Antimelanogene in antioksidativne aktivnosti etanolnega izvlečka Kummerowia Striata: Kummerowia Striata uravnava antimelanogeno aktivnost z znižanjem ekspresije TRP-1, TRP-2 in MITF

POVZETEK

Kummerowia striata (K. striata) se uporablja kot tradicionalno zdravilo za zdravljenje vnetij. Da bi ugotovili, ali ima koristne antimelanogene in antioksidativne aktivnosti, smo raziskali biološke aktivnosti etanolnega izvlečka Kummerowia striata (EKS) z uporabo različnih sistemov modelov in vitro in celične kulture. Antimelanogeno aktivnost so ocenili v celicah melanoma B16F10 v smislu sinteze melanina in in vitro inhibitorne aktivnosti tirozinaze. Testi antioksidantov so bili izvedeni z uporabo 2,2-difenil-1-pikrilhidrazila (DPPH) in 2,2'-kazino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfonske kisline) diamonijeve soli (ABTS). EKS je pokazal močno antioksidativno delovanje pri testih DPPH in ABTS. Ravni transkripcije mRNA in ravni izražanja beljakovin tirozinaze, s tirozinazo povezanega proteina 1, s tirozinazo povezanega proteina 2 in transkripcijskega faktorja, povezanega z mikroftalmijo, so se z zdravljenjem z EKS zmanjšale v odvisnosti od odmerka.

Poleg tega EKS ni vplival na viabilnost celic pri različnih koncentracijah, uporabljenih v tej študiji, kar kaže, da mehanizem delovanja zaviranja sinteze melanina, ki ga posreduje EKS, ne vključuje citotoksičnosti. Prav tako smo potrdili, da sta p-kumarinska kislina in kvercetin pomembni spojini za antimelanogenezo in antioksidativne lastnosti EKS. Naše ugotovitve skupaj prvič kažejo, da ima EKS antimelanogene in antioksidativne aktivnosti. Nadaljnje vrednotenje in razvoj EKS kot funkcionalnega dodatka ali kozmetičnega izdelka je lahko koristen za beljenje kože in zmanjšanje gub.

Za beljenje smo ugotovili, da ima cistanča belilni učinek, cistanča pa je bogata z vitaminom C, ki velja za zelo učinkovito belilno sredstvo. Vitamin C lahko zavira sintezo melanina, vrste melanina, ki lahko naredi kožo pusto. Hkrati lahko vitamin C spodbuja tudi proizvodnjo kolagena, ki je snov, ki naredi kožo bolj čvrsto in elastično.

Poleg zgoraj naštetih sestavin Cistanche vsebuje tudi vrsto aminokislin in elementov v sledovih, ki so prav tako zelo koristni za zdravje kože. Na primer, cink, ki ga vsebuje Cistanche, lahko pomaga pri zdravljenju aken in sončnih opeklin, hkrati pa preprečuje staranje kože. Poleg tega ima Cistanche dober zaščitni učinek na jetra in imunski sistem.

Kliknite dodatek cistanche deserticola

1. Uvod

Študije o zunanjem staranju so pokazale, da ima koža pomembno vlogo pri prepoznavanju človekovega staranja [1,2]. Staranje kože lahko razdelimo na dve vrsti: kronološko staranje, ki ga spremlja postopno poslabšanje strukture in delovanja kože skozi čas, drugo pa je eksogeno staranje (fotostaranje), pri katerem se tekstura kože spremeni zaradi dolgotrajnega staranja. dolgotrajna izpostavljenost sončni svetlobi [3,4]. Prosti radikali in reaktivne kisikove vrste so najpomembnejše sestavine, ki spodbujajo staranje kože. Povzročajo oksidativni stres v kožnih celicah, pri tem nastale snovi pa povzročajo povečano proizvodnjo melanina in gube.

Melanin se sintetizira z oksidacijo tirozinaze ali L-3,4-dihidroksifenilalanina (L-DOPA) prek aktivnosti tirozinaze in s tirozinazo povezanega proteina 1 (TRP-1). Melanociti igrajo pomembno vlogo pri zaščiti kože pred poškodbami zaradi sevanja [5,6]. Biosintezo melanina v melanocitih posreduje encim tirozinaza, ki uravnava tvorbo L-DOPA s hidrolizo tirozina in tvorbo kinona DOPA z oksidacijo DOPA [7,8]. Poleg tega je z mikroftalmijo povezan transkripcijski faktor (MITF) ključni transkripcijski faktor, ki uravnava transkripcijo melanogenih encimov (tj. tirozinaze, TRP-1 in TRP-2) [9,10]. Tirozinazo in TRP-1 transkripcijsko uravnava MITF, ki ima pomembno vlogo v poti sinteze melanina [11,12].

Kummerowia striata (Thunb. ex Murray) Schindl (K. striata) je enoletna rastlina, ki izvira iz vzhodne Azije, vključno s Korejo, Kitajsko in Japonsko. Rastlina se že dolgo uporablja kot tradicionalno zdravilno zelišče pri zdravljenju vnetja. Namen te študije je bil analizirati potencialne antimelanogene in antioksidativne aktivnosti etanolnega ekstrakta K. striata (EKS) in njegovih dveh spojin. Antioksidativne aktivnosti so bile ocenjene glede na njihove aktivnosti lovljenja prostih radikalov z uporabo 2,2'-kazino-bis (3-etilbenzotiazolin-6-sulfonske kisline) diamonijeve soli (ABTS) in 2,{{11 }}difenil-1-pikrilhidrazil (DPPH) testi. Aktivnosti proti tirozinazi so ocenili s testom inhibicije tirozinaze. Ugotovili smo, da so EKS in njegove spojine obetavni kandidati za uporabo v kozmetičnih izdelkih za beljenje kože in zmanjševanje gub.

2. Materiali in metode

2.1. Pogoji celične kulture

Celične linije mišjega melanoma B16F10 so bile kupljene iz ameriške zbirke tipskih kultur (Manassas, VA, ZDA). Celice smo gojili v Dulbeccovem modificiranem mediju Eagle (DMEM, Gibco, San Jose, CA, ZDA), dopolnjenem z 10 odstotki fetalnega govejega seruma (FBS) in penicilinom/streptomicinom (Gibco, ZDA) v vlažni atmosferi s 5 odstotki CO2 v zraku. pri 37 stopinjah.

2.2. Reagenti

Naslednja protitelesa so bila kupljena iz komercialnih virov: anti-tirozinaza, anti-TRP-1, anti-TRP-2 in anti-MITF (ThermoFisher Scientific, Rockford, IL, ZDA); proti- -aktinska protitelesa ter konjugati mišjega in kunčjega IgG-peroksidaze hrena (Cell Signaling, Beverly, MA, ZDA).

2.3. Priprava izvlečka Kummerowia striata

Nadzemne dele K. striata (Thunb. ex Murray) Schindler je septembra 2013 zbral v mestu Gimpo, Gyeonggi, Južna Koreja, identificiral pa jih je profesor Joa Sub Oh, Fakulteta za farmacijo, Univerza Dankook, Cheonan, Južna Koreja. Vzorec vavčerja (G63) je bil deponiran v Bio-center, Gyeonggido Business & Science Accelerator, Suwon, Južna Koreja. Nadzemne dele K. striata (Thunb. ex Murray) Schindler (1,8 kg) ekstrahiramo s 70-odstotnim EtOH (3 × 18 L) pri sobni temperaturi. Združene ekstrakte EtOH smo nato koncentrirali v vakuumu pri 40 stopinjah, da smo dobili 180 g ostanka. Ekstrakt EtOH smo suspendirali v destilirani vodi in nato zaporedoma porazdelili z diklorometanom (CH2Cl2), etil acetatom (EtOAc) in butanolom (n-BuOH). MC frakcijo (7,52 g) smo ločili s tekočinsko kolonsko kromatografijo [steklena kolona (7,5 × 40 cm), napolnjena s silikagelom (70–230 mesh)] z uporabo gradientnih mešanic kot eluentov (CH2Cl2 → MeOH).

Frakcije eluenta F001–F006 so bile pridobljene iz tega začetnega ločevanja s tekočinsko kromatografijo. Frakcijo F003 smo očistili s kolonsko kromatografijo z uporabo steklene kolone (5,0 × 40 cm), napolnjene z gelom ODS-C18. Kolono smo nato eluirali s H2O → MeOH, kar je povzročilo sedem podfrakcij (F007-F013). p-kumarno kislino (15,2 mg) smo izolirali iz F007 s tekočinsko kolonsko kromatografijo [steklena kolona (3,0 × 40 cm), napolnjena z ODS-C18] z uporabo gradientne elucije (H2O → MeOH). Kvercetin (13,5 mg) smo izolirali iz F004 s tekočinsko kolonsko kromatografijo [steklena kolona (3,0 × 40 cm), napolnjena z ODS-C18] z uporabo gradientne elucije (H2O → MeOH). Njihove strukture so bile pojasnjene s kombinacijo 1D in 2D jedrske magnetne resonance (NMR) in masne spektrometrije ter s primerjavo s poročano literaturo [13,14].

2.4. Splošni postopki

1D in 2D [1H-1H korelacijska spektroskopija (COSY), heteronuklearna enojna kvantna koherenca (HSQC) in heteronuklearna korelacija več vezi (HMBC)] NMR spektri so bili izmerjeni na Bruker Ascend III 70{ {25}} MHz NMR spektrometer (Rheinstetten, Nemčija) s tetrametilsilanom kot internim standardom. Kemični premiki so bili izraženi kot vrednosti δ. Masni spektri ionizacije z elektrosprejem (ESI) so bili pridobljeni na masnem spektrometru LTQ Orbitrap XL (Thermo Scientific). Odprto kolonsko kromatografijo smo izvedli s silikagelom (Kiesel gel 60, 70–230 mesh in 230–400 mesh; Merck) in ODS-C18 gel ODS-A (12 nm S7 μm, YMC GEL, Japonska). Tankoplastno kromatografijo smo izvedli s predhodno prevlečenim silikagelom 60 F254 (0,25 mm, Merck) oziroma s predhodno prevlečenim silikagelom 60 RP-18 F-254S (0,25 mm, Merck). Vse kemikalije in topila so bile analitske kakovosti in uporabljene brez nadaljnjega čiščenja.

2.5. Test viabilnosti celic

3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolijev bromid (MTT) je bil izveden za določitev učinka EKS na celico sposobnost preživetja. Celice mišjega melanoma B16F10 smo gojili v 96-ploščah z vdolbinicami (1 × 104 celic/vdolbinico) in 24 ur obdelali z EKS. Skupaj smo dodali 100 μL medija brez seruma, ki je vseboval 10-odstotno raztopino MTT (5 mg/ml), in ga inkubirali 3 ure. Medij smo odstranili in dvakrat sprali s fosfatno pufrano fiziološko raztopino (PBS). Nato smo v vsako vdolbino dodali 100 μL dimetil sulfoksida (DMSO) in raztopili v stresalniku. Absorbanco smo izmerili pri 540 nm z ELISA čitalnikom (Molecular Device, ZDA).

2.6. Vsebnost celičnega melanina

Celice B16F10 smo gojili v 6-ploščah z vdolbinicami pri gostoti 1 × 105 celic na vdolbinico in jih inkubirali 24 ur. Melanogenezo smo inducirali s 100 nM -melanocite stimulirajočim hormonom (-MSH). Celice smo obdelali z arbutinom (pozitivna kontrola) in EKS v različnih koncentracijah ter gojili 72 ur. Po dvakratnem izpiranju s PBS smo dodali lizni pufer [100 mM natrijevega fosfata (pH 6,8) in 0,1 mM fenilmetan sulfonil fluorida (PMSF), 1 odstotek Triton X-100] in raztopili pri -80 stopinjah 30 minut. Po žetvi celic je 1 N NaOH, ki je vseboval 10 odstotkov DMSO, reagiral pri 65 stopinjah 1 uro, da se je peleta raztopila, absorbanca pa je bila izmerjena pri 405 nm.

2.7. Test inhibicije tirozinaze

Inhibicijsko aktivnost tirozinaze smo izmerili z uporabo metode, ki so jo opisali Yagi et al. [15]. Reakcija je bila izvedena v 0.1 M pufru kalijevega fosfata (pH 6,5), ki je vseboval 1,5 mM L-tirozina in 1250 enot/ml gobje tirozinaze. Reakcijsko mešanico smo inkubirali pri 37 stopinjah 20 minut. Testni vzorci so bili testirani na inhibicijo tirozinaze z merjenjem njenega učinka na aktivnost tirozinaze z uporabo čitalnika ELISA pri 490 nm. Arbutin je bil uporabljen kot pozitivna kontrola.

2.8. Test aktivnosti lovljenja radikalov DPPH

Aktivnost lovljenja radikalov DPPH je bila izmerjena z uporabo metode, ki sta jo opisala Blois [16] in Ozgen et al. [17]. Na kratko, 100 μL raztopine DPPH, raztopljene v metanolu, smo dodali k 100 μL EKS, ki smo ga razredčili na zahtevano koncentracijo, in reakcijo izvajali pri sobni temperaturi 30 minut. Absorbanco smo izmerili pri 517 nm z ELISA čitalnikom (Molecular Device, ZDA). Kot pozitivno kontrolo smo uporabili antioksidant butiliran hidroksianizol (BHA) in določili vrednost IC50 EKS.

2.9. ABTS aktivnost odstranjevanja radikalov

Aktivnost lovljenja radikalov ABTS je bila izmerjena z uporabo predhodno opisane metode [18,19]. ABTS plus je nastal z mešanjem 7 mM raztopine ABTS in 2,45 mM raztopine kalijevega persulfata (K2S2O8) z ABTS: K2S2O8 (razmerje 2:1) 12–16 ur, da se tvori kation (ABTS plus). Vrednost absorbance pri 734 nm je bila 1,35 ± 0,05. Skupno je 100 μL razredčene raztopine in 100 μL EKS, razredčenega na zahtevane koncentracije, reagiralo pri sobni temperaturi 6 minut, absorbanca pa je bila izmerjena pri 734 nm z uporabo čitalnika ELISA. Kot pozitivno kontrolo smo uporabili BHA, antioksidant, in določili vrednost IC50 EKS.

2.10. Reverzna transkripcija-verižna reakcija s polimerazo (RT-PCR)

Celice melanoma B16F10 so bile zasejane v 6-plošče z vdolbinicami pri gostoti 1 × 106 celic/vdolbinico in obdelane z EKS (100–400 ug/mL) 72 ur. Za ekstrakcijo celotne RNA smo v vsako vdolbino dodali reagent Trizol (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc.), da smo celice lizirali, in dodali 200 μL kloroforma. Nato smo mešanico centrifugirali pri 13,000 obratih na minuto 20 minut pri 4 stopinjah in supernatant mešali z izopropanolom 30 minut pri -70 stopinjah. Po centrifugiranju pri 13,000 obratih na minuto 20 minut pri 4 stopinjah smo supernatant odstranili in v vsako epruveto dodali 70 odstotkov EtOH-dietilpirokarbonatne vode. Po centrifugiranju pri 13,000 obratih na minuto 5 minut pri 4 stopinjah smo supernatant odstranili in posušili pri sobni temperaturi.

Nato je bil 1 ug ekstrahirane celotne RNA reverzno prepisan v enoverižno cDNA z oligo dT z uporabo Taq DNA polimeraze in SuperScript®III First-Strand Synthesis System (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Inc.). cDNA je bila pomnožena v MyGene™Series Peltier Thermal Cycler Model MG96 G (LongGene Scientific Instruments, Hangzhou, Kitajska) z uporabo specifičnih primerjev in predmešanice AccuPower® Pfu PCR (Bioneer Corporation, Daejeon, Republika Koreja). Pogoji cikliranja PCR so bili 5 minut pri 95 stopinjah, čemur je sledilo 30 ciklov po 30 sekund pri 95 stopinjah, 30 sekund pri 60 stopinjah, 1 minuta pri 72 stopinjah in končno podaljšanje za 10 minut pri 72 stopinjah. Po pomnoževanju smo produkte PCR elektroforizirali na 1,5-odstotnem agaroznem gelu, ki je vseboval etidijev bromid, in analizirali z uporabo UV transiluminatorja.

2.11. Western blot analiza

Celice melanoma B16F10 smo gojili v DMEM, dopolnjenem z 10 odstotki FBS pri gostoti 1 × 106 celic v 6-ploščah z vdolbinicami pri 37 stopinjah in 5 odstotkih CO2 24 ur. Po odstranitvi gojišča je bil EKS (100–400 ug/ml), razredčen v mediju, obdelan 72 ur. Celice smo sprali s PBS, pobrali s pufrom RIPA (Sigma Aldrich) in centrifugirali pri 15,000 obratih na minuto 15 minut pri 4 stopinjah. Celotne beljakovine so bile ekstrahirane iz celic in kvantificirane z uporabo Bradfordove metode. Proteine ​​smo ločili z elektroforezo v 8-odstotnem natrijevem dodecil sulfatu in poliakrilamidnem gelu in prenesli na nitrocelulozno membrano (Whatman, Dassel, Nemčija). Membrana je bila blokirana s 5 odstotki BSA 1 uro pri sobni temperaturi in inkubirana čez noč s primarnim protitelesom pri 4 stopinjah. Membrano smo nato sprali in inkubirali s sekundarnimi protitelesi, konjugiranimi s hrenovo peroksidazo, 1 uro pri sobni temperaturi. Membrana je bila oprana in detektirana s SuperSignal® West Pico Chemiluminescent Substrate (ThermoFisher Scientific, Rockford, IL, ZDA).

2.12. Statistična analiza

Statistična analiza je bila izvedena z uporabo Studentovega t-testa z Microsoft Excel 2007 (Microsoft Corporation, Redmond, WA, ZDA). Rezultati so predstavljeni kot povprečje ± standardna deviacija in p< 0.05 was considered to indicate a statistically significant difference. 

Slika 1. Učinki etanolnega ekstrakta Kummerowia striata na inhibicijo tirozinaze, celično sposobnost preživetja in sintezo melanina (A) Inhibicijsko aktivnost etanolnega ekstrakta Kummerowia striata (EKS) na tirozinazo smo analizirali z merjenjem količine dopakroma, ki nastane v reakciji. Arbutin je bil uporabljen kot pozitivna kontrola. (B) Vsebnost melanina v celicah B16F10, stimuliranih z 100 nM MSH. Vsebnost melanina je bila izračunana kot odstotek vsebnosti v kontroli. (C) B16F10 mišje melanomske celice so bile obdelane z EKS (25–400 ug/ml) in arbutinom (400 ug/ml). Citotoksičnost EKS in arbutina je bila določena s testom MTT. Vrednosti predstavljajo povprečje ± SD treh neodvisnih ponovitev. Statistična značilnost je navedena kot *P <0,05, **P <0,01 v primerjavi z neobdelanimi vzorci ali celicami, obdelanimi z -MSH.

\

Slika 2. Antioksidativna aktivnost etanolnega ekstrakta Kummerowia striata (A in B) Aktivnost lovljenja prostih radikalov je bila določena, kot je opisano. Antioksidativno aktivnost smo izmerili s testom aktivnosti lovljenja radikalov DPPH in testom ABTS plus radikalski kation. Kot pozitivno kontrolo smo uporabili butilirani hidroksianizol. Vrednosti predstavljajo povprečje ± SD treh neodvisnih ponovitev. Statistična značilnost je navedena kot *P < 0.05, **P < 0,01, v primerjavi z neobdelanimi vzorci.

3. Rezultati

3.1. Antimelanogenezni učinki EKS

Za določitev antimelanogenih aktivnosti EKS smo uporabili test gobove tirozinaze z uporabo L-tirozina kot substrata in gobove tirozinaze kot vira encima. Ker je tirozinaza ključni encim, ki katalizira stopnjo omejevanja hitrosti v biosintezi melanina, smo najprej izmerili sposobnost EKS za zaviranje tirozinaze. Kot je prikazano na sliki 1A, je imel EKS pomemben zaviralni učinek na aktivnost tirozinaze v odvisnosti od odmerka. Ti rezultati kažejo, da je EKS pokazal zaviralne učinke na aktivnost gobove tirozinaze, zaviralni učinek EKS pa je bil podoben učinku arbutina, uporabljenega kot pozitivna kontrola.

Nato smo za določitev učinka EKS na sintezo melanina kvantificirali vsebnost melanina v celicah melanoma B16F10, zdravljenih z EKS. Kot je prikazano na sliki 1B, je zdravljenje z EKS zmanjšalo vsebnost melanina v celicah melanoma na način, ki je odvisen od odmerka, kar kaže, da je lahko zmanjšanje celičnega melanina posledica zaviranja aktivnosti tirozinaze. Poleg tega je raziskovanje učinka EKS na sposobnost preživetja celic melanoma B16F10 pokazalo, da EKS pri uporabljeni koncentraciji ni imel pomembnega citotoksičnega učinka na celice B16F10 (slika 1C). Te ugotovitve jasno kažejo, da ima EKS antimelanogene učinke z zaviranjem aktivnosti tirozinaze in sinteze melanina v celicah melanoma B16F10, ne da bi povzročil citotoksičnost.

3.2. Antioksidativno delovanje EKS

Lovilna aktivnost EKS je bila določena z uporabo prostih radikalov DPPH (slika 2A). EKS je pokazal večjo antioksidativno aktivnost (lovilna aktivnost=50.22 odstotkov, IC50=98.71 ug/ml). Sposobnost čiščenja EKS je bila ocenjena tudi z uporabo radikalnega kationa ABTS (slika 2B). Sposobnost čiščenja radikalov ABTS pri EKS je bila podobna tisti pri pozitivni kontroli BHA (zmogljivost čiščenja=99.53 odstotkov, IC50=24.64 ug/ml). Ti rezultati kažejo, da ima EKS večjo antioksidativno aktivnost.

3.3. Vpliv EKS na izražanje genov za sintezo melanina

Da bi raziskali molekularne mehanizme, s katerimi EKS nadalje uravnava melanogenezo, smo preučili spremembe v izražanju melanogenih genov in proteinov, kot so tirozinaza, TRP-1, TRP-2 in MITF, ki igrajo ključno vlogo pri melanogenezi [20]. Kot je prikazano na sliki 3A, je ekspresijo mRNA tirozinaze, TRP-1, TRP-2 in MITF sprožil -MSH; vendar je zdravljenje z EKS znatno zmanjšalo ekspresijo mRNA (100–400 ug/ml). Poleg tega je EKS pokazal močno inhibitorno aktivnost, podobno kot arbutin pozitivne kontrole. Nato je bil učinek EKS na izražanje proteinov, povezanih z melanogenezo, ocenjen z Western blot analizo. Kot je prikazano na sliki 3B, je zdravljenje z EKS izrazito zaviralo -MSH-inducirane ravni izražanja tirozinaze, TRP-1, TRP-2 in MITF v celicah B16F10. Te ugotovitve skupaj kažejo, da bi zaviralne učinke EKS na melanogenezo v celicah B16F10 lahko posredovali z znižano regulacijo melanogenih genov in proteinov, kot so tirozinaza, TRP1, TRP-2 in MITF.

Slika 3. Učinki etanolnega ekstrakta Kummerowia striata na proces biosinteze melanina (A) Izražanje tirozinaze, TRP1, TRP2 in MITF na ravni mRNA je bilo določeno z uporabo RT-PCR. Arbutin je bil uporabljen kot pozitivna kontrola. MRNA tirozinaze, TRP1, TRP2 in MITF smo analizirali s protokolom denzitometrije. Arbutin je bil uporabljen kot pozitivna kontrola. (B) Ekspresija tirozinaze, TRP1, TRP2 in MITF na ravni beljakovin je bila določena z Western blottingom. Arbutin je bil uporabljen kot pozitivna kontrola. Tirozinazo, TRP1, TRP2 in MITF smo analizirali s protokolom denzitometrije. Arbutin je bil uporabljen kot pozitivna kontrola. Vrednosti predstavljajo povprečje ± SD treh neodvisnih ponovitev. Statistični pomen je označen kot *P < {{10}}.05, **P < 0,01, v primerjavi s celicami, obdelanimi z -MSH.

Slika 4. Inhibicijska aktivnost tirozinaze in antioksidativna aktivnost aktivnih spojin etanolnega ekstrakta Kummerowia striata (A) Analizirana je bila inhibicijska aktivnost tirozinaze p-kumarinske kisline in kvercetina (12,5–50 μM). (B) Antimelanogeno delovanje kumarne kisline in kvercetina (100–400 μM) smo analizirali v celicah B16F10. (C) Antioksidativno aktivnost p-kumarinske kisline in kvercetina (6,25–100 μM) smo izmerili z uporabo ABTS plus testa radikalnih kationov. Arbutin in BHA sta bila uporabljena kot pozitivna kontrola. Vrednosti predstavljajo povprečje ± SD treh neodvisnih ponovitev. Statistična značilnost je navedena kot *P <0,05, **P <0,01, v primerjavi z neobdelanimi vzorci.

3.4. p-kumarinska kislina in kvercetin iz EKS sta pokazala močno antimelanogeno in antioksidativno delovanje

Nato smo poskušali identificirati in očistiti funkcionalne spojine, prisotne v EKS, ki kažejo močne antimelanogene in antioksidativne lastnosti. Različne spojine so bile identificirane kot luteolin, p-kumarinska kislina, rožmarinska kislina, kvercetin, genistein in (plus)-katehin. Med njimi sta p-kumarinska kislina in kvercetin zavirala tirozinazo in sintezo melanina ter pokazala sposobnost odstranjevanja, podobno kot arbutin, dobro znano sredstvo za depigmentacijo, na način, ki je odvisen od odmerka (slika 4). Ti rezultati kažejo, da sta p-kumarinska kislina in kvercetin pomembni spojini za antimelanogene in antioksidativne lastnosti EKS.

4. Razprava

V tej študiji smo želeli analizirati antimelanogeni in antioksidativni potencial EKS in njegovih dveh spojin p-kumarinske kisline in kvercetina ter ugotovili, da ima EKS močno antimelanogeno in antioksidativno delovanje.

Pigmentacijo kože večinoma povzročajo melanociti v bazalni plasti kože po stimulaciji z UV sevanjem. Stimulirani keratinociti izločajo -MSH (majhen peptidni hormon) [21]. Izpostavljenost UV-žarkom torej povzroči nastajanje melanina, kar povzroči hiperpigmentacijo [22]. V zadnjem času so se številni raziskovalci osredotočili na razvoj novih in učinkovitih belilnih spojin, saj kozmetika z belilnimi učinki predstavlja velik del kozmetičnega trga. Študije o zaviranju biosinteze melanina so pokazale, da arbutin, kojična kislina in številni drugi naravni izdelki zavirajo melanogenezo in hiperpigmentacijo. Vendar so pred kratkim poročali o stranskih učinkih arbutina [23] in kojične kisline [24], zato je uporaba teh snovi morda omejena. Zato je treba razviti varne materiale za beljenje kože brez stranskih učinkov. Novejše raziskave so se osredotočile na razvoj kozmetike za beljenje kože iz naravnih materialov.

Več študij je pokazalo različne biološke aktivnosti izvlečkov K. striata. Zlasti je K. striata farmacevtsko učinkovita pri vnetju in oksidaciji [25, 26]. Vendar do danes niso poročali o učinkih in molekularnih mehanizmih K. striata na melanogenezo. V tej študiji prvič dokazujemo, da ima EKS antimelanogene in antioksidativne aktivnosti.

Tirozinaza, TRP-1 in TRP-2 imajo pomembno vlogo pri biosintezi melanina [27]. Tako mehanizem, na katerem temelji učinek sredstev za beljenje kože, vključuje zaviranje proizvodnje melanina z zmanjšanjem aktivnosti tirozinaze [28]. Znano je, da izražanje genov tirozinaze, TRP-1 in TRP-2 uravnava MITF [29]. V tej študiji je bilo ugotovljeno, da so antimelanogene aktivnosti EKS posredovane z zaviranjem aktivnosti tirozinaze in -MSH-inducirane sinteze melanina v celicah melanoma B16F10, brez indukcije citotoksičnosti (slika 1). Ugotovljeno je bilo, da so te antimelanogene aktivnosti EKS posredovane z znižanjem -MSH-inducirane mRNA in izražanja proteinov tirozinaze, TRP-1, TRP-2 in MITF (slika 3). Antioksidativno delovanje smo merili s testoma DPPH in ABTS. EKS je pokazal močno antioksidativno aktivnost, podobno BHA, ki je bila uporabljena kot pozitivna kontrola (slika 2). Aktivni spojini, ki sta prisotni v EKS, sta bili izolirani in potrjeni kot p-kumarinska kislina in kvercetin. Čeprav so za p-kumar poročali o različnih bioloških aktivnostih, vključno s kardioprotektivnimi [30], protivnetnimi [31, 32], antimutagenimi [33], antioksidativnimi [34, 35] in antimelanogenimi [36] kisline in kvercetina iz različnih rastlin, je to prva študija, ki poroča, da imata p-kumarinska kislina in kvercetin iz EKS antimelanogene in antioksidativne aktivnosti.

V tej študiji so ovrednotili antimelanogene in antioksidativne aktivnosti EKS. EKS je deloval antimelanogeno in antioksidativno z regulacijo aktivnosti tirozinaze in z -MSH inducirano sintezo melanina v celicah melanoma B16F10, ne da bi povzročil citotoksičnost. Glavni aktivni spojini sta bili p-kumarinska kislina in kvercetin. Tako naše ugotovitve prvič kažejo, da se EKS lahko uporablja kot potencialno sredstvo za depigmentacijo in antioksidant.

Nasprotja interesov

Avtorji izjavljajo, da ni navzkrižja interesov.

financiranje

To delo je podprl Program tehnološkega razvoja (S2393982), ki ga financira Ministrstvo za mala in srednja podjetja in startupe (MSS, Koreja).

Pregledni dokument

Dokument o preglednosti, povezan s tem člankom, je na voljo v spletni različici.

Reference

[1] P. Limtrakul, S. Yodkeeree, P. Thippraphan, W. Punfa, J. Srisomboon, Učinki proti staranju in inhibicija tirozinaze izvlečka butanola cvetov Cassia fistula, BMC komplement. Altern. med. 16 (2016) 497.

[2] A. Gragnani, S. Cornick, V. Chominski, S. Ribeiro de Noronha, S. Alves Corrêa de Noronha, L. Ferreira, Pregled glavnih teorij staranja kože, Adv. Staranje Res. 3 (2014) 265–284.

[3] TD Pedrosa, AO Barros, JR Nogueira, AC Fruet, IC Rodrigues, DQ Calcagno, MA Smith, TP de Souza, SB Barros, MC de Vasconcellos et al., Učinki juce proti gubam in beljenju ( Libidibia ferrea Mart.) izvlečki, Arch. Dermatol. Res. 308 (2016) 643–654.

[4] N. Delalle-Lozica, Lokalna terapija kot osnovna preventiva proti staranju, Acta Clin. Hrvat. 49 (2010) 529–536.

[5] N. Maddodi, A. Jayanthy, V. Setaluri, Sijoča ​​svetloba na pigmentacijo kože: temnejša in svetlejša stran učinkov UV-sevanja, Photochem. Photobiol. 88 (2012) 1075–1082.

[6] C. Dessinioti, AJ Stratigos, D. Rigopoulos, AD Katsambas, Pregled genetskih motenj hipopigmentacije: izkušnje iz biologije melanocitov, Exp. Dermatol. 18 (2009) 741–749.

[7] A. Nishina, A. Miura, M. Goto, K. Terakado, D. Sato, H. Kimura, Y. Hirai, H. Sato, N. Phay, Mansonone E iz merilnikov Mansonia je zaviral -MSH-inducirano melanogenezo v celicah B16 z zaviranjem izražanja CREB in fosforilacije v poti PI3K/Akt, Biol. Pharm. Bik. 41 (2018) 770–776.

[8] VJ Hearing, TM Ekel, tirozinaza pri sesalcih. Primerjava hidroksilacije tirozina in tvorbe melanina, Biochem. J. 57 (1976) 549–557.

[9] M. Kanlayavattanakul, N. Lourith, Rastline in naravni izdelki za zdravljenje hiperpigmentacije kože – pregled, Planta Med. (2018), https://doi.org/10.1055/a0583-0410 [Epub pred tiskom].

[10] M. Kanlayavattanakul, N. Lourith, Zdravljenje hiperpigmentacije kože z uporabo zelišč: pregled kliničnih dokazov, J. Cosmet. Laser Ther. 20 (2018) 123–131.

[11] JJ Hsiao, DE Fisher, Vloge transkripcijskega faktorja in pigmentacije pri melanomu, povezane z mikroftalmijo, Arch. Biochem. Biophys. 563 (2014) 28–34.

[12] LA Garraway, HR Widlund, MA Rubin, G. Getz, AJ Berger, S. Ramaswamy, R. Beroukhim, DA Milner, SR Granter, J. Du, C. Lee et al., Integrativne genomske analize identificirajo MITF kot onkogen za preživetje linije, pomnožen pri malignem melanomu, Nature 436 (2005) 117–122.

[13] X. Zhang, P. Guo, G. Sun, S. Chen, M. Yang, N. Fu, H. Wu, X. Xu, Fenolne spojine in flavonoidi iz plodov Pandanus tectorius Soland, J. Med . Rastline Res. 6 (2012) 2622–2626.

[14] H. Li, Q. Ma, Y. Liu, J. Qian, J. Zhou, Y. Zhou, Kemične sestavine iz Polygonum perfoliatum, Chin. J. Appl. Okolje. Biol. 15 (2009) 615–620.

[15] A. Yagi, T. Kanbara, N. Morinobu, Zaviranje gobove tirozinaze z izvlečkom aloje, Planta Med. 56 (1987) 515–517.

[16] MS Blois, Določanje antioksidantov z uporabo stabilnega prostega radikala, Nature 181 (1958) 1199–1200.

[17] U. Ozgen, A. Mavi, Z. Terzi, A. Yιldιrιm, M. Coşkun, PJ Houghton, Antioksidativne lastnosti nekaterih zdravilnih vrst Lamiaceae, Pharm. Biol. 44 (2006) 107–112.

[18] NJ Miller, C. Rice-Evans, MJ Davies, V. Gopinathan, A. Milner, Nova metoda za merjenje antioksidativne zmogljivosti in njena uporaba za spremljanje antioksidativnega statusa pri nedonošenčkih, Clin. Sci. 84 (1993) 407–412.

[19] S. Dudonne, X. Vitrac, P. Coutière, M. Woillez, JM Mérillon, Primerjalna študija antioksidativnih lastnosti in skupne vsebnosti fenolov 30 rastlinskih izvlečkov industrijskega pomena z uporabo testov DPPH, ABTS, FRAP, SOD in ORAC , J. Agric. Food Chem. 57 (2009) 1768–1774.

[20] M. Otreba, J. Rok, E. Buszman, D. Wrzesniok, Regulacija melanogeneze: vloga cAMP in MITF, Postepy Hig. med. Dosw. 66 (2012) 33–40.

[21] JS Han, JH Sung, SK Lee, Antimelanogenezna aktivnost hidroliziranega ekstrakta ginsenga (GINST) prek inhibicije JNK mitogen-aktivirane proteinske kinaze v celicah B16F10, J. Food Sci. 81 (2016) H2085–H2092.

[22] M. Chatatikun, A. Chiabchalard, Tajske rastline z visoko stopnjo antioksidantov, aktivnostjo lovljenja prostih radikalov, aktivnostjo proti tirozinazi in kolagenazi, BMC komplement. Altern. med. 17 (2017) 487.

[23] C. Couteau, LJ Coiffard, Določanje fotostabilnosti arbutina, rastlinskega belilnega sredstva, Farmaco 55 (2000) 410–413.

[24] Y. Higashi, Y. Fujii, Določanje kojične kisline v kozmetičnih izdelkih za beljenje kože s tekočinsko kromatografijo visoke ločljivosti v kombinaciji z ultravijolično detekcijo po derivatizaciji pred kolono s 4-fluoro-7-nitro{ {6}},1,3-benzoksazol, J. Cosmet. Sci. 63 (2017) 205–212.

[25] JY Tao, L. Zhao, ZJ Huang, XY Zhang, SL Zhang, QG Zhang, Zhang BH FeiXiao, QL Feng, GH Zheng, Protivnetni učinki izvlečka etanola iz Kummerowia striata (Thunb.) Schindl na LPS- stimulirana celica RAW264.7, Vnetje 31 (2008) 154–166.

[26] J.-H. Lee, J.-S. Park, Antioksidativne aktivnosti s topilom ekstrahiranih frakcij iz Kummerowia striata (Thunb.) Schindl, Indian J. Sci. Technol. 8 (2015) 28–31.

[27] S. Kippenberger, S. Loitsch, F. Solano, A. Bernd, R. Kaufmann, Kvantifikacija transkriptov tirozinaze, TRP-1 in Trp-2 v človeških melanocitih s konkurenčno reverzno transkriptazo multiplex PCR– regulacija s steroidnimi hormoni, J. Invest.Dermatol. 110 (1998) 364–367.

[28] YD Park, SY Kim, YJ Lyou, DY Lee, JM Yang, TXM13 celice človeškega melanoma: nov vir za kinetiko inhibicije človeške tirozinaze in za presejalne belilne agente, Biochem. Cell Biol. 84 (2006) 112–116.

[29] A. Tuerxuntayi, YQ Liu, A. Tulake, M. Kabas, A. Eblimit, HA Aisa, izvleček Kalizirija poveča izražanje tirozinaze, TRP-1, TRP-2 in MITF pri mišjem melanomu B16 celice, komplement BMC. Altern. med. 14 (2014) 166.

[30] N. Prasanna, DN Krishnan, M. Rasool, Kardiotoksičnost pri podganah, povzročena z natrijevim arzenitom: zaščitna vloga p-kumarne kisline, običajnega prehranskega polifenola, Toxicol. Meh. Metode 23 (2013) 255–262.

[31] SJ Pragasam, V. Venkatesan, M. Rasool, Imunomodulatorni in protivnetni učinek p-kumarne kisline, običajnega prehranskega polifenola na eksperimentalno vnetje pri podganah, Vnetje 36 (2013) 169–176.

[32] M. Lee, M. Son, E. Ryu, Kim JG Yu SS, BW Kang, GH Sung, H. Cho, H. Kang, Kvercetinom povzročena apoptoza preprečuje okužbo z EBV, Oncotarget 6 (2015) 12603–12624 .

[33] LR Ferguson, IF Lim, AE Pearson, J. Ralph, PJ Harris, Bakterijska antimutageneza s hidroksicimetnimi kislinami iz rastlinskih celičnih sten, Mutat. Res. 542 (2003) 49–58.

[34] C. Castelluccio, G. Paganga, N. Melikian, GP Bolwell, J. Pridham, J. Sampson, C. Rice-Evans, Antioksidativni potencial intermediatov pri presnovi fenilpropanoidov v višjih rastlinah, FEBS Lett. 368 (1995) 188–192.

[35] IM Erden, A. Kahraman, Zaščitni učinek flavonola kvercetina proti oksidativnemu stresu, ki ga povzroča ultravijolično pri podganah, Toxicology 154 (2000) 21–29.

[36] SM An, Koh JS in Boo YC: p-kumarinska kislina ne zavira le aktivnosti človeške tirozinaze in vitro, ampak tudi melanogenezo v celicah, izpostavljenih UVB, Phytother. Res. 24 (2010) 1175–1180.

For more information:1950477648nn@gmail.com