org/) in Pregledano

Swiss-Prot filtrira proteine, omeji vrsto na "človeško" in popravi ciljni protein spojine na ime gena. Integrirajte ciljne rezultate obeh baz podatkov, da dobite potencialno ciljno knjižnico spojin.

2.2 Napovedna analiza ciljev, povezanih s staranjem

Uporabite baze podatkov GeneCards (https://www.genecards.org/) in OMIM (https://omim.org/) za iskanje s ključnimi besedami "old, senile, decrepit, senescence, feeble, caducity", kjer GeneCards Genes z rezultat Večji ali enak 10 % so bili pregledani, rezultati obeh baz podatkov so bili združeni, podvojeni geni so bili odstranjeni in končno so bili doseženi cilji, povezani s staranjem. Nato združite cilje funkcionalnih dejavnikov pod točko 2.1 z zgoraj omenjenimi cilji, povezanimi s staranjem, vzemite presečišče in narišite Vennov diagram.

2.3 Izgradnja mreže protein-protein interakcije (PPI).

Vnesite dobljeni cilj preseka v podatkovno platformo STRING 11.5 (http://string-db.org/), omejite vrsto na "Homo sapiens", najvišja stopnja zaupanja ocene interakcije je 0.900, in pridobite omrežje PPI. Shranite podatke v formatu .TSV in jih uvozite v Cytoscope

3. 8.0 programsko opremo, prilagodite velikost vozlišča in barvno globino z vrednostjo stopnje, da dobite mrežo PPI aktivnih sestavin in tarč bolezni Cistanche deserticola. Točke, katerih trije parametri stopnje, vmesnosti in bližine so bili vsi večji od mediane, so bile izbrane kot osrednje tarče in po pregledu je bilo pridobljenih skupno 8 osrednjih tarč.

2. 4 Bioanaliza genske ontologije (GO) in Kjotski geni in geni

Analiza obogatitve poti Enciklopedije skupin (KEGG) uporablja bazo podatkov OmicsBean (http://www.omicsbean.cn/login/) za izvedbo funkcionalne analize GO in analize obogatitve poti KEGG na ciljih presečišča, razvrščanje glede na vrednost P, in analizirati nastale poti.

2.5 Konstrukcija mreže zdravilnih materialov-sestavnih delov-tarč

Uvozite medicinske materiale, komponente, tarče in poti v programsko opremo Cytoscope 3.8.0 za izgradnjo mreže zdravilne snovi-komponente-tarčne poti Cistanche deserticola.

2.6 Gojenje nematod

Ogorčice smo gojili pri 20 stopinjah z uporabo medija NGM (ki je vseboval 0.750 g NaCl, 0,625 g triptona in 4,250 g agarja v 250 ml dvakrat destilirane vode). Kot vir hrane smo uporabili sterilizirano Escherichia coli OP50 (65 stopinj, 45 minut) in enakomerno porazdelili po površini gojišča kulture NGM. Za sinhronizacijo ogorčic uporabite raztopino za lizo (5 % NaClO, 5 mol·L–1 NaOH) in gojite sinhronizirane ogorčice do stopnje L4 v inkubatorju pri 20 stopinjah. Ogorčice stopnje L4 so bile naključno izbrane in razdeljene v kontrolno skupino (medij NGM) in skupine za dajanje Cistanche deserticola z različnimi masnimi koncentracijami za poskuse.

2.7 Priprava zdravila

Vzemite 10 g zdravilnega materiala Cistanche deserticola, dodajte destilirano vodo v skladu z razmerjem snov-tekočina 1:10, zavrtite in ekstrahirajte dvakrat, vsakič 2 uri, združite vodne ekstrakte, filtrirajte in koncentrirajte do suhega pod zmanjšan pritisk. Za pripravo matične raztopine z masno koncentracijo 50 mg·mL–1 (glede na količino surovega zdravila) uporabite sterilno destilirano vodo. Uporabite gojišče NGM za pripravo raztopin s končnimi masnimi koncentracijami 0, 25, 50, 75, 100, 200 in 500 ug·mL–1 za kasnejšo uporabo.

2.8 Preskus strupenosti

N2 nematode smo prenesli v petrijevke z različnimi masnimi koncentracijami Cistanche deserticola (0, 25, 50, 100, 200, 500 ug·mL–1), 100 v vsaki skupini. Dan dajanja so šteli kot dan 0. Vsak dan zamenjajte medij, ki vsebuje sveže zdravilo, in zabeležite smrt ogorčic, da dobite varno območje odmerjanja Cistanche deserticola.

2.9 Stresni poskus

Ogorčice N2 smo prenesli v celice z različnimi masnimi koncentracijami Cistanche deserticola (0, 25, 50, 75 ug·mL–1

) v petrijevki, 100 v vsaki skupini. Dan dajanja zdravila smo šteli kot dan 0. Sveže gojišče, ki je vsebovalo zdravilo, smo zamenjali vsak dan. Stresni poskus je bil izveden 7. dan dajanja zdravila. V eksperimentu z oksidativnim stresom smo ogorčice iz vsake skupine prenesli v gojišče NGM (na vsakih 10 mL medija NGM smo dodali 10 μL 30 % H2O2) in vsakih 30 minut beležili preživetje ogorčic. V poskusu toplotnega stresa so bile ogorčice nenehno izpostavljene 35 stopinjam in gojene, stanje preživetja ogorčic pa je bilo zabeleženo vsaki 2 uri.

2. 10 Poskus z upogibom telesa

Vzemite ogorčice N2, jih razvrstite v skupine in jih tretirajte enako kot v 2.9. 3. in 7. dan po dajanju zdravila je bil izveden poskus upogibanja telesa. Iz vsake skupine je bilo vzetih 20 ogorčic, zaznano in zabeleženo pa je bilo število telesnih upogibov ogorčic v 30 s.

2. 11 Poskus faringealne črpalke

Vzemite ogorčice N2, združite in jih dajte pod enakimi pogoji kot 2.9, dajte 1 ogorčico v vsako petrijevko in nastavite 5 vzporednic za vsako masno koncentracijo. Opazujte pod stereomikroskopom 0, 3. in 7. dan dajanja. Pogostost požiranja ogorčic smo vsakokrat opazovali 60 s in zabeležili število faringealnih črpalk.

2.12 Reprodukcijski poskus

Vzemite ogorčice stopnje L1 N2 in jih postavite v medij za zdravilo ter jih gojite do stopnje L4. Nato jih vsak dan prenesite v nov medij, ki vsebuje zdravilo z različnimi masnimi koncentracijami, in izmerite število jajčec, ki so jih odložile ogorčice. Stare plošče z jajčeci so postavljene na. Po 48-urnem gojenju pri 20 stopinjah smo določili število potomcev. Vsaka petrijevka vsebuje 1 ogorčico, za vsako masno koncentracijo pa je nastavljenih 5 vzporednic.

2.13 Določanje kopičenja lipofuscina

Vzemite ogorčice N2, združite in uporabite enako zdravljenje kot v 2.9, s 100 ogorčicami v vsaki skupini. Poskusi merjenja lipofuscina so bili izvedeni 7. in 11. dan dajanja zdravila. Naključno smo izbrali 35 ogorčic in jih položili na 2 % agarozne plošče, anestezirali z 2 % NaN3 in uporabili fluorescenčni mikroskop (valovna dolžina vzbujalne svetlobe je bila 360–370 nm, oddana svetloba (valovna dolžina: 420–460 nm) Opazujte modro avtofluorescenco v ogorčici in uporabite programsko opremo imageJ 1.51 za kvantificiranje intenzivnosti fluorescence.

2. 14 Določanje vsebnosti MDA, ROS in aktivnosti antioksidativnih encimov

Vzemite ogorčice N2, združite in izvajajte enako zdravljenje kot v 2.9, z 100 ogorčicami v vsaki skupini. Sedmi dan po dajanju smo ogorčice na gojišču vsake skupine sprali z 0,9 % raztopino natrijevega klorida in zbrali v 1,5 ml centrifugalno epruveto, homogenizirali na ledu in centrifugirali pri 3000 r·min{{ 10}} 10 minut (centrifugalni polmer 42,5 mm), vzemite supernatant po centrifugiranju in uporabite komplet za merjenje aktivnosti vsebnosti SOD, CAT, GSH-Px in MDA. V poskusu določanja ROS so bile ogorčice trikrat sprane s pufrom M9, dane v raztopino DCFH-DA s končno koncentracijo 10 μmol·L–1 in inkubirane pri 37 stopinjah v temi 20 minut, stresanje vsakih 5 min. Nato dvakrat sperite s pufrom M9 in postavite ogorčice na predmetno stekelce. Posnemite slike s fluorescenčnim mikroskopom (valovna dolžina vzbujevalne svetlobe 485 nm, valovna dolžina emisijske svetlobe 520 nm) in uporabite programsko opremo ImageJ 1.51 za oceno relativne intenzivnosti fluorescence.

2. 15 Faktor pospeševanja razpada-16 (DAF-16), jedrska translokacija SKN-1 in SOD-3, glutation S-transferaza-4 (GST{{ 8}}), beljakovine toplotnega šoka-16. 2 (HSP -16. 2) Vizualizacija z uporabo transgenih ogorčic TJ356 oziroma LG333 za poskuse jedrske translokacije beljakovin DAF-16 in SKN-1.

Transgene ogorčice CF1553, CL2166 in TJ375 so bile uporabljene za določanje izražanja proteinov SOD-3, GST-4 in HSP-16.2. Združevanje in upravljanje sta enaka tistim pod 2.9. Sedmi dan po dajanju zdravila je bil uporabljen fluorescenčni mikroskop za fotografiranje ogorčic v vsaki skupini, programska oprema ImageJ 1.51 pa je bila uporabljena za kvantificiranje intenzivnosti fluorescence GFP.

2. 16 Določitev življenjske dobe mutiranih ogorčic

Poskusi so bili izvedeni z uporabo ogorčic CF1038, EU1, PS3551 oziroma DA1116 in so bili razdeljeni na kontrolno skupino in skupino za dajanje Cistanche deserticola 75 ug·mL–1. Vsak dan smo šteli stopnjo preživetja ogorčic v vsaki skupini. 2. 17 qRT-PCR poskus: ogorčice N2 stopnje L4 so bile prenesene v gojišče NGM (ki vsebuje 150 μmol·L–1 pentfluorouracila), ki vsebuje različne masne koncentracije Cistanche deserticola (0, 25, 50, 75 ug·mL–1), 20 Inkubirajte pri stopinjah 6 dni. Celotno RNA iz ogorčic smo ekstrahirali z metodo Trizol in jo reverzno prepisali v cDNA za kvantifikacijo mRNA. Podatki so bili obdelani z metodo 2–ΔΔCt, kot notranji referenčni gen pa je bil uporabljen act-1.

2. 18 Analiza podatkov

Za statistično analizo je bila uporabljena programska oprema SPSS 19.0, podatki pa so izraženi kot (-x ± s). Razlike med skupinami so bile analizirane z enosmerno ANOVA in P<0.05 was considered a statistically significant difference.

3. Rezultat

3.1 Potencialne učinkovine in tarče Cistanche deserticola

S pregledom literature in združevanjem s prejšnjimi raziskavami te raziskovalne skupine je bilo 12 kemičnih komponent, vključno s feniletanoidnimi glikozidi, iridoidi in lignani, izbranih kot ciljne spojine za mrežne farmakološke raziskave. Specifične informacije so prikazane v tabeli 3. Po odstranitvi dvojnikov iz zbirke podatkov je bilo pridobljenih skupno 86 ciljnih vrednosti za 12 potencialnih učinkovin.